CN114019155A - 一种基于抗酪氨酸羟化酶抗体的免疫探针及其制备与应用 - Google Patents
一种基于抗酪氨酸羟化酶抗体的免疫探针及其制备与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种基于抗酪氨酸羟化酶抗体的免疫探针及其制备与应用，免疫探针为近红外荧光染料与抗酪氨酸羟化酶抗体的偶联物；制备方法包括以下步骤：1)将抗酪氨酸羟化酶抗体与还原剂混合，之后振荡反应，再加入溶解在有机溶剂中的近红外荧光染料，得到混合物；2)将步骤1)中的混合物加入至脱盐柱，除去残余的近红外荧光染料，之后离心收集上清液，即得到免疫探针。与现有技术相比，本发明中的免疫探针最大吸收在600‑1000nm区域，具有较大的摩尔吸光系数，适用于光声成像，在肾去交感神经消融术中可以通过光声成像提供实时手术指导和术后效果评估，可应用于与酪氨酸羟化酶过表达的生物细胞、组织或器官的靶向性活体成像和相关疾病的手术指导。
Description
技术领域
本发明属于荧光成像技术领域，涉及一种可用于光声成像且特异性识别神经密集区域的染料修饰的基于抗酪氨酸羟化酶抗体的免疫探针及其制备与应用。
背景技术
光声成像(PAI，photoacoustic imaging)是一种将光学成像和超声成像融合在一起的混合成像手段，且在过去二十年里迅速应用于生物医学领域，取得了令人瞩目的进展。纯光学成像受限于生物组织的光散射而无法在不同组织深度保持其高分辨率的优势，而与之相反的是，光声成像本身即是利用了组织光散射的性质，从而能够保证组织深度在厘米级时依旧能够提供高对比度高分辨率的光学图像，这使得PAI成为一种在各类临床成像应用中很有应用前途的成像技术。光声成像的原理是用一个纳米秒的脉冲激光(脉冲持续时间<10ns)照明生物组织样品，分子吸收光能并将其转变成热能，产生温度上升；由升温导致的热弹性膨胀而产生的声波信号可以被超声波传感器检测到并进一步通过计算转换为图像。声音受到的组织散射带来的干扰较少，甚至少于光学信号所受干扰的千分之一，因此声学信号在生物中的传播时间要长得多，在不同组织深度亦无明显衰减。
生物组织中的内源性发色团是具有固有光学吸收的，如血红蛋白、黑色素、脂质、色素和水。基于每一个发色团的特征吸收光谱，光声成像可以在多个波长对其进行相对量化标定，调查相关疾病的生理参数变化，以了解其背后的机制以及它们是如何对生物机体进行有效管理的。由于其内源性和无标记的特征，此类发色团适用于患有相关疾病的患者病情的长期监控。举例说明，光声检测可以区分脱氧血红蛋白(Hb)和氧合血红蛋白(HbO2)，适用于测量血管中的SO2检测，从而可以进一步反映机体的缺血、缺氧或低氧血症等相关生理症状。光声成像也可以利用皮肤中黑色素的特异性吸收，检测黑色素瘤的色素性病变和毛囊病变。动脉斑块和皮脂腺也可以通过脂质在特定组织中的特定吸收而被光声系统所检测。但是，此类内源性发色团可能存在对比度不够或者多个发色团之间吸收光谱的区分度不够等问题，外源性造影剂的研发将会具有更好的对比度，更深的成像深度和更强的针对性。值得注意的是，一些可用于临床的造影试剂，如吲哚菁绿、亚甲基蓝等均为优良的外源性光声检测探针。
高血压是一种心血管疾病中发病率较高、死亡率逐年攀升的发病率的疾病，在全球范围内有近10亿患者。虽然抗高血压药物治疗在降低心血管疾病和死亡风险方面非常有效，但是大约10％的患者患有抗药性高血压，其具体可以解释为至少对包括利尿剂在内的抗高血压药物的最大剂量产生耐受，严重影响到患者身心健康的一类顽固性高血压疾病。肾动脉血管内去神经技术是近年来研发的一种重要的用于治疗顽固性高血压的新型策略，且已经进入临床试验阶段(ClinicalTrials.gov，编号NCT00888433)。有效数据显示，血管内射频消融术(RDN，renal denervation surgery)可以持续安全有效地减弱肾交感神经活动，导致肾脏去甲肾上腺素溢出效应显著下降，最终导致TRH患者血压持续性和实质性降低，起到显著疗效。尽管以射频导管为基础的肾去神经技术取得了一定成功，但仍存在一些局限性。射频导管系统对肾动脉璧内的神经系统持续性无差别性进行消融，但是由于射频导管频率能量高度集中在尖端，因此更多的能量沉积在动脉壁处，导致肾动脉内皮细胞及周围组织损伤。肾交感神经是随机分布在血管壁中，其密集分布的位置个体差异较大，现阶段经验依赖的“盲消”手段也有很大几率大致无效消融，从而给病人增加了无效手术的风险。此外，现阶段的手术成功与否主要依赖于手术后的病人症状观察和诊断，并无直观有效的术后评估手段。
因此，肾去交感神经术亟需一种可实时有效成像技术，提供术前诊断、术中指导、术后评估等信息。迄今为止，已经有超声成像、放射成像等手段试用于此方面的手术指导，但主要集中于肾血管系统的追踪和成像，依旧不能实时直观地提供肾神经系统相关信息。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于抗酪氨酸羟化酶抗体的免疫探针及其制备与应用。本发明中的免疫探针是以酪氨酸羟化酶为靶点的抗体与近红外荧光染料共价偶联的免疫探针，可特异性识别神经密集区域且在术中提供指导。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种基于抗酪氨酸羟化酶抗体的免疫探针，该免疫探针为近红外荧光染料与抗酪氨酸羟化酶抗体的偶联物。近红外荧光染料是指一类发射光谱在600-900nm范围内的荧光染料，包括由奇数个碳原子组成共振次甲基(甲川基)共轭链并被两个含氮杂环封端构成的菁染料、由3、6位氨基取代的氧杂蒽母体与9位碳原子取代芳基构成的罗丹明染料、由二氟化硼二吡咯甲川染料及其衍生物构成的BODIPY染料等。
进一步地，所述的偶联为共价偶联。共价偶联是指由相邻原子通过共用电子并与共用电子之间形成稳定的化学键的偶联方式。
进一步地，所述的抗体以酪氨酸羟化酶为抗原，该抗原的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。该抗体是一类能与酪氨酸羟化酶特异性结合的抗体，根据其来源可具体分为大鼠可溶性酪氨酸羟化酶抗体、抗牛纹状体可溶性酪氨酸羟化酶抗体、针对来自人和大鼠嗜铬细胞瘤的酪氨酸羟化酶的抗体、针对来自PC12细胞的酪氨酸羟化酶的抗体、以及兔和四种抗大鼠纹状体酪氨酸的单克隆抗体等，根据其性质可具体分为多克隆抗体、单克隆抗体、单域抗体等。
优选地，本发明中的抗体为可通过酰胺反应、马来酰亚胺基团和巯基的反应等与一系列染料形成共价偶联的一类抗体。
进一步地，所述的免疫探针的光声成像区域为600-1000nm区域，即其最大吸收波长在600-1000nm区域。
一种基于抗酪氨酸羟化酶抗体的免疫探针的制备方法，该方法包括以下步骤：
1)将抗酪氨酸羟化酶抗体与还原剂混合，之后振荡反应，再加入溶解在有机溶剂中的近红外荧光染料，得到混合物；
2)将步骤1)中的混合物加入至脱盐柱，除去残余的近红外荧光染料，之后离心收集上清液，即得到所述的免疫探针。
进一步地，步骤1)中，所述的还原剂包括磷酸三(2-氯乙基)酯、二乙基三胺五乙酸、5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)中的一种或更多种。
进一步地，步骤1)中，所述的有机溶剂包括N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜中的一种或更多种。
进一步地，步骤1)中，振荡反应过程中，反应温度为4-60℃，优选为37℃，反应时间为50-70min，优选为60min。
进一步地，步骤2)中，离心过程中，离心温度为3-5℃，优选为4℃，离心时间为0.5-1.5min，优选为1min，离心转速为7000-9000r/min，优选为8000r/min。
一种基于抗酪氨酸羟化酶抗体的免疫探针在光声成像技术中的应用。该免疫探针具有光热效应和较大的摩尔吸光系数，适用于光声成像，例如可应用于与酪氨酸羟化酶过表达的生物细胞、组织或器官(如肾上腺、肾交感神经、腹腔神经节、T淋巴细胞、肠神经等)的靶向性成像，及神经相关疾病(如高血压、胶原性关节炎、“C”型尼曼K匹克病、外周神经母细胞性肿瘤、先天性巨结肠症等)的活体示踪成像和手术指导，例如应用在光声成像指导肾去神经外科手术中。
当用脉冲激光照射已经注射了该免疫探针的生物组织时，该免疫探针可以吸收对应光程的光子，从而引起升温，进一步导致组织热膨胀产生超声换能器可检测的压力波，通过反投影算法得到重建后的图像，与通过传统超声检测到的图像重合，即可用于判断该免疫探针在生物组织内的分布及位置信息。
本发明中，抗原为酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)，其在神经元中催化L-酪氨酸转变为二羟基苯丙氨酸(多巴)，二羟基苯丙氨酸(多巴)作为底物参与了儿茶酚胺(CA)类神经递质去甲肾上腺(norepinephrine，NE)和多巴胺(dopamine，DA)的生成，在大脑和肾上腺中高表达，可用作神经细胞的免疫组化分析、细胞流式分析以及免疫印迹分析(western blot abreview)中的标记抗体。
与现有技术相比，本发明具有以下特点：
1)本发明中的免疫探针为近红外荧光染料与抗酪氨酸羟化酶抗体的偶联物，是首个基于抗酪氨酸羟化酶抗体的可用于光声成像的免疫探针，并首次尝试光声成像系统对肾交感神经进行共定位活体成像的去肾交感神经手术。
2)本发明中的免疫探针可应用于与酪氨酸羟化酶过表达的生物细胞、组织或器官的靶向性活体成像和相关疾病的手术指导，在肾去交感神经消融术中可以通过光声成像提供实时手术指导和术后效果评估。
3)本发明中的免疫探针具有成本低廉、生物安全、适于成药等优势。
附图说明
图1为NIR-II免疫探针指导肾去神经手术示意图，其中，A为注射TH-ICGM用于肾交感神经光声共定位活体成像的示意图，B为肾交感神经调节机制及RDN手术位置。
图2为TH-ICGM的表征，其中，A为TH-ICGM的合成图，B为TH和TH-ICGM的SDS-PAGE结果，C为所得SDS-PAGE胶图在不同光学区域对应的荧光成像图，D为TH-ICGM相应的相对量子效率汇总表，E为TH-ICGM在NIR-I和NIR-II区域的吸收光谱和发射光谱谱图，F为NIR-I和NIR-II吸光度和对应的荧光光谱峰值汇总及线性拟合图，用于相对荧光量子效率的计算。
图3为通过总结TH(8.8μmol/L)、TH-ICGM(7.6μmol/L)和ICGM(2.5μmol/L)的紫外-可见吸收光谱，计算药物抗体比(DAR)值。
图4为TH-ICGM在不同时间点的NIR-II生物成像，其中，A为裸鼠注射TH-ICGM(400μL×0.128mg/mL)、1300nm长通滤光片和808nm激发激光(2mw·cm-2)的明场，B为3min时的成像图，C为8min时的成像图，D为29min时的成像图，G为59min时的成像图，H为151min时的成像图，I为170min时的成像图，E为切除的组织和器官的生物成像图，F为进一步切除的肾上腺和肾脏的荧光成像图，以确认TH-ICGM的成功递送。
图5为TH-ICGM的分辨率计算相关图谱，其中，A为将TH-ICGM(400μL×0.128mg/mL)腹腔注射到小鼠体内后在170min的时间点在λem≥1300nm区域的NIR-II生物成像的明场图，B为荧光场图，C为相应重叠图，D为根据图5中沿白虚线的荧光强度，通过高斯函数校准计算分辨率。
图6为肾上腺(A至H)和肾脏(I至P)的荧光扫描肾上腺冰冻切片，其中，肾上腺图中，A为DAPI，B为FITC修饰的抗酪氨酸羟化酶兔源多克隆抗体，C为TH-ICGM，D为以上三者的叠图，E、F、G、H为对应的局部放大图；肾脏图中，I为DAPI，J为FITC修饰的抗酪氨酸羟化酶兔源多克隆抗体，K为TH-ICGM，L为以上三者的叠图，M、N、O、P为对应的局部放大图。所用的肾上腺和肾脏冰冻切片来自图4中腹腔注射TH-ICGM的小鼠，TH-ICGM所用的荧光场属于切片自带的来自TH-ICGM的荧光信号。
图7中，A为RDN手术过程，B为小鼠制备NIR-II生物成像的明场，C为切除小鼠组织和器官生物成像，D、E为肾脏和邻近神经节和相应的NIR-II生物成像λem≥1300nm区域。
图8为TH-ICGM的生物安全性分析图，是通过对注射了TH-ICGM的小鼠进行解剖后得到的肝肾脾进行免疫组化分析而得到的，其中，A-C来自健康鼠的肝(A)、肾(B)、脾(C)，D-F来自注射了TH-ICGM的小鼠的肝(D)、肾(E)、脾(F)。健康鼠和注射了TH-ICGM的小鼠的肝小叶结构清晰，肝细胞数量正常，均表现出正常的肝脏细胞状态；肾脏均可以观察到分界清楚的皮髓质，形态结构正常的肾小球以及排列紧密的肾小管，肾脏上皮细胞也处于正常状态，印证了健康鼠和注射TH-ICGM的小鼠肾脏正常；两者的白髓和红髓数量均正常，印证了脾脏正常。综上所述，TH-ICGM是一种生物相容性较好，安全无毒的注射制剂。
图9为注射了TH-ICGM的小鼠的肾上腺镀银染色图(A)和镀银染色局部放大图(B)、免疫组化染色图(C)和局部放大图(D)、肾镀银染色图(E)及局部放大图(F)、肾脏免疫组化染色图(G)及局部放大图(H)。
图10为NIR-II与光声生物成像的共同定位相关图，其中，A1为裸鼠注射TH-ICGM(400μL×0.128mg/mL)后在配有1300-nm长通滤光片和808nm激发器的NIR-II活体成像仪上进行成像所得到的活体成像图，A2、A3分别为沿标有“x”和“y”的白色虚线统计荧光强度，B1为明场和荧光场的重叠图，B2为B1中沿虚线的荧光强度统计图，C为同一只小鼠的超声成像，D1为在925nm处的光声成像，D2为沿白色虚线“z”的荧光强度统计图，E1为裸鼠注射TH-ICGM(400μL×0.128mg/mL)后在配有1300-nm长通滤光片和808nm激发器的NIR-II活体成像仪上进行成像所得到的活体成像图，E2、E3分别为沿标有“x”和“y”的白色虚线统计荧光强度，F1为明场和荧光场的重叠图，F2为F1中沿虚线的荧光强度统计图，G为同一小鼠的超声成像，H1为在925nm处的光声成像，H2为沿白色虚线“z”标记的荧光强度统计图。
图11为RDN术后一周注射了TH-ICGM(400μL×0.128mg/mL)的小鼠在不同时间点的成像图，其中，A为小鼠的明场图像，B为5min时期小鼠的NIR-II成像图，图像中的亮点为TH-ICGM注射点，可以看到大部分材料迅速进入到肾脏和肠道代谢中，由于信号过强，基本无法观测到其在腹腔神经节处的成像信号；C为42min时期的成像图，大部分材料进入到肠道和脾脏中，腹腔神经节可见，但是两侧的肾动脉处信号及肾脏信号消失；D和F分别为其在76min和111min时期的NIR-II成像图。从始至终，近两个小时的跟踪成像中，均为观察到在术前清晰可见的肾动脉区域。
图12为近红外荧光染料ICGM的制备过程示意图。
图13为近红外荧光染料ICGM的中间体(3)的结构核磁表征图。
图14为近红外荧光染料ICGM的中间体(6)的结构核磁表征图。
图15为近红外荧光染料ICGM的中间体(7)的结构核磁表征图。
图16为近红外荧光染料ICGM的中间体(8)的结构核磁表征图。
图17为近红外荧光染料ICGM的结构核磁表征图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
为了能更彻底地理解本发明，以下列出一些定义。下述定义意在包含语法等同成分。
本发明中“近红外”意指红外光(Near Infrared，NIR)，是介于可见光(VIS)和中红外光(MIR)之间的电磁波，习惯上又将近红外区划分为近红外一区(750-900nm)和近红外二区(1000-1700nm)两个区域。近红外区域是人们最早发现的非可见光区域。
本发明中“抗体偶联物”意指通过一个化学链接将具有生物活性的小分子连接到抗体上，抗体作为载体将小分子靶向运输到目标细胞中。
本发明中“抗体”意指由基本上为公认的免疫球蛋白基因的全部或部分所编码的一种或多种多肽组成的蛋白质。所述公认的免疫球蛋白基因，例如在人中，包括kappa(κ)、lambda(λ)和重链基因座，其中包含了无数的可变区基因，以及分别编码IgM、IgD、IgG、IgE和IgA同种型的恒定区基因mu(μ)、delta(δ)、gamma(γ)、epsilon(ε)、alpha(α)。本发明中的抗体意指包括全长抗体和抗体片段，以及来自任意生物体的天然抗体，工程抗体，或为试验、治疗目的或其它如下所进一步规定的目的而重组产生的抗体。术语“抗体”包括抗体片段，为本领域所公知，诸如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv，scFv或抗体的抗原结合的其它亚序列，或通过修饰完整抗体或使用重组DNA技术重新合成的那些抗体而产生的抗体片段。术语“抗体”包括单克隆以及多克隆抗体。抗体可以是拮抗剂、激动剂、中和性抗体、或抑制性抗体、或刺激性抗体。本发明的抗体可以是非人抗体，嵌合抗体，人源化抗体或完全人抗体。
本发明中使用的“抗原”意指可以在动物体内刺激抗体产生或T细胞反应的化合物、组合物或物质，包括注射或吸收到动物体内的组合物，可以是蛋白质、糖类、脂质或其它病原体。
本发明中使用的“氨基酸”意指20种天然存在的氨基酸之一或任一非天然类似物，它们可位于具体规定的位置。本发明中“蛋白质”意指至少两个共价连接的氨基酸，其包括蛋白质、多肽、寡肽和肽。蛋白质可由天然存在的氨基酸和肽键构成，或由合成的肽模拟物结构构成，该肽模拟物即“类似物”。因此本发明中使用的“氨基酸”或“肽残基”意指天然存在和合成的氨基酸。举例来说，对于本发明目的而言，高苯基丙氨酸、瓜氨酸和降亮氨酸被认为是用于本发明目的的氨基酸。“氨基酸”也包括诸如脯氨酸和羟脯氨酸的亚氨基酸残基。侧链可以是(R)或(S)构型。在优选的实施方案中，氨基酸以(S)或L-构型存在。如果使用非天然存在的侧链，可使用非氨基酸取代，例如以阻止或延迟体内降解。
除非另外说明，否则本发明使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。除非上下文另有明确说明，否则单数术语“一”，“一个”和“该”包括复数指示物。尽管与本发明描述的那些类似或等同的方法和材料可用于本公开的实践或测试，但下文描述了合适的方法和材料。术语“包含”表示“包括”。本发明提及的所有出版物、专利和其他参考文献均通过引用整体并入。如果发生冲突，将以本说明书(包括术语解释)为准。另外，材料、方法和实施例仅是说明性的而不是限制性的。
下述实施例中使用的标准的重组DNA技术和分子克隆技术是本领域所熟知的(Ausubel，F.M等人，Current Protocols in Molecular Biology,Greene PublishingAssoc.和Wiley-Interscience出版)，适用于微生物生长的材料和方法是本领域熟知的。主要化学、生物试剂购自KAPA Biosystems，New England Biolabs，TransGen Biotech，Thermo Fisher Scientific，OMEGA bio-tek等，或可按本领域已知方法制备(a)A.L.Antaris,H.Chen,K.Cheng,Y.Sun,G.Hong,C.Qu,S.Diao,Z.Deng,X.Hu,B.Zhang,X.Zhang,O.K.Yaghi,Z.R.Alamparambil,X.Hong,Z.ChengH.Dai,Nat.Mater.2016,15,235-242.；(b)K.K.Maiti,A.Samanta,M.Vendrell,K.S.Soh,M.OlivoY.T.Chang,Chem.Commun.2011,47,3514-3516.。
实施例1：
近红外荧光染料与抗体的偶联物的制备
本发明近红外荧光染料与抗体的偶联物的制备按图2中A所示步骤进行，具体如下：
(1)抗体和还原剂混合后，振荡反应一段时间，近红外荧光染料溶解在有机溶剂中，分批加入盛有抗体和还原剂的混合液中。还原剂用于破坏抗体的二硫键，选自各种有机和无机还原剂，优选磷酸三(2-氯乙基)酯、二乙基三胺五乙酸、5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)。有机溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜等，反应温度为4-60℃，优选37℃。反应时间优选60分钟，得到混合物。
(2)将步骤(1)所得混合物加入脱盐柱。收小分子染料对应颜色的流分，在离心机上离心一段时间，收上清液。离心温度优选4℃，离心时间优选1分钟，离心转速优选8000rpm。得到目标近红外荧光染料与抗体的偶联物。
实施例2：
近红外荧光染料ICGM的制备按图12所示步骤进行，具体如下：
(1)中间体(2)的制备
化合物(1)(2.09g，10mmol)溶解在5mL甲苯中，逐滴加入盛有1,3-丙烷磺酸内酯的茄型瓶中，在110℃反应8小时，过滤收集暗灰色固体，用20mL三氯甲烷分三次洗涤，得到中间体(2)。
(2)中间体(3)的制备
将中间体(2)(3.31g，10mmol)和盐酸谷氨酸二胍(2.85g，10mmol)加入含有乙酸酐(3mL)和乙酸钾(0.98g，10mmol)的50mL圆底瓶中。整个混合物加热至70℃后保持1小时，冷却至室温，倒入饱和碳酸氢钠溶液中。红色沉淀用乙醚洗涤。最终产物经洗脱剂CH2Cl2/MeOH(20/1；v/v)过柱分离，得到红色固体。1H NMR(400MHz,cd3od)δ7.40(dd,J＝11.0,5.8Hz,2H),7.32(d,J＝8.9Hz,1H),7.27(d,J＝8.2Hz,1H),7.20(dd,J＝15.0,11.3Hz,1H),7.00(d,J＝8.9Hz,1H),6.94(t,J＝7.2Hz,1H),6.85(t,J＝7.2Hz,1H),6.77(t,J＝7.9Hz,3H),6.59–6.53(m,1H),6.50(d,J＝15.0Hz,1H),6.43(d,J＝8.1Hz,2H),5.80(dd,J＝14.2,11.3Hz,1H),4.64(dd,J＝13.6,11.7Hz,1H),4.54(dd,J＝3.5,2.5Hz,1H),4.08–4.00(m,2H),2.18–2.10(m,2H),1.17(s,9H).EMI-MS:Calcd(C31H32N2O4S):528.66,found:527.70[M-1].
(3)中间体(5)的制备
将化合物(4)(4.18g，20mmol)和2-溴乙胺氢溴化物(2.04g，10mmol)碾磨后加入到圆底烧瓶中，加热至130℃反应8小时。将混合物冷却至室温，用30mL氯仿洗涤得到红灰色沉淀。EMI-MS:Calcd(C17H21N2):253.36,found:254.14。
(4)中间体(6)的制备
将中间体(5)(3.48g，10mmol)、二碳酸二叔丁酯(2.18g，10mmol)加入含N,N’-二异丙基乙胺(3.23g，25mmol)的三氯甲烷30mL中。将混合物加热至60℃，加热6小时。最后的溶液用水清洗，然后用乙醚萃取。最终产物经洗脱剂CH2Cl2/MeOH(50/1；v/v)柱层析分离，得到中间体(6)。1H NMR(400MHz,cdcl3)δ7.93(d,J＝8.5Hz,1H),7.73(d,J＝8.2Hz,1H),7.65(d,J＝8.7Hz,1H),7.36(t,J＝7.7Hz,1H),7.16(t,J＝7.5Hz,1H),7.02(d,J＝8.6Hz,1H),4.65(t,J＝7.0Hz,1H),3.95(s,2H),3.76(t,J＝5.5Hz,2H),3.47–3.33(m,2H),1.64(s,6H),1.42(d,J＝12.0Hz,10H).
(5)中间体(7)的制备
将中间体(3)(0.528g，1mmol)和中间体(6)(0.353g，1mmol)加入含有乙酸酐(3mL)和乙酸钾(0.098g，10mmol)的50mL圆底烧瓶中。将混合物全部加热至80℃后保持10分钟，变绿，冷却至室温，用乙醚洗涤。绿色沉淀经层析纯化，洗脱剂为CH2Cl2/MeOH(20/1；v/v)，得到中间体(7)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.15(t,J＝7.6Hz,2H),7.98–7.86(m,5H),7.62(d,J＝8.8Hz,1H),7.58(d,J＝8.6Hz,1H),7.55(d,J＝8.3Hz,2H),7.39(td,J＝7.4,4.0Hz,2H),6.52(dd,J＝28.6,14.7Hz,2H),6.35(dd,J＝17.3,14.3Hz,2H),4.43–4.34(m,2H),4.31–4.19(m,2H),3.70(dt,J＝13.2,6.6Hz,1H),3.51(t,J＝5.4Hz,2H),3.33(s,2H),3.20(dd,J＝14.8,7.4Hz,1H),3.03(t,J＝6.7Hz,2H),2.32–2.22(m,2H),1.97–1.85(m,11H),1.35(d,J＝6.6Hz,3H),1.15(s,7H).13C NMR(101MHz,MeOD)δ185.72,173.66,172.59,156.81,150.75,150.43,140.19,139.63,133.47,133.15,131.92,131.82,130.37,130.01,129.68,129.58,128.11,128.02,127.19,126.01,124.48,124.40,121.93,121.87,78.72,54.46,50.84,50.61,44.10,42.61,42.43,37.95,27.20,26.35,26.07,23.08,11.81,11.78.
(6)中间体(8)的制备
将中间体(7)加入TFA/CH2Cl2(1/20；v/v)，在室温下再搅拌2小时。绿色溶液用旋转蒸发器除去多余的TFA和CH2Cl2的水清洗，用洗脱剂CH2Cl2/MeOH进行色谱纯化(4/1；v/v)。1HNMR(400MHz,MeOD)δ8.21(d,J＝8.6Hz,1H),8.19–8.16(m,1H),8.00(d,J＝8.3Hz,1H),7.99–7.95(m,2H),7.93(dd,J＝7.5,2.4Hz,2H),7.70(d,J＝9.9Hz,1H),7.64(d,J＝8.9Hz,1H),7.58(dd,J＝14.1,5.6Hz,3H),7.49(d,J＝8.6Hz,1H),7.47–7.38(m,2H),6.68–6.50(m,3H),6.40(dd,J＝28.7,10.9Hz,2H),4.49–4.43(m,1H),4.42–4.36(m,1H),4.36–4.31(m,1H),4.30–4.24(m,1H),3.79–3.73(m,1H),3.55–3.49(m,1H),3.05–2.98(m,2H),2.28(dd,J＝14.8,7.9Hz,3H),2.00–1.93(m,9H),1.17(s,3H).EMI-MS:Calcd(C40H43N2O3S):645.85,found:645.40[M-1].
(7)ICGM的制备
将中间体(8)(0.401g，0.5mmol)和DIPEA(0.064g，0.5mmol)加入到含有TSTU(0.150g，0.5mmol)、3-马来酰亚胺丙酸(0.085g，0.5mmol)和30mL CH2Cl2的圆底瓶中。全部搅拌6小时，通过TLC薄板层析跟踪。然后用洗脱剂CH2Cl2/MeOH(15/1；v/v)。1H NMR(400MHz,cd3od)δ8.19(dd,J＝8.2,6.2Hz,2H),7.99(d,J＝9.2Hz,1H),7.94(t,J＝9.4Hz,3H),7.67(d,J＝8.6Hz,1H),7.59(dd,J＝14.1,7.1Hz,2H),7.54(d,J＝8.8Hz,1H),7.43(dd,J＝17.4,7.5Hz,2H),6.61–6.54(m,2H),6.49(d,J＝12.3Hz,1H),6.31(d,J＝13.2Hz,1H),4.45–4.40(m,2H),4.29–4.24(m,2H),3.62–3.60(m,1H),3.58(d,J＝7.0Hz,1H),3.33(s,6H),3.21(dd,J＝14.9,7.5Hz,2H),3.02(t,J＝6.7Hz,2H),2.29(dd,J＝14.9,7.3Hz,3H),1.95(s,7H),1.35(dd,J＝6.9,2.9Hz,6H),1.27(s,1H)。
图13、图14、图15、图16、图17分别为该近红外荧光染料ICGM的中间体(3)、中间体(6)、中间体(7)、中间体(8)和ICGM的结构核磁表征图。
实施例3：
TH-ICGM的合成、纯化及表征
还原剂TCEP(购自默克Sigma-Aldrich化学试剂)与购买所得抗酪氨酸羟化酶抗体TH(EP1532Y)(Abcam，ab137869)以10:1的摩尔比混合，于37℃反应20min，使键间二硫键打开，分十次加入溶解在30μL DMSO中的ICGM(2mg)，在4℃混合震荡，反应1小时，通过ThermoScientific Zeba脱盐柱除去残余的ICGM。所得TH-ICGM，8000rpm离心1分钟，取绿色上清液。通过SDS-PAGE蛋白电泳确认其成功偶联，近红外二窗活体成像仪(andor)确认其荧光强度,紫外可见吸收光谱确认其药物-抗体比值(drug-to-antibody ratio；DAR)(具体检测方法见文献Cell Host Microbe 2020,27,891-898e895；Nat.Mater.2016,15,235-242.)。
图2是荧光染料ICGM与目标抗体共价偶联后得到的TH-ICGM及目标抗体TH的SDS-PAGE胶图和对应的在不同成像窗口的荧光强度。抗酪氨酸羟化酶抗体(TH)为市售。用ICGM修饰TH遵循半胱氨酸偶联ADC(抗体药物偶联物)的常规合成程序，一般包括三个步骤(图2中的A图)。TCEP用于链间二硫键的还原，生成巯基与下一步加入的ICGM的马来酰亚胺基团反应。整个反应在4℃下进行1小时。脱盐柱有助于除去多余的ICGM。二硫键的断裂可能导致抗体的重组或失活，重组或失活抗体通常稳定性和水溶性较差。因此，需要在高速离心(8000rpm)完全消除TH-ICGM的非活性副产物。药物负荷(Drug-to-antibody ratio，DAR)通常发生在2、4、6或8之间，这是由于每个二硫键会产生两个巯基，由还原剂和药物的浓度决定，进而影响疗效和特性。在本工作中，通过紫外-可见吸收光谱评估计算DAR值为5.58，表明ICGM在一个TH抗体上的共价附着数集中在4或6(图3)。通过SDS-PAGE和NIR-II光学成像证实了ICGM与TH抗体的成功结合。实际上，TH-ICGM在制备用于SDS-PAGE的样品时需使用到强还原剂(巯基乙醇和溴酚蓝)和高温预制(95℃，5分钟)，导致部分ICGM脱离链接位置或变质。因此，在NIR-II窗口内只能观察到TH-ICGM所对应的条带(图2中的C图)。TH-ICGM的吸收光谱在近红外二窗区域(λex＝916nm)，并具有较高的NIR-II区域荧光量子效率(QM1070 nm＝1.03％，是ICG在此处的两倍)，甚至在λem≥1300nm时仍可见(图2中的F图)。如图2中C图所示，TH-ICGM(0.16nmol)在进行SDS-PAGE后，将胶图拿到NIR-II成像仪上在λem≥1100nm区域(Iλem≥1100nm＝7192)荧光强度最大，进入λem≥1200nm区域(Iλem≥1200nm＝2008)和λem≥1300nm区域(Iλem≥1300nm＝1256)荧光强度急剧下降。然而，与其他区域相比，脂质组织更容易吸收1210nm左右的光，而水则倾向于吸收1100nm左右的光，因此λem≥1300nm区域更适合于生物成像。
实施例4：
近红外荧光免疫探针的应用实验
1、TH-ICGM作为NIR-II荧光免疫探针的应用
雌性裸鼠(～6周)购自上海吉辉实验动物饲养有限公司，再饲喂一周使其适应环境。将TH-ICGM溶液注射至小鼠肾脏附近，以提高递送准确性。然后用异氟烷气体麻醉小鼠。然后分别在3min、8min、29min、59min、151min和170min采集NIR-II图像(图4)，并在功率密度为10mw·cm-2的808nm激光器照射下在λem≥1300nm的光学窗口进行荧光成像。
分子量在5000以上的生物分子的运输在很大程度上依赖于腹膜淋巴运输。腹腔注射单克隆抗体(mAbs)有助于提高单克隆抗体在相应靶点的浓度，减缓免疫探针从腹膜运输系统进入到血液循环系统的速度。因此采用腹腔注射的方法进行给药，以弥补TH对肾交感神经系统在靶向性上的不足。将TH-ICGM注射到肾脏附近后，TH-ICGM迅速聚集在腹腔神经节周围(图4中的B图)。用虚线画一条与脊柱平行的线，沿这条以“a”为零轴的线分析荧光强度数据(图4中的B图)。荧光强度较高(最大3.72×104)，从神经节伸出的腰交感神经纤维仅有两条，一条宽1.78mm，一条宽7.88mm(基于荧光信号强度和高斯拟合所得结果)。在第5分钟，由于神经节和纤维的位置靠近脊柱，隐藏在多个器官下方，荧光强度下降到1.75×104(在第三神经纤维处)。纤维数增加到3条，宽度分别为1.21mm、0.88mm和1.45mm。可以观察到肾上腺、前哨淋巴结和腹腔神经节结。TH-ICGM随时间推移(29min)延伸至交感神经纤维区域，通过高斯函数计算其宽度分别为0.91mm、1.21mm和0.96mm(图4中的D图)。荧光强度普遍增加(3.72×104)，主要是因为TH-ICGM已经递送到血液循环系统，信号分布在整个腹腔。实时观察TH-ICGM腹膜递送共170min，其分辨率计算为0.15mm(图5)。随着时间的推移，荧光从右肾向另一侧移动，并延伸至整个腹腔(图4中的G图)。然后小鼠经心脏灌注，去除血液中多余的荧光信号并对器官和组织位置和形态起到固定作用，便于后期制备免疫组化样本。对器官组织进行解剖和NIR-II生物成像，可以直观地观察到荧光信号集中的区域。肠和肝为主要代谢途径，腹腔神经节、肾脏动脉和静脉、肾上腺则为TH-ICGM主要靶向的区域(图4中的E图和F图)。
2、TH-ICGM的共聚焦扫描成像
将TH-ICGM注射并确认成功递送至特定区域的小鼠(图4)肾上腺和肾脏切除，准备冰冻切片和共聚焦成像。肾上腺位于肾的顶部，外层称为肾上腺皮质，中央核称为髓质，刺激交感神经系统释放肾上腺素。DAPI染色反映细胞核数量(图6中的A图)。肾上腺皮质包含3个不同的区域。如图6中的D图所示，位于肾上腺被膜下的肾小球带(ZG)包含成簇排列的细胞，小梁与被膜连续连接并分离。这些细胞产生钠和水重吸收所必需的醛固酮，具有明显的圆形细胞核，与邻近区域的细胞(ZF)相比，具有更高的核/胞浆比。束状带(ZF)是最厚的带(约占70％)，由柱状分泌细胞组成，细胞之间有突出的毛细血管。网状带(ZR)也由多面体细胞组成，多数呈圆形巢状，少量呈纤维状。肾上腺供血系统由小动脉支撑，小动脉穿过被膜，没有肌壁，形成毛细血管区域，供应肾上腺皮质并进一步运输到髓质区[10]。确定它的位置依靠的现象是，虚线圈出的区域没有TH-ICGM的荧光信号，该小鼠的肾上腺和肾脏组织均是在心脏灌注除去血液后再进一步手术切除做成冰冻切片的，因此原先残存于血液中的TH-ICGM会被除去，但成功递送并与酪氨酸羟化酶靶点相结合的区域的信号会被保留。银染色和免疫组化染色也有助于分析肾上腺和肾脏结构(图9)。
肾脏的三维结构已经有很多相关报道，肾交感神经一般分布在肾动脉周围。这些观察结果与本专利的共焦成像结果一致(图6)。用另一种连有FITC染料且靶向到酪氨酸羟化酶的多克隆抗体直接在冷冻切片上标记成像的区域与TH-ICGM信号区域完全一致，荧光强度分布略有差异，说明TH-ICGM已成功输送至肾脏。TH-ICGM或DAPI有一个区域没有荧光信号，位置与文献报道的肾动脉所在位置吻合。然而，TH-ICGM在其周围比TH-specificpAbs获得更高的荧光强度(图6中J图、K图、L图)。这主要是因为肾供血通过腹主动脉的肾动脉分支，在进入肾实质之前进一步分成多个节段的血管。主要的动、静脉最终延伸到几个不同的肾微血管网，说明TH-ICGM的运输途径主要是通过其肾微血管网络进行，因此肾动脉血管所在位置没有荧光信号，但肾动脉血管的周围TH-ICGM对应通道的荧光信号强度较高。
因此，确认TH-ICGM可以成功递送到酪氨酸羟化酶丰富的区域，如肾上腺和肾脏，同时定位肾旁手术位置。基于TH-ICGM的共聚焦成像也有助于全面了解肾上腺和肾脏的结构，特别是毛细血管丰富的区域。综上所述，TH-ICGM是一种优秀的免疫探针，既可以提供肉眼可见的交感神经的活体成像，又可以用共聚焦进一步扫描观察的微观成像，以上应用显示出其作为一种肾神经系统相关疾病辅助试剂具有广泛的应用前景。
实施例5：
TH-ICGM通过NIR-II和光声生物成像共同定位指导肾去神经外科手术中的应用(图1)
基于上述实验结果，可以注意到，尽管报道中提到NIR-II探针具有较高的空间分辨率，但染色修饰的免疫探针仍会集中在抗原丰富区，信号的重叠导致空间识别能力的丧失。局限在二维(2D)平面内的成像图对RDN手术的指导意义有限。在此，本专利选择光声成像来弥补缺失维度的信息。基于特定内源性探针的光声成像会受到不需要的本征分子PAI的光吸收干扰，产生背景噪声，因此如TH-ICGM这样的具有较大的摩尔吸光系数且吸收峰值靠近近红外二窗区域的探针会避免此类干扰，从而提高其成像的精准度。如图10所示，TH-ICGM经腹腔内注射右侧区域，仍顺利到达手术位置，证明其具有操作简单和靶向性好等优势。画一条标有“x”轴的白色虚线，并沿着它收集荧光强度的相关数据。如图10中A1图所示，荧光强度最高的位置位于手术位置的中央，为前哨淋巴结。有五个密集的荧光发射区域代表腹腔神经节的位置。采集沿白色虚线“y”方向的荧光强度信号，寻找后续RDN手术的手术位置。测量左肾(标记“a”)的手术支点为(-0.96mm,4.85mm)，右肾(标记“b”)的手术支点为(0mm,4.19mm)。图10中B1图、B2图中沿虚线的荧光强度统计是为了计算帮助基于抗体的生物分子运输的毛细血管壁宽度。明场与荧光场重叠图像清晰印证了TH-ICGM从淋巴系统到毛细血管系统的传递途径。
光声成像提供了两个通道，包括超声和来自TH-ICGM的相应的925nm光声信号。如图10中的C图和D1图所示，TH-ICGM的光声信号一般分布在腹膜，淋巴结，肠区，脊柱上方及两侧肾动脉和肾交感神经重叠区域。由于TH-ICGM最终转运至毛细血管系统，而且肠道系统几乎覆盖了整个腹腔的一半，因此TH-ICGM被肠道摄取和代谢是不可避免的。NIR-II和光声仪的双重生物成像将有助于准确区分器官位置和信号分布。采集沿白色虚线“z”方向的荧光强度统计，测定手术位中心点的三维坐标，“a”为6.41mm，“b”为5.15mm。也就是说，左、右肾的手术位置为(-0.96mm,4.85mm,6.41mm)，右肾(标记为“b”)的手术位置为(0mm,4.19mm,5.15mm)，与解剖后所得小鼠的肾动脉和静脉所在区域位置相似(图7)。
现有的导管装置型号与所用小鼠的体型不相匹配，这导致接受该手术的小鼠死亡率过高。因此，使用饱和10％苯酚乙醇作为替代品模拟了该去肾交感神经手术。用沾有10％苯酚(苯酚/乙醇；1/9)的棉签反复擦拭可见的肾动脉和静脉，以去除上面的神经纤维。小鼠被缝合并接受术后1周的护理，以进行下一次NIR-II和光声生物成像。如图10中的E1图和E2图所示，腹腔注射的TH-ICGM由于术后目标递送位点里的靶标剩余有限，而迅速进入肠道区域(图11)，腹腔神经节仍然存在。因此，多余的免疫探针将在代谢相关器官内的富集导致出现大面积的荧光信号干扰，从而导致很难出现如正常小鼠注射TH-ICGM后的腹腔神经纤维成像效果图。根据NIR-II成像结果(图10中的F图)和光声结果(图10中的H图)，位于肾动静脉的手术信号也消失，表明肾去神经手术成功。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 复旦大学
<120> 一种基于抗酪氨酸羟化酶抗体的免疫探针及其制备与应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 528
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Met Pro Thr Pro Asp Ala Thr Thr Pro Gln Ala Lys Gly Phe Arg Arg
1 5 10 15
Ala Val Ser Glu Leu Asp Ala Lys Gln Ala Glu Ala Ile Met Val Arg
20 25 30
Gly Gln Gly Ala Pro Gly Pro Ser Leu Thr Gly Ser Pro Trp Pro Gly
35 40 45
Thr Ala Ala Pro Ala Ala Ser Tyr Thr Pro Thr Pro Arg Ser Pro Arg
50 55 60
Phe Ile Gly Arg Arg Gln Ser Leu Ile Glu Asp Ala Arg Lys Glu Arg
65 70 75 80
Glu Ala Ala Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val Pro Ser Glu Pro Gly
85 90 95
Asp Pro Leu Glu Ala Val Ala Phe Glu Glu Lys Glu Gly Lys Ala Val
100 105 110
Leu Asn Leu Leu Phe Ser Pro Arg Ala Thr Lys Pro Ser Ala Leu Ser
115 120 125
Arg Ala Val Lys Val Phe Glu Thr Phe Glu Ala Lys Ile His His Leu
130 135 140
Glu Thr Arg Pro Ala Gln Arg Pro Arg Ala Gly Gly Pro His Leu Glu
145 150 155 160
Tyr Phe Val Arg Leu Glu Val Arg Arg Gly Asp Leu Ala Ala Leu Leu
165 170 175
Ser Gly Val Arg Gln Val Ser Glu Asp Val Arg Ser Pro Ala Gly Pro
180 185 190
Lys Val Pro Trp Phe Pro Arg Lys Val Ser Glu Leu Asp Lys Cys His
195 200 205
His Leu Val Thr Lys Phe Asp Pro Asp Leu Asp Leu Asp His Pro Gly
210 215 220
Phe Ser Asp Gln Val Tyr Arg Gln Arg Arg Lys Leu Ile Ala Glu Ile
225 230 235 240
Ala Phe Gln Tyr Arg His Gly Asp Pro Ile Pro Arg Val Glu Tyr Thr
245 250 255
Ala Glu Glu Ile Ala Thr Trp Lys Glu Val Tyr Thr Thr Leu Lys Gly
260 265 270
Leu Tyr Ala Thr His Ala Cys Gly Glu His Leu Glu Ala Phe Ala Leu
275 280 285
Leu Glu Arg Phe Ser Gly Tyr Arg Glu Asp Asn Ile Pro Gln Leu Glu
290 295 300
Asp Val Ser Arg Phe Leu Lys Glu Arg Thr Gly Phe Gln Leu Arg Pro
305 310 315 320
Val Ala Gly Leu Leu Ser Ala Arg Asp Phe Leu Ala Ser Leu Ala Phe
325 330 335
Arg Val Phe Gln Cys Thr Gln Tyr Ile Arg His Ala Ser Ser Pro Met
340 345 350
His Ser Pro Glu Pro Asp Cys Cys His Glu Leu Leu Gly His Val Pro
355 360 365
Met Leu Ala Asp Arg Thr Phe Ala Gln Phe Ser Gln Asp Ile Gly Leu
370 375 380
Ala Ser Leu Gly Ala Ser Asp Glu Glu Ile Glu Lys Leu Ser Thr Leu
385 390 395 400
Tyr Trp Phe Thr Val Glu Phe Gly Leu Cys Lys Gln Asn Gly Glu Val
405 410 415
Lys Ala Tyr Gly Ala Gly Leu Leu Ser Ser Tyr Gly Glu Leu Leu His
420 425 430
Cys Leu Ser Glu Glu Pro Glu Ile Arg Ala Phe Asp Pro Glu Ala Ala
435 440 445
Ala Val Gln Pro Tyr Gln Asp Gln Thr Tyr Gln Ser Val Tyr Phe Val
450 455 460
Ser Glu Ser Phe Ser Asp Ala Lys Asp Lys Leu Arg Ser Tyr Ala Ser
465 470 475 480
Arg Ile Gln Arg Pro Phe Ser Val Lys Phe Asp Pro Tyr Thr Leu Ala
485 490 495
Ile Asp Val Leu Asp Ser Pro Gln Ala Val Arg Arg Ser Leu Glu Gly
500 505 510
Val Gln Asp Glu Leu Asp Thr Leu Ala His Ala Leu Ser Ala Ile Gly
515 520 525
Claims (10)
1.一种基于抗酪氨酸羟化酶抗体的免疫探针，其特征在于，该免疫探针为近红外荧光染料与抗酪氨酸羟化酶抗体的偶联物。
2.根据权利要求1所述的一种基于抗酪氨酸羟化酶抗体的免疫探针，其特征在于，所述的偶联为共价偶联。
3.根据权利要求1所述的一种基于抗酪氨酸羟化酶抗体的免疫探针，其特征在于，所述的抗体以酪氨酸羟化酶为抗原，该抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
4.根据权利要求1所述的一种基于抗酪氨酸羟化酶抗体的免疫探针，其特征在于，所述的免疫探针的光声成像区域为600-1000nm区域。
5.一种如权利要求1至4任一项所述的基于抗酪氨酸羟化酶抗体的免疫探针的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
1)将抗酪氨酸羟化酶抗体与还原剂混合，之后振荡反应，再加入溶解在有机溶剂中的近红外荧光染料，得到混合物；
2)将步骤1)中的混合物加入至脱盐柱，除去残余的近红外荧光染料，之后离心收集上清液，即得到所述的免疫探针。
6.根据权利要求5所述的一种基于抗酪氨酸羟化酶抗体的免疫探针的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述的还原剂包括磷酸三(2-氯乙基)酯、二乙基三胺五乙酸、5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)中的一种或更多种。
7.根据权利要求5所述的一种基于抗酪氨酸羟化酶抗体的免疫探针的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述的有机溶剂包括N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜中的一种或更多种。
8.根据权利要求5所述的一种基于抗酪氨酸羟化酶抗体的免疫探针的制备方法，其特征在于，步骤1)中，振荡反应过程中，反应温度为4-60℃，反应时间为50-70min。
9.根据权利要求5所述的一种基于抗酪氨酸羟化酶抗体的免疫探针的制备方法，其特征在于，步骤2)中，离心过程中，离心温度为3-5℃，离心时间为0.5-1.5min，离心转速为7000-9000r/min。
10.一种如权利要求1至4任一项所述的基于抗酪氨酸羟化酶抗体的免疫探针在光声成像技术中的应用。
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2021
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