CN114008215A

CN114008215A - 寡核苷酸合成的质量控制方法

Info

Publication number: CN114008215A
Application number: CN202080038030.5A
Authority: CN
Inventors: 迈克尔·春·浩·陈; 戈登·罗斯·米钦罗伊
Original assignee: Newclay Biotechnology Co ltd
Current assignee: Newclay Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-05-22
Filing date: 2020-05-22
Publication date: 2022-02-01
Also published as: EP3973075A1; GB201907209D0; WO2020234605A1

Abstract

本发明涉及用于在非模板依赖性末端转移酶延伸的循环期间确保寡核苷酸合成的质量的方法和组合物。可以确定每个延伸循环掺入的核苷酸的量，从而确认所提供的核苷酸已经有效地掺入以使链延伸。

Description

寡核苷酸合成的质量控制方法

发明领域

本发明涉及用于在非模板依赖性酶促延伸的循环期间寡核苷酸合成的质量控制的方法和组合物。

发明背景

核酸合成对现代生物技术是重要的。科学界人工合成DNA、RNA和蛋白质的能力已经使生物技术领域的快速发展成为可能。

人工DNA合成允许生物技术和制药公司开发一系列肽治疗剂，诸如用于治疗糖尿病的胰岛素。它允许研究人员表征细胞蛋白质，以开发新的小分子疗法用于治疗我们的老年人口如今面临的疾病，诸如心脏病和癌症。它甚至为创造生命铺平了道路，如文特尔研究所(Venter Institute)在2010年展示的那样，当时他们将人工合成的基因组放入细菌细胞中。

然而，目前的DNA合成技术未满足生物技术产业的需求。尽管是一项成熟的技术，但以可行的收率合成长度大于200个核苷酸的DNA链是非常具有挑战性的，并且大多数DNA合成公司通常仅提供最多120个核苷酸。相比之下，平均蛋白质编码基因为约2000个-3000个连续核苷酸，染色体长度为至少一百万个连续核苷酸并且平均真核基因组数量在数十亿个核苷酸的数量级。为了制备长度为数千个碱基对的核酸链，如今所有主要的基因合成公司都依赖于“合成和拼接”技术的变化形式，其中重叠的40mer-60mer片段通过酶促复制和延伸被合成和拼接在一起。目前的方法通常允许长达3kb的长度用于常规生产。

不能一次化学合成超过120个-200个核苷酸的DNA原因是由于目前产生DNA的方法，该方法使用合成化学(即亚磷酰胺技术)一次偶联一个核苷酸来制造DNA。即使每个核苷酸偶联步骤的效率是99％有效，在数学上也不可能以可接受的收率合成长于200个核苷酸的DNA。文特尔研究所通过花费4年和2000万USD以合成细菌的相对小的基因组说明了这个艰苦的过程。

已知的DNA测序方法使用模板依赖性DNA聚合酶来向生长的双链底物中添加3’-可逆封端的核苷酸。在“合成测序”方法中，每一个添加的核苷酸都含有染料，允许用户识别模板链的精确序列。尽管在双链DNA上，这项技术能够产生在500bp-1000bp之间长的链。然而，这项技术不适合于从头合成核酸，因为需要现有的核酸链充当模板。

已经进行了使用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)进行从头单链DNA合成的各种尝试。与受控的从头单链DNA合成相比，不受控的从头单链DNA合成利用TdT在单链DNA上的脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)3’加尾特性，以例如为下一代测序文库制备创建均聚衔接子序列。在受控延伸中，需要使用可逆的脱氧核苷酸三磷酸封端技术来防止dNTP不受控地添加到生长的DNA链的3’末端。开发通过TdT的受控的单链DNA合成方法对于用于基因组装或杂交微阵列的原位DNA合成将是非常宝贵的，因为它消除了对无水环境的需求，并且允许使用与有机溶剂不相容的各种聚合物。然而，还没有显示TdT能有效地添加含有3’-O-可逆封端部分的核苷三磷酸用于构建从头合成循环所需的新生单链DNA链，并且因此长链的合成是低效的。

因此，需要一种有效制备长链寡核苷酸的新方法，以便提供一种能够克服与目前可用的方法相关的问题的改进的核酸合成方法。目前主题的发明人已经开发了这样的一种方法，该方法在专利申请WO2016128731中公开。随着这种有效制备长链寡核苷酸的新方法的出现，需要有方法和组合物来评估由非模板依赖性合成产生的产物/链的质量。

发明概述

固相核酸合成(酶促合成和基于亚磷酰胺的合成两者)的主要误差来源来自于未能向期望序列中添加核苷酸。这样的失败导致缺失，缺失导致生物序列的移码突变。不管用于合成所述核酸的方法如何，评估核苷酸偶联效率以及由此合成特定核酸的质量的能力是至关重要的。

当使用亚磷酰胺化学合成核酸时，偶联效率是用于评估合成质量的主要指标之一。亚磷酰胺核酸合成的偶联效率通过脱保护的5’-二甲氧基三苯甲基(DMT)基团的颜色原位测量。5’-DMT基团在亚磷酰胺合成中充当可逆终止子，控制每个合成循环中一个且仅一个亚酰胺化物(amidite)的添加。当脱保护时，从5’-DMT基团释放的DMT阳离子的橙色被洗脱；这样的颜色可以经由分光光度计定量，以确定每个亚磷酰胺合成循环的偶联效率。

然而，与亚磷酰胺化学不同，非模板化酶促核酸合成不会导致任何易于经由分光光度手段检测的基团的产生。除了掺入核苷酸之外，酶促核酸合成导致无机焦磷酸和质子的产生。虽然无机焦磷酸本身不易于经由分光光度手段检测，但是可通过多种手段诸如酶偶联反应检测。由于TdT进行链歧化反应的能力，快速去除无机焦磷酸的偏好使得检测作为定量偶联效率的手段的无机焦磷酸变得复杂。此外，这样的反应经常重新合成核苷三磷酸分子，这在以核苷酸三磷酸为TdT底物的反应中是有问题的。

本文描述了用于寡核苷酸合成的质量控制的方法和组合物。对于提供核苷酸单体的每个循环，可以检测用于延伸链的核苷酸单体的量。随着合成的进行，合成的质量是逐碱基确定的，而不是简单地在合成结束时测量全长链的纯度。

监测在一个或更多个核苷酸单体反应循环中进行。可以在每个循环中进行监测。术语每个循环是指在已经添加核苷酸之后直接进行监测。质量测量在延伸循环期间或在延伸循环之后在组装完整链之前进行。该术语是指在核苷酸延伸之后监测，而不仅仅是在合成结束时监测，并且不要求监测每一个循环。因此，如果进行100个延伸循环，则每隔一个循环的监测也在本发明的范围内。类似地，如果进行50个循环，则可以仅监测49个。权利要求仅仅要求合成的质量随着合成的进行而确定，而不仅仅是在结束时确定，也不要求每一个循环都必须被监测。监测每个和每一个循环都在所要求保护的发明的范围内，但不是必须的。

描述了一种用于通过非模板依赖性合成来检测一个或更多个核苷酸掺入生长链的技术。所描述的方法依赖于检测作为非模板依赖性DNA合成的结果的热量、pH、磷酸浓度和/或焦磷酸浓度的变化。

上式代表核苷酸dNTP的掺入，它可以是掺入生长的DNA链中的任何修饰的或未修饰的核苷酸，包括G：鸟嘌呤，A：腺嘌呤；T：胸腺嘧啶，或C：胞嘧啶。核苷酸不必限于dNTP(即2’-脱氧NTP)。它们包括可以被酶掺入的任何多磷酸物质，包括核糖核苷5’-三磷酸。核苷酸可以被可逆封闭，使得每条链仅掺入一个单体。封闭物可以在单体上的任何位置，包括任选地在3’位置。核苷酸也可以在含氮碱基处被分子实体诸如小分子、肽、寡糖、聚合物或蛋白质可逆封闭。核苷酸也可以被胺掩蔽，以掩蔽含氮碱基上的氨基基团并阻止氢键键合。氨基基团随后可以被去掩蔽，以露出游离氨基(NH₂)基团。核苷酸通常是未标记的，以便合成未修饰的链，但是核苷酸可以任选地被标记。为了控制期望的序列，通常每个循环添加单一核苷酸种类，但是如果期望的链序列是简并的，可以添加多于一个核苷酸。

DNA聚合酶可以是末端脱氧核苷酸转移酶。该酶可以被修饰以增加3’-封闭的核苷酸的掺入。

通过监测热量、pH、焦磷酸水平或磷酸水平的变化来监测上述反应中核苷酸的掺入，以提供质量控制信息。

上述反应中的T为约22kT或每核苷酸掺入～570meV，并且可以根据本发明以及ΔpH来测量。

附图简述

图1：磷酸检测的一种实施方案。通过诸如酶结合、酶偶联反应和/或无机分子结合的方法，对从非模板化酶促核酸合成产生的磷酸进行定量。上述方法产生可检测的信号来定量核苷酸掺入的水平。

图2：将焦磷酸酶和标记至荧光团的磷酸结合蛋白偶联以监测和定量通过工程化TdT的可逆终止的核苷酸掺入。

图3：焦磷酸检测作为一种监测和定量通过工程化TdT的可逆终止的核苷酸掺入的方法。

发明详述

热量：

本文公开了一种用于通过监测温度变化，监测一个或更多个核苷酸通过非模板依赖性合成向生长链的掺入的方法。核苷酸掺入导致由释放的焦磷酸产生的溶液的温度升高。例如通过添加焦磷酸酶完成的焦磷酸分裂成两个无机磷酸分子，将产生进一步的温度变化。因此，在本发明的一种实施方案中，通过合适的灵敏仪器监测温度的变化，以检测是否已经发生了成功的核苷酸掺入。

pH：

本文公开了一种用于通过监测pH变化，监测一个或更多个核苷酸通过非模板依赖性合成向生长链的掺入的方法。核苷酸掺入导致由释放的焦磷酸和无机磷酸产生的在溶液中的负电荷增加。例如通过添加焦磷酸酶完成的焦磷酸分裂成两个无机磷酸分子，将进一步降低溶液中的电荷。因此，在本发明的一种实施方案中，通过合适的灵敏仪器诸如离子敏感的场效应晶体管(ISFET)监测pH的变化，以检测是否已经发生了成功的核苷酸掺入。

焦磷酸：

本文公开了用于通过监测焦磷酸浓度，监测一个或更多个核苷酸通过非模板依赖性合成向生长链的掺入的方法。在一种方法中，焦磷酸通过与小分子的相互作用、螯合、结合或缔合来检测。在另一种方法中，焦磷酸通过与生物分子的相互作用、螯合、结合或缔合来检测。生物分子可以由蛋白质、DNA、RNA或其组合形成。这些相互作用产生可检测的信号。

在一种实施方案中，小分子是或包括螯合的Zn(II)复合物。在另一种实施方案中，小分子是三联吡啶-Zn(II)复合物。在另外的实施方案中，三联吡啶-Zn(II)复合物是咔唑或氨基修饰的。在另外的实施方案中，含有三联吡啶-Zn(II)复合物的分子与焦磷酸相互作用并且产生可检测的信号，诸如吸光度、化学发光和/或荧光的变化。

在另一种方法中，作为成功的核苷酸掺入的结果，检测释放的焦磷酸的实时生物发光检测。在本发明的一种实施方案中，释放的焦磷酸通过ATP硫酸化酶从腺苷5’-磷酰硫酸转化为ATP，并且ATP的水平由产生成比例光信号的萤光素酶感测，该成比例光信号由光感测装置检测。

在本发明的另一种实施方案中，从固定的寡核苷酸去除反应的添加溶液，并且然后通过包括ATP硫酸化酶和萤光素酶的生物发光再生循环检测去除的添加溶液中的释放的焦磷酸。检测去除的添加溶液中的焦磷酸的优点是，生物发光再生循环的试剂(例如，通过TdT向寡核苷酸起始子中添加ATP硫酸化酶产物ATP)不可能干扰酶促核酸合成过程。

在本发明的实施方案中，使用生物发光再生循环(BRC)监测一个或更多个核苷酸通过非模板依赖性合成向生长链的掺入。在BRC中，稳态水平的生物发光从产生焦磷酸的过程产生。焦磷酸在存在ATP硫酸化酶和腺苷5’-磷酰硫酸的情况下反应产生ATP。ATP在萤光素酶催化的反应中与萤光素反应，产生光并再生焦磷酸。焦磷酸被循环以产生ATP，并且再生循环继续。因为ATP硫酸化酶的动力学性质比萤光素酶快得多，所以产生了稳定状态，其中ATP和焦磷酸的浓度以及光产生的速率保持相对恒定。在时间间隔内对光子进行计数，以确定成功的核苷酸掺入的数量。

在本发明的一种实施方案中，提供了用于监测焦磷酸浓度的变化的试剂盒。

核苷酸可以携带可逆封闭物。核苷酸可以携带3’-封闭物。3’-封闭物是3’羟基上的保护基团，其可以被去除以释放3’-OH，在这种情况下，封闭物充当可逆终止子。核苷酸可以携带附接至含氮碱基的可逆终止子。碱基封闭基团是保护基团，其可以被去除以通过非模板依赖性酶诸如TdT实现核苷酸的添加。核苷酸可以共价地或非共价地结合至非模板依赖性酶诸如TdT。术语封闭物的每次提及包括任选地3’-封闭物。

公开了一种酶促核酸合成的方法，该方法包括：

a)提供固定的核酸起始序列；

b)通过将固定的核酸起始序列暴露于包含以下的反应溶液，将封闭的核苷三磷酸添加到所述起始序列中：

·封闭的核苷三磷酸；

·核酸转移酶或非模板依赖性聚合酶，诸如工程化末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)；

·所需的缓冲液组分；和

·焦磷酸感测试剂，诸如三联吡啶-Zn(II)复合物或同时存在以下所有物质：腺苷5’-磷酰硫酸、ATP硫酸化酶、萤光素和萤光素酶；

c)定量在步骤(b)期间产生的焦磷酸的量；

d)从起始序列去除所有试剂；

e)在存在裂解剂的情况下，从封闭的核苷裂解封闭基团；和

f)通过用洗涤溶液洗涤固定的起始核酸来去除裂解剂。

步骤(b)-(f)可以被重复，以向上述DNA起始序列中添加多于一个核苷酸。

酶促核酸合成的另外的方法可以包括：

a)提供固定的核酸起始序列；

·封闭的核苷三磷酸；

·所需的缓冲液组分；

c)从固定的核酸起始子中去除(b)的反应溶液；

d)将用于定量在(b)期间产生的焦磷酸的试剂引入到(c)的去除的溶液中，用于定量焦磷酸的试剂可以包括三联吡啶-Zn(II)复合物、腺苷5’-磷酰硫酸、ATP硫酸化酶、萤光素、萤光素酶或其组合；

e)定量(c)的去除的反应溶液中的焦磷酸；

f)用洗涤溶液洗涤固定的起始核酸；

g)在存在裂解剂的情况下，从封闭的核苷裂解封闭基团；和

h)通过用洗涤溶液洗涤固定的起始核酸来去除裂解剂。

步骤(b)-(h)可以被重复，以向上述核酸起始序列中添加多于一个核苷酸。

上文直接提到的酶促核酸合成的另外的方法具有将封闭的核苷三磷酸的掺入与产生的焦磷酸分子的检测分离的优点。这种分离是有利的，因为焦磷酸检测试剂可能干扰封闭的核苷三磷酸的掺入。例如，当使用腺苷5’-磷酰硫酸、ATP硫酸化酶、萤光素、萤光素酶或其组合通过生物发光检测焦磷酸时，产生ATP。在酶促核酸合成的方法中，ATP可以通过TdT掺入到核酸起始子的3’末端。因此，这种掺入代表一种突变，这对核酸合成的准确性是有害的。

磷酸：

本文公开了用于通过监测磷酸浓度随时间的变化，监测一个或更多个核苷酸通过非模板依赖性合成向生长链的掺入的方法。该方法包括使用无机焦磷酸酶来催化焦磷酸转化为两个磷酸根离子，一个焦磷酸分子在成功添加一个核苷酸期间被释放出。可以检测到磷酸根离子的存在，并且从而检测到原始焦磷酸分子的存在，并获得关于核苷酸添加的成功或失败的信息。

在此处，我们提出了定量酶促核酸合成的一种或更多种方法的偶联效率的方法。我们没有定量无机焦磷酸，而是将无机焦磷酸酶的反应与磷酸感测测定偶联，无机焦磷酸酶将一个无机焦磷酸分子转化为两个无机磷酸分子。通过这种方法，我们快速地去除可能对酶促核酸合成有害的无机焦磷酸，并检测产生的磷酸的量，作为确定偶联效率的手段。

在本发明的一种实施方案中，使用磷酸结合蛋白(PBP)检测磷酸根离子的存在。

在本发明的一种实施方案中，磷酸结合蛋白是天然的，在本发明的另一种实施方案中，磷酸结合蛋白序列是被修饰的。在本发明的一种实施方案中，磷酸结合蛋白是大肠杆菌(E.coli)磷酸结合蛋白。

在本发明的一种实施方案中，磷酸结合蛋白与荧光标签缀合。

在本发明的一种实施方案中，提供了用于监测磷酸浓度的变化的试剂盒。

在一种实施方案中，核酸合成的方法包括在非模板化酶促DNA合成中使用TdT和3’-O-可逆终止的2’-脱氧核苷5’-三磷酸(dNTP)。当TdT在寡核苷酸的3’末端掺入dNTP时，产生无机焦磷酸和质子。当与无机焦磷酸酶(PPiase)偶联时，无机焦磷酸转化为无机磷酸。因此，对于由TdT掺入的每1个dNTP分子，产生2个无机磷酸分子。通过磷酸感测测定，可以确定由

定义的偶联效率。在偶联效率等式

中，N被先验地认为是由5’-固定的寡核苷酸提供的游离3’-OH末端的数量，并且N+1通过磷酸感测测定来定量。

在一种实施方案中，上文的磷酸感测测定利用共价地偶联至荧光染料的磷酸结合蛋白(PBP)，诸如含有突变A197C的大肠杆菌PBP，所述荧光染料诸如N-[2-(1-马来酰亚胺基)乙基]-7-(二乙氨基)香豆素-3-甲酰胺(MDCC)或四甲基罗丹明(rho)。在大肠杆菌PBP中，MDCC或rho与PBP共价偶联。例如，MDCC通过硫酯键在A197C与PBP共价偶联。当大肠杆菌PBP-MDCC或PBP-rho与无机磷酸的分子结合时，导致荧光信号分别增加7倍或18倍。

在另一种实施方案中，磷酸感测测定是基于无机磷酸与麦芽糖在存在酶的情况下产生葡萄糖的反应。然后葡萄糖被特异性氧化以产生产物，该产物与探针反应以产生荧光。在一种实施方案中，酶是麦芽糖磷酸化酶，其在存在无机磷酸的情况下将麦芽糖转化为葡萄糖-1-磷酸和葡萄糖。然后，葡萄糖氧化酶将葡萄糖转化为葡萄糖酸内酯和H₂O₂。最后，用辣根过氧化物酶(HRP)作为催化剂，H₂O₂与Amplex Red试剂反应以产生试卤灵(resorufin)。所得的荧光或吸收的增加与样品中无机磷酸的量成比例。

在另一种实施方案中，磷酸感测测定由无机磷酸与钼酸铵的复合物形成组成，其可作为颜色变化检测。

在另一种实施方案中，磷酸感测测定基于孔雀石绿、钼酸铵和游离磷酸之间形成的绿色复合物的定量。

在另一种实施方案中，磷酸感测测定由磷酸化酶和在磷酸化后变得可检测的底物组成。实例包括在存在7-甲基鸟苷或2-氨基-6-巯基-7-甲基嘌呤的情况下使用磷酸化酶。

酶促核酸合成的方法可以包括：

a)提供固定的核酸起始序列；

·封闭的核苷三磷酸；

·所需的缓冲液组分；

·焦磷酸酶；和

·磷酸感测试剂；

c)定量在步骤(b)期间产生的磷酸的量；

d)从起始序列去除所有试剂；

e)在存在裂解剂的情况下，从封闭的核苷裂解封闭基团；和

f)通过用洗涤溶液洗涤固定的起始核酸来去除裂解剂。

步骤(b)-(f)可以被重复，以向上述核酸起始序列中添加多于一个核苷酸。

酶促核酸合成的另外的方法可以包括：

a)提供固定的核酸起始序列；

·封闭的核苷三磷酸；

·所需的缓冲液组分；

c)从固定的核酸起始子去除(b)的反应溶液；

d)将用于水解焦磷酸和定量在(b)期间产生的释放的磷酸的试剂引入(c)的去除的反应溶液中；

e)定量(c)的去除的溶液中的释放的磷酸；

f)用洗涤溶液洗涤固定的起始核酸；

g)在存在裂解剂的情况下，从封闭的核苷裂解封闭基团；和

h)通过用洗涤溶液洗涤固定的起始核酸来去除裂解剂。

上文直接提到的酶促核酸合成的另外的方法具有将封闭的核苷三磷酸的掺入与产生的磷酸分子的检测分离的优点。如果磷酸检测试剂干扰封闭的核苷三磷酸的掺入，这种分离可以是有利的。

本文中提及的“起始序列”是指具有核苷酸单体可以附接的游离3’-末端的短寡核苷酸。在一种实施方案中，起始序列是DNA起始序列。在可选择的实施方案中，起始序列是RNA起始序列。

使用酶促手段来合成链。延伸循环可以使用核酸转移酶或非模板依赖性聚合酶诸如工程化末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)进行，其中核苷酸单体是核苷三磷酸。

合成的链的长度可以是例如至少25个碱基(n＝25)。

可逆封闭的核苷三磷酸可以是3’-可逆封闭的核苷三磷酸。3’-可逆封闭物可以选自3’-O-CH₂N₃、3’-O-CH₂CHCH₂、3’-O-CH₂CH₂CN或3’-O-NH₂。

本文中提及的“DNA起始序列”包括可以附接封闭的核苷酸三磷酸的小DNA序列，即从DNA起始序列的末端合成DNA。在一种实施方案中，起始序列是单链的。在可选择的实施方案中，起始序列是双链的。本领域技术人员将理解，3’-突出端(即，游离3’-末端)允许有效添加。

在一种实施方案中，起始序列被固定在固体支持物上。起始序列可以被附接到在水性条件下稳定的固体支持物，使得该方法可以经由流动装置容易地进行。

在一种实施方案中，起始序列经由可逆的相互作用部分被固定在固体支持物上，该可逆的相互作用部分例如化学可裂解的接头、抗体/免疫原性表位、生物素/生物素结合蛋白(诸如亲和素或链霉亲和素)或谷胱甘肽-GST标签。因此，在另外的实施方案中，该方法另外包括通过去除起始序列中的可逆的相互作用部分，诸如通过与蛋白酶K一起孵育，来提取所得的核酸。

在一种实施方案中，起始序列包含酶可识别的碱基或碱基序列。由酶诸如糖基化酶识别的碱基，可以被去除以产生可以通过化学手段或酶促手段裂解的无碱基位点。碱基序列可以被限制性酶识别和裂解。

因此，在一种实施方案中，所得的连续寡核苷酸序列从固定状态释放。在一种实施方案中，这种释放通过从一个或更多个固定的寡核苷酸中去除非规范碱基并在所得的无碱基位点处裂解链来进行。在一种实施方案中，非规范碱基是尿嘧啶，其通过尿嘧啶DNA糖基化酶去除。在可选择的实施方案中，非规范碱基是8-氧代鸟嘌呤，其通过甲酰嘧啶DNA糖基化酶去除。

在可选择的实施方案中，起始序列经由化学可裂解的接头，诸如二硫化物、烯丙基或叠氮化物掩蔽的半缩醛胺醚接头被固定在固体支持物上。因此，在一种实施方案中，该方法另外包括通过裂解化学接头来提取所得的连续寡核苷酸序列：对于二硫化物接头，通过添加三(2-羧乙基)膦(TCEP)或二硫苏糖醇(DTT)；对于烯丙基接头，通过添加钯络合物；或对于叠氮化物掩蔽的半缩醛胺醚接头，通过添加TCEP。

在一种实施方案中，使用聚合酶进行延伸循环，并且核苷酸单体是核苷三磷酸。在一种实施方案中，使用非模板依赖性聚合酶进行延伸循环，并且核苷酸单体是核苷三磷酸。在一种实施方案中，使用非模板依赖性聚合酶进行延伸循环，并且核苷酸单体是可逆封闭的核苷三磷酸。

在一种实施方案中，使用非模板依赖性聚合酶进行延伸循环，并且核苷酸单体是3’-可逆封闭的核苷三磷酸。3’-封闭的核苷5’-三磷酸可以被任何可以被去掩蔽以露出3’-OH的化学基团封闭。3’-封闭的核苷三磷酸可以被3’-O-叠氮基甲基、3’-氨基氧基、3’-O-烯丙基基团、3’-O-氰乙基、3’-O-乙酰基、3’-O-硝酸、3’-O-磷酸、3’-O-乙酰基乙酰丙酯、3’-O-叔丁基二甲基硅烷、3’-O-三甲基(甲硅烷基)乙氧基甲基、3’-O-邻硝基苄基和3’-O-对硝基苄基封闭。

3’-封闭的核苷5’-三磷酸也可以被任何可以直接用于化学连接的化学基团封闭，所述化学连接诸如铜催化的或不含铜的叠氮化物-炔烃点击反应和四嗪-烯烃点击反应。3’-封闭的核苷三磷酸可以包括含有叠氮化物、炔烃、烯烃和四嗪的化学部分。

在特定实施方案中，3’-可逆封闭物选自3’-O-CH₂N₃、3’-O-CH₂CHCH₂、3’-O-CH₂CH₂CN或3’-O-NH₂。

在一种实施方案中，非模板依赖性聚合酶是末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)。在一种实施方案中，非模板依赖性聚合酶是修饰的TdT。在一种实施方案中，在存在包含一种或更多种缓冲液(例如，Tris或二甲胂酸盐)、一种或更多种盐(例如，Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Zn² ⁺、Co²⁺等，全部都带有适当的抗衡离子，诸如Cl)和无机焦磷酸酶(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)同源物)的延伸溶液的情况下添加TdT。将理解，缓冲液和盐的选择取决于最佳的酶活性和稳定性。无机焦磷酸酶的使用有助于减少由于TdT水解核苷三磷酸引起的焦磷酸的积累。因此，无机焦磷酸酶的使用具有降低(1)逆向反应和(2)TdT链歧化的速率的优点。

本文中提及的“核苷三磷酸”是指含有结合到三个磷酸基团的核苷(即附接到脱氧核糖或核糖糖分子的碱基)的分子。含有脱氧核糖的核苷三磷酸的实例为：三磷酸脱氧腺苷(dATP)、三磷酸脱氧鸟苷(dGTP)、三磷酸脱氧胞苷(dCTP)或三磷酸脱氧胸苷(dTTP)。含有核糖的核苷三磷酸的实例为：三磷酸腺苷(ATP)、三磷酸鸟苷(GTP)、三磷酸胞苷(CTP)或三磷酸尿苷(UTP)。其他类型的核苷，诸如天然存在的修饰的核苷和人工核苷可以与三个磷酸结合以形成核苷三磷酸。这样的核苷可以包括核苷的任何功能等同物，包括胺掩蔽的核苷5’-三磷酸，诸如6-叠氮基-腺苷、4-叠氮基-胞啶或2-叠氮基-鸟苷。

因此，本文中提及的“3’-封闭的核苷三磷酸”是指在3’末端具有阻止进一步添加核苷酸的另外的基团，即通过用保护基团取代3’-OH基团的核苷三磷酸(例如，dATP、dGTP、dCTP或dTTP)。

将理解，本文中提及的“3’-封闭物”、“3’-封闭基团”或“3’-保护基团”是指阻止进一步的核苷酸添加的附接到核苷三磷酸的3’末端的基团。这种方法使用可逆的3’-封闭基团，该基团可以通过裂解被去除，以允许添加另外的核苷酸。相比之下，不可逆的3’-封闭基团是指其中3’-OH基团既不可以被暴露也不能通过裂解露出的dNTP。

3’-封闭的核苷5’-三磷酸可以被任何化学基团封闭，这些化学基团可以被去掩蔽以露出3’-OH。3’-封闭的核苷三磷酸可以被以下基团封闭：3’-O-叠氮基甲基、3’-氨基氧基、3’-O-烯丙基基团、3’-O-氰乙基、3’-O-乙酰基、3’-O-硝酸、3’-O-磷酸、3’-O-乙酰基乙酰丙酯、3’-O-叔丁基二甲基硅烷、3’-O-三甲基(甲硅烷基)乙氧基甲基、3’-O-邻硝基苄基和3’-O-对硝基苄基。

本文中提及的“裂解剂”是指能够从3’-封闭的核苷三磷酸裂解3’-封闭基团的物质，或者是指能够从固体支持物裂解固定的寡核苷酸的物质。在一种实施方案中，裂解剂是化学裂解剂。在可选择的实施方案中，裂解剂是酶裂解剂。

本领域技术人员将理解，裂解剂的选择取决于所使用的3’-核苷封闭基团的类型。例如，三(2-羧乙基)膦(TCEP)或三(羟丙基)膦(THPP)可以用于裂解3’-O-叠氮基甲基基团，钯络合物可以用于裂解3’-O-烯丙基基团，或者亚硝酸钠可以用于裂解3’-氨基氧基基团。因此，在一种实施方案中，裂解剂选自：三(2-羧乙基)膦(TCEP)、钯络合物或亚硝酸钠。

在一种实施方案中，裂解剂是在存在含有变性剂诸如尿素、盐酸胍、甲酰胺或甜菜碱的裂解溶液的情况下添加的。变性剂的添加具有能够破坏DNA中任何不期望的二级结构的优点。在另外的实施方案中，裂解溶液包含一种或更多种缓冲液。本领域技术人员将理解，缓冲液的选择取决于所需的精确裂解化学和裂解剂。

发明人先前已经开发了工程化末端转移酶的选择，其中任何一种都可以用于当前的方法中。

末端转移酶在自然界中普遍存在，并且存在于许多物种中。许多已知的TdT序列已经在NCBI数据库http://www.ncbi.nlm.nih.gov/中被报道。各种所描述的末端转移酶的序列示出了具有高度保守序列的一些区域，以及在不同物种之间高度不同的一些区域。

发明人已经修饰了来自斑点雀鳝(Lepisosteus oculatus)TdT(斑点雀鳝(spotted gar))的末端转移酶(如下所示)。然而，对应的修饰可以引入到来自任何其他物种的类似的末端转移酶序列中，包括上文在各种NCBI条目中列出的序列。

斑点雀鳝(spotted gar,Lepisosteus oculatus)的氨基酸序列在下文示出。

SEQ ID NO 1：野生型斑点雀鳝TdT

发明人已经鉴定了氨基酸序列中具有改进的性质的多于一个区域。某些区域改进酶的溶解度和处理能力。某些其他区域改进在3’位置掺入具有修饰的核苷酸的能力。

本文描述了当与野生型序列SEQ ID NO 1或其截短版本或其他物种中的末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的同源氨基酸序列或任何物种的Polμ、Polβ、Polλ和Polθ的同源氨基酸序列或任何物种的X家族聚合酶的同源氨基酸序列相比时，包含氨基酸修饰的修饰的末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)，其中氨基酸在以下氨基酸中的一个或更多个处被修饰：

V32、A33、I34、F35、A53、V68、V71、E97、I101、M108、G109、A110、Q115、V116、S125、T137、Q143、M152、E153、N154、H155、N156、Q157、I158、I165、N169、N173、S175、E176、G177、P178、C179、L180、A181、F182、M183、R184、A185、L188、H194、A195、I196、S197、S198、S199、K200、E203、G204、D210、Q211、T212、K213、A214、I216、E217、D218、L220、Y222、V228、D230、Q238、T239、L242、L251、K260、G261、F262、H263、S264、L265、E267、Q269、A270、D271、N272、A273、H275、F276、T277、K278、M279、Q280、K281、S291、A292、A293、V294、C295、K296、E298、A299、Q300、A301、Q304、I305、T309、V310、R311、L312、I313、A314、I318、V319、T320、G328、K329、E330、C331、L338、T341、P342、E343、M344、G345、K346、W349、L350、L351、N352、R353、L354、I355、N356、R357、L358、Q359、N360、Q361、G362、I363、L364、L365、Y366、Y367、D368、I369、V370、K376、T377、C381、K383、D388、H389、F390、Q391、K392、F394、I397、K398、K400、K401、E402、L403、A404、A405、G406、R407、D411、A421、P422、P423、V424、D425、N426、F427、A430、R438、F447、A448、R449、H450、E451、R452、K453、M454、L455、L456、D457、N458、H459、A460、L461、Y462、D463、K464、T465、K466、K467、T474、D477、D485、Y486、I487、D488、P489。

改进修饰的核苷酸的掺入的修饰可以在下文所示的一个或更多个选定区域中。根据从斑点雀鳝TdT获得的突变数据、序列比对和结构数据选择区域，所述斑点雀鳝TdT与DNA和3’-修饰的dNTP共结晶。第二修饰可以选自在下文的序列中突出显示的以下氨基酸区域中的一个或更多个：VAIF、MGA、MENHNQI、SEGPCLAFMRA、HAISSS、DQTKA、KGFHS、QADNA、HFTKMQK、SAAVCK、EAQA、TVRLI、GKEC、TPEMGK、YYDIV、DHFQK、LAAG、APPVDNF、FARHERKMLLDNHALYDKTKK和DYIDP。

提及的特定序列包括其截短物。本文包括修饰的末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)，当与野生型序列SEQ ID NO 1或其截短版本或其他物种中的末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的同源氨基酸序列相比时，所述修饰的末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)包含至少一个氨基酸修饰，其中修饰选自SEQ ID NO 1的序列的氨基酸区域WLLNRLINRLQNQGILLYYDIV、VAIF、MGA、MENHNQI、SEGPCLAFMRA、HAISSS、DQTKA、KGFHS、QADNA、HFTKMQK、SAAVCK、EAQA、TVRLI、GKEC、TPEMGK、DHFQK、LAAG、APPVDNF、FARHERKMLLDNHALYDKTKK和DYIDP或其他物种中的同源区域中的一个或更多个。

截短的蛋白质可以至少包括下文所示的区域(SEQ ID NO 2)

本文描述了修饰的末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)，其包含至少以下序列：

或者其他物种中的同源区域，其中该序列在以下序列的一个或更多个氨基酸区域WLLNRLINRLQNQGILLYYDI、MENHNQI、SEGPCLAFMRA、HAISSS、DQTKA、KGFHS、QADNA、HFTKMQK、SAAVCK、EAQA、TVRLI、GKEC、TPEMGK、DHFQK、LAAG、APPVDNF、FARHERKMLLDNHALYDKTKK和DYIDP中具有一个或更多个氨基酸修饰：

序列同源性延伸至家族X聚合酶的所有修饰的成员或野生型成员，诸如DNA Polμ(也被称为DNA聚合酶mu或POLM)、DNA Polβ(也被称为DNA聚合酶β或POLB)和DNA Polλ(也被称为DNA聚合酶λ或POLL)。本领域熟知的是，所有的家族X成员聚合酶(其中TdT是成员)要么具有末端转移酶活性，要么可以被工程化以获得类似于末端脱氧核苷酸转移酶的末端转移酶活性(Biochim Biophys Acta.2010年5月；1804(5):1136–1150)。例如，当以下人类TdTloop1氨基酸序列

…ESTFEKLRLPSRKVDALDHF…

被工程化来取代以下人类Polμ氨基酸残基

…HSCCESPTRLAQQSHMDAF…时，

含有人类TdT loop1的嵌合人类Polμ获得了稳健的末端转移酶活性(Nucleic Acids Res.2006年9月；34(16):4572–4582)。

此外，在美国专利申请第2019/0078065号中普遍展示，当被工程化成含有TdTloop1嵌合体时，家族X聚合酶可以获得稳健的末端转移酶活性。此外，还证明了TdT可以通过loop1基序中的特异性突变转化为模板依赖性聚合酶(Nucleic Acids Research,2009年6月,37(14):4642-4656)。如本领域所示，家族X聚合酶可以被简单地修饰以展示模板依赖性或非模板依赖性核苷酸转移酶活性。因此，在该专利中展示的所有基序、区域和突变可以简单地扩展到修饰的X家族聚合酶，以使修饰的X家族聚合酶能够掺入3’-修饰的核苷酸、可逆终止的核苷酸和修饰的核苷酸，总体上实现核酸合成的方法。

改进溶解度的修饰包括在下文的序列中突出显示的氨基酸区域WLLNRLINRLQNQGILLYYDIV内的修饰。

改进修饰的核苷酸的掺入的修饰可以在下文所示的一个或更多个选定区域中。第二修饰可以选自在下文的序列中突出显示的以下氨基酸区域中的一个或更多个：VAIF、EDN、MGA、ENHNQ、FMRA、HAI、TKA、FHS、QADNA、MQK、SAAVCK、EAQA、TVR、KEC、TPEMGK、DHFQ、LAAG、APPVDN、FARHERKMLLDNHA和YIDP。

本文描述了修饰的末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)，当与野生型序列或其他物种中的末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的同源氨基酸序列相比时，所述修饰的末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)包含至少一个氨基酸修饰，其中该修饰选自野生型序列的序列的氨基酸区域WLLNRLINRLQNQGILLYYDI、VAIF、EDN、MGA、ENHNQ、FMRA、HAI、TKA、FHS、QADNA、MQK、SAAVCK、EAQA、TVR、KEC、TPEMGK、DHFQ、LAAG、APPVDN、FARHERKMLLDNHA和YIDP或其他物种中的同源区域中的一个或更多个。

同源是指具有共同进化起源的两种或更多种蛋白质之间的蛋白质序列，蛋白质包括来自同一生物物种中的超家族的蛋白质以及来自不同物种的同源蛋白质。这样的蛋白质(及其编码核酸)具有序列同源性，如它们的序列相似性所反映的，无论是在同一性百分比方面，还是在存在特定残基或基序和保守位置方面。多种蛋白质(及其编码核酸)序列比对工具可以用于确定序列同源性。例如，欧洲分子生物学实验室(EMBL)提供的Clustal Omega多重序列比对程序可以用于确定序列同源性或同源区域。

本文描述的改进的序列可以包含两种修饰，即

a.第一修饰在野生型序列的序列的氨基酸区域WLLNRLINRLQNQGILLYYDI或其他物种中的同源区域内；并且

b.第二修饰选自野生型序列的序列的氨基酸区域VAIF、EDN、MGA、ENHNQ、FMRA、HAI、TKA、FHS、QADNA、MQK、SAAVCK、EAQA、TVR、KEC、TPEMGK、DHFQ、LAAG、APPVDN、FARHERKMLLDNHA和YIDP或其他物种中的同源区域中的一个或更多个。

区域WLLNRLINRLQNQGILLYYDIV或来自其他物种的对应区域内的修饰有助于改进酶的溶解度。氨基酸区域WLLNRLINRLQNQGILLYYDIV内的修饰可以是在一个或更多个加下划线的氨基酸处。

特定的变化可以选自W-Q、N-P、R-K、L-V、R-L、L-W、Q-E、N-K、Q-K或I-L。

序列WLLNRLINRLQNQGILLYYDIV可以被改变为QLLPKVINLWEKKGLLLYYDLV。

与野生型序列相比，第二修饰改进在3’位置具有修饰的核苷酸的掺入。第二修饰可以选自野生型序列的序列的氨基酸区域VAIF、EDN、MGA、ENHNQ、FMRA、HAI、TKA、FHS、QADNA、MQK、SAAVCK、EAQA、TVR、KEC、TPEMGK、DHFQ、LAAG、APPVDN、FARHERKMLLDNHA和YIDP或其他物种中的同源区域中的一个或更多个。第二修饰可以选自在下文的序列中突出显示的野生型序列的序列的氨基酸区域VAIF、EDN、MGA、ENHNQ、FMRA、HAI、TKA、FHS、QADNA、MQK、SAAVCK、EAQA、TVR、KEC、TPEMGK、DHFQ、LAAG、APPVDN、FARHERKMLLDNHA和YIDP或其他物种中的同源区域中的两个或更多个。

标识的位置从位置V32、E74、M108、F182、T212、D271、M279、E298、A421、L456、Y486开始。本文公开的修饰包含在定义的位置处的至少一个修饰。

修饰的氨基酸可以在区域FMRA中。修饰的氨基酸可以在区域QADNA中。修饰的氨基酸可以在区域EAQA中。修饰的氨基酸可以在区域APP中。修饰的氨基酸可以在区域LDNHA中。修饰的氨基酸可以在区域YIDP中。区域FARHERKMLLDNHA有利于消除修饰中的底物偏倚。FARHERKMLLDNHA区域呈现出在物种之间高度保守。

选自一个或更多个氨基酸区域FMRA、QADNA、EAQA、APP、FARHERKMLLDNHA和YIDP的修饰可以在加下划线的氨基酸处。

用于修饰的位置可以包括A53、V68、V71、D75、E97、I101、G109、Q115、V116、S125、T137、Q143、N154、H155、Q157、I158、I165、G177、L180、A181、M183、A195、K200、T212、K213、A214、E217、T239、F262、S264、Q269、N272、A273、K281、S291、K296、Q300、T309、R311、E330、T341、E343、G345、N352、N360、Q361、I363、Y367、H389、L403、G406、D411、A421、P422、V424、N426、R438、F447、R452、L455和/或D488。

氨基酸变化包括以下任何一种：A53G、V68I、V71I、D75N、D75Q、E97A、I101V、G109E、G109R、Q115E、V116I、V116S、S125R、T137A、Q143P、N154H、H155C、Q157K、Q157R、I158M、I165V、G177D、L180V、A181E、M183R、A195P、K200R、T212S、K213S、A214R、E217Q、T239S、F262L、S264T、Q269K、N272K、A273S、A273T、K281R、S291N、K296R、Q300D、T309A、R311W、E330N、T341S、E343Q、G345R、N352Q、N360K、Q361K、I363L、Y367C、H389A、L403R、G406R、D411N、A421L、A421M、A421V、P422A、P422C、V424Y、N426R、R438K、F447W、R452K、L455I和/或D488P。

氨基酸变化包括以下任何两种或更多种：A53G、V68I、V71I、D75N、D75Q、E97A、I101V、G109E、G109R、Q115E、V116I、V116S、S125R、T137A、Q143P、N154H、H155C、Q157K、Q157R、I158M、I165V、G177D、L180V、A181E、M183R、A195P、K200R、T212S、K213S、A214R、E217Q、T239S、F262L、S264T、Q269K、N272K、A273S、A273T、K281R、S291N、K296R、Q300D、T309A、R311W、E330N、T341S、E343Q、G345R、N352Q、N360K、Q361K、I363L、Y367C、H389A、L403R、G406R、D411N、A421L、A421M、A421V、P422A、P422C、V424Y、N426R、R438K、F447W、R452K、L455I和/或D488P。

将QADNA修饰成KADKA、QADKA、KADNA、QADNS、KADNT或QADNT有利于将3’-O-修饰的核苷三磷酸掺入核酸的3’-末端，并消除在掺入修饰的核苷三磷酸期间的底物偏倚。将APPVDN修饰成MCPVDN、MPPVDN、ACPVDR、VPPVDN、LPPVDR、ACPYDN、LCPVDN或MAPVDN有利于将3’-O-修饰的核苷三磷酸掺入核酸的3’-末端，并消除在掺入修饰的核苷三磷酸期间的底物偏倚。将FARHERKMLLDRHA修饰成WARHERKMILDNHA、FARHERKMILDNHA、WARHERKMLLDNHA、FARHERKMLLDRHA或FARHEKKMLLDNHA也有利于将3’-O-修饰的核苷三磷酸掺入核酸的3’-末端，并消除在掺入修饰的核苷三磷酸期间的底物偏倚。

修饰可以选自以下序列中的一个或更多个：FRRA、QADKA、EADA、MPP、FARHERKMLLDRHA和YIPP。包括修饰的末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)，其中第二修饰选自以下序列中的两种或更多种：FRRA、QADKA、EADA、MPP、FARHERKMLLDRHA和YIPP。包括修饰的末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)，其中第二修饰含有以下序列中的每一种：FRRA、QADKA、EADA、MPP、FARHERKMLLDRHA和YIPP。

公开了一种用于监测非模板依赖性核酸合成的质量的组合物，所述监测非模板依赖性核酸合成的质量包括测量每个反应循环中掺入的核苷酸单体的量，所述组合物包含无机焦磷酸酶、末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)、3’-O-可逆封闭的dNTP和荧光标记的磷酸结合蛋白。

公开了一种用于监测非模板依赖性核酸合成的质量的组合物，所述监测非模板依赖性核酸合成的质量包括测量每个反应循环中掺入的核苷酸单体的量，所述组合物包含末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)、3’-O-可逆封闭的dNTP和三联吡啶-Zn(II)复合物。

实施例

实施例1：将焦磷酸酶和标记至荧光团的磷酸结合蛋白偶联以监测和定量通过工程化TdT的可逆终止的核苷酸掺入。

测试作为监测非模板化酶促DNA合成的手段的PBP-MDCC(Thermo FisherScientific)。将PBP-MDCC(0.5μM)、工程化TdT(0.04mg/ml)、焦磷酸酶(0.01mg/ml)、dATP-ONH₂(0.25mM)、荧光标记的寡核苷酸起始子(购自IDT；表1中的SEQ ID 662和663；5μM)(SeqID 3和4)和所需的缓冲液组分混合在一起，并在37℃孵育持续10分钟。

分别在430nm和460nm的激发波长和发射波长监测反应，并在反应开始之后60s测量。

表1：

GA(ddC)	662-GA-ddC	GGG CAA TCA GGT GGA/3ddC/
			GAC	663-GA-C	GGG CAA TCA GGT GGA C

除非另有说明，否则所有反应在开始之前都经过磷酸擦洗(phosphate mopped)，以去除溶液中任何预先存在的磷酸。磷酸擦洗是指用嘌呤核苷磷酸化酶(Sigma-Aldrich；来自微生物来源)孵育溶液。PNP酶以1单位/ml使用，并且7-甲基鸟苷(MEG)以200μM最终浓度使用(37℃持续10分钟)。

简言之，上图中的“尖峰擦洗(Spike Mop)”仅包含缓冲液组分和20μM磷酸，它们随后被磷酸擦洗。“GA(ddC)”1和2含有来自表1的寡核苷酸SEQ NO 662，而“GAC”1和2含有来自表1的寡核苷酸SEQ NO 663。GA(ddC)和GAC是完全组成的混合物，含有可逆终止的核苷酸添加所需的所有组分。“无擦洗”包含GA(ddC)反应组分，但在反应开始前没有进行磷酸擦洗。“尖峰”仅含有缓冲液组分和20μM磷酸。

如图2中可以看到的，通过比较“尖峰擦洗”和“尖峰”样品，磷酸擦洗成功消耗了20μM磷酸。如果样品没有被擦洗(“无擦洗”)，那么来自反应样品的背景荧光非常高。与“GA(ddC)”(3’-ddC；阴性对照，因为3’-双脱氧末端排除了添加)相比，60s时“GAC”反应的荧光高近2.5倍。该实验清楚地示出，使用PBP-MDCC检测可逆终止的核苷酸向寡核苷酸的3’末端的成功添加是可行的。

实施例2：焦磷酸检测作为一种监测和定量通过工程化TdT的可逆终止的核苷酸掺入的方法。

将工程化TdT(仅在指示时存在；0.04mg/ml)、焦磷酸酶(仅在指示时存在；0.01mg/ml)、dTTP-ONH₂(仅在指示时存在；0.25mM)、固定的寡核苷酸起始子(仅在指示时存在；1pmol)和所需的缓冲液组分混合在一起，并在37℃孵育指定的时间量。

首先从固定的寡核苷酸中取出样品。然后通过在室温将样品与ATP硫酸化酶和腺苷磷酰硫酸一起孵育持续30分钟来检测焦磷酸(Lonza Bioscience)。然后在室温将萤光素酶和萤光素与样品一起孵育持续10min(Lonza Bioscience)。通过在Typhoon Trio(Amersham Biosciences)上成像来检测发光。

反应条件为(1)缓冲液+焦磷酸+固定的寡核苷酸(0.1μM)；(2)缓冲液+焦磷酸+固定的寡核苷酸(0.5μM)；(3)缓冲液+焦磷酸+固定的寡核苷酸(1.0μM)；(4)缓冲液+工程化TdT+dTTP-ONH₂+固定的寡核苷酸(0min)；(5)缓冲液+工程化TdT+dTTP-ONH₂+固定的寡核苷酸(10min)；(6)缓冲液+dTTP-ONH₂+固定的寡核苷酸(10min)；和(7)缓冲液+dTTP-ONH₂+固定的寡核苷酸+焦磷酸酶(10min)。

如图3中可以看到的，通过比较反应条件4和5，可以通过ATP硫酸化酶-萤光素酶生物发光再生循环来监测随时间的核苷酸掺入。如果反应混合物中含有焦磷酸酶，则检测不到发光，证实该测定对焦磷酸是特异性的。

序列表

<110> 纽克莱生物科技有限公司

<120> 寡核苷酸合成的质量控制方法

<130> P31293WO1

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 494

<212> PRT

<213> 斑点雀鳝(Lepisosteus oculatus)

<400> 1

Met Leu His Ile Pro Ile Phe Pro Pro Ile Lys Lys Arg Gln Lys Leu

1 5 10 15

Pro Glu Ser Arg Asn Ser Cys Lys Tyr Glu Val Lys Phe Ser Glu Val

20 25 30

Ala Ile Phe Leu Val Glu Arg Lys Met Gly Ser Ser Arg Arg Lys Phe

35 40 45

Leu Thr Asn Leu Ala Arg Ser Lys Gly Phe Arg Ile Glu Asp Val Leu

50 55 60

Ser Asp Ala Val Thr His Val Val Ala Glu Asp Asn Ser Ala Asp Glu

65 70 75 80

Leu Trp Gln Trp Leu Gln Asn Ser Ser Leu Gly Asp Leu Ser Lys Ile

85 90 95

Glu Val Leu Asp Ile Ser Trp Phe Thr Glu Cys Met Gly Ala Gly Lys

100 105 110

Pro Val Gln Val Glu Ala Arg His Cys Leu Val Lys Ser Cys Pro Val

115 120 125

Ile Asp Gln Tyr Leu Glu Pro Ser Thr Val Glu Thr Val Ser Gln Tyr

130 135 140

Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Met Glu Asn His Asn Gln Ile Phe Thr

145 150 155 160

Asp Ala Phe Ala Ile Leu Ala Glu Asn Ala Glu Phe Asn Glu Ser Glu

165 170 175

Gly Pro Cys Leu Ala Phe Met Arg Ala Ala Ser Leu Leu Lys Ser Leu

180 185 190

Pro His Ala Ile Ser Ser Ser Lys Asp Leu Glu Gly Leu Pro Cys Leu

195 200 205

Gly Asp Gln Thr Lys Ala Val Ile Glu Asp Ile Leu Glu Tyr Gly Gln

210 215 220

Cys Ser Lys Val Gln Asp Val Leu Cys Asp Asp Arg Tyr Gln Thr Ile

225 230 235 240

Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly Leu Lys Thr Ala Glu Lys

245 250 255

Trp Tyr Arg Lys Gly Phe His Ser Leu Glu Glu Val Gln Ala Asp Asn

260 265 270

Ala Ile His Phe Thr Lys Met Gln Lys Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Asp

275 280 285

Asp Ile Ser Ala Ala Val Cys Lys Ala Glu Ala Gln Ala Ile Gly Gln

290 295 300

Ile Val Glu Glu Thr Val Arg Leu Ile Ala Pro Asp Ala Ile Val Thr

305 310 315 320

Leu Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly Lys Glu Cys Gly His Asp Val Asp

325 330 335

Phe Leu Ile Thr Thr Pro Glu Met Gly Lys Glu Val Trp Leu Leu Asn

340 345 350

Arg Leu Ile Asn Arg Leu Gln Asn Gln Gly Ile Leu Leu Tyr Tyr Asp

355 360 365

Ile Val Glu Ser Thr Phe Asp Lys Thr Arg Leu Pro Cys Arg Lys Phe

370 375 380

Glu Ala Met Asp His Phe Gln Lys Cys Phe Ala Ile Ile Lys Leu Lys

385 390 395 400

Lys Glu Leu Ala Ala Gly Arg Val Gln Lys Asp Trp Lys Ala Ile Arg

405 410 415

Val Asp Phe Val Ala Pro Pro Val Asp Asn Phe Ala Phe Ala Leu Leu

420 425 430

Gly Trp Thr Gly Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Phe Ala

435 440 445

Arg His Glu Arg Lys Met Leu Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys

450 455 460

Thr Lys Lys Ile Phe Leu Pro Ala Lys Thr Glu Glu Asp Ile Phe Ala

465 470 475 480

His Leu Gly Leu Asp Tyr Ile Asp Pro Trp Gln Arg Asn Ala

485 490

<210> 2

<211> 355

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 截短的TdT序列

<400> 2

Thr Val Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Met Glu Asn His

1 5 10 15

Asn Gln Ile Phe Thr Asp Ala Phe Ala Ile Leu Ala Glu Asn Ala Glu

20 25 30

Phe Asn Glu Ser Glu Gly Pro Cys Leu Ala Phe Met Arg Ala Ala Ser

35 40 45

Leu Leu Lys Ser Leu Pro His Ala Ile Ser Ser Ser Lys Asp Leu Glu

50 55 60

Gly Leu Pro Cys Leu Gly Asp Gln Thr Lys Ala Val Ile Glu Asp Ile

65 70 75 80

Leu Glu Tyr Gly Gln Cys Ser Lys Val Gln Asp Val Leu Cys Asp Asp

85 90 95

Arg Tyr Gln Thr Ile Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly Leu

100 105 110

Lys Thr Ala Glu Lys Trp Tyr Arg Lys Gly Phe His Ser Leu Glu Glu

115 120 125

Val Gln Ala Asp Asn Ala Ile His Phe Thr Lys Met Gln Lys Ala Gly

130 135 140

Phe Leu Tyr Tyr Asp Asp Ile Ser Ala Ala Val Cys Lys Ala Glu Ala

145 150 155 160

Gln Ala Ile Gly Gln Ile Val Glu Glu Thr Val Arg Leu Ile Ala Pro

165 170 175

Asp Ala Ile Val Thr Leu Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly Lys Glu Cys

180 185 190

Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Thr Pro Glu Met Gly Lys Glu

195 200 205

Val Trp Leu Leu Asn Arg Leu Ile Asn Arg Leu Gln Asn Gln Gly Ile

210 215 220

Leu Leu Tyr Tyr Asp Ile Val Glu Ser Thr Phe Asp Lys Thr Arg Leu

225 230 235 240

Pro Cys Arg Lys Phe Glu Ala Met Asp His Phe Gln Lys Cys Phe Ala

245 250 255

Ile Ile Lys Leu Lys Lys Glu Leu Ala Ala Gly Arg Val Gln Lys Asp

260 265 270

Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Phe Val Ala Pro Pro Val Asp Asn Phe

275 280 285

Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Thr Gly Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp

290 295 300

Leu Arg Arg Phe Ala Arg His Glu Arg Lys Met Leu Leu Asp Asn His

305 310 315 320

Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Lys Ile Phe Leu Pro Ala Lys Thr Glu

325 330 335

Glu Asp Ile Phe Ala His Leu Gly Leu Asp Tyr Ile Asp Pro Trp Gln

340 345 350

Arg Asn Ala

355

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SEQ ID NO: 3，在位置16的C为双脱氧C

<400> 3

gggcaatcag gtggac 16

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SEQ ID NO: 4

<400> 4

gggcaatcag gtggac 16

Claims

1.一种用于监测非模板依赖性酶促核酸合成的质量的方法，包括在一个或更多个反应循环之后测量掺入的核苷酸单体的量。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述测量检测由核苷酸掺入引起的变化，其中所述变化选自：pH变化、温度变化、磷酸浓度变化和/或焦磷酸浓度变化。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述核苷酸单体是可逆封闭的核苷三磷酸。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述核苷酸单体是可逆3’-封闭的核苷三磷酸。

5.根据权利要求4所述的方法，其中3’-可逆封闭物选自3’-O-CH₂N₃、3’-O-CH₂CHCH₂、3’-O-CH₂CH₂CN或3’-O-NH₂。

6.根据权利要求2所述的方法，其中使用离子敏感的场效应晶体管(ISFET)检测pH变化。

7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中直接原位检测释放的焦磷酸。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述焦磷酸通过与螯合的Zn(II)复合物缔合来检测。

9.根据权利要求7所述的方法，其中所述焦磷酸通过包括用ATP硫酸化酶、萤光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶或其组合进行催化的生物发光再生循环来检测。

10.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述焦磷酸被水解成磷酸，并且检测磷酸的形成。

11.根据权利要求10所述的方法，其中检测磷酸与钼酸铵的复合物形成。

12.根据权利要求11所述的方法，其中检测磷酸与孔雀石绿和钼酸铵的复合物形成。

13.根据权利要求10所述的方法，其中基于磷酸与麦芽糖在存在酶的情况下产生葡萄糖的反应来检测磷酸的存在，其中所述葡萄糖然后被特异性氧化以产生产物，所述产物与探针反应产生荧光。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述酶是麦芽糖磷酸化酶，所述麦芽糖磷酸化酶在存在磷酸的情况下将麦芽糖转化为葡萄糖-1-磷酸和葡萄糖，其中葡萄糖氧化酶将所述葡萄糖转化为葡萄糖酸内酯和H₂O₂，H₂O₂在存在辣根过氧化物酶(HRP)的情况下与AmplexRed试剂反应产生试卤灵。

15.根据权利要求10所述的方法，其中使用荧光标记的磷酸结合蛋白来检测所述磷酸。

16.根据权利要求10所述的方法，其中监测每次添加新的核苷5’-三磷酸物质时的磷酸输出，以评估核酸合成的质量。

17.一种用于监测非模板依赖性酶促核酸合成的质量的方法，包括：

a)提供固定的核酸起始序列；

b)通过将所述固定的核酸起始序列暴露于包含以下的反应溶液，将封闭的核苷三磷酸添加到所述起始序列中：

·封闭的核苷三磷酸；

·所需的缓冲液组分；

·和磷酸或焦磷酸感测试剂；

c)定量在步骤(b)期间由其产生的磷酸或焦磷酸的量；

d)从所述起始序列去除所有试剂；

e)在存在裂解剂的情况下，从封闭的核苷裂解封闭基团；和

f)通过用洗涤溶液洗涤所述固定的起始核酸来去除所述裂解剂，

其中步骤(b)-(f)能够被重复，以向上述核酸起始序列中添加多于一个核苷酸。

18.一种用于监测非模板依赖性酶促核酸合成的质量的方法，包括：

a)提供固定的核酸起始序列；

·封闭的核苷三磷酸；

·所需的缓冲液组分；

c)从所述固定的核酸起始子中去除(b)中的所述反应溶液；

d)将用于定量在(b)期间由其产生的焦磷酸或磷酸的试剂引入到(c)的去除的反应溶液中；

e)定量(c)的去除的反应溶液中的焦磷酸或磷酸；

f)用洗涤溶液洗涤所述固定的起始核酸；

g)在存在裂解剂的情况下，从封闭的核苷裂解封闭基团；和

h)通过用洗涤溶液洗涤所述固定的起始核酸来去除所述裂解剂，

其中步骤(b)-(h)能够被重复，以向上述核酸起始序列中添加多于一个核苷酸。

19.根据权利要求17或权利要求18所述的方法，其中用于定量焦磷酸的所述试剂选自：

(a)螯合的Zn(II)复合物；或

(b)ATP硫酸化酶、萤光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶或其组合。

20.根据权利要求17或权利要求18所述的方法，其中所述反应中的试剂包括焦磷酸酶和用于定量磷酸的试剂，所述用于定量磷酸的试剂选自：

(a)钼酸铵；

(b)钼酸铵和孔雀石绿；

(c)麦芽糖磷酸化酶、葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶和Amplex Red；或

(d)荧光标记的磷酸结合蛋白。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述核苷封闭物选自3’-O-CH₂N₃、3’-O-CH₂CHCH₂、3’-O-CH₂CH₂CN或3’-O-NH₂。

22.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述监测在每个所述反应循环中进行。

23.一种用于监测非模板依赖性核酸合成的质量的组合物，所述监测非模板依赖性核酸合成的质量包括测量每个反应循环中掺入的核苷酸单体的量，所述组合物包含末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)、3’-O-可逆封闭的dNTP和用于定量由于核苷酸单体掺入而释放的焦磷酸或磷酸的试剂。

24.根据权利要求23所述的组合物，其中用于定量焦磷酸的所述试剂包括螯合的Zn(II)复合物。

25.根据权利要求23所述的组合物，其中用于定量焦磷酸的所述试剂包括ATP硫酸化酶、萤光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶或其组合。

26.根据权利要求23所述的组合物，其中所述组合物包含焦磷酸酶和用于定量磷酸的试剂，所述用于定量磷酸的试剂选自：

a.钼酸铵，带有或不带有孔雀石绿；

b.麦芽糖磷酸化酶、葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶和Amplex Red；或

c.荧光标记的磷酸结合蛋白。