CN114008210A - 基于肽的非蛋白质负荷递送 - Google Patents
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Abstract
本文描述了涉及蛋白质和/或非蛋白质负荷的转导的方法、组合物、试剂盒和合成肽穿梭剂。所述方法通常包括使靶真核细胞与非蛋白质负荷和一定浓度的合成肽穿梭剂接触,与不存在所述合成肽穿梭剂的情况相比,所述浓度的合成肽穿梭剂足以增加所述非蛋白质负荷的转导效率。在实施方案中,所述非蛋白质负荷可以是用于治疗疾病的药物,如小分子药物。在其他实施方案中,描述了对蛋白质和/或非蛋白质负荷具有转导活性的新型合成肽穿梭剂,以及碘化丙啶或其他膜不可渗透的荧光DNA嵌入剂作为替代负荷用于选择对蛋白质和非蛋白质负荷二者均具有转导活性的多功能合成肽穿梭剂的用途。
Description
本说明书涉及非蛋白质负荷(cargo)的细胞内递送。更具体地,本说明书涉及合成肽穿梭剂用于小分子和其他非蛋白质负荷的细胞内递送的用途,以及对蛋白质和小分子二者具有转导活性的改善的合成肽穿梭剂。
本说明书引用了许多文献,将其内容通过引用以其整体并入本文。
背景技术
大多数药物传统上一直是小分子有机化合物,其足够小且具有亲脂性从而穿过细胞膜以接合细胞内靶标。在常规的药物发现过程中,常规地选择小分子药物候选物不仅基于它们对其生物靶标的亲和力,而且还基于它们类似于药物的物理化学特性,这些特性尤其控制它们在细胞内递送并到达其生物靶标的能力。因此,在常规的药物开发观念下,在大规模筛选工作中鉴定为显示高靶标结合亲和力和特异性的化合物可能最终被放弃作为临床药物候选物,因为它们减弱的细胞内递送能力。此外,甚至细胞膜可渗透的化合物也可以受益于改善的细胞内/胞质溶胶递送,例如以提高摄取速度和/或降低用于获得所需生物效应而施用的浓度。因此,需要可促进小分子负荷的细胞内/胞质溶胶递送的技术,以在药物设计方面提供更大的灵活性,并且可能为使用原本基于传统小分子药物设计可能被放弃的新型治疗化合物打开大门。
发明内容
合成肽穿梭剂表示一种最近定义的肽家族,其先前被报道为快速且有效地将蛋白质负荷转导至各种靶真核细胞的胞质溶胶和/或细胞核。WO/2016/161516中描述了第一代此类肽穿梭剂,其中所述肽穿梭剂包含与细胞穿透结构域(CPD)可操作地连接的内体渗漏结构域(ELD)。WO/2018/068135随后描述了基于一组十五个设计参数合理设计的其他合成肽穿梭剂,其目的是改善蛋白质负荷的转导,同时降低第一代肽穿梭剂的毒性。本公开文本涉及如下发现,即先前报道为转导大蛋白质负荷的此类合成肽穿梭剂通常也具有快速且有效地转导较小的非蛋白质负荷(例如,小分子有机化合物)的能力。呈现于实施例2中的实验结果表明,包含WO/2016/161516和WO/2018/068135中描述的穿梭剂的代表性成员以及另外的合理设计的穿梭剂的合成肽穿梭剂能够转导膜不可渗透的荧光染料碘化丙啶(PI),其可以被视为小分子有机化合物负荷。引人注目的是,未能遵守WO/2018/068135中描述的用于蛋白质负荷递送的关键合理设计参数的阴性对照肽也未能转导PI,表明WO/2018/068135用于蛋白质负荷递送的合理设计参数通常也可以应用于递送非蛋白质负荷的肽穿梭剂的设计。在实施例3中,显示了代表性合成肽穿梭剂不仅能够将刺猬信号传导途径的结构无关的小分子抑制剂细胞内递送至培养的细胞中,而且递送的抑制剂自由地与其细胞内靶标结合并发挥其抑制活性。在实施例4中,显示了代表性合成肽穿梭剂在剃毛小鼠中局部施加后能够实现刺猬信号传导的小分子抑制剂的体内递送和活性。在实施例5中,显示了不同的代表性合成肽穿梭剂能够实现作为钠通道抑制剂(QX-314)的膜不可渗透的小分子化合物的细胞内递送,从而导致诱发的电流振幅的相关降低,如通过膜片钳所测量的。最后,实施例6和7显示了针对PI和GFP-NLS转导活性对超过300种候选肽穿梭剂进行大规模筛选的结果,并揭示了PI转导效率与GFP-NLS转导效率之间的显著相关性,表明稳健的PI转导预测具有蛋白质负荷转导活性的穿梭剂。
在一些方面,本文描述了一种用于非蛋白质负荷转导的方法,所述方法包括使靶真核细胞与非蛋白质负荷和一定浓度的合成肽穿梭剂接触,与不存在所述合成肽穿梭剂的情况相比,所述浓度的合成肽穿梭剂足以增加所述非蛋白质负荷的转导效率。
在一些方面,本文描述了一种用于将非蛋白质负荷转导至靶真核细胞中的组合物,所述组合物包含用药学上合适的赋形剂配制的合成肽穿梭剂,其中与不存在所述合成肽穿梭剂的情况相比,所述组合物中的所述合成肽穿梭剂的浓度足以在施用后增加所述非蛋白质负荷向所述靶真核细胞中的转导效率和胞质溶胶和/或细胞核递送。
在一些方面,本文描述了一种用于疗法的组合物,所述组合物包含与有待于通过合成肽穿梭剂转导至靶真核细胞中的非蛋白质负荷(例如,治疗或生物活性的非蛋白质负荷)一起配制的所述合成肽穿梭剂,其中与不存在所述合成肽穿梭剂的情况相比,所述组合物中的所述合成肽穿梭剂的浓度足以在施用后增加所述非蛋白质负荷向所述靶真核细胞中的转导效率和胞质溶胶和/或细胞核递送。
在一些方面,本文描述了对蛋白质和非蛋白质负荷二者均具有转导活性的合成肽穿梭剂,所述穿梭剂包含SEQ ID NO:1至50中任一个的氨基酸序列或由其组成。在一些方面,本文描述了对蛋白质和非蛋白质负荷二者均具有转导活性的合成肽穿梭剂,所述穿梭剂包含如下氨基酸序列或由其组成,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1至50中的任一个相差不多于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸(例如,排除任何接头结构域,如富含柔性丝氨酸/甘氨酸的接头结构域)。在一些方面,本文描述了对蛋白质和非蛋白质负荷二者均具有转导活性的合成肽穿梭剂,所述穿梭剂包含如下氨基酸序列或由其组成,所述氨基酸序列与SEQID NO:1至50中的任一个至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同(例如,在排除任何接头结构域,如富含柔性丝氨酸/甘氨酸的接头结构域的情况下计算的)。
在一些方面,本文描述了一种在靶真核细胞中对蛋白质和非蛋白质负荷二者均具有转导活性的合成肽穿梭剂,所述穿梭剂是:
(1)长度为至少17、18、19或20个氨基酸的肽,所述肽包含
(2)两亲性α-螺旋基序,其具有
(3)带正电的亲水外表面和疏水外表面,
其中遵守以下参数(4)至(15)中的至少五个:
(4)基于每圈具有3.6个残基的α-螺旋的开放圆柱形表示,所述疏水外表面包含由空间上相邻的L、I、F、V、W和/或M氨基酸组成的高疏水核心,所述氨基酸占所述肽的氨基酸的12%至50%;
(5)所述肽具有3.5至11的疏水力矩(μ);
(6)所述肽在生理pH下具有至少+4的预测净电荷;
(7)所述肽具有8至13的等电点(pI);
(8)所述肽由35%至65%的如下氨基酸的任何组合构成:A、C、G、I、L、M、F、P、W、Y和V;
(9)所述肽由0%至30%的如下氨基酸的任何组合构成:N、Q、S和T;
(10)所述肽由35%至85%的如下氨基酸的任何组合构成:A、L、K或R;
(11)所述肽由15%至45%的如下氨基酸的任何组合构成:A和L,前提是所述肽中存在至少5%的L;
(12)所述肽由20%至45%的如下氨基酸的任何组合构成:K和R;
(13)所述肽由0%至10%的如下氨基酸的任何组合构成:D和E;
(14)所述肽中A和L残基的百分比(A+L%)与所述肽中K和R残基的百分比(K+R)之间的差小于或等于10%;以及
(15)所述肽由10%至45%的如下氨基酸的任何组合构成:Q、Y、W、P、I、S、G、V、F、E、D、C、M、N、T和H,
其中在适合于评估所述靶真核细胞中的负荷转导的真核细胞系模型(例如,HeLa)中,所述穿梭剂使碘化丙啶或其他膜不可渗透的荧光DNA嵌入剂的转导效率相比于缺乏所述穿梭剂的相应阴性对照增加至少3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10倍,和/或能够实现碘化丙啶或其他膜不可渗透的荧光DNA嵌入剂的至少10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%或60%的转导效率(例如,如通过流式细胞术所测定)。
在一些方面,本文描述了一种在靶真核细胞中对蛋白质和非蛋白质负荷二者均具有转导活性的合成肽穿梭剂,其中所述穿梭剂包含以下氨基酸序列或由其组成:(a)SEQ IDNO:1至50、58至78、80至107、109至139、141至146、149至161、163至169、171、174至234、236至240、242至260、262至285、287至294、296至300、302至308、310、311、313至324、326至332、338至342、或344中任一个的氨基酸序列;或(b)与(a)仅相差保守氨基酸取代(例如,相差不多于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守氨基酸取代,优选排除任何接头结构域,如富含柔性丝氨酸/甘氨酸的接头结构域)的氨基酸序列,其中在适合于评估所述靶真核细胞中的负荷转导的真核细胞系模型(例如,HeLa)中,所述穿梭剂使碘化丙啶或其他膜不可渗透的荧光DNA嵌入剂的转导效率相比于缺乏所述穿梭剂的相应阴性对照增加至少3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10倍;和/或能够实现碘化丙啶或其他膜不可渗透的荧光DNA嵌入剂的至少10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%或60%的转导效率(例如,如通过流式细胞术所测定)。
在一些方面,本文描述了一种在靶真核细胞中具有蛋白质负荷转导活性的合成肽穿梭剂,其中所述穿梭剂包含以下氨基酸序列或由其组成:(a)SEQ ID NO:52、57、79、108、140、147、148、173、241、261、286、295、301、309、312、325、333-337或343中任一个的氨基酸序列;或(b)与(a)仅相差保守氨基酸取代(例如,相差不多于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守氨基酸取代,优选排除任何接头结构域,如富含柔性丝氨酸/甘氨酸的接头结构域)的氨基酸序列,其中在适合于评估所述靶真核细胞中的负荷转导的真核细胞系模型(例如,HeLa)中,所述穿梭剂使GFP-NLS的转导效率相比于缺乏所述穿梭剂的相应阴性对照增加至少3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10倍,和/或能够实现GFP-NLS的至少7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%或30%的转导效率(例如,如通过流式细胞术所测定)。
在一些方面,本文描述了一种在靶真核细胞中对蛋白质和/或非蛋白质负荷具有转导活性的合成肽穿梭剂变体,所述合成肽穿梭剂变体与本文所定义的任一种合成肽穿梭剂相同,不同的是至少一个氨基酸被替代为含有与被替代氨基酸具有相似生理化学特性(例如,结构、疏水或电荷)的侧链的相应合成氨基酸,其中与不存在所述穿梭剂变体的情况相比,所述穿梭剂变体增加所述负荷在靶真核细胞中的转导效率。
在一些方面,本文描述了一种用于蛋白质和/或非蛋白质负荷转导的体外或体内方法,所述方法包括使靶真核细胞与所述负荷和一定浓度的如本文所定义的合成肽穿梭剂或合成肽穿梭剂变体接触,与不存在所述合成肽穿梭剂的情况相比,所述浓度的所述合成肽穿梭剂或合成肽穿梭剂变体足以增加所述负荷向所述靶真核细胞中的转导效率。
在一些方面,本文描述了一种用于疗法的组合物,所述组合物包含与有待于通过合成肽穿梭剂转导至靶真核细胞中的蛋白质和/或非蛋白质负荷一起配制的如本文所定义的合成肽穿梭剂或合成肽穿梭剂变体,其中与不存在所述合成肽穿梭剂的情况相比,所述组合物中的所述合成肽穿梭剂或合成肽穿梭剂变体的浓度足以在施用后增加所述负荷向所述靶真核细胞中的转导效率和胞质溶胶递送。
在一些方面,本文描述了一种试剂盒,所述试剂盒包含如本文所定义的合成肽穿梭剂或合成肽穿梭剂变体,以及有待于通过所述合成肽穿梭剂或合成肽穿梭剂变体转导的蛋白质和/或非蛋白质负荷。
在一些方面,本文描述了一种用于产生预期在靶真核细胞中对目的负荷具有转导活性的候选合成肽穿梭剂的方法,所述方法包括合成如下肽,所述肽是:(1)长度为至少17、18、19或20个氨基酸的肽,所述肽包含(2)两亲性α-螺旋基序,其具有(3)带正电的亲水外表面和疏水外表面,其中遵守本文定义的参数(4)至(15)中的至少五个,其中在适合于评估所述靶真核细胞中的负荷转导的真核细胞系模型(例如,HeLa)中,所述穿梭剂使碘化丙啶或其他膜不可渗透的荧光DNA嵌入剂的转导效率相比于缺乏所述穿梭剂的相应阴性对照增加至少3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10倍,和/或能够实现碘化丙啶或其他膜不可渗透的荧光DNA嵌入剂的至少10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%或60%的转导效率(例如,如通过流式细胞术所测定)。
在一些方面,本文描述了一种用于鉴定、限定或选择预期在靶真核细胞中对蛋白质和非蛋白质负荷二者均具有转导活性的合成肽穿梭剂的体外或体内方法,所述方法包括:提供适合于评估所述靶真核细胞中的负荷转导的模型真核细胞或模型生物体;提供候选合成肽穿梭剂(例如,如本文所定义);以及测量所述候选合成肽穿梭剂将碘化丙啶或其他膜不可渗透的荧光DNA嵌入剂转导至所述模型真核细胞或模型生物体中的转导活性(例如,转导效率,如通过流式细胞术),其中当在所述模型真核细胞或模型生物体中,碘化丙啶或其他膜不可渗透的荧光DNA嵌入剂的转导效率相比于缺乏所述候选合成肽穿梭剂的相应阴性对照增加至少3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10倍,和/或发生所述碘化丙啶或其他膜不可渗透的荧光DNA嵌入剂的至少10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%或60%的转导效率(例如,如通过流式细胞术所测定)时,预期所述候选穿梭剂在所述靶真核细胞中对蛋白质和非蛋白质负荷二者均具有转导活性。
一般定义
提供标题和其他标识符(例如,(a)、(b)、(i)、(ii)等)只是为了便于阅读说明书和权利要求书。说明书或权利要求中的标题或其他标识符的使用不一定要求该步骤或要素按字母或数字顺序或它们提供的顺序进行。
在权利要求书和/或说明书中,当与术语“包含(comprising)”连用时,词语“一个/一种(a或an)”的使用可以指“一个/一种(one)”,但也与“一个/一种或多个/多种(one ormore)”、“至少一个/一种(at least one)”和“一个/一种或超过一个/一种(one or morethan one)”的意思一致。
使用术语“约”指某一数值包括为了测定所述值而采用的装置或方法的误差的标准偏差。一般来说,术语“约”意指至多10%的可能变动。因此,某一数值的1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%和10%的变动被包括在术语“约”之内。除非另外指明,否则当在某一范围之前使用术语“约”适用于该范围的两端。
如本说明书和权利要求书中所用,词语“包含(comprising)”(和包含的任何形式,诸如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)、“具有(having)”(和具有的任何形式,诸如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包括(including)”(和包括的任何形式,诸如“包括(includes)”和“包括(include)”)或“含有(containing)”(和含有的任何形式,诸如“含有(contains)”和“含有(contain)”)是包容性的或是开放性的,且不排除另外、未列举的要素或方法步骤。
如本文所用,“蛋白质”或“多肽”或“肽”意指任何肽连接的氨基酸链,其可以包含或可以不包含任何类型的修饰(例如,化学或翻译后修饰,如乙酰化、磷酸化、糖基化、硫酸化、苏素化、异戊二烯化、泛素化等)。为进一步清楚起见,设想了蛋白质/多肽/肽修饰,只要所述修饰不破坏本文所述的穿梭剂的负荷转导活性即可。例如,本文所述的穿梭剂可以是线性的或环状的,可以用一种或多种D-或L-氨基酸合成,和/或可以与脂肪酸缀合(例如,在其N末端)。本文所述的穿梭剂的至少一个氨基酸还可以被替代为含有与被替代氨基酸具有相似生理化学特性(例如,结构、疏水或电荷)的侧链的相应合成氨基酸。
如本文所用,“结构域”或“蛋白质结构域”通常是指蛋白质的具有特定功能性或功能的部分。一些结构域在与蛋白质的其余部分分离时保留了它们的功能,因此可以以模块化方式使用。许多蛋白质结构域的模块化特征可以在其在本说明书的穿梭剂内的位置方面提供灵活性。然而,当在穿梭剂的某些位置(例如,在N末端或C末端区域,或在它们之间)进行工程化时,一些结构域可能表现更好。结构域在其内源性蛋白质中的位置有时指示了所述结构域应在穿梭剂内哪个位置进行工程化以及应使用哪种类型/长度的接头。鉴于本公开文本,技术人员可以使用标准的重组DNA技术来操纵本说明书的穿梭剂内的结构域的位置和/或数量。此外,本文所公开的测定以及本领域已知的其他测定可以用于评估在穿梭剂的上下文中每个结构域的功能性(例如,其促进跨越质膜的细胞穿透、内体逃逸和/或进入胞质溶胶的能力)。标准方法也可以用于评估穿梭剂的结构域是否影响有待于细胞内递送的负荷的活性。在这一方面,如本文所用的表述“可操作地连接”是指所述结构域在本说明书的穿梭剂的上下文中执行一种或多种其预期功能(例如,细胞穿透、内体逃逸和/或亚细胞靶向)的能力。为更清楚起见,表述“可操作地连接”意在定义两个或更多个结构域之间的功能连接,而不限于它们之间的特定顺序或距离。
如本文所用,在诸如“合成肽”、“合成肽穿梭剂”或“合成多肽”的表述中使用的术语“合成”旨在指可在体外产生(例如,化学合成和/或使用重组DNA技术产生)的非天然存在的分子。各种合成制剂的纯度可以通过例如高效液相色谱分析和质谱法来评估。化学合成方法可能优于细胞表达系统(例如,酵母或细菌蛋白质表达系统),因为它们可以排除对大量重组蛋白纯化步骤(例如,临床使用所需)的需要。相比之下,经由化学合成方法产生较长的合成多肽可能更复杂和/或成本更高,并且使用细胞表达系统可以更有利地产生此类多肽。在一些实施方案中,与由重组宿主细胞表达相对照,本说明书的肽或穿梭剂可以通过化学方法合成(例如,固相或液相肽合成)。在一些实施方案中,本说明书的肽或穿梭剂可以缺乏N末端甲硫氨酸残基。本领域技术人员可以通过使用一种或多种修饰的氨基酸(例如,非天然存在的氨基酸)或通过化学修饰本说明书的合成肽或穿梭剂来改变本说明书的合成肽或穿梭剂以适应稳定性的特殊需要或其他需要。
如本文所用,术语“独立的”通常旨在指彼此不共价结合的分子或药剂。例如,表述“独立的负荷”旨在指与本说明书的穿梭剂不共价结合(例如,不融合)的有待于细胞内递送(转导)的负荷。在一些方面,独立于(未融合至)负荷的穿梭剂可能是有利的,因为它提供了增加的穿梭剂多功能性——例如,能够容易地改变穿梭剂与负荷的比率(与受限于在穿梭剂与负荷之间的共价键的情况下的固定比率形成对照)。
如本文所用,表述“是或来自”或“来自”包括给定蛋白质结构域(例如,CPD或ELD)的功能变体,如不会消除蛋白质结构域的活性的保守氨基酸取代、缺失、修饰以及变体或功能衍生物。
本说明书的其他目的、优点和特征将在阅读其具体实施方案的以下非限制性描述后变得更加明显,所述具体实施方案仅以举例方式参照附图而给出。
附图说明
在附图中:
图1A-图1D显示了与不同类别的合成肽穿梭剂连同非蛋白质负荷(碘化丙啶,PI;图1A和图1B)或蛋白质负荷(GFP-NLS蛋白;图1C和图1D)共孵育1分钟的HeLa细胞的递送和活力结果。在负荷递送后两个小时通过流式细胞术获取结果,并将其表示为荧光细胞的百分比(PI+细胞%或GFP+细胞%)。显示的肽类别(从左到右):WO/2016/161516中所述的包含与细胞穿透结构域(CPD)可操作地连接的内体渗漏结构域(ELD)的合成肽穿梭剂;WO/2018/068135中所述的合理设计的合成肽穿梭剂;本文所述的另外的合理设计的合成肽穿梭剂;本文所述的环肽;以及未能遵守WO/2018/068135中所列的若干个合理设计参数的阴性对照肽。在图1A中,“FS然后PI”指示在用合成肽穿梭剂处理后1小时添加PI,从而确保PI阳性信号不是由于细胞死亡导致的。“阴性对照”是与仅负荷一起孵育的细胞(图1A和图1B中的“PI”或图1C和图1D中的“GFP-NLS”)或未暴露于负荷或肽穿梭剂的未处理细胞(“NT”,图1A-图1D)。
图2是总结图1A-图1D中的结果的表。
图3显示了通过肽穿梭剂FSD250D转导至NIH3T3 Gli-萤光素酶报告细胞中的刺猬信号传导小分子抑制剂(Gant61、HPI-4、伊曲康唑或ATO)的活性。与不存在肽穿梭剂的情况(“-FSD250D”)相比,在存在肽穿梭剂的情况下(“+FSD250D”;SEQ ID NO:36)成功的小分子转导导致用重组小鼠音猬因子蛋白(+mShh)刺激的NIH3T3 Gli-萤光素酶报告细胞的发光强度降低。
图4显示了通过肽穿梭剂FSD250D在剃毛小鼠的皮肤细胞中成功地在体内转导刺猬信号传导小分子抑制剂(Gant61和伊曲康唑)。小鼠皮肤的脱毛诱导与刺猬途径的强烈诱导相关的毛生长。该实验由以下组成:通过脱毛激活小鼠中的刺猬途径,然后测量通过在皮肤细胞中递送与细胞内靶标结合的小分子刺猬途径抑制剂(Gant61或伊曲康唑)对毛再生的延迟。结果表明,与不存在FSD250D的情况(“Gant61 100μM”和“伊曲康唑100μM”)或在仅存在穿梭肽的情况(“FSD250D”)相比,在存在FSD250D的情况下用小分子刺猬抑制剂(HedgeHog inhibitor)Gant61或伊曲康唑(“FSD250D+Gant61100μM”和“FSD250D+伊曲康唑100μM”)处理的小鼠在处理后10天显示出延迟的毛再生(*)。
图5A-图5C显示了在有或没有FSD194的情况下暴露于膜不可渗透的钠通道抑制剂QX-314后稳定表达钠通道Nav1.7的HEK293细胞的代表性膜片钳电生理学全细胞电流迹线。当在存在FSD194的情况下将细胞暂时暴露于QX-314和GFP-NLS时(即1mM QX-314+15μMGFP-NLS+5μM FSD194)观察到电流振幅的降低,这与细胞内QX-314的存在一致(图5C)。在不存在QX-314的情况下(即15μM GFP-NLS+5μM FSD194+;图2A)或在不存在FSD194的情况下(即2.5mM QX-314+15μM GFP-NLS;图2B)未观察到这种相同的电流振幅降低。此外,在QX-314+GFP-NLS+FSD194条件下和在FSD194+GFP-NLS条件下鉴定出GFP-NLS阳性细胞,但在QX-314+GFP-NLS条件下未鉴定出GFP-NLS阳性细胞,表明GFP-NLS确实与QX-314一起被肽穿梭剂共转导。
图6和图7显示了针对PI和GFP-NLS转导活性对超过300种候选肽穿梭剂进行大规模筛选的结果。图6显示了具有10%或更高的平均PI转导效率的所筛选的所有候选肽穿梭剂的结果,其根据它们的平均PI转导效率水平排序。图7显示了具有低于10%的平均PI转导效率和至少7%的平均GFP-NLS转导效率的所筛选的所有候选肽穿梭剂的结果,其根据它们的平均GFP-NLS转导效率水平排序。
序列表
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*肽名称从CA 3,040,645中使用的名称变化而来。
具体实施方式
在一些方面,本文描述了用于非蛋白质和/或蛋白质负荷转导的方法。所述方法通常包括使靶真核细胞与非蛋白质和/或蛋白质负荷以及一定浓度的合成肽穿梭剂接触,与不存在所述合成肽穿梭剂的情况相比,所述浓度的合成肽穿梭剂足以增加负荷的转导效率。本文还描述了对蛋白质和非蛋白质负荷二者具有双重转导活性的多功能合成肽穿梭剂,以及PI或其他膜不可渗透的荧光DNA嵌入剂作为“替代”负荷用于选择具有这种双重转导活性的合成肽穿梭剂的用途。
非蛋白质负荷
在一些实施方案中,所述非蛋白质负荷可以是分子量小于10 000、9000、8000、7000、6000、5000、4000、3000、2000或1000Da的化合物(例如,有机化合物)。在一些实施方案中,所述非蛋白质负荷可以是分子量在50至5000、50至4000、50至3000、50至2000或50至1000Da之间的化合物(例如,有机化合物)。在一些实施方案中,所述非蛋白质负荷可以是小分子,如与细胞内生物或治疗靶标结合的小分子药物。在一些实施方案中,所述非蛋白质负荷不是生物聚合物,如多核苷酸或多糖、特别是具有均匀负电荷的生物聚合物,如长度为大于50、60、70、80、90、100、150或200个核苷酸的多核苷酸。在一些实施方案中,所述非蛋白质负荷在水溶液中可以具有阳离子净电荷。在一些实施方案中,所述非蛋白质负荷不与所述合成肽穿梭剂共价结合(即独立于所述合成肽穿梭剂)(例如,在转导时)。
在一些实施方案中,所述非蛋白质负荷可以是如下负荷,其是细胞膜不可渗透的或具有低膜渗透性(例如,由于负荷的物理化学特性,阻止其自由扩散穿过细胞膜),其中本文所述的肽穿梭剂促进或增加其细胞内递送和/或进入胞质溶胶。在一些实施方案中,所述非蛋白质负荷可以是如下负荷,其是细胞膜可渗透的,其中本文所述的肽穿梭剂仍然增加其细胞内递送和/或进入细胞溶胶。在一些实施方案中,与仅施用负荷相比,本文所述的肽穿梭剂可以降低有待施用以实现其预期生物效应所需的负荷的量或浓度。
在一些实施方案中,待转导的非蛋白质负荷可以是用于治疗具有细胞内生物或治疗靶标的任何疾病或病症的药物。在一些实施方案中,所述非蛋白质负荷可以是用于治疗癌症(例如,皮肤癌、基底细胞癌、痣样基底细胞癌综合征)、炎症或炎症相关疾病(例如,银屑病、特应性皮炎、溃疡性结肠炎、荨麻疹、干眼病、干性或湿性年龄相关性黄斑变性、手指溃疡、光化性角化病、特发性肺纤维化)、疼痛(例如,慢性或急性)或影响肺的疾病(例如,囊性纤维化、哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)或特发性肺纤维化)的药物。
在特定实施方案中,待转导的非蛋白质负荷可以是或包含刺猬抑制剂(例如,伊曲康唑、泊沙康唑、三氧化二砷(ATO)、Gant61、PF-4708671、HPI-1、HPI-4)。在特定实施方案中,待转导的非蛋白质负荷可以是或包含疼痛抑制剂,如电压门控钠(Nav)通道抑制剂(例如,QX-314)。在特定实施方案中,待转导的非蛋白质负荷可以是或包含炎症的抑制剂,如导致炎性细胞因子产生的途径的抑制剂(例如,NF-κB途径抑制剂)。
在一些实施方案中,本文所述的穿梭剂可以具有将非蛋白质和蛋白质负荷二者均转导至靶真核细胞的胞质溶胶的能力。
合理的设计参数和肽穿梭剂
在一些方面,本文所述的穿梭剂可以是在靶真核细胞中对蛋白质负荷、非蛋白质负荷或蛋白质和非蛋白质负荷二者均具有转导活性的肽。在一些实施方案中,本文所述的穿梭剂优选地满足以下十五个合理设计参数中的一个或多个。
(1)在一些实施方案中,所述穿梭剂是长度为至少为17、18、19或20个氨基酸的肽。例如,所述肽可以包含17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸残基的最小长度,以及35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145或150个氨基酸残基的最大长度。在一些实施方案中,较短的肽(例如在17-50或20-50个氨基酸范围内)可能是特别有利的,因为它们可以更容易通过化学合成方法进行合成和纯化,这可能更适合于临床使用(与重组蛋白形成对照,其必须从细胞表达系统纯化)。虽然本说明书中的数字和范围通常作为5的倍数列出,但是本说明书不应受此限制。例如,在本说明书中描述的最大长度应该被理解为还包括56、57、58……61、62等的长度,并且本文的非列举仅仅是为了简洁起见。同样的推理适用于此处列出的同一性%。
(2)在一些实施方案中,所述肽穿梭剂包含两亲性α-螺旋基序。如本文所用,除非另有说明,否则表述“α-螺旋基序”或“α-螺旋”是指在连续氨基酸之间的旋转角为100度的右手式卷曲或螺旋构象(螺旋)和/或每圈具有3.6个残基的α-螺旋。如本文所用,表述“包含α-螺旋基序”或“两亲性α-螺旋基序”等是指如下三维构象,其是当在生物环境中时基于所述肽的一级氨基酸序列预测本说明书的肽(肽的区段)所采用的构象,不论所述肽在细胞中用作穿梭剂时实际上是否采用该构象。此外,本说明书的肽可以在肽的不同位置处包含一个或多个α-螺旋基序。例如,预测WO/2018/068135中的穿梭剂FSD5在其整个长度上采用一个α-螺旋(参见WO/2018/068135的图49C),而预测WO/2018/068135的穿梭剂FSD18包含朝向肽的N和C末端区域的两个分隔开的α-螺旋(参见WO/2018/068135的图49D)。在一些实施方案中,预测本说明书的穿梭剂不包含β-折叠基序,例如如WO/2018/068135的图49E和图49F所示。预测蛋白质和肽中α-螺旋和β-折叠存在的方法是本领域熟知的。例如,一种这样的方法基于使用PEP-FOLDTM的3D建模,其是用于从头肽结构预测的在线资源(http://bioserv.rpbs.univ-paris-diderot.fr/services/PEP-FOLD/)(Lamiable等人,2016;Shen等人,2014;Thévenet等人,2012)。预测肽和蛋白质中α-螺旋存在的其他方法是已知的并且容易为技术人员所用。
如本文所用,表述“两亲性”是指具有疏水和亲水元件的肽(例如基于包含肽的氨基酸的侧链)。例如,表述“两亲性α-螺旋”或“两亲性α-螺旋基序”是指基于形成螺旋的氨基酸侧链的性质,预测采用具有非极性疏水面和极性亲水面的α-螺旋基序的肽。
(3)在一些实施方案中,本说明书的肽穿梭剂包含具有带正电的亲水外表面的两亲性α-螺旋基序,例如富含R和/或K残基的外表面。如本文所用,表述“带正电的亲水外表面”是指基于α-螺旋轮投影,存在至少三个赖氨酸(K)和/或精氨酸(R)残基聚集在两亲性α-螺旋基序的一侧(例如参见WO/2018/068135的图49A,左侧小图)。可以使用各种程序来准备这种螺旋轮投影,例如在http://rzlab.ucr.edu/scripts/wheel/wheel.cgi上可获得的在线螺旋轮投影工具。在一些实施方案中,两亲性α-螺旋基序可以包含带正电的亲水外表面,基于连续氨基酸之间的旋转角为100度的α-螺旋和/或每圈具有3.6个残基的α-螺旋,所述带正电的亲水外表面包含:(a)在螺旋轮投影时的至少两个、三个或四个相邻的带正电的K和/或R残基;和/或(b)在螺旋轮投影时的包含三至五个K和/或R残基的六个相邻残基的区段。
在一些实施方案中,本说明书的肽穿梭剂包含两亲性α-螺旋基序,其包含疏水外表面,基于连续氨基酸之间的旋转角为100度的α-螺旋和/或每圈具有3.6个残基的α-螺旋,所述疏水外表面包含:(a)在螺旋轮投影时的至少两个相邻L残基;和/或(b)在螺旋轮投影时的包含选自L、I、F、V、W和M的至少五个疏水残基的十个相邻残基的区段。
(4)在一些实施方案中,本说明书的肽穿梭剂包含两亲性α-螺旋基序,其具有由空间上相邻的高疏水残基(例如L、I、F、V、W和/或M)构成的高疏水核心。在一些实施方案中,基于每圈具有3.6个残基的α-螺旋的开放圆柱形表示,所述高疏水核心可以由空间上相邻的L、I、F、V、W和/或M氨基酸组成,排除任何富含组氨酸的结构域时计算出所述氨基酸占所述肽的氨基酸的12%至50%(见下文),如WO/2018/068135的图49A右侧小图所示。在一些实施方案中,所述高疏水核心可以由空间上相邻的L、I、F、V、W和/或M氨基酸组成,所述氨基酸占所述肽的氨基酸的从12.5%、13%、13.5%、14%、14.5%、15%、15.5%、16%、16.5%、17%、17.5%、18%、18.5%、19%、19.5%或20%至25%、30%、35%、40%或45%。更具体地,高疏水核心参数可以通过首先以开放圆柱形表示排列肽的氨基酸,然后描绘连续的高疏水残基(L、I、F、V、W、M)的区域来计算,如WO/2018/068135的图49A右侧小图所示。然后将该描绘的高疏水核心中包含的高疏水残基的数量除以肽的总氨基酸长度,排除任何富含组氨酸的结构域(例如富含N-和/或C末端组氨酸的结构域)。例如,对于WO/2018/068135的图49A中所示的肽,在描绘的高疏水核心中存在8个残基,并且所述肽中总共25个残基(排除末端12个组氨酸)。因此,高疏水核心为32%(8/25)。
(5)疏水力矩涉及螺旋、肽或其部分的两亲性的量度,其由氨基酸侧链的疏水的矢量和计算(Eisenberg等人,1982)。用于计算多肽疏水力矩的在线工具可从以下获得:http://rzlab.ucr.edu/scripts/wheel/wheel.cgi。高疏水力矩指示强两亲性,而低疏水力矩指示弱两亲性。在一些实施方案中,本说明书的肽穿梭剂可以包含疏水力矩(μ)为3.5至11的肽或α-螺旋结构域或由其组成。在一些实施方案中,所述穿梭剂可以是包含两亲性α-螺旋基序的肽,所述α-螺旋基序具有在3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0的下限与9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9或11.0的上限之间的疏水力矩。在一些实施方案中,所述穿梭剂可以是具有在4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0的下限与9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.1、10.2、10.3、10.4或10.5的上限之间的疏水力矩的肽。在一些实施方案中,排除可能存在于所述肽中的任何富含组氨酸的结构域来计算疏水力矩。
(6)在一些实施方案中,本说明书的肽穿梭剂在生理pH下可具有至少+4的预测净电荷,其由K、R、D和E残基的侧链计算。例如,肽的净电荷在生理pH下可以是至少+5、+6、+7、至少+8、至少+9、至少+10、至少+11、至少+12、至少+13、至少+14、或至少+15。这些正电荷通常由带正电的赖氨酸和/或精氨酸残基的更多存在赋予,这与带负电的天冬氨酸和/或谷氨酸残基形成对照。
(7)在一些实施方案中,本说明书的肽穿梭剂可具有8至13,优选10至13的预测等电点(pI)。用于计算和/或测量肽的等电点的程序和方法或蛋白质是本领域已知的。例如,可以使用由以下可获得的Prot Param软件计算pI:http://web.expasy.org/protparam/
(8)在一些实施方案中,本说明书的肽穿梭剂可以由35%至65%的疏水残基(A、C、G、I、L、M、F、P、W、Y、V)组成。在特定实施方案中,所述肽穿梭剂可以由36%至64%、37%至63%、38%至62%、39%至61%或40%至60%的如下氨基酸的任何组合构成:A、C、G、I、L、M、F、P、W、Y和V。
(9)在一些实施方案中,本说明书的肽穿梭剂可以由0至30%的中性亲水残基(N、Q、S、T)构成。在特定实施方案中,所述肽穿梭剂可以由1%至29%、2%至28%、3%至27%、4%至26%、5%至25%、6%至24%、7%至23%、8%至22%、9%至21%或10%至20%的如下氨基酸的任何组合构成:N、Q、S和T。
(10)在一些实施方案中,本说明书的肽穿梭剂可以由35%至85%的如下氨基酸构成:A、L、K和/或R。在特定实施方案中,所述肽穿梭剂可以由36%至80%、37%至75%、38%至70%、39%至65%或40%至60%的如下氨基酸的任何组合构成:A、L、K或R。
(11)在一些实施方案中,本说明书的肽穿梭剂可以由15%至45%的氨基酸A和/或L构成,条件是在所述肽中存在至少5%的L。在特定实施方案中,所述肽穿梭剂可以由15%至40%、20%至40%、20%至35%或20%至30%的如下氨基酸的任何组合构成:A和L,条件是在所述肽中存在至少5%的L。
(12)在一些实施方案中,本说明书的肽穿梭剂可以由20%至45%的氨基酸K和/或R构成。在特定实施方案中,所述肽穿梭剂可以由20%至40%、20%至35%或20%至30%的如下氨基酸的任何组合构成:K和R。
(13)在一些实施方案中,本说明书的肽穿梭剂可以由0至10%的氨基酸D和/或E构成。在特定实施方案中,所述肽穿梭剂可以由5%至10%的如下氨基酸的任何组合构成:D和E。
(14)在一些实施方案中,所述肽穿梭剂中A和/或L的百分比与K和/或R的百分比之间的绝对差可以小于或等于10%。在特定实施方案中,所述肽穿梭剂中A和/或L的百分比与K和/或R的百分比之间的绝对差可以小于或等于9%、8%、7%、6%或5%。
(15)在一些实施方案中,本说明书的肽穿梭剂可以由10%至45%的如下氨基酸构成:Q、Y、W、P、I、S、G、V、F、E、D、C、M、N、T或H(即,不是A、L、K或R)。在特定实施方案中,所述肽穿梭剂可以由15%至40%、20%至35%或20%至30%的如下氨基酸的任何组合构成:Q、Y、W、P、I、S、G、V、F、E、D、C、M、N、T和H。
在一些实施方案中,本说明书的肽穿梭剂遵守本文所述的参数(1)至(15)中的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少九个、至少十个、至少十一个、至少十二个、十三个、至少十四个或全部。在特定实施方案中,本说明书的肽穿梭剂遵守参数(1)至(3)中的全部以及本文所述的参数(4)至(15)中的至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少十一个或全部。
在一些实施方案中,当本说明书的肽穿梭剂仅包含一个富含组氨酸的结构域时,所述一个富含组氨酸的结构域的残基可以包括在本文所述的参数(1)至(15)的计算/评估中。在一些实施方案中,当本说明书的肽穿梭剂包含多于一个富含组氨酸的结构域时,仅一个富含组氨酸的结构域的残基可以包括在本文所述的参数(1)至(15)的计算/评估中。例如,当本说明书的肽穿梭剂包含两个富含组氨酸的结构域:朝向N末端的第一富含组氨酸的结构域和朝向C末端的第二富含组氨酸的结构域时,仅所述第一富含组氨酸的结构域可以包括在本文所述的参数(1)至(15)的计算/评估中。
在一些实施方案中,可以实施机器学习或计算机辅助设计方法以产生遵守本文所述的参数(1)至(15)中的一个或多个的肽。一些参数如参数(1)和(5)-(15)可能更适合在计算机辅助设计方法中实现,而结构参数如参数(2)、(3)和(4)可能更适合手动设计方法。因此,在一些实施方案中,可以通过组合计算机辅助和手动设计方法来产生遵守参数(1)至(15)中的一个或多个的肽。例如,本文所示的充当有效穿梭剂的多种肽(和其他肽)的多序列比对分析揭示了一些共有序列的存在——即通常发现的疏水、阳离子、亲水、丙氨酸和甘氨酸氨基酸的交替模式。这些共有序列的存在可能导致遵守结构参数(2)、(3)和(4)(即两亲性α-螺旋形成,带正电的面和12%-50%的高疏水核心)。因此,这些和其他共有序列可以用于机器学习和/或计算机辅助设计方法,以产生遵守参数(1)-(15)中的一个或多个的肽。
因此,在一些实施方案中,本文所述的肽穿梭剂可以包含以下氨基酸序列或由其组成:
(a)[X1]-[X2]-[接头]-[X3]-[X4] (式1);
(b)[X1]-[X2]-[接头]-[X4]-[X3] (式2);
(c)[X2]-[X1]-[接头]-[X3]-[X4] (式3);
(d)[X2]-[X1]-[接头]-[X4]-[X3] (式4);
(e)[X3]-[X4]-[接头]-[X1]-[X2] (式5);
(f)[X3]-[X4]-[接头]-[X2]-[X1] (式6);
(g)[X4]-[X3]-[接头]-[X1]-[X2] (式7);或
(h)[X4]-[X3]-[接头]-[X2]-[X1] (式8),
其中:
[X1]选自:2[Φ]-1[+]-2[Φ]-1[ζ]-1[+]-;2[Φ]-1[+]-2[Φ]-2[+]-;1[+]-1[Φ]-1[+]-2[Φ]-1[ζ]-1[+]-;以及1[+]-1[Φ]-1[+]-2[Φ]-2[+]-;
[X2]选自:-2[Φ]-1[+]-2[Φ]-2[ζ]-;-2[Φ]-1[+]-2[Φ]-2[+]-;-2[Φ]-1[+]-2[Φ]-1[+]-1[ζ]-;-2[Φ]-1[+]-2[Φ]-1[ζ]-1[+]-;-2[Φ]-2[+]-1[Φ]-2[+]-;-2[Φ]-2[+]-1[Φ]-2[ζ]-;-2[Φ]-2[+]-1[Φ]-1[+]-1[ζ]-;以及-2[Φ]-2[+]-1[Φ]-1[ζ]-1[+]-;
[X3]选自:-4[+]-A-;-3[+]-G-A-;-3[+]-A-A-;-2[+]-1[Φ]-1[+]-A-;-2[+]-1[Φ]-G-A-;-2[+]-1[Φ]-A-A-;或-2[+]-A-1[+]-A;-2[+]-A-G-A;-2[+]-A-A-A-;-1[Φ]-3[+]-A-;-1[Φ]-2[+]-G-A-;-1[Φ]-2[+]-A-A-;-1[Φ]-1[+]-1[Φ]-1[+]-A;-1[Φ]-1[+]-1[Φ]-G-A;-1[Φ]-1[+]-1[Φ]-A-A;-1[Φ]-1[+]-A-1[+]-A;-1[Φ]-1[+]-A-G-A;-1[Φ]-1[+]-A-A-A;-A-1[+]-A-1[+]-A;-A-1[+]-A-G-A;以及-A-1[+]-A-A-A;
[X4]选自:-1[ζ]-2A-1[+]-A;-1[ζ]-2A-2[+];-1[+]-2A-1[+]-A;-1[ζ]-2A-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-1[ζ]-A-1[ζ]-A-1[+];-2[+]-A-2[+];-2[+]-A-1[+]-A;-2[+]-A-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-2[+]-1[ζ]-A-1[+];-1[+]-1[ζ]-A-1[+]-A;-1[+]-1[ζ]-A-2[+];-1[+]-1[ζ]-A-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-1[+]-2[ζ]-A-1[+];-1[+]-2[ζ]-2[+];-1[+]-2[ζ]-1[+]-A;-1[+]-2[ζ]-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-1[+]-2[ζ]-1[ζ]-A-1[+];-3[ζ]-2[+];-3[ζ]-1[+]-A;-3[ζ]-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-1[ζ]-2A-1[+]-A;-1[ζ]-2A-2[+];-1[ζ]-2A-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-2[+]-A-1[+]-A;-2[+]-1[ζ]-1[+]-A;-1[+]-1[ζ]-A-1[+]-A;-1[+]-2A-1[+]-1[ζ]-A-1[+];以及-1[ζ]-A-1[ζ]-A-1[+];并且
[接头]选自:-Gn-;-Sn-;-(GnSn)n-;-(GnSn)nGn-;-(GnSn)nSn-;-(GnSn)nGn(GnSn)n-;以及-(GnSn)nSn(GnSn)n-;
其中:[Φ]是氨基酸,其为:Leu、Phe、Trp、Ile、Met、Tyr或Val,优选Leu、Phe、Trp或Ile;[+]是氨基酸,其为:Lys或Arg;[ζ]是氨基酸,其为:Gln、Asn、Thr或Ser;A为氨基酸Ala;G是氨基酸Gly;S是氨基酸Ser;并且n是1至20、1至19、1至18、1至17、1至16、1至15、1至14、1至13、1至12、1至11、1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至1至4或1至3的整数。
在一些实施方案中,本发明的肽穿梭剂可以包含如下肽或其功能变体或由如下肽或其功能变体组成,所述肽与SEQ ID NO:1至50、58至78、80至107、109至139、141至146、149至161、163至169、171、174至234、236至240、242至260、262至285、287至294、296至300、302至308、310、311、313至324、326至332、338至342、或344中任一个的氨基酸序列或如WO/2018/068135中披露的SEQ ID NO:104、105、107、108、110-131、133-135、138、140、142、145、148、151、152、169-242和243-10 242中任一个的氨基酸序列至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同。在一些实施方案中,本发明的肽穿梭剂可以包含WO/2018/068135的SEQ ID NO:158和/或159的氨基酸序列基序,其在肽FSD5、FSD16、FSD18、FSD19、FSD20、FSD22和FSD23中的每一个中发现。在一些实施方案中,本发明的肽穿梭剂可以包含WO/2018/068135的SEQID NO:159的氨基酸序列基序,其与WO/2018/068135的SEQ ID NO:158的氨基酸序列基序可操作地连接。如本文所用,“功能变体”是指具有负荷转导活性的肽,其与参考肽相差一个或多个保守氨基酸取代。如本文在功能变体的上下文中所使用的,“保守氨基酸取代”是这样的取代,其中一个氨基酸残基被替代为具有相似侧链的另一个氨基酸残基。本领域已经明确定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族,包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性的侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸以及任选脯氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、以及芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
在一些实施方案中,本说明书的肽穿梭剂不包含WO/2018/068135的SEQ ID NO:57-59、66-72或82-102中任一个的氨基酸序列中的一种或多种。在一些实施方案中,本发明的肽穿梭剂不包含WO/2018/068135的SEQ ID NO:104、105、107、108、110-131、133-135、138、140、142、145、148、151、152、169-242和243-10 242中任一个的氨基酸序列中的一种或多种。更确切地说,在一些实施方案中,本说明书的肽穿梭剂可以涉及此类先前描述的穿梭剂肽的变体,其中所述变体被进一步工程化用于改善双重转导活性(即,能够更稳健地转导蛋白质和非蛋白质负荷)。
在一些实施方案中,如在真核细胞模型系统(例如永生化真核细胞系)中或在模型生物体中所测量,本说明书的肽穿梭剂可以具有“替代”负荷的转导效率和/或负荷递送得分的最小阈值。表述“转导效率”是指目的负荷被细胞内递送至其中的靶细胞群的百分比或比例,这可以通过例如流式细胞术、免疫荧光显微镜检查和可用于评估负荷转导效率的其他合适方法(例如,如WO/2018/068135中所述)来测定。在一些实施方案中,转导效率可以表示为负荷阳性细胞的百分比。在一些实施方案中,转导效率可以表示为在除了不存在负荷和穿梭剂(“无处理”;NT)或不存在穿梭剂(“仅负荷”)以外相同的条件下评估的相比于合适阴性对照的倍数增加(或倍数减少)。
如本文所用,表述“替代负荷”是指可以被具有已知负荷转导活性的穿梭剂转导的任何蛋白质或非蛋白质负荷,其细胞内递送和内体逃逸(即,胞质溶胶和/或细胞核递送)的水平可以容易地进行测量和/或跟踪(例如,经由荧光或功能测定),其中替代负荷旨在评估给定穿梭剂对于转导不同于替代负荷的目的负荷(例如,蛋白质或非蛋白质负荷,如与细胞内靶标结合的治疗活性负荷)的合适性。合适的替代负荷的例子可以包括荧光负荷(例如,PI或其他膜不可渗透的荧光DNA嵌入剂、GFP、GFP-NLS或其他荧光蛋白、荧光葡聚糖等)。非蛋白质负荷(如PI或其他膜不可渗透的荧光DNA嵌入剂)可能是特别有利的,因为它们相对便宜,并且仅在与基因组DNA结合后才展现出增强的荧光——这一特性使它们特别适合于区分内体捕获的负荷与内体逃逸的负荷(即进入胞质溶胶/细胞核区室的负荷)。如本文所用,任何合适的模型系统(例如,永生化细胞系、离体细胞、模型实验室生物体)可以用于评估替代负荷的穿梭剂转导活性。方便地,可以选择真核细胞系模型作为合适的模型系统,其中选择细胞系以提供评估最终将被转导的靶真核细胞中的转导活性的信息。事实上,多种细胞培养物和模型生物体可作为研究各种疾病的模型系统商购获得。
在一些实施方案中,本说明书的肽穿梭剂在合适的真核细胞模型系统中(例如,在HeLa或其他合适的永生化细胞系中)增加碘化丙啶或其他膜不可渗透的荧光DNA嵌入剂的转导效率。在一些实施方案中,在HeLa细胞或用于评估目的靶真核细胞中的负荷转导的其他合适的真核细胞系模型中,本说明书的肽穿梭剂使碘化丙啶或其他膜不可渗透的荧光DNA嵌入剂的转导效率相比于缺乏所述穿梭剂(“仅负荷”)的相应阴性对照增加至少3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10倍。在一些实施方案中,本说明书的肽穿梭剂能够在HeLa细胞或用于评估目的靶真核细胞中的负荷转导的其他合适的真核细胞系模型中实现至少10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%或60%的碘化丙啶或其他膜不可渗透的荧光DNA嵌入剂的转导效率(例如,如通过流式细胞术所测定)。
在一些实施方案中,本说明书的肽穿梭剂在合适的真核细胞模型系统中(例如,在HeLa或其他合适的永生化细胞系中)增加GFP-NLS或其他合适的蛋白质替代负荷的转导效率。在一些实施方案中,在HeLa细胞或用于评估目的靶真核细胞中的负荷转导的其他合适的真核细胞系模型中,本说明书的肽穿梭剂使GFP-NLS或其他合适的蛋白质替代负荷的转导效率相比于缺乏所述穿梭剂(“仅负荷”)的相应阴性对照增加至少3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、15、20、25、30、35、40、45或50倍。在一些实施方案中,本说明书的肽穿梭剂能够在HeLa细胞或用于评估目的靶真核细胞中的负荷转导的其他合适的真核细胞系模型中实现至少10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%或60%的GFP-NLS或其他合适的蛋白质替代负荷的转导效率(例如,如通过流式细胞术所测定)。
在一些实施方案中,本说明书的肽穿梭剂可以包含图6中所列的具有如下平均PI转导效率的穿梭剂或由其组成:至少10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%或60%。在一些实施方案中,本说明书的肽穿梭剂可以包含图6中所列的具有如下归一化平均PI递送得分的穿梭剂或由其组成:至少1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24、24.5、25、25.5、26、26.5、27、27.5、28、28.5、29、29.5、30、30.5、31、31.5、32、32.5、33、33.5、34、34.5、35、35.5、36、36.5、37、37.5、38、38.5、39、39.5、40、40.5、41、41.5、42、42.5、43、43.5、44、44.5、45、45.5、46、46.5、47、47.5、48、48.5、49、49.5、50、50.5、51、51.5、52、52.5、53、53.5、54、54.5、55、55.5、56、56.5、57、57.5、58、58.5、59、59.5或60。
在一些实施方案中,本说明书的肽穿梭剂可以包含图6中所列的具有如下平均GFP-NLS转导效率的穿梭剂或由其组成:至少7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%或60%。在一些实施方案中,本说明书的肽穿梭剂可包含图6中所列的具有如下归一化平均GFP-NLS递送得分的穿梭剂或由其组成:至少1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24、24.5、25、25.5、26、26.5、27、27.5、28、28.5、29、29.5、30、30.5、31、31.5、32、32.5、33、33.5、34、34.5、35、35.5、36、36.5、37、37.5、38、38.5、39、39.5、40、40.5、41、41.5、42、42.5、43、43.5、44、44.5、45、45.5、46、46.5、47、47.5、48、48.5、49、49.5、50、50.5、51、51.5、52、52.5、53、53.5、54、54.5、55、55.5、56、56.5、57、57.5、58、58.5、59、59.5、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195或200。
在一些实施方案中,本说明书的肽穿梭剂可以包含图7中所列的具有至少7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%或30%的平均GFP-NLS转导效率或至少2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24、24.5、25、25.5、26、26.5、27、27.5、28、28.5、29、29.5或30的归一化平均GFP-NLS递送得分的穿梭剂或由其组成。
在一些实施方案中,本说明书的穿梭剂可以包含穿梭剂变体,其与本文定义的穿梭剂相差不多于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。优选地,接头结构域(例如,富含柔性丝氨酸/甘氨酸的接头结构域)被排除在不同的氨基酸考虑之外,因为接头结构域的长度和/或氨基酸组成可以极大地变化而不影响转导活性。在一些实施方案中,本说明书的肽穿梭剂可以包含与本文所述的任一种穿梭剂仅相差保守氨基酸取代(例如,相差不多于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守氨基酸取代,优选排除任何接头结构域)的氨基酸序列或由其组成,其中在适合于评估所述靶真核细胞中的负荷转导的真核细胞系模型(例如,HeLa)中,穿梭剂使碘化丙啶或其他膜不可渗透的荧光DNA嵌入剂的转导效率相比于缺乏所述穿梭剂的相应阴性对照增加至少3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10倍;和/或能够实现碘化丙啶或其他膜不可渗透的荧光DNA嵌入剂的至少10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%或60%的转导效率(例如,如通过流式细胞术所测定)。在一些实施方案中,每个保守氨基酸取代选自同一氨基酸类别内的氨基酸,所述氨基酸类别是:脂肪族:G、A、V、L和I;含羟基或硫/硒:S、C、U、T和M;芳香族:F、Y和W;碱性:H、K和R;酸性及其酰胺:D、E、N和Q。
化学修饰和合成氨基酸
在一些实施方案中,本说明书的穿梭剂可以包含本文所述肽的寡聚体(例如,二聚体、三聚体等)。此类寡聚体可以通过共价结合相同或不同类型的穿梭剂单体来构建(例如,使用二硫桥连接引入单体序列中的半胱氨酸残基)。在一些实施方案中,本说明书的穿梭剂可以包含N末端和/或C末端半胱氨酸残基。
在一些实施方案中,本说明书的穿梭剂可以包含环肽或由环肽组成。在一些实施方案中,所述环肽可以经由朝向穿梭剂的N末端定位的第一残基与朝向穿梭剂的C末端定位的第二残基之间的共价连接形成。在一些实施方案中,所述第一和第二残基是位于所述穿梭剂的N和C末端的侧接残基。在一些实施方案中,所述第一和第二残基可以经由酰胺键连接以形成所述环肽。在一些实施方案中,所述环肽可以由所述穿梭剂内的两个半胱氨酸残基之间的二硫键形成,其中两个半胱氨酸残基朝向所述穿梭剂的N和C末端定位。在一些实施方案中,所述穿梭剂可以包含或被设计为包含N和C末端处的侧接半胱氨酸残基,其经由二硫键连接以形成环肽。在一些实施方案中,与相应的线性肽相比,本文所述的环状穿梭剂可以更具降解(例如,被蛋白酶降解)抗性和/或可以具有更长的半衰期。
在一些实施方案中,本说明书的穿梭剂可以包含一种或多种D-氨基酸。在一些实施方案中,本说明书的穿梭剂可以包含所述穿梭剂的N和/或C末端处的D-氨基酸。在一些实施方案中,所述穿梭剂可以完全由D-氨基酸构成。在一些实施方案中,与仅由L-氨基酸构成的相应肽相比,本文所述的具有一种或多种D-氨基酸的穿梭剂可以更具降解(例如,被蛋白酶降解)抗性和/或可以具有更长的半衰期。
在一些实施方案中,本说明书的穿梭剂可以包含对一个或多个氨基酸的化学修饰,其中所述化学修饰不破坏所述合成肽穿梭剂的转导活性。如本文在此上下文中使用的,术语“破坏”是指化学修饰不可逆地消除本文所述的肽穿梭剂的负荷转导活性。可暂时抑制、减弱或延迟本文所述的肽穿梭剂的负荷转导活性的化学修饰可以包括在对本说明书的穿梭剂的化学修饰中。在一些实施方案中,对本文所述的任一种穿梭剂的化学修饰可以在所述穿梭剂的N和/或C末端。化学修饰的例子包括添加乙酰基基团(例如,N末端乙酰基基团)、半胱酰胺基团(例如,C末端半胱酰胺基团)或脂肪酸(例如,C4-C16、C6-C14、C6-C12、C6-C8或C8脂肪酸,优选N末端)。
在一些实施方案中,本说明书的穿梭剂包含在靶真核细胞中对蛋白质和/或非蛋白质负荷具有转导活性的穿梭剂变体,所述变体与本说明书的任何穿梭剂相同,不同的是至少一个氨基酸被替代为含有与被替代氨基酸具有相似生理化学特性(例如,结构、疏水或电荷)的侧链的相应合成氨基酸或氨基酸类似物。在一些实施方案中,所述合成氨基酸替代:
(a)用以下任一种替代碱性氨基酸:α-氨基甘氨酸、α,γ-二氨基丁酸、鸟氨酸、α,β-二氨基丙酸、2,6-二氨基-4-己炔酸、β-(1-哌嗪基)-丙氨酸、4,5-脱氢-赖氨酸、δ-羟基赖氨酸、ω,ω-二甲基精氨酸、高精氨酸、ω,ω'-二甲基精氨酸、ω-甲基精氨酸、β-(2-喹啉基)-丙氨酸、4-氨基哌啶-4-甲酸、α-甲基组氨酸、2,5-二碘组氨酸、1-甲基组氨酸、3-甲基组氨酸、菠菜素(spinacine)、4-氨基苯丙氨酸、3-氨基酪氨酸、β-(2-吡啶基)-丙氨酸或β-(3-吡啶基)-丙氨酸;
(b)用以下任一种替代非极性(疏水)氨基酸:脱氢丙氨酸、β-氟丙氨酸、β-氯丙氨酸、β-碘丙氨酸、α-氨基丁酸、α-氨基异丁酸、β-环丙基丙氨酸、氮杂环丁烷-2-甲酸、α-烯丙基甘氨酸、炔丙基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、β-(2-噻唑基)-丙氨酸、硫代脯氨酸、3,4-脱氢脯氨酸、叔丁基甘氨酸、β-环戊基丙氨酸、β-环己基丙氨酸、α-甲基脯氨酸、戊氨酸、α-甲基缬氨酸、青霉胺、β,β-二环己基丙氨酸、4-氟脯氨酸、1-氨基环戊烷甲酸、哌可酸、4,5-脱氢亮氨酸、别异亮氨酸、正亮氨酸、α-甲基亮氨酸、环己基甘氨酸、顺式八氢吲哚-β-2-甲酸、β-(2-噻吩基)-丙氨酸、苯基甘氨酸、α-甲基苯丙氨酸、高苯丙氨酸、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸、β-(3-苯并噻吩基)-丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、4-溴苯丙氨酸、4-叔丁基苯丙氨酸、α-甲基色氨酸、β-(2-萘基)-丙氨酸、β-(1-萘基)-丙氨酸、4-碘苯丙氨酸、3-氟苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、4-甲基色氨酸、4-氯苯丙氨酸、3,4-二氯-苯丙氨酸、2,6-二氟-苯丙氨酸、n-in-甲基色氨酸、1,2,3,4-四氢去甲哈尔满(norharman)-3-甲酸、β,β-二苯丙氨酸、4-甲基苯丙氨酸、4-苯基苯丙氨酸、2,3,4,5,6-五氟-苯丙氨酸或4-苯甲酰基苯丙氨酸;
(c)用以下任一种替代极性不带电的氨基酸:β-氰基丙氨酸、β-脲基丙氨酸、高半胱氨酸、别苏氨酸、焦谷氨酸、2-氧代噻唑烷-4-甲酸、瓜氨酸、硫代瓜氨酸、高瓜氨酸、羟脯氨酸、3,4-二羟基苯丙氨酸、β-(1,2,4-三唑-1-基)-丙氨酸、2-巯基组氨酸、β-(3,4-二羟基苯基)-丝氨酸、β-(2-噻吩基)-丝氨酸、4-叠氮基苯丙氨酸、4-氰基苯丙氨酸、3-羟基甲基酪氨酸、3-碘酪氨酸、3-硝基酪氨酸、3,5-二硝基酪氨酸、3,5-二溴酪氨酸、3,5-二碘酪氨酸、7-羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸、5-羟色氨酸、甲状腺原氨酸、β-(7-甲氧基香豆素-4-基)-丙氨酸或4-(7-羟基-4-香豆素基)-氨基丁酸;和/或
(d)用以下任一种替代酸性氨基酸:γ-羟基谷氨酸、γ-亚甲基谷氨酸、γ-羧基谷氨酸、α-氨基己二酸、2-氨基庚二酸、α-氨基辛二酸、4-羧基苯丙氨酸、磺基丙氨酸、4-膦酰基苯丙氨酸或4-磺甲基苯丙氨酸。
富含组氨酸的结构域
在一些实施方案中,本说明书的肽穿梭剂还可以包含一个或多个富含组氨酸的结构域。在一些实施方案中,所述富含组氨酸的结构域可以是包含至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%或至少90%组氨酸残基的至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个氨基酸的延伸段。在一些实施方案中,富含组氨酸的结构域可以包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个或至少9个连续组氨酸残基。不受理论束缚,穿梭剂中的富含组氨酸的结构域可以通过在内体的酸性条件下对其咪唑基团进行质子化而在内体中充当质子海绵,提供内体膜不稳定的另一种机制,从而进一步促进内体捕获的负荷进入胞质溶胶的能力。在一些实施方案中,所述富含组氨酸的结构域可以位于所述肽穿梭剂的N和/或C末端处或朝向它们。
接头
在一些实施方案中,本说明书的肽穿梭剂可以包含一种或多种合适的接头(例如柔性多肽接头)。在一些实施方案中,此类接头可以分隔开两个或更多个两亲性α-螺旋基序(例如参见WO/2018/068135的图49D中的穿梭剂FSD18)。在一些实施方案中,接头可以用于将两个或更多个结构域(CPD、ELD或富含组氨酸的结构域)彼此分隔开。在一些实施方案中,可以通过添加没有旋转潜力的小疏水氨基酸序列(例如甘氨酸)和赋予稳定性和柔韧性的极性丝氨酸残基来形成接头。接头可以是柔软的并且允许穿梭剂的区域移动。在一些实施方案中,可以避免脯氨酸,因为它们可以增加显著的构象刚性。在一些实施方案中,所述接头可以是富含丝氨酸/甘氨酸的接头(例如GS、GGS、GGSGGGS、GGSGGGSGGGS等)。在一些实施方案中,包含合适接头的穿梭剂的使用可以有利于将负荷递送至悬浮细胞而非贴壁细胞。在一些实施方案中,所述接头可以包含以下项或由以下项组成:-Gn-;-Sn-;-(GnSn)n-;-(GnSn)nGn-;-(GnSn)nSn-;-(GnSn)nGn(GnSn)n-;或(GnSn)nSn(GnSn)n-,其中G是氨基酸Gly;S是氨基酸Ser;并且n是1至5的整数。
基于结构域的肽穿梭剂
在一些方面,本文所述的穿梭剂可以是如WO/2016/161516中所述的穿梭剂,其包含与细胞穿透结构域(CPD)可操作地连接的内体渗漏结构域(ELD)。
内体渗漏结构域(ELD)
在一些方面,本说明书的肽穿梭剂可以包含用于促进内体逃逸和进入细胞质区室的内体渗漏域(ELD)。如本文使用,表述“内体渗漏结构域”是指赋予内体捕获的负荷进入细胞质区室的能力的氨基酸序列。不受理论束缚,内体渗漏结构域是短序列(通常源自病毒或细菌肽),认为其诱导内体膜的不稳定化和内体内容物向细胞质中释放。如本文使用,表述“内体溶解肽”旨在指代具有内体膜不稳定特性的该普通类别的肽。因此,在一些实施方案中,本发明的合成肽或基于多肽的穿梭剂可以包含作为内体溶解肽的ELD。这种肽的活性可以例如使用WO/2016/161516的实施例2中所述的钙黄绿素内体逃逸测定来评估。
在一些实施方案中,ELD可以是在酸性pH破坏膜的肽,如pH-依赖性膜活性肽(PMAP)或pH-依赖性切割肽。例如,肽GALA和INF-7是当pH下降改变了它们所含的电荷时形成α螺旋的两亲性肽。更特别地,不受理论束缚,表明ELD如GALA由于pH降低导致构象改变后通过形成孔和膜脂质的翻转诱导内体渗漏(Kakudo,Chaki等人,2004,Li,Nicol等人,2004)。相比之下,表明ELD如INF-7通过在内体膜积累并使内体膜不稳定化诱导内体渗漏(El-Sayed,Futaki等人,2009)。因此,在内体成熟过程中,伴随的pH下降引起肽构象的变化且这使内体膜不稳定化,从而导致内体内容物的释放。认为相同的原理适用于假单胞菌的毒素A(Varkouhi,Scholte等人,2011)。pH下降后,毒素转位结构域的构象改变,允许其在形成孔的地方插入内体膜(London 1992,O'Keefe 1992)。这最终有利于内体的不稳定化和复合物向内体外部的转位。上述ELD涵盖在本说明书的ELD以及其作用机制未详尽界定的其他内体渗漏机制中。
在一些实施方案中,ELD可以是抗微生物肽(AMP)如线性阳离子α螺旋抗微生物肽(AMP)。由于其与细菌膜强相互作用的能力,这些肽在天然免疫应答中起关键作用。不受理论束缚,认为这些肽在水性溶液中呈现无序状态,但在疏水环境中采取α-螺旋二级结构。认为后者的构象有助于其典型的浓度依赖性膜破坏特性。当以特定浓度在内体中积累时,一些抗菌肽可能诱导内体渗漏。
在一些实施方案中,ELD可以是抗微生物肽(AMP)如杀菌肽-A/蜂毒肽杂交(CM)肽。认为这样的肽在具有膜破坏能力的最小和最有效的AMP-衍生肽中。杀菌肽是针对革兰氏阳性和革兰氏阴性菌都具有膜扰动能力的抗微生物肽家族。杀菌肽A(CA)即第一种被鉴定的抗菌肽,由具有线性结构的37个氨基酸构成。蜂毒肽(M)即一种26个氨基酸的肽,是在蜜蜂毒液中发现的细胞膜裂解因子。杀菌肽-蜂毒肽杂交肽已显示产生短的有效抗生素肽而对于真核细胞无细胞毒性(即非溶血性),一种在任何抗菌剂中都是理想的性质。这些嵌合肽构建自杀菌肽A亲水N末端结构域与蜂毒肽疏水N末端结构域的多种组合,且已对细菌模型系统进行了测试。两种26聚体,CA(1-13)M(1-13)和CA(1-8)M(1-18)(Boman等人,1989)已显示证明了广谱和改进的天然杀菌肽A效力而没有蜂毒肽的细胞毒性效应。
在产生较短CM系列肽的工作中,Andreu等人,1992的作者构建了杂交肽如26聚体(CA(1-8)M(1-18)),且将其与20聚体(CA(1-8)M(1-12))、18聚体(CA(1-8)M(1-10))和六种15聚体((CA(1-7)M(1-8)、CA(1-7)M(2-9)、CA(1-7)M(3-10)、CA(1-7)M(4-11)、CA(1-7)M(5-12)和CA(1-7)M(6-13))进行了比较。20和18聚体相比于CA(1-8)M(1-18)维持相似的活性。在六种15聚体中,CA(1-7)M(1-8)显示出低抗菌活性,而其他五种相比于26聚体显示出相似的抗生素效力且无溶血作用。因此,在一些实施方案中,本发明的合成肽或基于多肽的穿梭剂可以包含作为或来自CM系列肽变体(如上文所述的那些)的ELD。
在一些实施方案中,ELD可以是由与蜂毒肽的残基2-12(YGRKKRRQRRR)融合的杀菌肽-A(KWKLFKKIGAVLKVLTTG)的残基1-7构成的CM系列肽CM18,[C(1-7)M(2-12)]。当与细胞穿透肽TAT融合时,CM18显示独立地穿过质膜并使内体膜不稳定化,允许一些内体捕获的负荷释放至胞质溶胶(Salomone等人,2012)。然而,在作者的一些实验中,与荧光团(atto-633)融合的CM18-TAT11肽的使用引起了对于肽相比于荧光团的贡献的不确定性,这是由于荧光团本身已显示出对内体溶解的贡献—例如经由内体膜的光化学破坏(Erazo-Oliveras等人,2014)。
在一些实施方案中,ELD可以是具有WO/2016/161516的SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CM18,或与WO/2016/161516的SEQ ID NO:1具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、85%、90%、91%、92%、93%、94%或95%同一性且具有内体溶解活性的其变体。
在一些实施方案中,ELD可以是源自流感血凝素(HA)的HA2亚基的N末端的肽,当在内体中积累时其还可引起内体膜的不稳定化。
在一些实施方案中,本发明的合成肽或基于多肽的穿梭剂可以包含作为或来自表I中所述ELD的ELD,或具有内体逃逸活性和/或pH依赖性膜破坏活性的其变体。
表I:内体渗漏结构域的例子
在一些实施方案中,本发明的穿梭剂可以包含一个或多个ELD或一种或多种类型的ELD。更特别地,其可以包含至少2、至少3、至少4、至少5个或更多个ELD。在一些实施方案中,所述穿梭剂可以包含1-10个ELD、1-9个ELD、1-8个ELD、1-7个ELD、1-6个ELD、1-5个ELD、1-4个ELD、1-3个ELD等。
在一些实施方案中,ELD相对于本发明穿梭剂内其他结构域(CPD、富含组氨酸的结构域)的顺序或位置可以变化,只要保持穿梭剂的穿梭能力即可。
在一些实施方案中,ELD可以是表I中所列处并具有内体溶解活性的那些中的任一种的变体或片段。在一些实施方案中,ELD可以包含WO/2016/161516的SEQ ID NO:1-15、63或64中任一个的氨基酸序列,或与WO/2016/161516的SEQ ID NO:1-15、63或64中任一个至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、85%、90%、91%、92%、93%、94%或95%相同且具有内体溶解活性的序列或由其组成。
在一些实施方案中,本说明书的穿梭剂不包含WO/2016/161516的SEQ ID NO:1-15、63或64中任一个的氨基酸序列中的一个或多个。
细胞穿透结构域(CPD)
一些方面,本发明的穿梭剂可以包含细胞穿透结构域(CPD)。如本文使用的表述“细胞穿透结构域”是指赋予含有CPD的大分子(例如,肽或蛋白质)转导至细胞中的能力的氨基酸序列。
在一些实施方案中,CPD可以是(或可以来自)细胞穿透肽或细胞穿透肽的蛋白质转导结构域。细胞穿透肽可以作为载体发挥作用以成功地细胞内递送多种负荷(例如,多核苷酸、多肽、小分子化合物或以其他方式膜不可渗透的其他大分子/化合物)。细胞穿透肽通常包括富含碱性氨基酸的短肽,其与大分子融合(或以其他方式可操作地连接)后介导其内化至细胞中(Shaw,Catchpole等人,2008)。通过分析HIV-1转录顺式激活因子(Tat)蛋白的细胞穿透能力来鉴定第一种细胞穿透肽(Green和Loewenstein 1988,Vives,Brodin等人,1997)。该蛋白质包含称为“TAT”的短亲水氨基酸序列,其促进其插入质膜内并形成孔。自该发现起,已描述了多种其他细胞穿透肽。在该方面,在一些实施方案中,CPD可以是如表II中所列的细胞穿透肽或具有细胞穿透肽活性的其变体。
表II:细胞穿透肽的例子
不受理论束缚,认为细胞穿透肽与细胞质膜相互作用,然后通过胞饮作用或内吞作用穿过。在TAT肽的情况下,认为其亲水质和电荷促进其插入质膜内并形成孔(Herce和Garcia 2007)。还认为疏水肽(如SP)内的α螺旋基序在质膜内形成孔(Veach,Liu等人,2004)。
在一些实施方案中,本发明的穿梭剂可以包含一个或多个CPD或一种或多种类型的CPD。更特别地,其可以包含至少2、至少3、至少4或至少5个或更多个CPD。在一些实施方案中,所述穿梭剂可以包含在1与10个之间的CPD、在1与6个之间的CPD、在1与5个之间的CPD、在1与4个之间的CPD、在1与3个之间的CPD等。
在一些实施方案中,CPD可以是具有WO/2016/161516的SEQ ID NO:17的氨基酸序列的TAT,或与WO/2016/161516的SEQ ID NO:17具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%或95%同一性且具有细胞穿透活性的其变体;或具有WO/2016/161516的SEQ ID NO:18的氨基酸序列的穿膜肽,或与WO/2016/161516的SEQ ID NO:18具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%或95%同一性且具有细胞穿透活性的其变体。
在一些实施方案中,CPD可以是具有WO/2016/161516的SEQ ID NO:65的氨基酸序列的PTD4,或与WO/2016/161516的SEQ ID NO:65具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%或95%同一性的其变体。
在一些实施方案中,CPD相对于本说明书的穿梭剂内其他结构域(ELD、富含组氨酸的结构域)的顺序或位置可以变化,只要保持所述穿梭剂的穿梭能力即可。
在一些实施方案中,CPD可以是表II中所列的且具有细胞穿透活性的那些中任一种的变体或片段。在一些实施方案中,CPD可以包含WO/2016/161516的SEQ ID NO:16-27或65中任一个的氨基酸序列,或与WO/2016/161516的SEQ ID NO:16-27或65中任一个至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、85%、90%、91%、92%、93%、94%或95%相同且具有细胞穿透活性的序列,或由其组成。
在一些实施方案中,本说明书的穿梭剂不包含WO/2016/161516的SEQ ID NO:16-27或65的氨基酸序列中的任一个。
方法、试剂盒、用途、组合物和细胞
在一些实施方案中,本说明书涉及用于将蛋白质和/或非蛋白质负荷从细胞外空间递送至靶真核细胞的胞质溶胶和/或细胞核的方法。所述方法包括在存在一定浓度的穿梭剂的情况下使所述靶真核细胞与所述负荷接触,与不存在所述穿梭剂的情况相比,所述浓度的穿梭剂足以增加所述负荷的转导效率。在一些实施方案中,与不存在所述穿梭剂的情况相比,在存在所述穿梭剂的情况下使所述靶真核细胞与所述负荷接触导致所述非蛋白质负荷的转导效率增加至少10倍、20倍、30倍、40倍、50倍或100倍。
在一些实施方案中,本说明书涉及一种用于增加蛋白质和/或非蛋白质负荷向靶真核细胞的胞质溶胶和/或细胞核的转导效率的方法。如本文所用,表述“增加转导效率”是指本说明书的穿梭剂改善目的负荷(例如,非蛋白质负荷)在细胞内所递送至的靶细胞群的百分比或比例的能力。免疫荧光显微镜检查、流式细胞术和其他合适方法可以用于评估负荷转导效率。在一些实施方案中,本说明书的穿梭剂可以实现至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%或85%的转导效率,例如如通过免疫荧光显微镜检查、流式细胞术、FACS和其他合适方法所测量。在一些实施方案中,本说明书的穿梭剂可以实现上述转导效率之一以及至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的细胞活力,例如如通过WO/2018/068135的实施例3.3a中描述的测定或通过本领域中已知的另一种合适的测定所测量。
除了增加靶细胞转导效率之外,本说明书的穿梭剂还可以促进目的负荷(例如,蛋白质和/或非蛋白质负荷)向靶细胞的胞质溶胶和/或细胞核的递送。在这一方面,使用肽有效地将细胞外负荷递送至靶细胞的胞质溶胶和/或细胞核可能具有挑战性,因为负荷在穿过质膜后往往被捕获在细胞内的内体中,这可能限制其细胞内可用性并可能导致其最终的代谢降解。例如,已经报道使用来自HIV-1Tat蛋白的蛋白质转导结构域导致负荷被大量隔离至细胞内的囊泡中。在一些方面,本说明书的穿梭剂可以促进内体捕获的负荷从内体逃逸并进入细胞质区室的能力。在这一方面,例如在短语“增加非蛋白质负荷向胞质溶胶的转导效率”中“向胞质溶胶”的表述旨在指本说明书的穿梭剂允许细胞内递送目的负荷以逃避内体捕获并进入胞质溶胶和/或细胞核区室。在目的负荷进入胞质溶胶后,其可以自由地与其细胞内靶标(例如,细胞核、核仁、线粒体、过氧化物酶体)结合。
在一些实施方案中,因此,表述“向胞质溶胶”旨在不仅涵盖胞质溶胶递送,而且还涵盖递送至首先需要负荷进入细胞质区室的其他亚细胞区室。
在一些实施方案中,本说明书的方法是体外方法(例如,如用于治疗和/或诊断目的)。在其他实施方案中,本说明书的方法是体内方法(例如,如用于治疗和/或诊断目的)。在一些实施方案中,本说明书的方法包括非蛋白质负荷和合成肽穿梭剂的局部、肠内/胃肠道(例如,口服)或肠胃外施用。在一些实施方案中,本文描述了配制用于非蛋白质负荷和合成肽穿梭剂的局部、肠内/胃肠道(例如,口服)或肠胃外施用的组合物。
在一些实施方案中,本说明书的方法可以包括使所述靶真核细胞与如本文所定义的穿梭剂或组合物以及所述蛋白质和/或非蛋白质负荷接触。在一些实施方案中,所述穿梭剂或组合物可以与所述负荷预孵育以形成混合物,然后将所述靶真核细胞暴露于该混合物。在一些实施方案中,可以基于有待于细胞内递送的负荷的特征和/或物理化学特性来选择穿梭剂的类型。在其他实施方案中,可以选择穿梭剂的类型以考虑有待于细胞内递送的负荷的特征和/或物理化学特性、细胞类型、组织类型等。
在一些实施方案中,所述方法可以包括用所述穿梭剂或组合物多次处理所述靶细胞(例如,每天1、2、3、4次或更多次,和/或按预定时间表)。在这种情况下,较低浓度的所述穿梭剂或组合物可能是可取的(例如,为了降低毒性)。在一些实施方案中,所述细胞可以是悬浮细胞或贴壁细胞。在一些实施方案中,本领域技术人员将能够使用不同的穿梭剂、结构域、用途和方法的不同组合来调整本说明书的教导,以适应将蛋白质和/或非蛋白质负荷递送至具有所需活力的特定细胞的特定需求。
在一些实施方案中,本说明书的方法可以应用于在体内将蛋白质和/或非蛋白质负荷细胞内递送至细胞的方法。此类方法可以通过肠胃外施用或直接注射至组织、器官或系统中来实现。
在一些方面,本说明书的合成肽穿梭剂可以用于增加蛋白质和/或非蛋白质负荷(例如,治疗或生物活性蛋白质和/或非蛋白质负荷)向靶真核细胞中的转导效率的体外或体内方法中,其中所述合成肽穿梭剂或合成肽穿梭剂变体在一定浓度下使用或被配制为在一定浓度下使用,与不存在所述合成肽穿梭剂或合成肽穿梭剂变体的情况相比,所述浓度足以增加所述负荷向所述靶真核细胞中的转导效率和胞质溶胶和/或细胞核递送。
在一些实施方案中,本说明书的合成肽穿梭剂可以用于疗法中,其中所述合成肽穿梭剂或合成肽穿梭剂变体将具有治疗或生物活性的蛋白质和/或非蛋白质负荷转导至靶真核细胞的胞质溶胶和/或细胞核,其中所述合成肽穿梭剂或合成肽穿梭剂变体在一定浓度下使用(或被配制为在一定浓度下使用),与不存在所述合成肽穿梭剂的情况相比,所述浓度足以增加所述负荷向所述靶真核细胞中的转导效率。
在一些方面,本文描述了一种用于将非蛋白质负荷转导至靶真核细胞中的组合物,所述组合物包含用药学上合适的赋形剂配制的合成肽穿梭剂,其中与不存在所述合成肽穿梭剂的情况相比,所述组合物中的所述合成肽穿梭剂的浓度足以在施用后增加所述负荷在所述靶真核细胞中的转导效率和胞质溶胶和/或细胞核递送。在一些实施方案中,所述组合物还包含所述负荷。在一些实施方案中,所述组合物可以在施用或治疗用途之前与所述负荷混合。
在一些方面,本文描述了一种用于疗法的组合物,所述组合物包含与有待于通过合成肽穿梭剂转导至靶真核细胞中的蛋白质和/或非蛋白质负荷一起配制的所述合成肽穿梭剂,其中与不存在所述合成肽穿梭剂的情况相比,所述组合物中的所述合成肽穿梭剂的浓度足以在施用后增加所述负荷在所述靶真核细胞中的转导效率和胞质溶胶和/或细胞核递送。
在一些实施方案中,所述穿梭剂或组合物和所述蛋白质和/或非蛋白质负荷可以在存在或不存在血清的情况下暴露于靶细胞。在一些实施方案中,所述方法可以适合于临床或治疗用途。
在一些实施方案中,本说明书涉及一种用于将蛋白质和/或非蛋白质负荷从细胞外空间递送至靶真核细胞的胞质溶胶和/或细胞核的试剂盒。在一些实施方案中,本说明书涉及一种用于增加蛋白质和/或非蛋白质负荷向靶真核细胞的胞质溶胶的转导效率的试剂盒。所述试剂盒可以包含如本文所定义的穿梭剂或组合物以及合适的容器。
在一些实施方案中,所述靶真核细胞可以是动物细胞、哺乳动物细胞或人细胞。在一些实施方案中,所述靶真核细胞可以是干细胞(例如胚胎干细胞、多能干细胞、诱导型多能干细胞、神经干细胞、间充质干细胞、造血干细胞、外周血干细胞)、原代细胞(例如,成肌细胞、成纤维细胞)、免疫细胞(例如,NK细胞、T细胞、树突状细胞、抗原呈递细胞)、上皮细胞、皮肤细胞、胃肠道细胞、粘膜细胞或肺细胞。在一些实施方案中,所述靶细胞包括具有用于内吞作用(即产生内体)的细胞机制的那些细胞。
在一些实施方案中,本说明书涉及一种包含如本文所定义的合成肽穿梭剂的分离细胞。在一些实施方案中,所述细胞可以是蛋白质诱导的多能干细胞。应当理解,通常对DNA转染具有抗性或不适合DNA转染的细胞可能是本说明书的合成肽穿梭剂的关注候选物。
在一些实施方案中,本说明书涉及一种用于产生合成肽穿梭剂的方法,所述肽穿梭剂将蛋白质和/或非蛋白质负荷从细胞外空间递送至靶真核细胞的胞质溶胶和/或细胞核,所述方法包括合成如下肽,所述肽是:(1)长度为至少17、18、19或20个氨基酸的肽,其包含(2)两亲性α-螺旋基序,其具有(3)带正电的亲水外表面和疏水外表面,其中遵守本文定义的参数(4)至(15)中的至少五个。
在一些实施方案中,本说明书涉及一种用于鉴定或选择穿梭剂的方法,所述穿梭剂将蛋白质和/或非蛋白质负荷从细胞外空间递送至靶真核细胞的胞质溶胶和/或细胞核,所述方法包括:(a)合成如下肽,所述肽是如本文所定义的肽;(b)在存在所述肽的情况下使所述靶真核细胞与所述负荷接触;(c)测量在所述靶真核细胞中所述负荷的转导效率;以及(d)当观察到所述靶真核细胞中所述负荷的转导活性(例如,转导效率)增加时,鉴定或选择所述肽作为转导所述负荷的穿梭剂。
在一些方面,本说明书涉及一种用于将非蛋白质负荷转导至靶真核细胞中的组合物,所述组合物包含用药学上合适的赋形剂配制的合成肽穿梭剂,其中与不存在所述合成肽穿梭剂的情况相比,所述组合物中的所述合成肽穿梭剂的浓度足以在施用后增加所述负荷在所述靶真核细胞中的转导效率和胞质溶胶递送。在一些实施方案中,所述组合物还包含所述负荷。
在一些实施方案中,本说明书涉及包含本文所述的穿梭剂和如本文所述的负荷的口服配制品,例如肠溶衣口服剂型。
在一些实施方案中,可以设想本文描述的穿梭剂在食品、农业和/或农业产业中的应用。在一些实施方案中,本文所述的穿梭剂可以被配制成饲料添加剂以帮助体重增长和/或营养物的吸收。在一些实施方案中,本文所述的穿梭剂可以被配制成饲料添加剂以帮助体重增长和/或营养物的吸收。
在一些方面,本文描述了一种用于产生预期在靶真核细胞中对目的蛋白质和/或非蛋白质负荷具有转导活性的候选合成肽穿梭剂的方法,所述方法包括合成如下肽,所述肽是:(1)长度为至少17、18、19或20个氨基酸的肽,所述肽包含(2)两亲性α-螺旋基序,其具有(3)带正电的亲水外表面和疏水外表面,其中遵守本文定义的参数(4)至(15)中的至少五个,并且其中在适合于评估所述靶真核细胞中的负荷转导的真核细胞系模型(例如,HeLa)中,所述穿梭剂使碘化丙啶或其他膜不可渗透的荧光DNA嵌入剂的转导效率相比于缺乏所述穿梭剂的相应阴性对照增加至少3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10倍,和/或能够实现碘化丙啶或其他膜不可渗透的荧光DNA嵌入剂的至少10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%或60%的转导效率(例如,如通过流式细胞术所测定)。
在一些方面,本文描述了一种用于鉴定或选择预期在靶真核细胞中对蛋白质和/或非蛋白质负荷具有转导活性的合成肽穿梭剂的体外或体内方法,所述方法包括:提供适合于评估所述靶真核细胞中的负荷转导的模型真核细胞或模型生物体;提供候选合成肽穿梭剂(例如,如本文所定义的任何穿梭剂);以及测量所述候选合成肽穿梭剂将碘化丙啶或其他膜不可渗透的荧光DNA嵌入剂转导至所述真核细胞系模型中的转导活性(例如,负荷转导效率,如通过流式细胞术),其中当在所述模型真核细胞或模型生物体中,碘化丙啶或其他膜不可渗透的荧光DNA嵌入剂的转导效率相比于缺乏所述候选合成肽穿梭剂的相应阴性对照增加至少3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10倍,和/或发生所述碘化丙啶或其他膜不可渗透的荧光DNA嵌入剂的至少10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%或60%的转导效率(例如,如通过流式细胞术所测定)时,预期所述候选穿梭剂在所述靶真核细胞中对蛋白质和非蛋白质负荷二者均具有转导活性。
项目I
在一些方面,此处描述了以下项目中的一个或多个:
1.一种用于非蛋白质负荷转导的方法,所述方法包括使靶真核细胞与非蛋白质负荷和一定浓度的合成肽穿梭剂接触,与不存在所述合成肽穿梭剂的情况相比,所述浓度的合成肽穿梭剂足以增加所述非蛋白质负荷的转导效率。
2.根据项目1所述的方法,其中所述非蛋白质负荷:(a)是有机化合物;(b)具有小于10 000、9000、8000、7000、6000、5000、4000、3000、2000或1000Da、或在50至5000、50至4000、50至3000、50至2000或50至1000Da之间的分子量;(c)是小分子,如与细胞内生物或治疗靶标结合的小分子药物;(d)不是生物聚合物,如多核苷酸或多糖;(e)在转导时不与所述合成肽穿梭剂共价连接;或(f)(a)至(e)的任何组合。
3.根据项目1或项目2所述的方法,其中非蛋白质负荷是用于治疗癌症(例如,皮肤癌、基底细胞癌、痣样基底细胞癌综合征)、炎症或炎症相关疾病(例如,银屑病、特应性皮炎、溃疡性结肠炎、荨麻疹、干眼病、干性或湿性年龄相关性黄斑变性、手指溃疡、光化性角化病、特发性肺纤维化)、疼痛(例如,慢性或急性)或影响肺的疾病(例如,囊性纤维化、哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)或特发性肺纤维化)的药物。
4.根据项目1至3中任一项所述的方法,其中非蛋白质负荷是或包含刺猬抑制剂(例如,伊曲康唑、泊沙康唑、三氧化二砷(ATO)、Gant61、PF-4708671、HPI-1、HPI-4)、疼痛抑制剂如电压门控钠(Nav)通道抑制剂(例如,QX-314)和/或炎症的抑制剂(例如,炎性细胞因子产生的抑制剂或NF-κB途径抑制剂)。
5.根据项目1至4中任一项所述的方法,其中所述穿梭剂是:(1)长度为至少20个氨基酸的肽,所述肽包含(2)两亲性α-螺旋基序,其具有(3)带正电的亲水外表面和疏水外表面,其中遵守以下参数(4)至(15)中的至少五个:(4)基于每圈具有3.6个残基的α-螺旋的开放圆柱形表示,所述疏水外表面包含由空间上相邻的L、I、F、V、W和/或M氨基酸组成的高疏水核心,所述氨基酸占所述肽的氨基酸的12%至50%;(5)所述肽具有3.5至11的疏水力矩(μ);(6)所述肽在生理pH下具有至少+4的预测净电荷;(7)所述肽具有8至13的等电点(pI);(8)所述肽由35%至65%的如下氨基酸的任何组合构成:A、C、G、I、L、M、F、P、W、Y和V;(9)所述肽由0%至30%的如下氨基酸的任何组合构成:N、Q、S和T;(10)所述肽由35%至85%的如下氨基酸的任何组合构成:A、L、K或R;(11)所述肽由15%至45%的如下氨基酸的任何组合构成:A和L,前提是所述肽中存在至少5%的L;(12)所述肽由20%至45%的如下氨基酸的任何组合构成:K和R;(13)所述肽由0%至10%的如下氨基酸的任何组合构成:D和E;(14)所述肽中A和L残基的百分比(A+L%)与所述肽中K和R残基的百分比(K+R)之间的差小于或等于10%;以及(15)所述肽由10%至45%的如下氨基酸的任何组合构成:Q、Y、W、P、I、S、G、V、F、E、D、C、M、N、T和H。
6.根据项目5所述的方法,其中:(a)所述穿梭剂遵守参数(4)至(15)中的至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少十一个,或遵守其全部;(b)所述穿梭剂是具有20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸的最小长度和40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、60、65、70、80、90、100、110、120、130、140或150个氨基酸的最大长度的肽;(c)所述两亲性α-螺旋基序具有在3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0的下限与9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9或11.0的上限之间的疏水力矩(μ);(d)所述两亲性α-螺旋基序包含带正电的亲水外表面,基于连续氨基酸之间的旋转角为100度的α-螺旋和/或每圈具有3.6个残基的α-螺旋,所述带正电的亲水外表面包含:(i)在螺旋轮投影时的至少两个、三个或四个相邻的带正电的K和/或R残基;和/或(ii)在螺旋轮投影时的包含三至五个K和/或R残基的六个相邻残基的区段;(e)所述两亲性α-螺旋基序包含疏水外表面,基于连续氨基酸之间的旋转角为100度的α-螺旋和/或每圈具有3.6个残基的α-螺旋,所述疏水外表面包含:(i)在螺旋轮投影时的至少两个相邻L残基;和/或(ii)在螺旋轮投影时的包含选自L、I、F、V、W和M的至少五个疏水残基的十个相邻残基的区段;(f)所述疏水外表面包含高疏水核心,所述高疏水核心由空间上相邻的L、I、F、V、W和/或M氨基酸组成,所述氨基酸占所述穿梭剂的氨基酸的从12.5%、13%、13.5%、14%、14.5%、15%、15.5%、16%、16.5%、17%、17.5%、18%、18.5%、19%、19.5%或20%至25%、30%、35%、40%或45%;(g)所述穿梭剂具有在4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0的下限与9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.1、10.2、10.3、10.4或10.5的上限之间的疏水力矩(μ);(h)所述穿梭剂具有在+4、+5、+6、+7、+8、+9至+10、+11、+12、+13、+14或+15之间的预测净电荷;(i)所述穿梭剂具有10至13的预测pI;或(j)(a)至(i)的任何组合。
7.根据项目1至6中任一项所述的方法,其中所述穿梭剂遵守以下参数中的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个或全部:(8)所述穿梭剂由36%至64%、37%至63%、38%至62%、39%至61%或40%至60%的如下氨基酸的任何组合构成:A、C、G、I、L、M、F、P、W、Y和V;(9)所述穿梭剂由1%至29%、2%至28%、3%至27%、4%至26%、5%至25%、6%至24%、7%至23%、8%至22%、9%至21%或10%至20%的如下氨基酸的任何组合构成:N、Q、S和T;(10)所述穿梭剂由36%至80%、37%至75%、38%至70%、39%至65%或40%至60%的如下氨基酸的任何组合构成:A、L、K或R;(11)所述穿梭剂由15%至40%、20%至40%、20至35%或20至30%的如下氨基酸的任何组合构成:A和L;(12)所述穿梭剂由20%至40%、20%至35%或20%至30%的如下氨基酸的任何组合构成:K和R;(13)所述穿梭剂由5%至10%的如下氨基酸的任何组合构成:D和E;(14)所述穿梭剂中A和L残基的百分比(A+L%)与所述穿梭剂中K和R残基的百分比(K+R)之间的差小于或等于9%、8%、7%、6%或5%;以及(15)所述穿梭剂由15%至40%、20%至35%或20%至30%的如下氨基酸的任何组合构成:Q、Y、W、P、I、S、G、V、F、E、D、C、M、N、T和H。
8.根据项目1至7中任一项所述的方法,其中所述穿梭剂包含富含组氨酸的结构域,任选地其中所述富含组氨酸的结构域:(i)朝向所述穿梭剂的N末端和/或C末端定位;(ii)是包含至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%或至少90%组氨酸残基的至少3、至少4、至少5或至少6个氨基酸的延伸段;和/或包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8或至少9个连续组氨酸残基;或(iii)(i)和(ii)二者。
9.根据项目1至8中任一项所述的方法,其中所述穿梭剂包含富含丝氨酸和/或甘氨酸残基的柔性接头结构域。
10.根据项目1至9中任一项所述的方法,其中所述穿梭剂包含以下氨基酸序列或由其组成:(a)[X1]-[X2]-[接头]-[X3]-[X4](式1);(b)[X1]-[X2]-[接头]-[X4]-[X3](式2);(c)[X2]-[X1]-[接头]-[X3]-[X4](式3);(d)[X2]-[X1]-[接头]-[X4]-[X3](式4);(e)[X3]-[X4]-[接头]-[X1]-[X2](式5);(f)[X3]-[X4]-[接头]-[X2]-[X1](式6);(g)[X4]-[X3]-[接头]-[X1]-[X2](式7);或(h)[X4]-[X3]-[接头]-[X2]-[X1](式8),其中[X1]选自:2[Φ]-1[+]-2[Φ]-1[ζ]-1[+]-;2[Φ]-1[+]-2[Φ]-2[+]-;1[+]-1[Φ]-1[+]-2[Φ]-1[ζ]-1[+]-;以及1[+]-1[Φ]-1[+]-2[Φ]-2[+]-;[X2]选自-2[Φ]-1[+]-2[Φ]-2[ζ]-;-2[Φ]-1[+]-2[Φ]-2[+]-;-2[Φ]-1[+]-2[Φ]-1[+]-1[ζ]-;-2[Φ]-1[+]-2[Φ]-1[ζ]-1[+]-;-2[Φ]-2[+]-1[Φ]-2[+]-;-2[Φ]-2[+]-1[Φ]-2[ζ]-;-2[Φ]-2[+]-1[Φ]-1[+]-1[ζ]-;以及-2[Φ]-2[+]-1[Φ]-1[ζ]-1[+]-;[X3]选自-4[+]-A-;-3[+]-G-A-;-3[+]-A-A-;-2[+]-1[Φ]-1[+]-A-;-2[+]-1[Φ]-G-A-;-2[+]-1[Φ]-A-A-;或-2[+]-A-1[+]-A;-2[+]-A-G-A;-2[+]-A-A-A-;-1[Φ]-3[+]-A-;-1[Φ]-2[+]-G-A-;-1[Φ]-2[+]-A-A-;-1[Φ]-1[+]-1[Φ]-1[+]-A;-1[Φ]-1[+]-1[Φ]-G-A;-1[Φ]-1[+]-1[Φ]-A-A;-1[Φ]-1[+]-A-1[+]-A;-1[Φ]-1[+]-A-G-A;-1[Φ]-1[+]-A-A-A;-A-1[+]-A-1[+]-A;-A-1[+]-A-G-A;以及-A-1[+]-A-A-A;[X4]选自-1[ζ]-2A-1[+]-A;-1[ζ]-2A-2[+];-1[+]-2A-1[+]-A;-1[ζ]-2A-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-1[ζ]-A-1[ζ]-A-1[+];-2[+]-A-2[+];-2[+]-A-1[+]-A;-2[+]-A-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-2[+]-1[ζ]-A-1[+];-1[+]-1[ζ]-A-1[+]-A;-1[+]-1[ζ]-A-2[+];-1[+]-1[ζ]-A-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-1[+]-2[ζ]-A-1[+];-1[+]-2[ζ]-2[+];-1[+]-2[ζ]-1[+]-A;-1[+]-2[ζ]-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-1[+]-2[ζ]-1[ζ]-A-1[+];-3[ζ]-2[+];-3[ζ]-1[+]-A;-3[ζ]-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-1[ζ]-2A-1[+]-A;-1[ζ]-2A-2[+];-1[ζ]-2A-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-2[+]-A-1[+]-A;-2[+]-1[ζ]-1[+]-A;-1[+]-1[ζ]-A-1[+]-A;-1[+]-2A-1[+]-1[ζ]-A-1[+];以及-1[ζ]-A-1[ζ]-A-1[+];并且[接头]选自-Gn-;-Sn-;-(GnSn)n-;-(GnSn)nGn-;-(GnSn)nSn-;-(GnSn)nGn(GnSn)n-;以及-(GnSn)nSn(GnSn)n-;其中:[Φ]是氨基酸,其为:Leu、Phe、Trp、Ile、Met、Tyr或Val,优选Leu、Phe、Trp或Ile;[+]是氨基酸,其为:Lys或Arg;[ζ]是氨基酸,其为:Gln、Asn、Thr或Ser;A是氨基酸Ala;G是氨基酸Gly;S是氨基酸Ser;并且n是从1至20、1至19、1至18、1至17、1至16、1至15、1至14、1至13、1至12、1至11、1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至1至4或1至3的整数。
11.根据项目1至10中任一项所述的方法,其中所述穿梭剂包含如下肽或由其组成,所述肽与SEQ ID NO:19-50中任一个的氨基酸序列至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%相同。
12.根据项目1至11中任一项所述的方法,其中所述穿梭剂包含内体渗漏结构域(ELD)和/或细胞穿透结构域(CPD)。
13.根据项目1至12中任一项所述的方法,其中:(i)所述ELD是或来自:内体溶解肽;抗菌肽(AMP);线性阳离子α-螺旋抗菌肽;杀菌肽-A/蜂毒肽杂交(CM)肽;pH依赖性膜活性肽(PAMP);肽两亲物;源自流感血凝素(HA)的HA2亚基的N末端的肽;CM18;白喉毒素T结构域(DT);GALA;PEA;INF-7;LAH4;HGP;H5WYG;HA2;EB1;VSVG;假单胞菌毒素;蜂毒肽;KALA;JST-1;C(LLKK)3C;G(LLKK)3G;或其任何组合;(ii)所述CPD是或来自:细胞穿透肽或来自细胞穿透肽的蛋白质转导结构域;TAT;PTD4;穿膜肽;pVEC;M918;Pep-1;Pep-2;Xentry;精氨酸延伸段;转运素;SynB1;SynB3;或其任何组合;或(iii)(i)和(ii)二者。
14.根据项目1至13中任一项所述的方法,其中所述穿梭剂是环肽和/或包含一种或多种D-氨基酸。
15.根据项目1至14中任一项所述的方法,所述方法是体外方法,如用于治疗和/或诊断目的。
16.根据项目1至14中任一项所述的方法,所述方法是体内方法,如用于治疗和/或诊断目的。
17.根据项目16所述的方法,所述方法包括所述非蛋白质负荷和所述合成肽穿梭剂的局部、肠内/胃肠道(例如,口服)或肠胃外施用。
18.一种用于将非蛋白质负荷转导至靶真核细胞中的组合物,所述组合物包含用药学上合适的赋形剂配制的合成肽穿梭剂,其中与不存在所述合成肽穿梭剂的情况相比,所述组合物中的所述合成肽穿梭剂的浓度足以在施用后增加所述非蛋白质负荷向所述靶真核细胞中的转导效率和胞质溶胶递送。
19.根据项目17所述的组合物,所述组合物还包含所述非蛋白质负荷。
20.根据项目18或19所述的组合物,其中:(a)所述合成肽穿梭剂是根据项目1或5至14中任一项所述的;(b)所述非蛋白质负荷是根据项目2至4中任一项所述的;(c)所述组合物用于根据项目15至17中任一项所述的体外或体内方法中;或(d)(a)至(c)的任何组合。
21.一种用于根据项目1至17中任一项所述的方法的试剂盒,所述试剂盒包含根据项目1或5至14中任一项所述的合成肽穿梭剂以及根据项目2至4中任一项所述的非蛋白质负荷。
22.根据项目1至17中任一项所述的方法、根据项目18至20中任一项所述的组合物或根据项目21所述的试剂盒,其中所述靶真核细胞是动物细胞、哺乳动物细胞、人细胞、干细胞、原代细胞、免疫细胞、T细胞、NK细胞、树突状细胞、上皮细胞、皮肤细胞或胃肠道细胞。
23.一种对蛋白质和非蛋白质负荷二者均具有转导活性的合成肽穿梭剂,所述穿梭剂包含与SEQ ID NO:19-50中任一个至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%相同的氨基酸序列。
24.根据项目23所述的合成肽穿梭剂,所述合成肽穿梭剂是根据项目5至13中任一项所述的穿梭剂。
项目II
在一些方面,此处描述了以下项目中的一个或多个:
1.一种用于非蛋白质负荷转导的方法,所述方法包括使靶真核细胞与非蛋白质负荷和一定浓度的合成肽穿梭剂接触,与不存在所述合成肽穿梭剂的情况相比,所述浓度的合成肽穿梭剂足以增加所述非蛋白质负荷的转导效率。
2.根据项目1所述的方法,其中所述非蛋白质负荷:(a)是有机化合物;(b)具有小于10 000、9000、8000、7000、6000、5000、4000、3000、2000或1000Da、或在50至5000、50至4000、50至3000、50至2000或50至1000Da之间的分子量;(c)是小分子,如与细胞内生物或治疗靶标结合的小分子药物;(d)不是生物聚合物,如多核苷酸或多糖;(e)在转导时不与所述合成肽穿梭剂共价连接;或(f)(a)至(e)的任何组合。
3.根据项目1或项目2所述的方法,其中非蛋白质负荷是用于治疗癌症(例如,皮肤癌、基底细胞癌、痣样基底细胞癌综合征)、炎症或炎症相关疾病(例如,银屑病、特应性皮炎、溃疡性结肠炎、荨麻疹、干眼病、干性或湿性年龄相关性黄斑变性、手指溃疡、光化性角化病、特发性肺纤维化)、疼痛(例如,慢性或急性)或影响肺的疾病(例如,囊性纤维化、哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)或特发性肺纤维化)的药物。
4.根据项目1至3中任一项所述的方法,其中非蛋白质负荷是或包含刺猬抑制剂(例如,伊曲康唑、泊沙康唑、三氧化二砷(ATO)、Gant61、PF-4708671、HPI-1、HPI-4)、疼痛抑制剂如电压门控钠(Nav)通道抑制剂(例如,QX-314)和/或炎症的抑制剂(例如,炎性细胞因子产生的抑制剂或NF-κB途径抑制剂)。
5.根据项目1至4中任一项所述的方法,其中所述穿梭剂是:(1)长度为至少20个氨基酸的肽,所述肽包含(2)两亲性α-螺旋基序,其具有(3)带正电的亲水外表面和疏水外表面,其中遵守以下参数(4)至(15)中的至少五个:(4)基于每圈具有3.6个残基的α-螺旋的开放圆柱形表示,所述疏水外表面包含由空间上相邻的L、I、F、V、W和/或M氨基酸组成的高疏水核心,所述氨基酸占所述肽的氨基酸的12%至50%;(5)所述肽具有3.5至11的疏水力矩(μ);(6)所述肽在生理pH下具有至少+4的预测净电荷;(7)所述肽具有8至13的等电点(pI);(8)所述肽由35%至65%的如下氨基酸的任何组合构成:A、C、G、I、L、M、F、P、W、Y和V;(9)所述肽由0%至30%的如下氨基酸的任何组合构成:N、Q、S和T;(10)所述肽由35%至85%的如下氨基酸的任何组合构成:A、L、K或R;(11)所述肽由15%至45%的如下氨基酸的任何组合构成:A和L,前提是所述肽中存在至少5%的L;(12)所述肽由20%至45%的如下氨基酸的任何组合构成:K和R;(13)所述肽由0%至10%的如下氨基酸的任何组合构成:D和E;(14)所述肽中A和L残基的百分比(A+L%)与所述肽中K和R残基的百分比(K+R)之间的差小于或等于10%;以及(15)所述肽由10%至45%的如下氨基酸的任何组合构成:Q、Y、W、P、I、S、G、V、F、E、D、C、M、N、T和H。
6.根据项目5所述的方法,其中:(a)所述穿梭剂遵守参数(4)至(15)中的至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少十一个,或遵守其全部;(b)所述穿梭剂是具有20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸的最小长度和40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、60、65、70、80、90、100、110、120、130、140或150个氨基酸的最大长度的肽;(c)所述两亲性α-螺旋基序具有在3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0的下限与9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9或11.0的上限之间的疏水力矩(μ);(d)所述两亲性α-螺旋基序包含带正电的亲水外表面,基于连续氨基酸之间的旋转角为100度的α-螺旋和/或每圈具有3.6个残基的α-螺旋,所述带正电的亲水外表面包含:(i)在螺旋轮投影时的至少两个、三个或四个相邻的带正电的K和/或R残基;和/或(ii)在螺旋轮投影时的包含三至五个K和/或R残基的六个相邻残基的区段;(e)所述两亲性α-螺旋基序包含疏水外表面,基于连续氨基酸之间的旋转角为100度的α-螺旋和/或每圈具有3.6个残基的α-螺旋,所述疏水外表面包含:(i)在螺旋轮投影时的至少两个相邻L残基;和/或(ii)在螺旋轮投影时的包含选自L、I、F、V、W和M的至少五个疏水残基的十个相邻残基的区段;(f)所述疏水外表面包含高疏水核心,所述高疏水核心由空间上相邻的L、I、F、V、W和/或M氨基酸组成,所述氨基酸占所述穿梭剂的氨基酸的从12.5%、13%、13.5%、14%、14.5%、15%、15.5%、16%、16.5%、17%、17.5%、18%、18.5%、19%、19.5%或20%至25%、30%、35%、40%或45%;(g)所述穿梭剂具有在4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0的下限与9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.1、10.2、10.3、10.4或10.5的上限之间的疏水力矩(μ);(h)所述穿梭剂具有在+4、+5、+6、+7、+8、+9至+10、+11、+12、+13、+14或+15之间的预测净电荷;(i)所述穿梭剂具有10至13的预测pI;或(j)(a)至(i)的任何组合。
7.根据项目1至6中任一项所述的方法,其中所述穿梭剂遵守以下参数中的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个或全部:(8)所述穿梭剂由36%至64%、37%至63%、38%至62%、39%至61%或40%至60%的如下氨基酸的任何组合构成:A、C、G、I、L、M、F、P、W、Y和V;(9)所述穿梭剂由1%至29%、2%至28%、3%至27%、4%至26%、5%至25%、6%至24%、7%至23%、8%至22%、9%至21%或10%至20%的如下氨基酸的任何组合构成:N、Q、S和T;(10)所述穿梭剂由36%至80%、37%至75%、38%至70%、39%至65%或40%至60%的如下氨基酸的任何组合构成:A、L、K或R;(11)所述穿梭剂由15%至40%、20%至40%、20%至35%或20%至30%的如下氨基酸的任何组合构成:A和L;(12)所述穿梭剂由20%至40%、20%至35%或20%至30%的如下氨基酸的任何组合构成:K和R;(13)所述穿梭剂由5%至10%的如下氨基酸的任何组合构成:D和E;(14)所述穿梭剂中A和L残基的百分比(A+L%)与所述穿梭剂中K和R残基的百分比(K+R)之间的差小于或等于9%、8%、7%、6%或5%;以及(15)所述穿梭剂由15%至40%、20%至35%或20%至30%的如下氨基酸的任何组合构成:Q、Y、W、P、I、S、G、V、F、E、D、C、M、N、T和H。
8.根据项目1至7中任一项所述的方法,其中所述穿梭剂包含富含组氨酸的结构域,任选地其中所述富含组氨酸的结构域:(i)朝向所述穿梭剂的N末端和/或C末端定位;(ii)是包含至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%或至少90%组氨酸残基的至少3、至少4、至少5或至少6个氨基酸的延伸段;和/或包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8或至少9个连续组氨酸残基;或(iii)(i)和(ii)二者。
9.根据项目1至8中任一项所述的方法,其中所述穿梭剂包含富含丝氨酸和/或甘氨酸残基的柔性接头结构域。
10.根据项目1至9中任一项所述的方法,其中所述穿梭剂包含以下氨基酸序列或由其组成:(a)[X1]-[X2]-[接头]-[X3]-[X4](式1);(b)[X1]-[X2]-[接头]-[X4]-[X3](式2);(c)[X2]-[X1]-[接头]-[X3]-[X4](式3);(d)[X2]-[X1]-[接头]-[X4]-[X3](式4);(e)[X3]-[X4]-[接头]-[X1]-[X2](式5);(f)[X3]-[X4]-[接头]-[X2]-[X1](式6);(g)[X4]-[X3]-[接头]-[X1]-[X2](式7);或(h)[X4]-[X3]-[接头]-[X2]-[X1](式8),其中[X1]选自:2[Φ]-1[+]-2[Φ]-1[ζ]-1[+]-;2[Φ]-1[+]-2[Φ]-2[+]-;1[+]-1[Φ]-1[+]-2[Φ]-1[ζ]-1[+]-;以及1[+]-1[Φ]-1[+]-2[Φ]-2[+]-;[X2]选自-2[Φ]-1[+]-2[Φ]-2[ζ]-;-2[Φ]-1[+]-2[Φ]-2[+]-;-2[Φ]-1[+]-2[Φ]-1[+]-1[ζ]-;-2[Φ]-1[+]-2[Φ]-1[ζ]-1[+]-;-2[Φ]-2[+]-1[Φ]-2[+]-;-2[Φ]-2[+]-1[Φ]-2[ζ]-;-2[Φ]-2[+]-1[Φ]-1[+]-1[ζ]-;以及-2[Φ]-2[+]-1[Φ]-1[ζ]-1[+]-;[X3]选自-4[+]-A-;-3[+]-G-A-;-3[+]-A-A-;-2[+]-1[Φ]-1[+]-A-;-2[+]-1[Φ]-G-A-;-2[+]-1[Φ]-A-A-;或-2[+]-A-1[+]-A;-2[+]-A-G-A;-2[+]-A-A-A-;-1[Φ]-3[+]-A-;-1[Φ]-2[+]-G-A-;-1[Φ]-2[+]-A-A-;-1[Φ]-1[+]-1[Φ]-1[+]-A;-1[Φ]-1[+]-1[Φ]-G-A;-1[Φ]-1[+]-1[Φ]-A-A;-1[Φ]-1[+]-A-1[+]-A;-1[Φ]-1[+]-A-G-A;-1[Φ]-1[+]-A-A-A;-A-1[+]-A-1[+]-A;-A-1[+]-A-G-A;以及-A-1[+]-A-A-A;[X4]选自-1[ζ]-2A-1[+]-A;-1[ζ]-2A-2[+];-1[+]-2A-1[+]-A;-1[ζ]-2A-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-1[ζ]-A-1[ζ]-A-1[+];-2[+]-A-2[+];-2[+]-A-1[+]-A;-2[+]-A-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-2[+]-1[ζ]-A-1[+];-1[+]-1[ζ]-A-1[+]-A;-1[+]-1[ζ]-A-2[+];-1[+]-1[ζ]-A-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-1[+]-2[ζ]-A-1[+];-1[+]-2[ζ]-2[+];-1[+]-2[ζ]-1[+]-A;-1[+]-2[ζ]-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-1[+]-2[ζ]-1[ζ]-A-1[+];-3[ζ]-2[+];-3[ζ]-1[+]-A;-3[ζ]-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-1[ζ]-2A-1[+]-A;-1[ζ]-2A-2[+];-1[ζ]-2A-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-2[+]-A-1[+]-A;-2[+]-1[ζ]-1[+]-A;-1[+]-1[ζ]-A-1[+]-A;-1[+]-2A-1[+]-1[ζ]-A-1[+];以及-1[ζ]-A-1[ζ]-A-1[+];并且[接头]选自-Gn-;-Sn-;-(GnSn)n-;-(GnSn)nGn-;-(GnSn)nSn-;-(GnSn)nGn(GnSn)n-;以及-(GnSn)nSn(GnSn)n-;其中:[Φ]是氨基酸,其为:Leu、Phe、Trp、Ile、Met、Tyr或Val,优选Leu、Phe、Trp或Ile;[+]是氨基酸,其为:Lys或Arg;[ζ]是氨基酸,其为:Gln、Asn、Thr或Ser;A是氨基酸Ala;G是氨基酸Gly;S是氨基酸Ser;并且n是从1至20、1至19、1至18、1至17、1至16、1至15、1至14、1至13、1至12、1至11、1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至1至4或1至3的整数。
11.根据项目1至10中任一项所述的方法,其中所述穿梭剂包含以下氨基酸序列或由其组成:SEQ ID NO:1至50中任一个的氨基酸序列;与SEQ ID NO:1至50中任一个相差不多于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸(例如,排除任何接头结构域)的氨基酸序列;或与SEQ ID NO:1至50中任一个至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同(例如,排除任何接头结构域计算的)的氨基酸序列。
12.根据项目1至10中任一项所述的方法,其中所述穿梭剂包含以下氨基酸序列或由其组成:SEQ ID NO:1至50、58至78、80至107、109至139、141至146、149至161、163至169、171、174至234、236至240、242至260、262至285、287至294、296至300、302至308、310、311、313至324、326至332、338至342、或344中任一个的氨基酸序列;与SEQ ID NO:1至50、58至78、80至107、109至139、141至146、149至161、163至169、171、174至234、236至240、242至260、262至285、287至294、296至300、302至308、310、311、313至324、326至332、338至342、或344中任一个相差不多于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸(例如,排除任何接头结构域)的氨基酸序列;或与SEQ ID NO:1至50、58至78、80至107、109至139、141至146、149至161、163至169、171、174至234、236至240、242至260、262至285、287至294、296至300、302至308、310、311、313至324、326至332、338至342、或344中任一个至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同(例如,排除任何接头结构域计算的)的氨基酸序列。
13.根据项目1至12中任一项所述的方法,其中所述穿梭剂包含内体渗漏结构域(ELD)和/或细胞穿透结构域(CPD)。
14.根据项目1至13中任一项所述的方法,其中:(i)所述ELD是或来自:内体溶解肽;抗菌肽(AMP);线性阳离子α-螺旋抗菌肽;杀菌肽-A/蜂毒肽杂交(CM)肽;pH依赖性膜活性肽(PAMP);肽两亲物;源自流感血凝素(HA)的HA2亚基的N末端的肽;CM18;白喉毒素T结构域(DT);GALA;PEA;INF-7;LAH4;HGP;H5WYG;HA2;EB1;VSVG;假单胞菌毒素;蜂毒肽;KALA;JST-1;C(LLKK)3C;G(LLKK)3G;或其任何组合;(ii)所述CPD是或来自:细胞穿透肽或来自细胞穿透肽的蛋白质转导结构域;TAT;PTD4;穿膜肽;pVEC;M918;Pep-1;Pep-2;Xentry;精氨酸延伸段;转运素;SynB1;SynB3;或其任何组合;或(iii)(i)和(ii)二者。
15.根据项目1至14中任一项所述的方法,其中所述穿梭剂是环肽和/或包含一种或多种D-氨基酸。
16.根据项目1至15中任一项所述的方法,其中在适合于评估所述靶真核细胞中的负荷转导的真核细胞系模型(例如,HeLa)中,所述穿梭剂使碘化丙啶或其他膜不可渗透的荧光DNA嵌入剂的转导效率相比于缺乏所述穿梭剂的相应阴性对照增加至少3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10倍,和/或能够实现碘化丙啶或其他膜不可渗透的荧光DNA嵌入剂的至少10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%或60%的转导效率(例如,如通过流式细胞术所测定)。
17.根据项目1至16中任一项所述的方法,其中在适合于评估所述靶真核细胞中的负荷转导的真核细胞系模型(例如,HeLa)中,所述穿梭剂使GFP-NLS的转导效率相比于缺乏所述穿梭剂的相应阴性对照增加至少3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10倍,和/或能够实现GFP-NLS的至少7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%或60%的转导效率(例如,如通过流式细胞术所测定)。
18.根据项目1至17中任一项所述的方法,其中所述穿梭剂还包含对一个或多个氨基酸的化学修饰,其中所述化学修饰不破坏所述合成肽穿梭剂的转导活性。
19.根据项目18所述的方法,其中所述化学修饰是在所述穿梭剂的N和/或C末端。
20.根据项目18或19所述的方法,其中所述化学修饰是添加乙酰基基团(例如,N末端乙酰基基团)、半胱酰胺基团(例如,C末端半胱酰胺基团)或脂肪酸(例如,C4-C16脂肪酸,优选N末端)。
21.根据项目1至20中任一项所述的方法,所述方法是体外方法,如用于治疗和/或诊断目的。
22.根据项目1至20中任一项所述的方法,所述方法是体内方法,如用于治疗和/或诊断目的。
23.根据项目22所述的方法,所述方法包括所述非蛋白质负荷和所述合成肽穿梭剂的局部、肠内/胃肠道(例如,口服)或肠胃外施用。
24.一种用于将非蛋白质负荷转导至靶真核细胞中的组合物,所述组合物包含用药学上合适的赋形剂配制的合成肽穿梭剂,其中与不存在所述合成肽穿梭剂的情况相比,所述组合物中的所述合成肽穿梭剂的浓度足以在施用后增加所述非蛋白质负荷向所述靶真核细胞中的转导效率和胞质溶胶和/或细胞核递送。
25.根据项目24所述的组合物,所述组合物还包含所述非蛋白质负荷。
26.一种用于疗法的组合物,所述组合物包含与有待于通过合成肽穿梭剂转导至靶真核细胞中的非蛋白质负荷一起配制的所述合成肽穿梭剂,其中与不存在所述合成肽穿梭剂的情况相比,所述组合物中的所述合成肽穿梭剂的浓度足以在施用后增加所述非蛋白质负荷向所述靶真核细胞中的转导效率和胞质溶胶和/或细胞核递送。
27.根据项目24至26中任一项所述的组合物,其中:(a)所述合成肽穿梭剂是根据项目1或5至20中任一项所述的;(b)所述非蛋白质负荷是根据项目2至4中任一项所述的;(c)所述组合物用于根据项目21至23中任一项所述的体外或体内方法中;或(d)(a)至(c)的任何组合。
28.一种用于根据项目1至23中任一项所述的方法的试剂盒,所述试剂盒包含根据项目1或5至20中任一项所述的合成肽穿梭剂以及根据项目2至4中任一项所述的非蛋白质负荷。
29.根据项目1至23中任一项所述的方法、根据项目24至27中任一项所述的组合物或根据项目28所述的试剂盒,其中所述靶真核细胞是动物细胞、哺乳动物细胞、人细胞、干细胞、原代细胞、免疫细胞、T细胞、NK细胞、树突状细胞、上皮细胞、皮肤细胞或胃肠道细胞。
30.一种对蛋白质和非蛋白质负荷二者均具有转导活性的合成肽穿梭剂,所述穿梭剂包含以下氨基酸序列或由其组成:SEQ ID NO:19至50中任一个的氨基酸序列;与SEQIDNO:19至50中任一个相差不多于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸(例如,排除任何接头结构域)的氨基酸序列;或与SEQ ID NO:19至50中任一个至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同(例如,排除任何接头结构域计算的)的氨基酸序列。
31.根据项目30所述的合成肽穿梭剂,所述合成肽穿梭剂是根据项目5至20中任一项所述的穿梭剂。
32.一种在靶真核细胞中对蛋白质和非蛋白质负荷二者均具有转导活性的合成肽穿梭剂,所述穿梭剂是:(1)长度为至少17、18、19或20个氨基酸的肽,所述肽包含(2)两亲性α-螺旋基序,其具有(3)带正电的亲水外表面和疏水外表面,其中遵守以下参数(4)至(15)中的至少五个:(4)基于每圈具有3.6个残基的α-螺旋的开放圆柱形表示,所述疏水外表面包含由空间上相邻的L、I、F、V、W和/或M氨基酸组成的高疏水核心,所述氨基酸占所述肽的氨基酸的12%至50%;(5)所述肽具有3.5至11的疏水力矩(μ);(6)所述肽在生理pH下具有至少+4的预测净电荷;(7)所述肽具有8至13的等电点(pI);(8)所述肽由35%至65%的如下氨基酸的任何组合构成:A、C、G、I、L、M、F、P、W、Y和V;(9)所述肽由0%至30%的如下氨基酸的任何组合构成:N、Q、S和T;(10)所述肽由35%至85%的如下氨基酸的任何组合构成:A、L、K或R;(11)所述肽由15%至45%的如下氨基酸的任何组合构成:A和L,前提是所述肽中存在至少5%的L;(12)所述肽由20%至45%的如下氨基酸的任何组合构成:K和R;(13)所述肽由0%至10%的如下氨基酸的任何组合构成:D和E;(14)所述肽中A和L残基的百分比(A+L%)与所述肽中K和R残基的百分比(K+R)之间的差小于或等于10%;以及(15)所述肽由10%至45%的如下氨基酸的任何组合构成:Q、Y、W、P、I、S、G、V、F、E、D、C、M、N、T和H,其中在适合于评估所述靶真核细胞中的负荷转导的真核细胞系模型(例如,HeLa)中,所述穿梭剂使碘化丙啶或其他膜不可渗透的荧光DNA嵌入剂的转导效率相比于缺乏所述穿梭剂的相应阴性对照增加至少3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10倍,和/或能够实现碘化丙啶或其他膜不可渗透的荧光DNA嵌入剂的至少10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%或60%的转导效率(例如,如通过流式细胞术所测定)。
33.根据项目32所述的合成肽穿梭剂,其中在适合于评估所述靶真核细胞中的负荷转导的真核细胞系模型(例如,HeLa)中,所述穿梭剂使GFP-NLS的转导效率相比于缺乏所述穿梭剂的相应阴性对照增加至少3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10倍,和/或能够实现GFP-NLS的至少7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%或60%的转导效率(例如,如通过流式细胞术所测定)。
34.根据项目32或33所述的合成肽穿梭剂,其中:(a)所述穿梭剂遵守参数(4)至(15)中的至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少十一个,或遵守其全部;(b)所述穿梭剂是具有17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸的最小长度和40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、60、65、70、80、90、100、110、120、130、140或150个氨基酸的最大长度的肽;(c)所述两亲性α-螺旋基序具有在3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0的下限与9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9或11.0的上限之间的疏水力矩(μ);(d)所述两亲性α-螺旋基序包含带正电的亲水外表面,基于连续氨基酸之间的旋转角为100度的α-螺旋和/或每圈具有3.6个残基的α-螺旋,所述带正电的亲水外表面包含:(i)在螺旋轮投影时的至少两个、三个或四个相邻的带正电的K和/或R残基;和/或(ii)在螺旋轮投影时的包含三至五个K和/或R残基的六个相邻残基的区段;(e)所述两亲性α-螺旋基序包含疏水外表面,基于连续氨基酸之间的旋转角为100度的α-螺旋和/或每圈具有3.6个残基的α-螺旋,所述疏水外表面包含:(i)在螺旋轮投影时的至少两个相邻L残基;和/或(ii)在螺旋轮投影时的包含选自L、I、F、V、W和M的至少五个疏水残基的十个相邻残基的区段;(f)所述疏水外表面包含高疏水核心,所述高疏水核心由空间上相邻的L、I、F、V、W和/或M氨基酸组成,所述氨基酸占所述穿梭剂的氨基酸的从12.5%、13%、13.5%、14%、14.5%、15%、15.5%、16%、16.5%、17%、17.5%、18%、18.5%、19%、19.5%或20%至25%、30%、35%、40%或45%;(g)所述穿梭剂具有在4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0的下限与9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.1、10.2、10.3、10.4或10.5的上限之间的疏水力矩(μ);(h)所述穿梭剂具有在+4、+5、+6、+7、+8、+9至+10、+11、+12、+13、+14或+15之间的预测净电荷;(i)所述穿梭剂具有10至13的预测pI;或(j)(a)至(i)的任何组合。
35.根据项目32至34中任一项所述的合成肽穿梭剂,其中所述穿梭剂遵守以下参数中的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个或全部:(8)所述穿梭剂由36%至64%、37%至63%、38%至62%、39%至61%或40%至60%的如下氨基酸的任何组合构成:A、C、G、I、L、M、F、P、W、Y和V;(9)所述穿梭剂由1%至29%、2%至28%、3%至27%、4%至26%、5%至25%、6%至24%、7%至23%、8%至22%、9%至21%或10%至20%的如下氨基酸的任何组合构成:N、Q、S和T;(10)所述穿梭剂由36%至80%、37%至75%、38%至70%、39%至65%或40%至60%的如下氨基酸的任何组合构成:A、L、K或R;(11)所述穿梭剂由15%至40%、20%至40%、20至35%或20至30%的如下氨基酸的任何组合构成:A和L;(12)所述穿梭剂由20%至40%、20%至35%或20%至30%的如下氨基酸的任何组合构成:K和R;(13)所述穿梭剂由5%至10%的如下氨基酸的任何组合构成:D和E;(14)所述穿梭剂中A和L残基的百分比(A+L%)与所述穿梭剂中K和R残基的百分比(K+R)之间的差小于或等于9%、8%、7%、6%或5%;以及(15)所述穿梭剂由15%至40%、20%至35%或20%至30%的如下氨基酸的任何组合构成:Q、Y、W、P、I、S、G、V、F、E、D、C、M、N、T和H。
36.根据项目32至35中任一项所述的合成肽穿梭剂,其中所述穿梭剂:(i)包含根据项目8所述的富含组氨酸的结构域;(ii)包含根据项目9所述的柔性接头结构域;(iii)是根据项目10至14中任一个所述的穿梭剂;或(iv)(i)至(iii)中的任何组合。
37.根据项目32至36中任一项所述的合成肽穿梭剂,所述合成肽穿梭剂还包含对一个或多个氨基酸的化学修饰,其中所述化学修饰不破坏所述合成肽穿梭剂的转导活性。
38.根据项目37所述的合成肽穿梭剂,其中所述化学修饰是在所述穿梭剂的N和/或C末端。
39.根据项目37或38所述的合成肽穿梭剂,其中所述化学修饰是添加乙酰基基团(例如,N末端乙酰基基团)、半胱酰胺基团(例如,C末端半胱酰胺基团)或脂肪酸(例如,C4-C16脂肪酸,优选N末端)。
40.根据项目32至39中任一项所述的合成肽穿梭剂,其中所述穿梭剂包含以下氨基酸序列或由其组成:SEQ ID NO:1至50、58至78、80至107、109至139、141至146、149至161、163至169、171、174至234、236至240、242至260、262至285、287至294、296至300、302至308、310、311、313至324、326至332、338至342、或344中任一个的氨基酸序列;与SEQ ID NO:1至50、58至78、80至107、109至139、141至146、149至161、163至169、171、174至234、236至240、242至260、262至285、287至294、296至300、302至308、310、311、313至324、326至332、338至342、或344中任一个相差不多于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸(例如,排除任何接头结构域)的氨基酸序列;或与SEQ ID NO:1至50、58至78、80至107、109至139、141至146、149至161、163至169、171、174至234、236至240、242至260、262至285、287至294、296至300、302至308、310、311、313至324、326至332、338至342、或344中任一个至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同(例如,排除任何接头结构域计算的)的氨基酸序列。
41.一种在靶真核细胞中对蛋白质和非蛋白质负荷二者均具有转导活性的合成肽穿梭剂,其中所述穿梭剂包含以下氨基酸序列或由其组成:(a)SEQ ID NO:1至50、58至78、80至107、109至139、141至146、149至161、163至169、171、174至234、236至240、242至260、262至285、287至294、296至300、302至308、310、311、313至324、326至332、338至342、或344中任一个的氨基酸序列;或(b)与SEQ ID NO:1至50、58至78、80至107、109至139、141至146、149至161、163至169、171、174至234、236至240、242至260、262至285、287至294、296至300、302至308、310、311、313至324、326至332、338至342、或344中任一个仅相差保守氨基酸取代(例如,相差不多于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守氨基酸取代,优选排除任何接头结构域)的氨基酸序列,其中在适合于评估所述靶真核细胞中的负荷转导的真核细胞系模型(例如,HeLa)中,穿梭剂使碘化丙啶或其他膜不可渗透的荧光DNA嵌入剂的转导效率相比于缺乏所述穿梭剂的相应阴性对照增加至少3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10倍;和/或能够实现碘化丙啶或其他膜不可渗透的荧光DNA嵌入剂的至少10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%或60%的转导效率(例如,如通过流式细胞术所测定)。
42.根据项目41所述的合成肽穿梭剂,所述合成肽穿梭剂是根据项目32至39中任一项所述的合成肽穿梭剂。
43.一种在靶真核细胞中具有蛋白质负荷转导活性的合成肽穿梭剂,其中所述穿梭剂包含以下氨基酸序列或由其组成:(a)SEQ ID NO:52、57、79、108、140、147、148、173、241、261、286、295、301、309、312、325、333-337或343中任一个的氨基酸序列;或(b)与SEQID NO:52、57、79、108、140、147、148、173、241、261、286、295、301、309、312、325、333-337或343中任一个仅相差保守氨基酸取代(例如,相差不多于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守氨基酸取代,优选排除任何接头结构域)的氨基酸序列,其中在适合于评估所述靶真核细胞中的负荷转导的真核细胞系模型(例如,HeLa)中,穿梭剂使GFP-NLS的转导效率相比于缺乏所述穿梭剂的相应阴性对照增加至少3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10倍,和/或能够实现GFP-NLS的至少7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%或30%的转导效率(例如,如通过流式细胞术所测定)。
44.根据项目41至43中任一项所述的合成肽穿梭剂,其中每个保守氨基酸取代选自同一氨基酸类别内的氨基酸,所述氨基酸类别是:脂肪族:G、A、V、L和I;含羟基或硫/硒:S、C、U、T和M;芳香族:F、Y和W;碱性:H、K和R;酸性及其酰胺:D、E、N和Q。
45.一种在靶真核细胞中对蛋白质和/或非蛋白质负荷具有转导活性的合成肽穿梭剂变体,所述合成肽穿梭剂变体与根据项目32至44中任一项所述的合成肽穿梭剂相同,不同的是至少一个氨基酸被替代为含有与被替代氨基酸具有相似生理化学特性(例如,结构、疏水或电荷)的侧链的相应合成氨基酸,其中与不存在所述穿梭剂变体的情况相比,所述穿梭剂变体增加所述负荷在所述靶真核细胞中的转导效率。
46.根据项目45所述的合成肽穿梭剂变体,其中所述合成氨基酸替代:
(a)用以下任一种替代碱性氨基酸:α-氨基甘氨酸、α,γ-二氨基丁酸、鸟氨酸、α,β-二氨基丙酸、2,6-二氨基-4-己炔酸、β-(1-哌嗪基)-丙氨酸、4,5-脱氢-赖氨酸、δ-羟基赖氨酸、ω,ω-二甲基精氨酸、高精氨酸、ω,ω'-二甲基精氨酸、ω-甲基精氨酸、β-(2-喹啉基)-丙氨酸、4-氨基哌啶-4-甲酸、α-甲基组氨酸、2,5-二碘组氨酸、1-甲基组氨酸、3-甲基组氨酸、菠菜素、4-氨基苯丙氨酸、3-氨基酪氨酸、β-(2-吡啶基)-丙氨酸或β-(3-吡啶基)-丙氨酸;
(b)用以下任一种替代非极性(疏水)氨基酸:脱氢丙氨酸、β-氟丙氨酸、β-氯丙氨酸、β-碘丙氨酸、α-氨基丁酸、α-氨基异丁酸、β-环丙基丙氨酸、氮杂环丁烷-2-甲酸、α-烯丙基甘氨酸、炔丙基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、β-(2-噻唑基)-丙氨酸、硫代脯氨酸、3,4-脱氢脯氨酸、叔丁基甘氨酸、β-环戊基丙氨酸、β-环己基丙氨酸、α-甲基脯氨酸、戊氨酸、α-甲基缬氨酸、青霉胺、β,β-二环己基丙氨酸、4-氟脯氨酸、1-氨基环戊烷甲酸、哌可酸、4,5-脱氢亮氨酸、别异亮氨酸、正亮氨酸、α-甲基亮氨酸、环己基甘氨酸、顺式八氢吲哚-β-2-甲酸、β-(2-噻吩基)-丙氨酸、苯基甘氨酸、α-甲基苯丙氨酸、高苯丙氨酸、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸、β-(3-苯并噻吩基)-丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、4-溴苯丙氨酸、4-叔丁基苯丙氨酸、α-甲基色氨酸、β-(2-萘基)-丙氨酸、β-(1-萘基)-丙氨酸、4-碘苯丙氨酸、3-氟苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、4-甲基色氨酸、4-氯苯丙氨酸、3,4-二氯-苯丙氨酸、2,6-二氟-苯丙氨酸、n-in-甲基色氨酸、1,2,3,4-四氢去甲哈尔满-3-甲酸、β,β-二苯丙氨酸、4-甲基苯丙氨酸、4-苯基苯丙氨酸、2,3,4,5,6-五氟-苯丙氨酸或4-苯甲酰基苯丙氨酸;
(c)用以下任一种替代极性不带电的氨基酸:β-氰基丙氨酸、β-脲基丙氨酸、高半胱氨酸、别苏氨酸、焦谷氨酸、2-氧代噻唑烷-4-甲酸、瓜氨酸、硫代瓜氨酸、高瓜氨酸、羟脯氨酸、3,4-二羟基苯丙氨酸、β-(1,2,4-三唑-1-基)-丙氨酸、2-巯基组氨酸、β-(3,4-二羟基苯基)-丝氨酸、β-(2-噻吩基)-丝氨酸、4-叠氮基苯丙氨酸、4-氰基苯丙氨酸、3-羟基甲基酪氨酸、3-碘酪氨酸、3-硝基酪氨酸、3,5-二硝基酪氨酸、3,5-二溴酪氨酸、3,5-二碘酪氨酸、7-羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸、5-羟色氨酸、甲状腺原氨酸、β-(7-甲氧基香豆素-4-基)-丙氨酸或4-(7-羟基-4-香豆素基)-氨基丁酸;和/或
(d)用以下任一种替代酸性氨基酸:γ-羟基谷氨酸、γ-亚甲基谷氨酸、γ-羧基谷氨酸、α-氨基己二酸、2-氨基庚二酸、α-氨基辛二酸、4-羧基苯丙氨酸、磺基丙氨酸、4-膦酰基苯丙氨酸或4-磺甲基苯丙氨酸。
47.根据项目32至46中任一项所述的合成肽穿梭剂或合成肽穿梭剂变体,所述合成肽穿梭剂或合成肽穿梭剂变体用于增加蛋白质和/或非蛋白质负荷(例如,治疗活性蛋白质和/或非蛋白质负荷)向靶真核细胞中的转导效率的体外或体内方法中,其中所述合成肽穿梭剂或合成肽穿梭剂变体在一定浓度下使用,与不存在所述合成肽穿梭剂或合成肽穿梭剂变体的情况相比,所述浓度足以增加所述负荷向所述靶真核细胞中的转导效率和胞质溶胶和/或细胞核递送。
48.根据项目32至47中任一项所述的合成肽穿梭剂或合成肽穿梭剂变体,所述合成肽穿梭剂或合成肽穿梭剂变体用于疗法中,其中所述合成肽穿梭剂或合成肽穿梭剂变体将治疗活性蛋白质和/或非蛋白质负荷转导至靶真核细胞的胞质溶胶和/或细胞核,其中所述合成肽穿梭剂或合成肽穿梭剂变体在一定浓度下使用,与不存在所述合成肽穿梭剂的情况相比,所述浓度足以增加所述负荷向所述靶真核细胞中的转导效率。
49.一种用于蛋白质和/或非蛋白质负荷转导的体外或体内方法,所述方法包括使靶真核细胞与所述负荷和一定浓度的根据项目32至46中任一项所述的合成肽穿梭剂或合成肽穿梭剂变体接触,与不存在所述合成肽穿梭剂的情况相比,所述浓度的所述合成肽穿梭剂或合成肽穿梭剂变体足以增加所述负荷向所述靶真核细胞中的转导效率。
50.根据项目49所述的体外或体内方法,所述体外或体内方法是用于治疗和/或诊断目的的方法。
51.一种用于疗法的组合物,所述组合物包含与有待于通过合成肽穿梭剂转导至靶真核细胞中的蛋白质和/或非蛋白质负荷一起配制的根据项目32至46中任一项所述的合成肽穿梭剂或合成肽穿梭剂变体,其中与不存在所述合成肽穿梭剂的情况相比,所述组合物中的所述合成肽穿梭剂或合成肽穿梭剂变体的浓度足以在施用后增加所述负荷向所述靶真核细胞中的转导效率和胞质溶胶递送。
52.根据项目51所述的组合物,所述组合物被配制用于局部、肠内/胃肠道(例如,口服)或肠胃外施用。
53.一种试剂盒,所述试剂盒包含根据项目32至46中任一项所述的合成肽穿梭剂或合成肽穿梭剂变体,以及有待于通过所述合成肽穿梭剂或合成肽穿梭剂变体转导的蛋白质和/或非蛋白质负荷。
54.根据项目32至48中任一项所述的合成肽穿梭剂或合成肽穿梭剂变体、根据项目49或50所述的体外或体内方法、根据项目51或52所述的组合物或根据项目53所述的试剂盒,其中所述靶真核细胞是动物细胞、哺乳动物细胞、人细胞、干细胞、原代细胞、免疫细胞、T细胞、NK细胞、树突状细胞、上皮细胞、皮肤细胞或胃肠道细胞。
55.根据项目32至48或54中任一项所述的合成肽穿梭剂或合成肽穿梭剂变体、根据项目49或50或54所述的体外或体内方法、根据项目51、52或54所述的组合物或根据项目53或54所述的试剂盒,其中所述非蛋白质负荷是根据项目2至4中任一项所述的。
56.一种用于产生预期在靶真核细胞中对目的负荷具有转导活性的候选合成肽穿梭剂的方法,所述方法包括合成如下肽,所述肽是:(1)长度为至少17、18、19或20个氨基酸的肽,所述肽包含(2)两亲性α-螺旋基序,其具有(3)带正电的亲水外表面和疏水外表面,其中遵守以下参数(4)至(15)中的至少五个:(4)基于每圈具有3.6个残基的α-螺旋的开放圆柱形表示,所述疏水外表面包含由空间上相邻的L、I、F、V、W和/或M氨基酸组成的高疏水核心,所述氨基酸占所述肽的氨基酸的12%至50%;(5)所述肽具有3.5至11的疏水力矩(μ);(6)所述肽在生理pH下具有至少+4的预测净电荷;(7)所述肽具有8至13的等电点(pI);(8)所述肽由35%至65%的如下氨基酸的任何组合构成:A、C、G、I、L、M、F、P、W、Y和V;(9)所述肽由0%至30%的如下氨基酸的任何组合构成:N、Q、S和T;(10)所述肽由35%至85%的如下氨基酸的任何组合构成:A、L、K或R;(11)所述肽由15%至45%的如下氨基酸的任何组合构成:A和L,前提是所述肽中存在至少5%的L;(12)所述肽由20%至45%的如下氨基酸的任何组合构成:K和R;(13)所述肽由0%至10%的如下氨基酸的任何组合构成:D和E;(14)所述肽中A和L残基的百分比(A+L%)与所述肽中K和R残基的百分比(K+R)之间的差小于或等于10%;以及(15)所述肽由10%至45%的如下氨基酸的任何组合构成:Q、Y、W、P、I、S、G、V、F、E、D、C、M、N、T和H,其中在适合于评估所述靶真核细胞中的负荷转导的真核细胞系模型(例如,HeLa)中,所述穿梭剂使碘化丙啶或其他膜不可渗透的荧光DNA嵌入剂的转导效率相比于缺乏所述穿梭剂的相应阴性对照增加至少3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10倍,和/或能够实现碘化丙啶或其他膜不可渗透的荧光DNA嵌入剂的至少10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%或60%的转导效率(例如,如通过流式细胞术所测定)。
57.根据项目56所述的方法,其中所述候选合成肽穿梭剂是根据项目32至46中任一项所述的合成肽穿梭剂或合成肽穿梭剂变体。
58.一种用于鉴定、选择或限定预期在靶真核细胞中对蛋白质和非蛋白质负荷二者均具有转导活性的合成肽穿梭剂的体外或体内方法,所述方法包括:提供适合于评估所述靶真核细胞中的负荷转导的模型真核细胞或模型生物体;提供候选合成肽穿梭剂(例如,根据项目5至20或32至46中任一项所述);以及测量所述候选合成肽穿梭剂将碘化丙啶或其他膜不可渗透的荧光DNA嵌入剂转导至所述模型真核细胞或模型生物体中的转导活性(例如,负荷转导效率,如通过流式细胞术),其中当在所述模型真核细胞或模型生物体中,碘化丙啶或其他膜不可渗透的荧光DNA嵌入剂的转导效率相比于缺乏所述候选合成肽穿梭剂的相应阴性对照增加至少3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10倍,和/或发生所述碘化丙啶或其他膜不可渗透的荧光DNA嵌入剂的至少10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%或60%的转导效率(例如,如通过流式细胞术所测定)时,预期所述候选穿梭剂在所述靶真核细胞中对蛋白质和非蛋白质负荷二者均具有转导活性。
实施例
实施例1:材料与方法
本文未描述或指定的所有材料和方法一般如WO/2016/161516和/或WO/2018/068135中所用。
1.1材料与试剂
1.3细胞系和培养条件
按照制造商的说明书培养细胞。
FBS:胎牛血清
BCS:小牛血清
1.4碘化丙啶转导方案
实验前一天将HeLa细胞铺板于96孔培养皿中(20 000个细胞/孔)。制备包含合成肽穿梭剂(10μM)和碘化丙啶(PI)(10μg/mL)或GFP-NLS(10μM)的每种递送混合物,并将其用磷酸盐缓冲盐水(PBS)补足至50μL。将细胞用PBS洗涤一次,然后将穿梭剂/PI或穿梭剂/GFP-NLS在一分钟内添加在细胞上。然后将100μL含有10%FBS的DMEM添加至混合物并去除。将细胞用PBS洗涤一次并在含有10%FBS的DMEM中孵育。孵育2小时后通过流式细胞术分析细胞。对于“FS然后PI”条件,仅将合成肽穿梭剂(10μM)在1分钟内添加在HeLa细胞上,并在一小时后在相同的洗涤步骤后在一分钟内添加PI(10μg/mL)。在PI或GFP-NLS处理后一小时分析细胞。
1.5 Gli报告NIH3T3细胞中的刺猬途径抑制剂转导方案
如下制备负荷的原液:Gant61原液(在DMSO中20mM);HPI4原液(在DMSO中40mM);伊曲康唑原液(在DMSO中4.8mM(4mg/mL));三氧化二砷(ATO)原液(在H2O中40mM)。将肽穿梭剂(5μM)和刺猬途径抑制剂(100μM)混合,并用PBS使体积补足至50μL。
将刺猬信号传导途径Gli报告NIH 3T3细胞在含有10%小牛血清的DMEM中培养。将细胞胰蛋白酶化、离心并以1000万个细胞/mL重悬于PBS中。50μL细胞(500 000个细胞/孔)分布在圆底未处理的96孔板中。将重悬的细胞与含有肽穿梭剂(5μM)和刺猬途径抑制剂(100μM)的递送混合物混合。将细胞在室温下与递送混合物一起孵育90秒,在每孔中添加200μL含有10%小牛血清的DMEM(200μL),并将细胞离心(400g,4min)并用200μL PBS洗涤。然后将细胞重悬于200μL DMEM中,然后转移至含有1mL含10%小牛血清的DMEM的6孔板的孔中,并在37℃下孵育2小时。轻轻去除培养基,并将1ml对照培养基(Opti-MEMTM)或激活培养基(具有5μg/mL mShh的Opti-MEM)添加至每个孔。将细胞在37℃下孵育24-30小时。
为了分析,将细胞胰蛋白酶化并重悬于具有200μL Opti-MEMTM的每个孔中,然后等分至圆底96孔板的两个孔中。使用流式细胞术分析评估活力,并按照制造商的说明书使用ONE-Step萤光素酶测定来测量发光。
1.6刺猬途径抑制剂体内转导方案
根据建议将负荷悬浮:Gant61,在DMSO中20mM;伊曲康唑原液,在DMSO中4.8mM(4mg/mL)。将年龄在6至7周之间的雌性C57BL6小鼠剃毛并使用脱毛产品(NairTM)脱毛。脱毛后五天,将30μL含有PBS、合成肽穿梭剂FSD250D(SEQ ID NO:36)和/或负荷的混合物施加在3cm2脱毛皮肤上。在处理后3、10和17天对小鼠进行成像。
1.7 QX-314和GFP-NLS共转导和膜片钳技术
细胞培养。使稳定表达Nav1.7的HEK293细胞在补充有胎牛血清(FBS,10%)、L-谷氨酰胺(2mM)、青霉素(100U/mL)、链霉素(10mg/mL)的杜氏最低必须培养基(DMEM,GibcoBRL Life Technologies)中生长。将细胞在37℃下在5%CO2加湿气氛中孵育。
递送。在实验前24小时将细胞接种在24孔板中。将细胞用PBS洗涤两次。将含有1mMQX-314、5μM FSD194和15μM GFP-NLS蛋白的溶液在90秒内施加至细胞并通过抽吸去除。在存在GFP-NLS的情况下,使用5μM FSD194或2.5mM QX-314进行对照。将细胞用800μL含有10%FBS的DMEM洗涤,并转移至记录溶液中以进行电生理学。通过显微镜检查测定GFP阳性细胞,然后选择其用于膜片钳分析。
电生理学。在形成全细胞配置后30s内记录使用QX-314的频率方案。频率方案由来自10Hz下-140mV的保持电位的-20mV下10ms脉冲组成。使用具有膜片钳技术的全细胞配置的Axopatch 200B(Molecular Devices)在室温下记录HEK293细胞中的全细胞Na+电流。pClamp v10.0(Molecular Devices)用于脉冲刺激和记录。将电流在5kHz下过滤,使用Digidata 1550AD转换器(Molecular devices)以100kHz数字化,并存储在计算机上以用于后续分析。串联电阻补偿了70%-80%。必要时,使用在线漏减去除线性漏电流伪影。从8161玻璃(Corning)中拉出火抛光的低电阻电极(2MΩ)。
记录溶液。电解液:35mM NaCl、115mM NMDG、2mM KCl、1.5mM CaCl2、1.0mM MgCl2、10mM葡萄糖、10mM HEPES。用1M NaOH将pH调节至pH 7.3。电极溶液:35mM NaCl、105mM CsF、10mM EGTA和10mM HEPES。用1M CsOH将pH调节至pH 7.4。
实施例2:合成肽穿梭剂能够实现碘化丙啶的细胞内递送
碘化丙啶(PI)是荧光DNA嵌入染料,其通常在荧光显微镜检查和流式细胞术应用中用作细胞核染色剂。PI与DNA的结合导致荧光增强20到30倍以及其最大激发/发射光谱的偏移。由于PI通常不能穿过活细胞的质膜,因此它常规用于检测细胞群中的死细胞。在本文中令人惊讶地发现,包括WO/2016/161516和WO/2018/068135中描述的用于蛋白质负荷转导的穿梭剂肽在内的合成肽穿梭剂能够转导PI以及其他非蛋白质负荷。
将HeLa细胞如实施例1.3中所述进行培养,并如实施例1.4中所述经受PI转导方案,其中在一些实验中蛋白质负荷GFP-NLS作为对照被单独转导。在递送后两小时通过流式细胞术获取结果,并将其表示为荧光细胞的百分比(PI+细胞%或GFP+细胞%),如图1A-图1D所示并且如图2中所示的表中所总结。
图1和图2显示了与合成肽穿梭剂或对照肽连同非蛋白质负荷PI(图1A和图1B)或蛋白质负荷GFP-NLS(图1C和图1D)共孵育1分钟的HeLa细胞的递送和活力结果。测试了肽穿梭剂或对照肽的不同家族的多个成员。测试的第一组合成肽穿梭剂包含与细胞穿透结构域(CPD)(如先前在WO/2016/161516中针对其转导蛋白质负荷的能力所描述的)可操作地连接的内体渗漏结构域(ELD)。测试的第二组和第三组合成肽穿梭剂对应于那些针对递送蛋白质负荷而合理设计并优化的穿梭剂,所述第二组是先前在WO/2018/068135中描述的肽。测试的第四组合成肽穿梭剂对应于在其C与N末端之间具有酰胺键(例如,“FSD268环酰胺”;SEQ ID NO:49)或在N和C末端位置中添加的两个侧接半胱氨酸之间具有二硫桥的环肽(例如,“FSD268环二硫化物”;SEQ ID NO:50)。第五组肽是阴性对照肽,其不遵守WO/2018/068135中描述的若干个合成肽穿梭剂合理设计参数(例如,FSN3、FSN4和FSN8;分别为SEQID NO:54、55和57)。这些阴性对照肽还包括具有分别与肽穿梭剂FSD10、FSD268和FSD174(分别为SEQ ID NO:13、43和32)相同的氨基酸组成的“FSD10乱序”(SEQ ID NO:51)、“FSD268乱序”(SEQ ID NO:52)和“FSD174乱序”(SEQ ID NO:53),但其中氨基酸的顺序被改变以偏离WO/2018/068135中所述的若干个合理设计参数。在图1A和图1B中,“FS然后PI”指示在用合成肽穿梭剂处理后1小时添加PI,从而确保PI阳性信号不是由于细胞死亡。最后,图1A-图1D中最右侧条形对应于阴性对照,其中将细胞仅与负荷(图1A和图1B中的“PI”或图1C和图1D中的“GFP-NLS”)一起孵育,或者细胞是未暴露于负荷或穿梭肽的未处理细胞(“NT”,图1A-图1D)。
总的来说,结果表明包含与CPD可操作地连接的ELD的合成肽穿梭剂(如WO/2016/161516中所述)以及合理设计用于蛋白质负荷转导的合成肽穿梭剂(如WO/2018/068135中所述)的家族成员能够增加非蛋白质、相对低分子量负荷(如PI)的转导效率(以及其蛋白质转导活性)。引人注目的是,未能遵守WO/2018/068135中描述的用于蛋白质负荷递送的合理设计参数的若干个阴性对照肽也未能转导PI,表明WO/2018/068135的合理设计参数也可以应用于递送非蛋白质负荷的肽穿梭剂的设计。
此外,呈线性形式(FSD268;SEQ ID NO:43)、使用酰胺键(FSD268环酰胺;SEQ IDNO:49)或二硫化物(FSD268环二硫化物;SEQ ID NO:50)呈环状形式的相同合成肽穿梭剂增加PI的递送,从而证实了合成穿梭肽不必是线性的才具有功能。
实施例3:合成肽穿梭剂能够实现刺猬信号传导途径的小分子抑制剂的细胞内递
送
评价了对蛋白质负荷具有有效转导活性的合理设计的肽穿梭剂FSD250D(SEQ IDNO:36)如实施例1.5中所述在培养的细胞中转导刺猬信号传导途径的小分子抑制剂的能力。FSD250D肽具有与FSD250(SEQ ID NO:35)相同的氨基酸序列,不同的是FSD250D中的所有氨基酸都是D-氨基酸。结果示于图3和表1。
表1:将刺猬途径抑制剂递送至GLI报告NIH3T3细胞
*先前的实验确定,肽FSD250D与mShh的存在未显著导致发光强度的变化。
简而言之,NIH3T3 Gli-萤光素酶报告细胞系被设计为监测刺猬信号传导途径的活性,并且含有在稳定整合至NIH3T3细胞中的Gli响应元件的控制下的萤火虫萤光素酶基因。如图3和表1所示,将NIH3T3 Gli-萤光素酶报告细胞暴露于作为阳性对照(“阳性对照mShh”)的重组小鼠音猬因子蛋白导致发光强度的增加,而这在未暴露于mShh的阴性对照细胞(“阴性对照mShh”)中未观察到。肽穿梭剂FSD250D的存在对mShh刺激后的细胞发光强度没有影响(数据未显示),这是所预期的,因为mShh的受体(Patched)位于细胞表面(而非细胞内)。然而,与不存在FSD250D的情况相比,在存在FSD250D的情况下将报告细胞暴露于与细胞内靶标结合的结构不同的刺猬信号传导途径小分子抑制剂(Gant61、HPI-4、伊曲康唑或ATO)导致显著降低的细胞发光强度,从而表明小分子被肽穿梭剂成功转导。使用肽FSD19观察到类似的结果(数据未显示)。
实施例4:合成肽穿梭剂能够实现刺猬信号传导途径的小分子抑制剂的细胞内递
送
评价了对蛋白质负荷具有有效转导活性的合理设计的肽穿梭剂FSD250D(SEQ IDNO:36)如实施例1.6中所述在脱毛小鼠模型中转导刺猬信号传导途径的小分子抑制剂的能力。
简而言之,小鼠皮肤的脱毛诱导与刺猬途径的强烈诱导和Gli1的增加的表达相关的毛生长。该实验由以下组成:通过脱毛激活小鼠中的刺猬途径,然后测量通过在皮肤细胞中递送与细胞内靶标结合的小分子刺猬途径抑制剂(Gant61或伊曲康唑)对毛再生的延迟。图4中的结果表明,与不存在FSD250D的情况相比,在存在FSD250D的情况下,用小分子刺猬抑制剂Gant61或伊曲康唑(100μM)处理的小鼠在处理后10天显示出延迟的毛再生(*)。
实施例5:合成肽穿梭剂能够在HEK293细胞中实现小分子钠通道抑制剂(QX-314)
和GFP-NLS的共同细胞内递送
小分子化合物QX-314(利多卡因N-乙基溴)是利多卡因的季盐衍生物。QX-314是膜不可渗透的。当递送至细胞质时,QX-314阻断快速Na+依赖性动作电位和电压依赖性非失活Na+电导(Ilfeld和Yaksh,2009)。为了评价肽穿梭剂对小分子和蛋白质负荷的同时共转导,在存在或不存在肽穿梭剂FSD194(SEQ ID NO:33)的情况下,将稳定表达钠通道Nav1.7的HEK293细胞暴露于QX-314和GFP-NLS的混合物中。作为对照,还在不存在QX-314的情况下,将细胞用GFP-NLS和肽穿梭剂FSD194处理。使用如实施例1.7中所述的膜片钳技术评价结果并且处理的HEK293细胞的代表性全细胞Na+电流示于图5A-图5C。电流由10Hz下10ms去极化脉冲诱发。当在存在肽穿梭剂FSD194的情况下将细胞与QX-314和GFP-NLS一起孵育90秒时(即1mM QX-314+15μM GFP-NLS+5μM FSD194)观察到电流振幅的降低,这与细胞内QX-314的存在一致(图5C)。相比之下,当将细胞在没有QX-314(即15μM GFP-NLS+5μM FSD194+;图5A)或有QX-314但不存在FSD194(即2.5mM QX-314+15μM GFP-NLS;图5B)的情况下孵育时未观察到相同的电流振幅降低。此外,在QX-314+GFP-NLS+FSD194条件下和在FSD194+GFP-NLS条件下鉴定出GFP-NLS阳性细胞,但在QX-314+GFP-NLS条件下未鉴定出GFP-NLS阳性细胞,表明GFP-NLS确实与QX-314一起被肽穿梭剂共转导。
实施例6:稳健的PI转导预测具有蛋白质负荷转导活性的穿梭剂
用于鉴定、选择和/或限定具有蛋白质转导活性的新型肽穿梭剂的高通量筛选工作可能很快变得极其昂贵,因为大量的作为负荷的重组蛋白(特别是复杂蛋白质如重组免疫球蛋白)的制造和纯化是高成本的。使用GFP或GFP-NLS作为蛋白质负荷是有利的,因为它可以通过流式细胞术快速筛选以评估细胞内递送。然而,GFP-NLS的使用需要通过显微镜检查与流式细胞术测量并行来对每种肽穿梭剂进行验证,从而确保候选穿梭剂能够使GFP-NLS负荷避免内体截留并进入胞质溶胶/细胞核,这是消耗资源且费时的。因此,非常需要能够可靠地预测蛋白质转导活性和内体逃逸的更具成本效益的“替代”负荷。
实施例2中的结果证明对GFP(和其他蛋白质负荷)具有经验证的转导活性的合成肽穿梭剂也可以转导小分子如PI。这提出了相反的有趣可能性:PI是否可以用作可靠的“替代”负荷来筛选和鉴定/选择/限定对蛋白质负荷具有稳健转导活性的新型穿梭剂。在商业上,PI广泛可用且相对便宜。此外,仅在与基因组DNA结合后,PI才展现出20至30倍增强的荧光和最大激发/发射光谱的可检测偏移——这一特性使其特别适合于区分内体捕获负荷与可进入胞质溶胶/细胞核区室的内体逃逸负荷。因此,细胞内递送和内体逃逸二者均可以通过流式细胞术测量,因为任何保持被捕获在内体中的PI都不会到达细胞核,并且既不展现出增强的荧光,也不展现出光谱偏移。
为了评价PI作为新型穿梭剂的“替代”负荷的适用性,如实施例1.4中一般所述使用流式细胞术针对在HeLa细胞中的PI和GFP-NLS转导活性并行筛选了超过300种候选肽穿梭剂的专有文库。除了负荷的浓度(即对于PI为10μg/mL相比于对于GFP-NLS为10μM)外,转导方案在其他方面是相同的。
由于筛选了大量的肽,因此每个实验批次都并行地进行阴性对照,并且阴性对照包括其中细胞不暴露于穿梭肽或负荷的“无处理”(NT)对照以及其中在不存在穿梭剂的情况下将细胞暴露于负荷的“仅负荷”对照。结果示于图6和图7,其中“转导效率”是指对负荷(PI或GFP-NLS)呈阳性的所有活细胞的百分比。“平均递送得分”提供了在所有负荷阳性细胞中每个细胞中递送的负荷总量的进一步指示。平均PI或GFP-NLS递送得分通过以下方式来计算:所测量的对于活PI+或GFP+细胞的(至少一式两份样品的)平均荧光强度乘以活PI+或GFP+细胞的平均百分比,再除以100,000(对于GFP递送)或除以10,000(对于PI递送)。然后将每种候选穿梭剂的PI和GFP-NLS的平均递送得分通过除以对于每个实验批次并行进行的“仅负荷”阴性对照的平均递送得分进行归一化。因此,图6和图7中的“归一化平均递送得分”表示平均递送得分相对于“仅负荷”阴性对照的增加倍数。
观察到的对于阴性对照的批次间变化对于GFP-NLS相对较小,但在PI作为负荷时明显较高。例如,“仅负荷”阴性对照的转导效率的变化范围对于GFP-NLS为0.4%至1.3%且对于PI为0.9%至6.3%。此外,并行测试的若干种阴性对照肽(即已知具有低或无GFP转导活性的肽)的转导效率(例如,FSD174乱序;数据未显示)有时比“仅负荷”阴性对照得到更低的对于PI的转导效率(但对于GFP-NLS并非如此),在一些情况下多达5%的更低转导效率,这可能是由于PI与肽之间的非特异性相互作用。对于GFP-NLS转导实验未观察到这种现象。前述内容表明至少对于PI的穿梭剂转导效率可能更适合于与阴性对照肽的转导效率比较,而不适合与“仅负荷”条件比较。
针对PI和GFP-NLS转导活性对超过300种候选肽穿梭剂的筛选表明,显示出对于PI的稳健转导效率的穿梭剂通常与对于GFP-NLS的稳健转导效率相关。引人注目的是,逐渐更高的PI转导效率通常与逐渐更高的GFP-NLS转导效率相关。这通过以下方式来说明:将所有筛选的候选穿梭剂根据其PI转导效率分组至增量窗口,然后计算落在该PI%窗口内的所有穿梭剂的平均GFP转导效率,如下表所示。
图6显示了具有10%或更高的平均PI转导效率的所筛选的所有候选肽穿梭剂的结果,其根据它们的平均PI转导效率水平排序。引人注目的是,在具有至少10%的平均PI转导效率的306种候选肽穿梭剂中,96%的候选肽穿梭剂展现出10%或更高的GFP转导效率。至少15%和20%PI转导效率的阈值对应于与在所有实验批次中观察到的“仅负荷”阴性对照的最高PI转导效率(约6%)相比至少2.5和3倍高的值。在图6中列出的具有至少15%的平均PI转导效率的273种候选肽穿梭剂中,97%的候选肽穿梭剂展现出15%或更高的GFP转导效率。此外,在图6中列出的具有至少20%的平均PI转导效率的256种候选肽穿梭剂中,99.6%的候选肽穿梭剂展现出10%或更高的GFP转导效率,并且96%的候选肽穿梭剂展现出20%或更高的GFP转导效率。
这些结果强烈表明稳健的PI递送预测具有稳健蛋白质负荷转导活性的肽穿梭剂,因此PI确实可以用作“替代”负荷来筛选和识别/选择/限定具有双重负荷转导活性(即,对于小分子和蛋白质)的新型肽穿梭剂。
在图6中具有至少20%的平均PI转导效率的候选肽穿梭剂中包括具有小于20个残基长度的肽:FSD390(17aa)、FSD367(19aa)和FSD366(18aa)。在图6中具有至少20%的平均PI转导效率的候选肽穿梭剂中还包括包含非生理氨基酸类似物(例如,FSD435,其对应于FSD395,不同的是赖氨酸残基(K)被替代为L-2,4-二氨基丁酸残基)或化学修饰(例如,FSD438,其对应于FSD10,不同的是具有N末端辛酸修饰;FSD436,其对应于FSD222,不同的是苯丙氨酸残基(F)被替代为(2-萘基)-L-丙氨酸残基;FSD171,其对应于FSD168,不同的是具有N末端乙酰基基团和C末端半胱酰胺基团)的肽。这些结果证实了肽穿梭剂平台技术耐受使用非生理氨基酸或其类似物代替生理氨基酸和/或使用化学修饰的稳健性。
实施例7:较低水平的PI递送对具有蛋白质负荷转导活性的肽穿梭剂的预测性较
低
在实施例6中具有小于10%的平均PI转导效率但具有至少7%的平均GFP-NLS转导效率的所筛选的超过300种候选肽穿梭剂的结果示于图7,这次根据它们的平均GFP转导效率水平排序。
对于具有小于10%的PI转导效率的候选肽,本文采用的筛选方法的大规模性质可能排除了关于其负荷转导效率的潜在缺乏的任何明确结论。事实上,WO/2016/161516和WO/2018/068135披露了穿梭剂肽以浓度依赖性方式起作用,并且多个要素如穿梭剂浓度、负荷浓度、暴露时间和细胞类型可能影响穿梭剂在转导测定中的性能。本文所述的候选肽穿梭剂的大规模筛选对各个以及每个测试的肽施加“通用的”单一穿梭剂浓度、单一负荷浓度、单一暴露时间/方案。因此,仅基于在该大规模筛选中观察到的低PI转导效率,很难做出关于非蛋白质负荷转导活性的任何明确结论。
参考文献
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序列表
<110> 费尔丹生物公司
<120> 基于肽的非蛋白质负荷递送
<130> 16995-56
<150> CA 3.040.645
<151> 2019-04-18
<160> 344
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CM18-穿膜肽-cys
<400> 1
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1 5 10 15
Thr Gly Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp
20 25 30
Lys Lys Cys
35
<210> 2
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TAT-KALA
<400> 2
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Trp Glu Ala Lys Leu
1 5 10 15
Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys His Leu Ala Lys Ala Leu
20 25 30
Ala Lys Ala Leu Lys Ala Cys Glu Ala
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<210> 3
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 3
His His His His His His Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ala
1 5 10 15
Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln
20 25 30
Ala Arg Ala
35
<210> 4
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> His-LAH4-PTD4
<400> 4
His His His His His His Lys Lys Ala Leu Leu Ala Leu Ala Leu His
1 5 10 15
His Leu Ala His Leu Ala Leu His Leu Ala Leu Ala Leu Lys Lys Ala
20 25 30
Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala
35 40
<210> 5
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PTD4-KALA
<400> 5
Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala Trp Glu Ala Lys Leu
1 5 10 15
Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys His Leu Ala Lys Ala Leu
20 25 30
Ala Lys Ala Leu Lys Ala Cys Glu Ala
35 40
<210> 6
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EB1-PTD4
<400> 6
Leu Ile Arg Leu Trp Ser His Leu Ile His Ile Trp Phe Gln Asn Arg
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Arg Leu Lys Trp Lys Lys Lys Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala
20 25 30
Arg Ala
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<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> His-CM18-PTD4-6Cys
<400> 7
His His His His His His Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ala
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Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln
20 25 30
Ala Arg Ala Cys Cys Cys Cys Cys Cys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CM18-PTD4
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Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr
1 5 10 15
Thr Gly Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CM18-PTD4-6His
<400> 9
Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr
1 5 10 15
Thr Gly Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala His His His
20 25 30
His His His
35
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> His-CM18-PTD4-His
<400> 10
His His His His His His Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ala
1 5 10 15
Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln
20 25 30
Ala Arg Ala His His His His His His
35 40
<210> 11
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TAT-CM18
<400> 11
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Cys Lys Trp Lys Leu
1 5 10 15
Phe Lys Lys Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly
20 25 30
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD5
<400> 12
His His His His His His Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Lys
1 5 10 15
Leu Trp Thr Gln Gly Arg Arg Leu Lys Ala Lys Arg Ala Lys Ala His
20 25 30
His His His His His
35
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD10
<400> 13
Lys Trp Lys Leu Ala Arg Ala Phe Ala Arg Ala Ile Lys Lys Leu Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Ala Arg Ala Leu Arg Arg Gln Ala Arg
20 25 30
Thr Gly
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<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD12
<400> 14
Lys Trp Lys Leu Ala Arg Ala Phe Ala Arg Ala Ile Lys Lys Leu Tyr
1 5 10 15
Ala Arg Ala Leu Arg Arg Gln Ala Arg Thr Gly
20 25
<210> 15
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD18
<400> 15
Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Lys Leu Trp Thr Gln Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Gly Gly Ser Gly Arg Arg Leu Lys Ala Lys Arg Ala Lys Ala
20 25 30
<210> 16
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD19
<400> 16
His His His His His His Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Lys
1 5 10 15
Thr Trp Thr Gln Gly Arg Arg Leu Lys Ala Lys Ser Ala Gln Ala Ser
20 25 30
Thr Arg Gln Ala His His His His His His
35 40
<210> 17
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD21
<400> 17
His His His His His His Phe Leu Lys Ile Trp Ser Arg Leu Ile Lys
1 5 10 15
Ile Trp Thr Gln Gly Arg Arg Lys Gly Ala Gln Ala Ala Phe Arg
20 25 30
<210> 18
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD23
<400> 18
His His His His His His Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Lys
1 5 10 15
Glu Trp Thr Gln Gly Arg Arg Leu Glu Ala Lys Arg Ala Glu Ala His
20 25 30
His His His His His
35
<210> 19
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD120
<400> 19
His His His His His His Phe Leu Lys Ile Trp Ser Arg Leu Ile Lys
1 5 10 15
Ile Trp Thr Gln Gly Leu Arg Lys Gly Ala Gln Ala Ala Lys Arg
20 25 30
<210> 20
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD127
<400> 20
His His His His His His Leu Leu Lys Ile Trp Ser Arg Leu Ile Lys
1 5 10 15
Gly Trp Thr Gln Gly Trp Arg Thr Ile Ala Gln Ala Leu Gly
20 25 30
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<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD129
<400> 21
Phe Leu Lys Ile Trp Ser Arg Leu Ile Lys Ile Trp Thr Gln Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Gly Gly Ser Arg Arg Lys Gly Ala Gln Ala Ala Phe Arg
20 25 30
<210> 22
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD131
<400> 22
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1 5 10 15
Ile Trp Thr Gln Gly Arg Arg Lys Gly Ala Gln Ala Ala Phe Arg His
20 25 30
His His His His His
35
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<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD134
<400> 23
Leu Ile Arg Lys Trp Ile His Leu Ile His Ser Trp Phe Gln Asn Leu
1 5 10 15
Arg Arg Leu Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD146
<400> 24
Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Lys Leu Trp Thr Gln Gly Gly
1 5 10 15
Ser Pro Pro Pro Ser Gly Arg Arg Leu Lys Ala Lys Arg Ala Lys Ala
20 25 30
<210> 25
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD155
<400> 25
Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Lys Leu Trp Thr Gln Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Glu Gly Ser Gly Arg Arg Leu Lys Ala Lys Arg Ala Lys Ala
20 25 30
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD156
<400> 26
Trp Ile Arg Leu Phe Thr Lys Leu Trp Arg Ile Phe Gln Gln Gly Lys
1 5 10 15
Arg Ile Lys Ala Lys Arg Ala
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<213> 人工序列
<220>
<223> FSD157
<400> 27
Trp Ile Arg Leu Phe Thr Lys Leu Trp Arg Ile Phe Gln Gln Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Gly Gly Ser Lys Arg Ile Lys Ala Lys Arg Ala
20 25
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<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD159
<400> 28
Trp Ile Arg Leu Phe Thr Lys Leu Trp Arg Ile Phe Arg Gln Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Gly Gly Ser Lys Arg Ile Lys Ala Lys Ala Ala
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<210> 29
<211> 25
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 29
Ile Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Ile Lys Ile Trp Thr Gln Gly Arg
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Arg Lys Lys Ala Gln Ala Ala Lys Arg
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<211> 25
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 30
Leu Leu Lys Ile Trp Ser Arg Leu Ile Lys Ile Trp Thr Gln Gly Arg
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Arg Leu Gly Ala Arg Ala Gln Ala Arg
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<213> 人工序列
<220>
<223> FSD173
<400> 31
Leu Leu Lys Ile Trp Ser Arg Leu Ile Lys Ile Trp Thr Gln Gly Arg
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Arg Leu Gly Ala Arg Ala Ala Arg Gln Ala Arg
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<213> 人工序列
<220>
<223> FSD174
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Leu Leu Lys Ile Trp Ser Arg Leu Ile Lys Ile Trp Thr Gln Gly Arg
1 5 10 15
Arg Leu Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Arg Ala Ala Arg Gln Ala
20 25 30
Arg
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 33
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Gly Ser Gly Gly Gly Ser Arg Arg Leu Lys Ala Lys Arg Ala Lys Ala
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD220
<400> 34
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1 5 10 15
Arg Ile Lys Ala Lys Arg Ala
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<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD250
<400> 35
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Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Arg Ala Ala Arg Gln Ala Arg
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<210> 36
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD250D
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(30)
<223> 所有D-氨基酸
<400> 36
Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Lys Leu Trp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Arg Ala Ala Arg Gln Ala Arg
20 25 30
<210> 37
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD253
<400> 37
Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Lys Leu Trp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Arg Gly Gly Arg Gly Ser Ala Arg Ala Ala Arg Gln Ala Arg
20 25 30
<210> 38
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD258
<400> 38
Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Lys Leu Trp Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Gly Gly Ser Ala Arg Ala Ala Arg Gln Ala Arg
20 25
<210> 39
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD262
<400> 39
Lys Trp Lys Leu Leu Arg Leu Trp Ser Arg Leu Leu Arg Leu Trp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Arg Ala Ala Arg Gln Ala Arg
20 25 30
<210> 40
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD263
<400> 40
Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Lys Leu Trp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg
20 25 30
<210> 41
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD264
<400> 41
Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Lys Leu Trp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Arg Ala Ala Ala Arg Ala Ala Arg
20 25 30
<210> 42
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD265
<400> 42
Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Lys Leu Trp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg
20 25 30
<210> 43
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD268
<400> 43
Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Lys Leu Trp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Ala Arg Ala Gln Ala Arg Gln Ala Arg
20 25 30
<210> 44
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD286
<400> 44
Lys Trp Lys Leu Leu Arg Ala Leu Ala Arg Leu Leu Lys Leu Ala Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Arg Arg Leu Gly Ala Arg Ala Gln Ala
20 25 30
Arg
<210> 45
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD271
<400> 45
Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Lys Leu Trp Arg
1 5 10 15
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Arg Ala Ala Arg Gln Ala Arg
20 25 30
<210> 46
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD272
<400> 46
Lys Trp Lys Leu Ala Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Lys Leu Trp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Arg Ala Ala Arg Gln Ala Arg
20 25 30
<210> 47
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD273
<400> 47
Lys Trp Lys Leu Leu Arg Ala Trp Ser Arg Leu Leu Lys Leu Trp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Arg Ala Ala Arg Gln Ala Arg
20 25 30
<210> 48
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD276
<400> 48
Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Arg Ala Trp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Arg Ala Ala Arg Gln Ala Arg
20 25 30
<210> 49
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD268 环酰胺
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(32)
<223> 环肽: 在K1 与 R32之间的共价连接
<400> 49
Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Lys Leu Trp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Ala Arg Ala Gln Ala Arg Gln Ala Arg
20 25 30
<210> 50
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD268 二硫化物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(32)
<223> 环肽: 在C1 与 C34之间的二硫键
<400> 50
Cys Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Lys Leu Trp
1 5 10 15
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Ala Arg Ala Gln Ala Arg Gln Ala
20 25 30
Arg Cys
<210> 51
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD10 乱序
<400> 51
Lys Trp Lys Leu Ala Arg Ala Phe Ala Arg Ala Ile Lys Lys Leu Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Ala Arg Ala Leu Arg Arg Gln Ala Arg
20 25 30
Thr Gly
<210> 52
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD268 乱序
<400> 52
Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Lys Leu Trp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Ala Arg Ala Gln Ala Arg Gln Ala Arg
20 25 30
<210> 53
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD174 乱序
<400> 53
Leu Gly Arg Ser Gly Arg Ile Lys Ile Gly Gly Trp Ser Ala Leu Ala
1 5 10 15
Ser Arg Ala Arg Gln Ala Arg Gly Leu Lys Ile Trp Thr Gln Gly Arg
20 25 30
Leu
<210> 54
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSN3
<400> 54
His His His His His His Gln Phe Leu Cys Phe Trp Leu Asn Lys Met
1 5 10 15
Gly Lys His Asn Thr Val Trp His Gly Arg His Leu Lys Cys His Lys
20 25 30
Arg Gly Lys Gly
35
<210> 55
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSN4
<400> 55
His His His His His His Leu Leu Tyr Leu Trp Arg Arg Leu Leu Lys
1 5 10 15
Phe Trp Cys Ala Gly Arg Arg Val Tyr Ala Lys Cys Ala Lys Ala Tyr
20 25 30
Gly Cys Phe
35
<210> 56
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSN7
<400> 56
Leu Ile Lys Leu Trp Ser Arg Phe Ile Lys Phe Trp Thr Gln Gly Arg
1 5 10 15
Arg Ile Lys Ala Lys Leu Ala Arg Ala Gly Gln Ser Trp Phe Gly
20 25 30
<210> 57
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSN8
<400> 57
His His His His His His Phe Arg Lys Leu Trp Leu Ala Ile Val Arg
1 5 10 15
Ala Lys Lys
<210> 58
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD117
<400> 58
His His His His His His Phe Leu Lys Phe Trp Ser Arg Leu Phe Lys
1 5 10 15
Phe Trp Thr Gln Gly Arg Arg Lys Gly Ala Gln Ala Ala Phe Arg
20 25 30
<210> 59
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD118
<400> 59
His His His His His His Ile Leu Lys Ile Trp Ser Arg Leu Ile Lys
1 5 10 15
Ile Trp Thr Gln Gly Arg Arg Lys Gly Ala Gln Ala Ala Ile Arg
20 25 30
<210> 60
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD119
<400> 60
His His His His His His Phe Leu Lys Ile Trp Ser Arg Ala Leu Ile
1 5 10 15
Lys Ile Trp Thr Gln Gly Leu Arg Lys Gly Ala Gln Ala Ala Lys Arg
20 25 30
<210> 61
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD121
<400> 61
His His His His His His Val Leu Lys Ile Trp Ser Arg Leu Ile Lys
1 5 10 15
Ile Trp Thr Gln Gly Arg Arg Lys Gly Ala Gln Ala Ala Val Arg
20 25 30
<210> 62
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD122
<400> 62
His His His His His His Phe Leu Lys Val Trp Ser Arg Leu Val Lys
1 5 10 15
Val Trp Thr Gln Gly Arg Arg Lys Gly Ala Gln Ala Ala Phe Arg
20 25 30
<210> 63
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD123
<400> 63
His His His His His His Val Leu Lys Val Trp Ser Arg Leu Val Lys
1 5 10 15
Val Trp Thr Gln Gly Arg Arg Lys Gly Ala Gln Ala Ala Val Arg
20 25 30
<210> 64
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD124
<400> 64
His His His His His His Phe Leu Lys Ile Trp Gln Arg Leu Ile Lys
1 5 10 15
Ile Trp Gln Gln Gly Arg Arg Lys Gly Ala Gln Ala Ala Phe Arg
20 25 30
<210> 65
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD125
<400> 65
His His His His His His Phe Leu Lys Ile Trp Asn Arg Leu Ile Lys
1 5 10 15
Ile Trp Asn Asn Gly Arg Arg Lys Gly Ala Asn Ala Ala Phe Arg
20 25 30
<210> 66
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD126
<400> 66
His His His His His His Phe Leu Lys Ile Trp Ser Arg Leu Ile Lys
1 5 10 15
Ile Trp Thr Gln Gly Trp Arg Thr Gly Ala Gln Ala Gly Phe
20 25 30
<210> 67
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD127
<400> 67
His His His His His His Leu Leu Lys Ile Trp Ser Arg Leu Ile Lys
1 5 10 15
Gly Trp Thr Gln Gly Trp Arg Thr Ile Ala Gln Ala Leu Gly
20 25 30
<210> 68
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD128
<400> 68
His His His His His His Phe Leu Lys Ile Trp Ser Arg Leu Ile Lys
1 5 10 15
Ile Trp Pro Gln Pro Arg Arg Lys Gly Ala Gln Ala Ala Phe Arg
20 25 30
<210> 69
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD130
<400> 69
Leu Ile Lys Ile Trp Thr Gln Phe Leu Lys Ile Trp Ser Arg Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Gly Gly Ser Arg Arg Leu Gly Ala Arg Ala Gln Ala Arg
20 25 30
<210> 70
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD132
<400> 70
His His His His His His Arg Phe Ala Ala Gln Ala Gly Lys Arg Arg
1 5 10 15
Gly Gln Thr Trp Ile Lys Ile Leu Arg Ser Trp Ile Lys Leu Phe
20 25 30
<210> 71
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD133
<400> 71
His His His His Phe Leu His His Ser Trp Ile Lys Lys Ile Leu Arg
1 5 10 15
Thr Trp Ile Arg Arg Gly Gln Gln Ala Gly Lys Phe Ala Ala Arg
20 25 30
<210> 72
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD135
<400> 72
Leu Ile Arg Lys Trp Ile His Leu Ile His Ser Trp Phe Gln Asn Leu
1 5 10 15
Arg Arg Leu Gln Ala Arg Ala Gln Ala Arg Gln Ala Arg
20 25
<210> 73
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD137
<400> 73
Leu Leu Arg Lys Trp Ser His Leu Leu His Ile Trp Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Gln Ala Arg Ala Gln Ala Arg Gln Ala Arg
20 25
<210> 74
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD138
<400> 74
Lys Trp Lys Leu Ala Arg Ala Phe Ala Arg Ala Ile Lys Ile Phe Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Arg Arg Leu Lys Ala Lys Arg Ala Lys
20 25 30
Ala
<210> 75
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD139
<400> 75
His His His His His His Leu Ile Arg Leu Trp Ser His Leu Ile His
1 5 10 15
Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Leu Lys Trp Lys Lys Lys Tyr Ala Arg
20 25 30
Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala
35 40
<210> 76
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD140
<400> 76
His His His His His His Leu Ile Arg Leu Trp Ser His Leu Ile His
1 5 10 15
Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Leu Lys Trp Lys Lys Lys Tyr Ala Arg
20 25 30
Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala His His His His His His
35 40 45
<210> 77
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD141
<400> 77
Leu Ile Arg Leu Trp Ser His Leu Ile His Ile Trp Phe Gln Asn Arg
1 5 10 15
Arg Leu Lys Trp Lys Lys Lys Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Ala
20 25 30
Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala
35 40
<210> 78
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD142
<400> 78
Phe Leu Lys Ile Trp Ser His Leu Ile His Ile Trp Thr Gln Gly Arg
1 5 10 15
Arg Leu Lys Ala Lys Arg Ala Lys Ala
20 25
<210> 79
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD143
<400> 79
Leu Ile Arg Lys Trp Ile His Leu Ile His Ser Trp Phe Gln Gly Arg
1 5 10 15
Arg Leu Gly Ala Arg Ala
20
<210> 80
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD144
<400> 80
His His His His His His Lys Lys Ala Leu Leu Ala His Ala Leu His
1 5 10 15
Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu His Leu Ala His Ala Leu Lys Lys Ala
20 25 30
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg His His His His His
35 40 45
His
<210> 81
<211> 52
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD145
<400> 81
His His His His His His Lys Lys His Leu Leu Ala His Ala Leu His
1 5 10 15
Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu His Leu Ala His Ala Leu Ala His Leu
20 25 30
Lys Lys Ala Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg His His
35 40 45
His His His His
50
<210> 82
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD147
<400> 82
Leu Leu Lys Leu Trp Thr Gln Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Gly Gly Ser Arg Arg Leu Lys Ala Lys Arg Ala Lys Ala
20 25 30
<210> 83
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD148
<400> 83
His His His His His His Met Val Thr Val Leu Phe Arg Arg Leu Arg
1 5 10 15
Ile Arg Arg Ala Cys Gly Pro Pro Arg Val Arg Val
20 25
<210> 84
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD149
<400> 84
His His His His His His Met Val Arg Val Leu Thr Arg Phe Leu Arg
1 5 10 15
Ile Gly Ala Arg Cys Arg Arg Pro Pro Val Val Arg
20 25
<210> 85
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD150
<400> 85
His His His His His His Trp Ile Thr Trp Leu Phe Lys Arg Leu Lys
1 5 10 15
Ile Arg Arg Ala Ala Gly Gln Ser Lys Phe Arg Ile Ala Gly
20 25 30
<210> 86
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD151
<400> 86
His His His His His His Trp Ile Thr Trp Leu Arg Lys Ile Leu Lys
1 5 10 15
Arg Phe Arg Lys Ala Ala Gln Ser Gly Phe Arg Ile Ala Gly
20 25 30
<210> 87
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD152
<400> 87
His His His His His His Trp Ile Thr Trp Leu Arg Lys Ile Leu Lys
1 5 10 15
Arg Phe Gly Lys Ala Ala Gln Ser Gly Phe Arg Ile Ala Arg
20 25 30
<210> 88
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD153
<400> 88
His His His His His His Trp Ile Thr Trp Leu Arg Lys Ile Leu Lys
1 5 10 15
Arg Leu Gly Gly Ala Ala Gln Ser Ile Ile Thr Gly Gly Gln
20 25 30
<210> 89
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD154
<400> 89
His His His His His His Trp Ile Thr Trp Leu Phe Lys Arg Leu Lys
1 5 10 15
Ile Arg Arg Ala Ala Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Ser Lys Phe
20 25 30
Arg Ile Ala Gly
35
<210> 90
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD158
<400> 90
Trp Ile Arg Leu Phe Thr Lys Leu Trp Arg Ile Phe Arg Gln Gly Lys
1 5 10 15
Arg Ile Lys Ala Lys Ala Ala
20
<210> 91
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD160
<400> 91
Ile Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Ile Lys Ile Trp Thr Gln Gly Arg
1 5 10 15
Arg Leu Gly Ala Gln Ala Ala Leu Arg
20 25
<210> 92
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD161
<400> 92
Ile Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Ile Lys Ile Trp Thr Gln Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Gly Gly Ser Arg Arg Leu Gly Ala Gln Ala Ala Leu Arg
20 25 30
<210> 93
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD163
<400> 93
Ile Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Ile Lys Ile Trp Thr Gln Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Gly Gly Ser Arg Arg Lys Lys Ala Gln Ala Ala Lys Arg
20 25 30
<210> 94
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD164
<400> 94
Leu Leu Lys Ile Trp Ser Arg Leu Ile Lys Ile Trp Thr Gln Gly Arg
1 5 10 15
Arg Leu Gly Ala Arg Ala Ala Arg Ala
20 25
<210> 95
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD165
<400> 95
Leu Leu Lys Ile Trp Ser Arg Leu Ile Lys Ile Trp Thr Gln Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Gly Gly Ser Arg Arg Lys Lys Ala Arg Ala Ala Arg Ala
20 25 30
<210> 96
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD166
<400> 96
Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Ile Lys Ile Trp Thr Lys Gly Arg
1 5 10 15
Arg Lys Lys Ala Arg Ala Ala Gln Ala Arg
20 25
<210> 97
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD167
<400> 97
Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Ile Lys Ile Trp Thr Lys Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Gly Gly Ser Arg Arg Lys Lys Ala Arg Ala Ala Gln Ala Arg
20 25 30
<210> 98
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD169
<400> 98
Leu Leu Lys Ile Trp Ser Arg Leu Ile Lys Ile Trp Thr Gln Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Gly Gly Ser Arg Arg Leu Gly Ala Arg Ala Gln Ala Arg
20 25 30
<210> 99
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD170
<400> 99
Leu Ile Lys Ile Trp Thr Gln Leu Leu Lys Ile Trp Ser Arg Gly Arg
1 5 10 15
Arg Leu Gly Ala Arg Ala Gln Ala Arg
20 25
<210> 100
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD171
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰基
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (25)..(25)
<223> 酰胺
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (25)..(25)
<223> 半胱酰胺
<400> 100
Leu Leu Lys Ile Trp Ser Arg Leu Ile Lys Ile Trp Thr Gln Gly Arg
1 5 10 15
Arg Leu Gly Ala Arg Ala Gln Ala Arg
20 25
<210> 101
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD172
<400> 101
Leu Leu Lys Ile Trp Ser Arg Leu Ile Lys Ile Trp Thr Gln Gly Arg
1 5 10 15
Arg Leu Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Arg Ala Gln Ala Arg
20 25 30
<210> 102
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD175
<400> 102
Leu Leu Lys Ile Trp Ser Arg Leu Ile Lys Ile Trp Thr Gln Gly Arg
1 5 10 15
Arg Leu Gly Gly Ser Ala Arg Ala Ala Arg Gln Ala Arg
20 25
<210> 103
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD176
<400> 103
Leu Leu Lys Ile Trp Ser Arg Leu Ile Lys Ile Trp Thr Gln Gly Arg
1 5 10 15
Arg Leu Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ala Arg Ala Ala
20 25 30
Arg Gln Ala Arg
35
<210> 104
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD177
<400> 104
Lys Leu Lys Ile Trp Ser Arg Leu Ile Arg Lys Trp Thr Lys Gly Leu
1 5 10 15
Arg Leu Gly Ala Gln Ala Gln Ala Arg
20 25
<210> 105
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD178
<400> 105
Lys Leu Lys Ile Trp Ser Arg Leu Ile Arg Lys Trp Thr Lys Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Gly Gly Ser Leu Arg Leu Gly Ala Gln Ala Gln Ala Arg
20 25 30
<210> 106
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD179
<400> 106
Leu Leu Lys Ile Trp Ser Arg Leu Ile Lys Ile Trp Thr Gln Gly Arg
1 5 10 15
Gly Arg Glu Ser Arg Lys Pro Arg Lys Ser Arg Gln
20 25
<210> 107
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD180
<400> 107
Leu Leu Lys Ile Trp Ser Arg Leu Ile Lys Ile Trp Thr Gln Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Gly Gly Ser Arg Gly Arg Glu Ser Arg Lys Pro Arg Lys Ser
20 25 30
Arg Gln
<210> 108
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD181
<400> 108
Leu Leu Lys Ile Trp Ser Arg Leu Ile Lys Ile Trp Thr Gln Gly Leu
1 5 10 15
Gly Leu Leu Val Leu Arg Val Arg Ala Gly Lys Arg
20 25
<210> 109
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD182
<400> 109
Leu Leu Lys Ile Trp Ser Arg Leu Ile Lys Ile Trp Thr Gln Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Gly Gly Ser Leu Gly Leu Leu Val Leu Arg Val Arg Ala Gly
20 25 30
Lys Arg
<210> 110
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD183
<400> 110
Leu Leu Lys Ile Trp Ser Arg Leu Ile Lys Ile Trp Thr Gln Gly Arg
1 5 10 15
Arg Leu Gly Ala Arg Ala
20
<210> 111
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD184
<400> 111
Leu Leu Lys Ile Trp Ser Arg Leu Ile Lys Ile Trp Thr Gln Gly Arg
1 5 10 15
Arg Leu Gly Ala Arg Ala Ala Arg
20
<210> 112
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD185
<400> 112
Leu Leu Lys Ile Trp Ser Arg Leu Ile Lys Ile Trp Thr Gln Gly Arg
1 5 10 15
Arg Leu Gly Ala Arg Ala Ala Arg Gln
20 25
<210> 113
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD186
<400> 113
Leu Leu Lys Ile Trp Ser Arg Leu Ile Lys Ile Trp Thr Gln Gly Arg
1 5 10 15
Gly Leu Glu Ala Arg Ala Pro Arg Lys Ala Arg
20 25
<210> 114
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD187
<400> 114
Leu Leu Lys Ile Trp Ser Arg Leu Ile Lys Ile Trp Thr Gln Gly Arg
1 5 10 15
Arg Leu Gly Ala Arg Lys Pro Arg Lys Ser Arg Gln
20 25
<210> 115
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD188
<400> 115
Leu Leu Lys Ile Trp Ser Arg Leu Ile Lys Ile Trp Thr Gln Gly Arg
1 5 10 15
Gly Arg Glu Ser Arg Ala Ala Arg Gln Ala Arg
20 25
<210> 116
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD189
<400> 116
Leu Leu Lys Ile Trp Ser Arg Leu Ile Lys Ile Trp Thr Gln Gly Arg
1 5 10 15
Arg Leu Gly Arg Ala Gln Arg Ala Gln Arg Ala
20 25
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<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD190
<400> 117
Leu Leu Lys Ile Trp Ser Arg Leu Ile Lys Ile Trp Thr Gln Gly Arg
1 5 10 15
Ala Gln Arg Ala Gln Arg Ala
20
<210> 118
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD191
<400> 118
His His His His His His Leu Leu Lys Ile Trp Ser Arg Leu Ile Lys
1 5 10 15
Ile Trp Thr Gln Gly Thr Arg Ser Lys Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro
20 25 30
<210> 119
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD192
<400> 119
His His His His His His Leu Leu Lys Ile Trp Ser Arg Leu Ile Lys
1 5 10 15
Ile Trp Thr Gln Gly Val Gly Arg Val His Arg Leu Leu Arg Lys
20 25 30
<210> 120
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD193
<400> 120
Lys Trp Lys Leu Leu Lys Ile Trp Ser Arg Leu Ile Lys Ile Trp Arg
1 5 10 15
Arg Leu Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Arg Ala Ala Arg Gln Ala
20 25 30
Arg
<210> 121
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD195
<400> 121
Leu Leu Lys Ile Trp Ser Arg Leu Ile Lys Ile Trp Thr Gln Gly Arg
1 5 10 15
Arg Leu Lys Ala Arg Ala Gln Ala Arg
20 25
<210> 122
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD196
<400> 122
Leu Leu Lys Ile Trp Ser Arg Leu Ile Lys Ile Trp Thr Gln Gly Arg
1 5 10 15
Arg Leu Gly Ala Arg Ala Ala Ala Arg
20 25
<210> 123
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD197
<400> 123
Leu Leu Lys Ile Trp Ser Arg Leu Ile Lys Ile Trp Thr Gln Gly Arg
1 5 10 15
Arg Leu Lys Ala Arg Ala Ala Ala Arg
20 25
<210> 124
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD198
<400> 124
Trp Ser Arg Leu Ile Lys Ile Trp Thr Gln Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Arg Arg Lys Gly Ala Gln Ala Ala Phe Arg
20 25
<210> 125
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD199
<400> 125
Trp Ser Arg Leu Ile Thr Lys Ile Trp Arg Ile Phe Thr Gln Gly Arg
1 5 10 15
Arg Leu Gly Ala Arg Ala Ala
20
<210> 126
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD200
<400> 126
Trp Ser Arg Leu Ile Thr Lys Ile Trp Arg Ile Phe Thr Gln Gly Arg
1 5 10 15
Arg Leu Lys Ala Arg Ala Ala
20
<210> 127
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD201
<400> 127
Trp Ser Arg Leu Ile Lys Leu Trp Thr Gln Gly Arg Arg Leu Lys Ala
1 5 10 15
Arg Ala Ala
<210> 128
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD202
<400> 128
Trp Ile Arg Leu Phe Lys Leu Trp Gln Gln Gly Lys Arg Ile Lys Ala
1 5 10 15
Lys Arg Ala
<210> 129
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD203
<400> 129
Trp Ser Arg Leu Ile Lys Ile Trp Thr Gln Gly Arg Arg Leu Gly Ala
1 5 10 15
Arg Ala Gln Ala Arg
20
<210> 130
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD204
<400> 130
Leu Leu Lys Ile Trp Ser Arg Leu Ile Lys Ile Trp Thr Gln Gly Arg
1 5 10 15
Arg Leu Gly Ala Arg
20
<210> 131
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD205
<400> 131
Trp Ser Arg Leu Ile Lys Ile Trp Thr Gln Gly Arg Arg Leu Gly Ala
1 5 10 15
Arg
<210> 132
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD206
<400> 132
Lys Ile Trp Ser Arg Leu Ile Lys Ile Trp Thr Gln Gly Arg Arg Leu
1 5 10 15
Gly Ala Arg Ala Gln
20
<210> 133
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD207
<400> 133
Leu Ala Lys Ala Trp Ala Arg Ala Ile Lys Ile Trp Thr Gln Gly Arg
1 5 10 15
Arg Leu Gly Ala Arg Ala Gln Ala Arg
20 25
<210> 134
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD208
<400> 134
Lys Trp Lys Leu Ala Arg Ala Phe Ala Arg Ala Ile Lys Lys Leu Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Arg Arg Leu Gly Ala Arg Ala Gln Ala Arg
20 25 30
<210> 135
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD209
<400> 135
Leu Leu Lys Ile Trp Ser Arg Leu Ile Lys Ile Trp Thr Gln Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Ala Arg Ala Leu Arg Arg Gln Ala Arg Thr
20 25 30
Gly
<210> 136
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD210
<400> 136
Lys Trp Lys Leu Ala Arg Ala Phe Ala Arg Ala Ile Lys Lys Leu Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Arg Arg Leu Lys Ala Lys Arg Ala Lys Ala
20 25 30
<210> 137
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD211
<400> 137
Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Lys Leu Trp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Ala Arg Ala Leu Arg Arg Gln Ala Arg
20 25 30
Thr Gly
<210> 138
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD212
<400> 138
Trp Ser Arg Leu Leu Lys Leu Trp Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Arg
1 5 10 15
Arg Leu Lys Ala Lys Arg Ala Lys Ala
20 25
<210> 139
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD213
<400> 139
Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Lys Leu Trp Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Arg Arg Leu Lys Ala Lys
20 25
<210> 140
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD214
<400> 140
Trp Ser Arg Leu Leu Lys Leu Trp Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Arg
1 5 10 15
Arg Leu Lys Ala Lys
20
<210> 141
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD215
<400> 141
Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Lys Leu Trp Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Arg Arg Leu Lys Ala Lys Arg Ala
20 25
<210> 142
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD216
<400> 142
Leu Leu Lys Ile Trp Ser Arg Leu Ile Lys Ile Trp Thr Gln Gly Arg
1 5 10 15
Gly Arg Ser Arg Lys Pro Arg Lys Ser Arg Gln
20 25
<210> 143
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD217
<400> 143
Lys Trp Lys Leu Lys Leu Trp Arg Leu Lys Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Arg Arg Ala Lys Ala
20
<210> 144
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD218
<400> 144
Lys Trp Lys Leu Lys Leu Trp Arg Leu Lys Ser Arg Leu Lys Leu Trp
1 5 10 15
Arg Leu Lys Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Arg Arg Ala Lys Ala
20 25 30
<210> 145
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD219
<400> 145
Trp Ile Arg Leu Trp Thr His Leu Trp His Ile Trp Gln Gln Gly Lys
1 5 10 15
Arg Ile Lys Ala Lys Arg Ala
20
<210> 146
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD221
<400> 146
Trp Lys Leu Ile Arg Leu Phe Thr Arg Leu Ile Lys Ile Trp Gly Gln
1 5 10 15
Arg Arg Leu Lys Ala Lys Arg Ala
20
<210> 147
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD222
<400> 147
Leu Ala Arg Ala Phe Ala Arg Ala Ile Lys Ile Phe Gly Gln Arg Arg
1 5 10 15
Leu Lys Ala Lys Arg Ala
20
<210> 148
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD223
<400> 148
Leu Ala Arg Ala Phe Ala Arg Ala Ile Lys Ile Phe Gln Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Arg Arg Leu Lys Ala Lys Arg Ala
20 25
<210> 149
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD224
<400> 149
Lys Trp Lys Leu Ala Arg Ala Phe Ala Arg Ala Ile Lys Ile Phe Gly
1 5 10 15
Gln Arg Arg Leu Lys Ala Lys Arg Ala
20 25
<210> 150
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD225
<400> 150
Lys Trp Lys Leu Ala Arg Ala Phe Ala Arg Ala Ile Lys Ile Phe Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Arg Arg Leu Lys Ala Lys Arg Ala
20 25 30
<210> 151
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD226
<400> 151
Lys Trp Lys Leu Ala Arg Ala Phe Ala Arg Ala Ile Lys Ile Phe Gly
1 5 10 15
Gln Arg Arg Leu Gly Ala Arg Ala Gln Ala Arg
20 25
<210> 152
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD227
<400> 152
Lys Trp Lys Leu Ala Arg Ala Phe Ala Arg Ala Ile Lys Ile Phe Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Arg Arg Leu Gly Ala Arg Ala Gln Ala
20 25 30
Arg
<210> 153
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD228
<400> 153
Lys Trp Lys Leu Ala Arg Ala Phe Ala Arg Ala Ile Lys Ile Phe Gly
1 5 10 15
Gln Arg Arg Leu Lys Ala Lys Arg Ala Lys Ala
20 25
<210> 154
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD229
<400> 154
Lys Trp Lys Leu Ala Arg Ala Phe Ala Arg Ala Ile Lys Ile Phe Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Arg Arg Leu Lys Ala Lys Arg Ala Lys
20 25 30
Ala
<210> 155
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD230
<400> 155
Lys Trp Lys Leu Ala Lys Ala Trp Ala Arg Ala Leu Lys Leu Trp Gly
1 5 10 15
Arg Arg Leu Gly Ala Arg Ala Gln Ala Arg
20 25
<210> 156
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD231
<400> 156
Lys Trp Lys Leu Ala Arg Ala Phe Ala Arg Ala Ile Lys Lys Leu Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Arg Arg Leu Lys Ala Lys Arg Ala Leu Lys
20 25 30
Ala
<210> 157
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD232
<400> 157
Lys Trp Lys Trp Ala Arg Ala Trp Ala Arg Ala Trp Lys Lys Trp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Arg Arg Leu Gly Ala Arg Ala Gln Ala Arg
20 25 30
<210> 158
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD233
<400> 158
Lys Leu Lys Leu Ala Arg Ala Leu Ala Arg Ala Leu Lys Lys Leu Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Arg Arg Leu Gly Ala Arg Ala Gln Ala Arg
20 25 30
<210> 159
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD234
<400> 159
Lys Ile Lys Ile Ala Arg Ala Ile Ala Arg Ala Ile Lys Lys Ile Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Arg Arg Leu Gly Ala Arg Ala Gln Ala Arg
20 25 30
<210> 160
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD235
<400> 160
Lys Phe Lys Phe Ala Arg Ala Phe Ala Arg Ala Phe Lys Lys Phe Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Arg Arg Leu Gly Ala Arg Ala Gln Ala Arg
20 25 30
<210> 161
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD236
<400> 161
Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Lys Leu Trp Ser
1 5 10 15
Arg Leu Leu Lys Leu Trp Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Arg Arg Leu
20 25 30
Gly Ala Arg Ala Gln Ala Arg
35
<210> 162
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD237
<400> 162
Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp Thr Gln Leu Leu Lys Leu Trp Thr
1 5 10 15
Gln Leu Leu Lys Leu Trp Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Arg Arg Leu
20 25 30
Gly Ala Arg Ala Gln Ala Arg
35
<210> 163
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD238
<400> 163
Lys Trp Lys Leu Leu Lys Ile Trp Ser Arg Leu Ile Lys Ile Trp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Ala Arg Ala Gln Ala Arg Gln Ala Arg
20 25 30
<210> 164
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD239
<400> 164
Lys Trp Lys Leu Leu Lys Ile Trp Thr Gln Leu Ile Lys Ile Trp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Ala Arg Gln Ala Arg Gln Ala Arg
20 25 30
<210> 165
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD240
<400> 165
Lys Trp Lys Ala Leu Leu Ala Leu Ala Leu His Leu Ala His Leu Ala
1 5 10 15
Leu His Leu Lys Lys Ala Gly Arg Arg Lys Gly Ala Gln Ala Ala Phe
20 25 30
Arg
<210> 166
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD241
<400> 166
Lys Trp Lys Leu Ala Arg Ala Phe Ala Arg Ala Ile Lys Lys Leu Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg
20 25 30
Ala
<210> 167
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD243
<400> 167
Leu Leu Lys Ile Trp Ser Arg Leu Ile Lys Ile Trp Thr Gln Gly Arg
1 5 10 15
Arg Leu Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg
20 25 30
Gln Ala Arg Ala
35
<210> 168
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD244
<400> 168
Lys Trp Lys Leu Ala Lys Ala Trp Ala Arg Ala Leu Lys Leu Trp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Lys Ala Lys
20 25 30
Arg Ala
<210> 169
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD246
<400> 169
Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Lys Leu Trp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Lys Ala Lys
20 25 30
Arg Ala
<210> 170
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD247
<400> 170
Leu Leu Lys Ile Trp Ser Arg Leu Ile Lys Ile Trp Thr Gln Gly Arg
1 5 10 15
Arg Leu Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg
20 25 30
Lys Ala Lys Arg Ala
35
<210> 171
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD248
<400> 171
Lys Trp Lys Leu Ala Lys Ala Trp Ala Arg Ala Leu Lys Leu Trp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Arg Ala Ala Arg Gln Ala Arg
20 25 30
<210> 172
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD250 乱序
<400> 172
Arg Gly Lys Leu Trp Ser Leu Ser Lys Leu Lys Gly Trp Gly Gly Ala
1 5 10 15
Arg Ala Ser Lys Ala Gln Leu Ala Arg Leu Gly Leu Trp Arg
20 25 30
<210> 173
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD250E
<400> 173
Lys Trp Lys Leu Leu Glu Leu Trp Ser Glu Leu Leu Glu Leu Trp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Arg Ala Ala Arg Gln Ala Arg
20 25 30
<210> 174
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD251
<400> 174
Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Lys Leu Trp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Glu Ala Ala Glu Gln Ala Glu
20 25 30
<210> 175
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD254
<400> 175
Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Lys Leu Trp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Arg Gly Gly Arg Gly Ser Ala Arg Ala Ala Arg Gln Ala Arg
20 25 30
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<211> 32
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 176
Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp Gly Gly Ser Arg Leu Leu Lys Leu
1 5 10 15
Trp Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Arg Ala Ala Arg Gln Ala Arg
20 25 30
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<211> 33
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<213> 人工序列
<220>
<223> FSD256
<400> 177
Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Gly Arg Trp Ser Arg Leu Gly Leu Lys
1 5 10 15
Leu Trp Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Arg Ala Ala Arg Gln Ala
20 25 30
Arg
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<211> 32
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 178
Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp Ala Ala Ser Arg Leu Leu Lys Leu
1 5 10 15
Trp Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Arg Ala Ala Arg Gln Ala Arg
20 25 30
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<211> 33
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<220>
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<400> 179
Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Ala Arg Trp Ser Arg Leu Ala Leu Lys
1 5 10 15
Leu Trp Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Arg Ala Ala Arg Gln Ala
20 25 30
Arg
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Arg Trp Arg Leu Leu Arg Leu Trp Ser Arg Leu Leu Arg Leu Trp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Arg Ala Ala Arg Gln Ala Arg
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<211> 30
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<213> 人工序列
<220>
<223> FSD261
<400> 181
Gly Gly Ser Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Lys Leu Trp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Arg Ala Ala Arg Gln Ala Arg
20 25 30
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<212> PRT
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<220>
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Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Lys Leu Trp Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Ala Arg Ala Ala Arg Gln Ala Arg
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<211> 31
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<213> 人工序列
<220>
<223> FSD267
<400> 183
Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Lys Leu Trp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Ala Arg Ala Ala Arg Tyr Ala Arg
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 184
Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Lys Leu Trp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Ala Arg Ala Tyr Ala Arg Tyr Ala Arg
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<220>
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Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Lys Leu Trp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala Ala Glu Lys
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Lys Trp Lys Leu Ala Arg Ala Trp Ser Arg Leu Leu Lys Leu Trp Gly
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Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Arg Ala Ala Arg Gln Ala Arg
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<211> 30
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<220>
<223> FSD275
<400> 187
Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Ala Lys Leu Trp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Arg Ala Ala Arg Gln Ala Arg
20 25 30
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<211> 30
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<213> 人工序列
<220>
<223> FSD276
<400> 188
Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Arg Ala Trp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Arg Ala Ala Arg Gln Ala Arg
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<220>
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Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Ala Arg Ala Trp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Arg Ala Ala Arg Gln Ala Arg
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<220>
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Lys Trp Lys Leu Ala Arg Ala Trp Ser Arg Leu Ala Arg Ala Trp Gly
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Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Arg Ala Ala Arg Gln Ala Arg
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Lys Trp Lys Leu Ala Arg Ala Leu Ala Arg Ala Trp Ser Arg Gly Gly
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Ser Gly Gly Gly Ser Ala Arg Ala Ala Arg Gln Ala Arg
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Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp Lys Arg Leu Leu Lys Lys Trp Gly
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Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Arg Ala Ala Arg Gln Ala Arg
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<212> PRT
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<220>
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Lys Trp Ser Leu Leu Lys Leu Trp Ser Ala Leu Leu Lys Leu Trp Gly
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Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Arg Ala Ala Arg Gln Ala Arg
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Lys Trp Lys Leu Trp Lys Leu Leu Ser Arg Leu Trp Lys Leu Leu Gly
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Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Arg Ala Ala Arg Gln Ala Arg
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Lys Trp Lys Leu Ala Arg Lys Phe Lys Arg Ala Ile Lys Lys Phe Gly
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Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Arg Ala Ala Arg Gln Ala Arg
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Lys Trp Ala Leu Ala Arg Ala Phe Ala Arg Ala Ile Ala Ile Phe Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Arg Ala Ala Arg Gln Ala Arg
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Leu Ala Arg Ala Phe Ala Arg Ala Ile Lys Ile Phe Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Gln Arg Arg Leu Gly Ala Arg Ala Gln Ala Arg
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<213> 人工序列
<220>
<223> FSD287
<400> 198
Lys Trp Lys Leu Leu Arg Ala Leu Ala Arg Leu Leu Lys Ala Leu Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Arg Arg Leu Gly Ala Arg Ala Gln Ala
20 25 30
Arg
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<212> PRT
<213> 人工序列
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Lys Trp Lys Leu Leu Lys Trp Trp Ser Arg Leu Leu Lys Trp Trp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Ala Arg Ala Gln Ala Arg Gln Ala Arg
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<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD289
<400> 200
Lys Trp Lys Leu Leu Lys Phe Trp Ser Arg Leu Leu Lys Phe Trp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Ala Arg Ala Gln Ala Arg Gln Ala Arg
20 25 30
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<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD290
<400> 201
Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Tyr Ser Arg Leu Leu Lys Leu Tyr Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Ala Arg Ala Gln Ala Arg Gln Ala Arg
20 25 30
<210> 202
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 202
Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Phe Ser Arg Leu Leu Lys Leu Phe Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Ala Arg Ala Gln Ala Arg Gln Ala Arg
20 25 30
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<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD292
<400> 203
Lys Trp Lys Leu Leu Ser Leu Trp Ser Ser Leu Leu Ser Leu Trp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Ala Arg Ala Gln Ala Arg Gln Ala Arg
20 25 30
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 204
Lys Trp Lys Leu Leu Ser Leu Trp Ser Arg Leu Leu Ser Leu Trp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Ala Arg Ala Gln Ala Arg Gln Ala Arg
20 25 30
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<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD2294
<400> 205
Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp Ser Ser Leu Leu Lys Leu Trp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Ala Arg Ala Gln Ala Arg Gln Ala Arg
20 25 30
<210> 206
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD295
<400> 206
Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp Ser Leu Leu Lys Leu Trp Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Gly Gly Ser Gln Ala Arg Ala Gln Ala Arg Gln Ala Arg
20 25 30
<210> 207
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD296
<400> 207
Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Lys Leu Trp Gln
1 5 10 15
Gln Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Ala Arg Ala Gln Ala Arg Gln
20 25 30
Ala Arg
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<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD297
<400> 208
Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Lys Leu Trp Asn
1 5 10 15
Asn Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Ala Arg Ala Gln Ala Arg Gln
20 25 30
Ala Arg
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<211> 32
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<220>
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<400> 209
Ser Trp Ser Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Lys Leu Trp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Ala Arg Ala Gln Ala Arg Gln Ala Arg
20 25 30
<210> 210
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Lys Leu Trp Ile
1 5 10 15
Lys Ile Phe Gly Gln Ala Arg Ala Gln Ala Arg Gln Ala Arg
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<210> 211
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 211
Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Lys Leu Trp Trp
1 5 10 15
Arg Ile Phe Gly Gln Ala Arg Ala Gln Ala Arg Gln Ala Arg
20 25 30
<210> 212
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<212> PRT
<213> 人工序列
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp Ser
1 5 10 15
Arg Leu Leu Lys Leu Trp Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
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<213> 人工序列
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Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Lys Leu Trp Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gln Ala Arg Ala Gln Ala Arg Gln Ala Arg
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 214
Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Lys Leu Trp Gly
1 5 10 15
Gln Ala Arg Ala Gln Ala Arg Gln Ala Arg
20 25
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<211> 25
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 215
Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Lys Leu Trp Gln
1 5 10 15
Ala Arg Ala Gln Ala Arg Gln Ala Arg
20 25
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<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 216
Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Lys Leu Trp Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gln Ala Arg Ala Gln Ala Arg Gln Ala Arg
20 25 30
<210> 217
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD306
<400> 217
Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Lys Leu Trp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Ala Arg Gln Ala Arg
20 25
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<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 218
Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Lys Leu Trp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Ala Arg
20 25
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<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 219
Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Lys Leu Trp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ala Arg Ala Gly Ala Arg Gly Ala Arg
20 25 30
<210> 220
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD309
<400> 220
Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Lys Leu Trp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Ala Gly Ala Gln Ala Gly Gln Ala Gly
20 25 30
<210> 221
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 221
Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Lys Leu Trp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Gly Arg Gly Gln Gly Arg Gln Gly Arg
20 25 30
<210> 222
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD311
<400> 222
Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Lys Leu Trp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Arg Gly Gly Arg Gly Gly Gly Arg
20 25 30
<210> 223
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD312
<400> 223
Trp Ile Arg Leu Phe Thr Lys Leu Trp Ile Phe Gln Gln Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Lys Arg Ile Lys Ala Lys Arg Ala
20 25
<210> 224
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD313
<400> 224
Trp Ile Arg Leu Phe Ser Arg Leu Trp Arg Ile Phe Gln Gln Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Gly Gly Ser Lys Arg Ile Lys Ala Lys Arg Ala
20 25
<210> 225
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD314
<400> 225
Lys Trp Lys Trp Ile Arg Leu Phe Ser Arg Leu Trp Arg Ile Phe Gln
1 5 10 15
Gln Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Lys Arg Ile Lys Ala Lys Arg Ala
20 25 30
<210> 226
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD315
<400> 226
Trp Ile Arg Leu Phe Ser Arg Leu Trp Arg Ile Phe Gln Gln Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Gly Gly Ser Gln Ala Arg Ala Gln Ala Arg Gln Ala Arg
20 25 30
<210> 227
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD316
<400> 227
Lys Trp Lys Trp Ile Arg Leu Phe Ser Arg Leu Trp Arg Ile Phe Gln
1 5 10 15
Gln Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Ala Arg Ala Gln Ala Arg Gln
20 25 30
Ala Arg
<210> 228
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD317
<400> 228
Trp Ile Arg Leu Phe Thr Lys Leu Trp Gln Ile Phe Gln Gln Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Arg Ala Ala Arg Gln Ala Arg
20 25 30
<210> 229
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD318
<400> 229
Trp Ile Arg Leu Phe Thr Lys Leu Trp Arg Ile Phe Gln Gln Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Arg Ala Ala Arg Gln Ala Arg
20 25 30
<210> 230
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD319
<400> 230
Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Lys Leu Trp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala Ala Gln Lys
20 25
<210> 231
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD320
<400> 231
Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Lys Leu Trp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala Ala Gln Gln
20 25
<210> 232
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD321
<400> 232
Lys Trp Lys Leu Ala Lys Ala Trp Ser Arg Ala Ile Lys Ile Trp Gly
1 5 10 15
Ala Arg Ala Gln Ala Arg Gln Ala
20
<210> 233
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD322
<400> 233
Lys Trp Lys Leu Ala Lys Ala Trp Ser Arg Ala Leu Lys Leu Trp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Arg Ala Gln Ala Arg Gln Ala
20 25 30
<210> 234
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD323
<400> 234
Trp Ile Arg Leu Phe Thr Arg Leu Ile Lys Ile Trp Gly Gln Arg Arg
1 5 10 15
Leu Lys Ala Lys Arg Ala
20
<210> 235
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD324
<400> 235
Trp Ala Arg Ala Phe Ala Arg Ala Trp Arg Ile Phe Gln Gln Arg Arg
1 5 10 15
Leu Lys Ala Lys Arg Ala
20
<210> 236
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD325
<400> 236
Trp Ala Arg Ala Phe Ala Arg Ala Trp Arg Ile Phe Gln Gln Arg Arg
1 5 10 15
Leu Ala Arg Ala Ala Arg Gln Ala Arg
20 25
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<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD326
<400> 237
Leu Ala Arg Ala Phe Ala Arg Ala Ile Lys Ile Phe Gly Gln Ala Arg
1 5 10 15
Ala Gln Ala Arg Gln Ala Arg
20
<210> 238
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD327
<400> 238
Leu Ala Arg Ala Phe Ala Arg Ala Ile Lys Ile Phe Gly Arg Arg Leu
1 5 10 15
Lys Ala Lys Arg Ala Lys Ala
20
<210> 239
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD328
<400> 239
Leu Ala Arg Ala Phe Ala Arg Ala Ile Lys Ile Phe Gly Arg Arg Leu
1 5 10 15
Gly Ala Arg Ala Gln Ala Arg
20
<210> 240
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD330
<400> 240
Leu Ala Arg Ala Phe Ala Arg Ala Leu Leu Lys Leu Trp Gly Gln Arg
1 5 10 15
Arg Leu Lys Ala Lys Arg Ala
20
<210> 241
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD331
<400> 241
Lys Trp Lys Leu Ala Arg Ala Phe Ala Arg Ala Gly Gln Arg Arg Leu
1 5 10 15
Lys Ala Lys Arg Ala
20
<210> 242
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD332
<400> 242
Lys Trp Lys Leu Ala Arg Ala Phe Ala Arg Ala Gly Arg Arg Leu Gly
1 5 10 15
Ala Arg Ala Gln Ala Arg
20
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD333
<400> 243
Lys Trp Lys Leu Leu Arg Leu Leu Leu Arg Leu Leu Lys Lys Leu Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Ala Arg Ala Gln Ala Arg Gln Ala Arg
20 25 30
<210> 244
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD334
<400> 244
Lys Trp Lys Leu Leu Arg Trp Leu Trp Arg Leu Leu Lys Lys Leu Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Ala Arg Ala Gln Ala Arg Gln Ala Arg
20 25 30
<210> 245
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD335
<400> 245
Lys Trp Lys Leu Ala Arg Leu Leu Leu Arg Ala Leu Lys Lys Leu Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Ala Arg Ala Gln Ala Arg Gln Ala Arg
20 25 30
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<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD336
<400> 246
Lys Trp Lys Leu Leu Arg Leu Phe Leu Arg Leu Phe Lys Lys Leu Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Ala Arg Ala Gln Ala Arg Gln Ala Arg
20 25 30
<210> 247
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD337
<400> 247
Lys Trp Lys Leu Ala Arg Trp Leu Trp Arg Ala Leu Lys Lys Leu Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Ala Arg Ala Gln Ala Arg Gln Ala Arg
20 25 30
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<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD338
<400> 248
Lys Trp Lys Leu Leu Arg Trp Phe Trp Arg Leu Phe Lys Lys Leu Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Ala Arg Ala Gln Ala Arg Gln Ala Arg
20 25 30
<210> 249
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD339
<400> 249
Lys Trp Lys Leu Ala Arg Leu Phe Leu Arg Ala Phe Lys Lys Leu Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Ala Arg Ala Gln Ala Arg Gln Ala Arg
20 25 30
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<213> 人工序列
<220>
<223> FSD340
<400> 250
Lys Trp Lys Leu Ala Arg Trp Phe Trp Arg Ala Phe Lys Lys Leu Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Ala Arg Ala Gln Ala Arg Gln Ala Arg
20 25 30
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<213> 人工序列
<220>
<223> FSD341
<400> 251
Leu Leu Lys Ile Trp Ser Arg Leu Ile Lys Ile Trp Thr Gln Gly Arg
1 5 10 15
Arg Leu Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Ala Arg Ala Leu Arg Arg
20 25 30
Gln Ala Arg Thr Gly
35
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD342
<400> 252
Lys Trp Lys Leu Ala Arg Trp Phe Trp Arg Ala Phe Lys Lys Leu Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Ala Arg Ala Leu Arg Arg Gln Ala Arg
20 25 30
Thr Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Lys Trp Lys Leu Leu Gln Leu Trp Ser Arg Leu Leu Gln Leu Trp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Arg Ala Ala Arg Gln Ala Arg
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD344
<400> 254
Gln Trp Gln Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Lys Leu Trp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Arg Ala Ala Arg Gln Ala Arg
20 25 30
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD345
<400> 255
Lys Leu Lys Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Lys Leu Trp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Arg Ala Ala Arg Gln Ala Arg
20 25 30
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<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD346
<400> 256
Lys Phe Lys Leu Leu Lys Leu Phe Ser Arg Leu Leu Lys Leu Phe Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Arg Ala Ala Arg Gln Ala Arg
20 25 30
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<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Leu Ser Arg Leu Leu Lys Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Arg Ala Ala Arg Gln Ala Arg
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD348
<400> 258
Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Leu Ser Arg Leu Leu Lys Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Arg Ala Ala Arg Gln Ala Arg
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD349
<400> 259
Lys Trp Lys Trp Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Trp Lys Leu Trp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Arg Ala Ala Arg Gln Ala Arg
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<213> 人工序列
<220>
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Lys Trp Lys Leu Leu Lys Phe Trp Ser Arg Leu Leu Lys Phe Trp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Arg Ala Ala Arg Gln Ala Arg
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<213> 人工序列
<220>
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Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Phe Ser Arg Leu Phe Lys Leu Trp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Arg Ala Ala Arg Gln Ala Arg
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<213> 人工序列
<220>
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Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Ile Lys Ile Trp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Arg Ala Ala Arg Gln Ala Arg
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<213> 人工序列
<220>
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Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Gln Ser Arg Leu Leu Lys Leu Gln Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Arg Ala Ala Arg Gln Ala Arg
20 25 30
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<213> 人工序列
<220>
<223> FSD354
<400> 264
Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Lys Leu Trp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Gly Arg
20 25
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<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD355
<400> 265
Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Lys Leu Trp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ala Arg
20 25
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<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD356
<400> 266
Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Lys Leu Trp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Ala Gly
20 25
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<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD357
<400> 267
Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Lys Leu Trp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Arg Arg Arg
20 25
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<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD358
<400> 268
Lys Trp Lys Leu Leu His Leu Trp Ser Arg Leu Leu His Leu Trp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Arg Ala Ala Arg Gln Ala Arg
20 25 30
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<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD359
<400> 269
Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp Ser Lys Leu Leu Lys Leu Trp Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Lys Ala Ala Lys Gln Ala Lys
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<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD360
<400> 270
Arg Trp Arg Leu Leu Arg Leu Trp Ser Arg Leu Leu Arg Leu Trp Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Arg Ala Ala Arg Gln Ala Arg
20 25 30
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD361
<400> 271
Leu Leu Lys Leu Trp Ser Lys Leu Leu Lys Leu Trp Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ala Lys Ala Ala Lys Gln Ala Lys
20 25
<210> 272
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD362
<400> 272
Leu Leu Arg Leu Trp Ser Arg Leu Leu Arg Leu Trp Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ala Arg Ala Ala Arg Gln Ala Arg
20 25
<210> 273
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD363
<400> 273
Leu Leu Lys Leu Trp Ser Lys Leu Leu Lys Leu Trp Gly Gly Gly Ala
1 5 10 15
Lys Ala Ala Lys Gln Ala Lys
20
<210> 274
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD364
<400> 274
Leu Leu Arg Leu Trp Ser Arg Leu Leu Arg Leu Trp Gly Gly Gly Ala
1 5 10 15
Arg Ala Ala Arg Gln Ala Arg
20
<210> 275
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD365
<400> 275
Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Lys Leu Trp Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gln Ala Arg
20
<210> 276
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD366
<400> 276
Lys Trp Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Lys Leu Trp Gly Gly Gly Gln
1 5 10 15
Ala Arg
<210> 277
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD367
<400> 277
Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Lys Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gln Ala Arg
<210> 278
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD368
<400> 278
Lys Trp Lys Leu Ala Arg Ala Phe Ala Arg Ala Ser Arg Leu Leu Lys
1 5 10 15
Leu Trp Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Arg Ala Ala Arg Gln Ala
20 25 30
Arg
<210> 279
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD369
<400> 279
Lys Trp Lys Leu Ala Arg Ala Phe Ala Arg Ala Leu Lys Leu Trp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Arg Ala Ala Arg Gln Ala Arg
20 25 30
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<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD370
<400> 280
Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Lys Lys Leu Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Arg Ala Ala Arg Gln Ala Arg
20 25 30
<210> 281
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD371
<400> 281
Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Lys Leu Trp Gln
1 5 10 15
Gln Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Arg Ala Ala Arg Gln Ala Arg
20 25 30
<210> 282
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD372
<400> 282
Lys Trp Lys Leu Ala Arg Ala Phe Ala Arg Ala Ile Lys Lys Leu Asn
1 5 10 15
Asn Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Ala Arg Ala Leu Arg Arg Gln
20 25 30
Ala Arg Thr Gly
35
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD373
<400> 283
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu
1 5 10 15
Lys Leu Trp Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 284
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD374
<400> 284
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu Leu Lys Ile Trp Ser Arg Leu Ile
1 5 10 15
Lys Ile Trp Thr Gln Gly Arg Arg Leu Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
20 25 30
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<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD375
<400> 285
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Lys Trp Lys Leu Ala Arg Ala Phe Ala
1 5 10 15
Arg Ala Ile Lys Lys Leu Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 286
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD376
<400> 286
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu Ala Arg Ala Phe Ala Arg Ala Ile
1 5 10 15
Lys Ile Phe Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 287
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD377
<400> 287
Gly Gly Gly Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp Ser Arg Leu Leu Lys
1 5 10 15
Leu Trp Gly Gly Gly
20
<210> 288
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD378
<400> 288
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Lys Trp Lys Trp Ile Arg Leu Phe Ser
1 5 10 15
Arg Trp Ile Arg Leu Phe Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
20 25
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<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD379
<400> 289
Lys Trp Lys Leu Ser Lys Leu Trp Ser Lys Leu Ser Lys Leu Trp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Arg Ala Ala Arg Gln Ala Arg
20 25 30
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<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD381
<400> 290
Leu Leu Lys Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Lys Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Ala Arg Ala Gln Ala Arg Gln Ala Arg
20 25 30
<210> 291
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD382
<400> 291
Leu Leu Lys Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Lys Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Arg Ala Gln Ala Arg Gln Ala Arg
20 25
<210> 292
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD383
<400> 292
Leu Leu Lys Leu Leu Leu Lys Leu Leu Lys Leu Leu Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Gln Ala Arg Ala Gln Ala Arg Gln Ala Arg
20 25
<210> 293
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD384
<400> 293
Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Lys Leu Leu Gly Gln Ala Arg
1 5 10 15
Ala Gln Ala Arg Gln Ala Arg
20
<210> 294
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD385
<400> 294
Leu Leu Lys Leu Leu Lys Leu Leu Leu Lys Leu Leu Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Gln Ala Arg Ala Gln Ala Arg Gln Ala Arg
20 25
<210> 295
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD386
<400> 295
Leu Leu Lys Leu Leu Lys Leu Leu Leu Lys Leu Leu Lys Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Lys Gly Gly Gly Lys Gly Gly Lys
20 25
<210> 296
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD387
<400> 296
Gln Leu Gln Leu Leu Arg Leu Leu Leu Arg Leu Leu Lys Lys Leu Gln
1 5 10 15
Leu Gln
<210> 297
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD388
<400> 297
Lys Trp Lys Leu Ala Arg Ala Phe Ser Arg Ala Ile Lys Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Ala Arg Ala Leu Arg Arg Gln Ala Arg
20 25 30
Thr Gly
<210> 298
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD389
<400> 298
Lys Trp Lys Leu Ala Lys Ala Phe Ser Lys Ala Ile Lys Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Ala Lys Ala Leu Lys Lys Gln Ala Lys
20 25 30
Thr Gly
<210> 299
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD390
<400> 299
Lys Trp Lys Leu Trp Ser Lys Leu Leu Lys Leu Trp Ser Lys Leu Trp
1 5 10 15
Lys
<210> 300
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD391
<400> 300
Gly Gly Lys Gly Gly Lys Gly Gly Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp
1 5 10 15
Ser Arg Leu Leu Lys Leu Trp Gly Gly Lys Gly Gly Lys Gly Gly
20 25 30
<210> 301
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD392
<400> 301
Gly Gly Trp Gly Gly Trp Gly Gly Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp
1 5 10 15
Ser Arg Leu Leu Lys Leu Trp Gly Gly Trp Gly Gly Trp Gly Gly
20 25 30
<210> 302
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD393
<400> 302
Arg Ala Gln Arg Ala Ala Arg Ala Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Trp
1 5 10 15
Leu Lys Leu Leu Arg Ser Trp Leu Lys Leu Leu Lys Trp Lys
20 25 30
<210> 303
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD394
<400> 303
Lys Trp Lys Leu Ala Arg Ala Phe Ala Arg Ala Ile Lys Ile Phe Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Lys Trp Lys Leu Ala Arg Ala
20 25 30
Phe Ala Arg Ala Ile Lys Ile Phe
35 40
<210> 304
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD395
<400> 304
Lys Leu Lys Leu Leu Lys Leu Leu Leu Lys Leu Leu Lys Lys Leu Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Ala Lys Ala Gln Ala Lys Gln Ala Lys
20 25 30
<210> 305
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD396
<400> 305
Lys Leu Lys Leu Ala Lys Leu Leu Leu Lys Ala Leu Lys Lys Leu Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Ala Lys Ala Gln Ala Lys Gln Ala Lys
20 25 30
<210> 306
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD397
<400> 306
Lys Leu Lys Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Lys Lys Leu Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Ala Lys Ala Gln Ala Lys Gln Ala Lys
20 25 30
<210> 307
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD398
<400> 307
Lys Leu Lys Leu Leu Lys Ala Leu Ala Lys Leu Leu Lys Lys Ala Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Ala Lys Ala Gln Ala Lys Gln Ala Lys
20 25 30
<210> 308
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD399
<400> 308
Lys Leu Lys Leu Ala Lys Ala Leu Leu Lys Ala Leu Lys Lys Leu Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Ala Lys Ala Gln Ala Lys Gln Ala Lys
20 25 30
<210> 309
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD400
<400> 309
Lys Leu Lys Ala Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Lys Ala Leu Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Ala Lys Ala Gln Ala Lys Gln Ala Lys
20 25 30
<210> 310
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD401
<400> 310
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Lys Trp Lys Leu Leu Lys Leu Trp Ser
1 5 10 15
Arg Leu Leu Lys Leu Trp Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Arg Ala
20 25 30
Ala Arg Gln Ala Arg
35
<210> 311
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD402
<400> 311
Leu Leu Lys Leu Leu Leu Lys Leu Leu Lys Lys Leu Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Gln Ala Lys Ala Gln Ala Lys Gln Ala Lys
20 25
<210> 312
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD403
<400> 312
Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Lys Lys Leu Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Gln Ala Lys Ala Gln Ala Lys Gln Ala Lys
20 25
<210> 313
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD404
<400> 313
Lys Leu Lys Leu Leu Leu Lys Leu Leu Lys Lys Leu Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Gln Ala Lys Ala Gln Ala Lys Gln Ala Lys
20 25
<210> 314
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD406
<400> 314
Lys Leu Lys Leu Leu Lys Leu Leu Leu Lys Leu Leu Lys Lys Leu Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Lys Ala Gln Ala Lys Gln Ala
20 25 30
<210> 315
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD407
<400> 315
Lys Leu Lys Leu Leu Lys Leu Leu Leu Lys Leu Leu Lys Lys Leu Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Lys Ala Ala Lys Gln Ala Lys
20 25 30
<210> 316
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD408
<400> 316
Lys Leu Lys Leu Leu Lys Leu Leu Leu Lys Leu Leu Lys Lys Leu Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Ala Gly
20 25
<210> 317
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD409
<400> 317
Lys Leu Lys Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Lys Lys Leu Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Ala Gly
20 25
<210> 318
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD410
<400> 318
Lys Leu Lys Leu Leu Lys Leu Leu Leu Lys Leu Leu Lys Lys Leu Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Leu Ala Lys
20 25 30
<210> 319
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD411
<400> 319
Lys Leu Lys Leu Leu Lys Leu Leu Leu Lys Leu Leu Lys Lys Leu Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Ala Lys Ala Leu Ala Lys Gln Ala Lys
20 25 30
<210> 320
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD412
<400> 320
Lys Leu Lys Leu Leu Lys Leu Leu Leu Lys Leu Leu Lys Lys Leu Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu Ala Gly
20 25
<210> 321
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD413
<400> 321
Lys Leu Lys Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Lys Lys Leu Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Ala Lys Ala Leu Ala Lys Gln Ala Lys
20 25 30
<210> 322
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD414
<400> 322
Leu Leu Lys Lys Leu Leu His Leu Leu His Ser Leu Leu Gln Asn Leu
1 5 10 15
Lys Lys Leu Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Ala Lys Ala Gln Ala
20 25 30
Lys Gln Ala Lys
35
<210> 323
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD415
<400> 323
Leu Ile Arg Lys Trp Ile His Leu Ile His Ser Trp Phe Gln Asn Leu
1 5 10 15
Arg Arg Leu Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Ala Lys Ala Gln Ala
20 25 30
Lys Gln Ala Lys
35
<210> 324
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD416
<400> 324
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Lys Trp Lys Leu Ala Lys Ala Trp Ser
1 5 10 15
Arg Ala Leu Lys Leu Trp Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 325
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD417
<400> 325
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu Ala Lys Ala Trp Ser Arg Ala Leu
1 5 10 15
Lys Leu Trp Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 326
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD418
<400> 326
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Lys Leu Lys Leu Leu Lys Leu Leu Leu
1 5 10 15
Lys Leu Leu Lys Lys Leu Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 327
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD419
<400> 327
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Lys Leu Lys Leu Ala Lys Ala Leu Ala
1 5 10 15
Lys Ala Leu Lys Lys Leu Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 328
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD421
<400> 328
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu Leu Lys Lys Leu Leu His Leu Leu
1 5 10 15
His Ser Leu Leu Gln Asn Leu Lys Lys Leu Gly Gly Ser Gly Gly Gly
20 25 30
Ser
<210> 329
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD422
<400> 329
His His His His His His Lys Trp Lys Leu Ala Arg Ala Phe Ala Arg
1 5 10 15
Ala Ile Lys Lys Leu His His His His His His
20 25
<210> 330
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD423
<400> 330
His His His His His His Leu Ala Arg Ala Phe Ala Arg Ala Ile Lys
1 5 10 15
Ile Phe His His His His His His
20
<210> 331
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD424
<400> 331
Lys Trp Lys Leu Ala Arg Ala Phe Ala Arg Ala Ile Lys Lys Leu Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 332
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD425
<400> 332
Lys Leu Lys Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Lys Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Ala Lys Ala Gln Ala Lys Gln Ala Lys
20 25 30
<210> 333
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD426
<400> 333
Lys Leu Lys Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Lys Lys Leu Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Lys Lys Leu Lys Ala Lys Lys Ala Leu Lys
20 25 30
Ala
<210> 334
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD427
<400> 334
Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Lys Lys Leu Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Lys Lys Leu Lys Ala Lys Lys Ala Leu Lys Ala
20 25 30
<210> 335
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD428
<400> 335
Lys Leu Lys Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Lys Lys Leu Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Lys Lys Leu Lys Ala Lys Lys Ala
20 25 30
<210> 336
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD429
<400> 336
Lys Leu Lys Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Lys Lys Leu Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Lys Lys Leu Lys Ala Lys
20 25
<210> 337
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD430
<400> 337
Lys Leu Lys Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Lys Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Lys Lys Leu Lys Ala Lys Leu Ala Leu Lys
20 25 30
Ala
<210> 338
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD431
<400> 338
Lys Trp Lys Leu Ala Lys Ala Phe Ala Lys Ala Ile Lys Lys Leu Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Ala Lys Ala Leu Lys Lys Gln Ala Lys
20 25 30
Thr Gly
<210> 339
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD432
<400> 339
Lys Trp Lys Leu Ala Arg Ala Phe Ala Arg Ala Ile Lys Lys Leu Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Ala Lys Ala Gln Ala Lys Gln Ala Lys
20 25 30
<210> 340
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD433
<400> 340
Lys Leu Lys Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Lys Lys Leu Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Ala Arg Ala Leu Arg Arg Gln Ala Arg
20 25 30
Thr Gly
<210> 341
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD434
<400> 341
Lys Trp Lys Leu Ala Lys Ala Phe Ala Lys Ala Ile Lys Lys Leu Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Lys Gly Gly Lys Lys Gln Gly Lys
20 25 30
Thr Gly
<210> 342
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD435
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(32)
<223> Xaa 是 L-2,4-二氨基丁酸
<400> 342
Xaa Leu Xaa Leu Leu Xaa Leu Leu Leu Xaa Leu Leu Xaa Xaa Leu Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Ala Xaa Ala Gln Ala Xaa Gln Ala Xaa
20 25 30
<210> 343
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD436
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(22)
<223> Xaa 是 (2-萘基)-L-丙氨酸
<400> 343
Leu Ala Arg Ala Xaa Ala Arg Ala Ile Lys Ile Xaa Gly Gln Arg Arg
1 5 10 15
Leu Lys Ala Lys Arg Ala
20
<210> 344
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FSD438
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(1)
<223> N末端辛酸
<400> 344
Lys Trp Lys Leu Ala Arg Ala Phe Ala Arg Ala Ile Lys Lys Leu Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Ala Arg Ala Leu Arg Arg Gln Ala Arg
20 25 30
Thr Gly
Claims (58)
1.一种用于非蛋白质负荷转导的方法,所述方法包括使靶真核细胞与非蛋白质负荷和一定浓度的合成肽穿梭剂接触,与不存在所述合成肽穿梭剂的情况相比,所述浓度的合成肽穿梭剂足以增加所述非蛋白质负荷的转导效率。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述非蛋白质负荷:
(a)是有机化合物;
(b)具有小于10 000、9000、8000、7000、6000、5000、4000、3000、2000或1000Da、或在50至5000、50至4000、50至3000、50至2000或50至1000Da之间的分子量;
(c)是小分子,如与细胞内生物或治疗靶标结合的小分子药物;
(d)不是生物聚合物,如多核苷酸或多糖;
(e)在转导时不与所述合成肽穿梭剂共价连接;或
(f)(a)至(e)的任何组合。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中非蛋白质负荷是用于治疗癌症(例如,皮肤癌、基底细胞癌、痣样基底细胞癌综合征)、炎症或炎症相关疾病(例如,银屑病、特应性皮炎、溃疡性结肠炎、荨麻疹、干眼病、干性或湿性年龄相关性黄斑变性、手指溃疡、光化性角化病、特发性肺纤维化)、疼痛(例如,慢性或急性)或影响肺的疾病(例如,囊性纤维化、哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)或特发性肺纤维化)的药物。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法,其中非蛋白质负荷是或包含刺猬抑制剂(例如,伊曲康唑、泊沙康唑、三氧化二砷(ATO)、Gant61、PF-4708671、HPI-1、HPI-4)、疼痛抑制剂如电压门控钠(Nav)通道抑制剂(例如,QX-314)和/或炎症的抑制剂(例如,炎性细胞因子产生的抑制剂或NF-κB途径抑制剂)。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法,其中所述穿梭剂是:
(1)长度为至少20个氨基酸的肽,所述肽包含
(2)两亲性α-螺旋基序,其具有
(3)带正电的亲水外表面和疏水外表面,
其中遵守以下参数(4)至(15)中的至少五个:
(4)基于每圈具有3.6个残基的α-螺旋的开放圆柱形表示,所述疏水外表面包含由空间上相邻的L、I、F、V、W和/或M氨基酸组成的高疏水核心,所述氨基酸占所述肽的氨基酸的12%至50%;
(5)所述肽具有3.5至11的疏水力矩(μ);
(6)所述肽在生理pH下具有至少+4的预测净电荷;
(7)所述肽具有8至13的等电点(pI);
(8)所述肽由35%至65%的如下氨基酸的任何组合构成:A、C、G、I、L、M、F、P、W、Y和V;
(9)所述肽由0%至30%的如下氨基酸的任何组合构成:N、Q、S和T;
(10)所述肽由35%至85%的如下氨基酸的任何组合构成:A、L、K或R;
(11)所述肽由15%至45%的如下氨基酸的任何组合构成:A和L,前提是所述肽中存在至少5%的L;
(12)所述肽由20%至45%的如下氨基酸的任何组合构成:K和R;
(13)所述肽由0%至10%的如下氨基酸的任何组合构成:D和E;
(14)所述肽中A和L残基的百分比(A+L%)与所述肽中K和R残基的百分比(K+R)之间的差小于或等于10%;以及
(15)所述肽由10%至45%的如下氨基酸的任何组合构成:Q、Y、W、P、I、S、G、V、F、E、D、C、M、N、T和H。
6.根据权利要求5所述的方法,其中:
(a)所述穿梭剂遵守参数(4)至(15)中的至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少十一个,或遵守其全部;
(b)所述穿梭剂是具有20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸的最小长度和40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、60、65、70、80、90、100、110、120、130、140或150个氨基酸的最大长度的肽;
(c)所述两亲性α-螺旋基序具有在3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0的下限与9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9或11.0的上限之间的疏水力矩(μ);
(d)所述两亲性α-螺旋基序包含带正电的亲水外表面,基于连续氨基酸之间的旋转角为100度的α-螺旋和/或每圈具有3.6个残基的α-螺旋,所述带正电的亲水外表面包含:(i)在螺旋轮投影时的至少两个、三个或四个相邻的带正电的K和/或R残基;和/或(ii)在螺旋轮投影时的包含三至五个K和/或R残基的六个相邻残基的区段;
(e)所述两亲性α-螺旋基序包含疏水外表面,基于连续氨基酸之间的旋转角为100度的α-螺旋和/或每圈具有3.6个残基的α-螺旋,所述疏水外表面包含:(i)在螺旋轮投影时的至少两个相邻L残基;和/或(ii)在螺旋轮投影时的包含选自L、I、F、V、W和M的至少五个疏水残基的十个相邻残基的区段;
(f)所述疏水外表面包含高疏水核心,所述高疏水核心由空间上相邻的L、I、F、V、W和/或M氨基酸组成,所述氨基酸占所述穿梭剂的氨基酸的从12.5%、13%、13.5%、14%、14.5%、15%、15.5%、16%、16.5%、17%、17.5%、18%、18.5%、19%、19.5%或20%至25%、30%、35%、40%或45%;
(g)所述穿梭剂具有在4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0的下限与9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.1、10.2、10.3、10.4或10.5的上限之间的疏水力矩(μ);
(h)所述穿梭剂具有在+4、+5、+6、+7、+8、+9至+10、+11、+12、+13、+14或+15之间的预测净电荷;
(i)所述穿梭剂具有10至13的预测pI;或
(j)(a)至(i)的任何组合。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法,其中所述穿梭剂遵守以下参数中的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个或全部:
(8)所述穿梭剂由36%至64%、37%至63%、38%至62%、39%至61%或40%至60%的如下氨基酸的任何组合构成:A、C、G、I、L、M、F、P、W、Y和V;
(9)所述穿梭剂由1%至29%、2%至28%、3%至27%、4%至26%、5%至25%、6%至24%、7%至23%、8%至22%、9%至21%或10%至20%的如下氨基酸的任何组合构成:N、Q、S和T;
(10)所述穿梭剂由36%至80%、37%至75%、38%至70%、39%至65%或40%至60%的如下氨基酸的任何组合构成:A、L、K或R;
(11)所述穿梭剂由15%至40%、20%至40%、20%至35%或20%至30%的如下氨基酸的任何组合构成:A和L;
(12)所述穿梭剂由20%至40%、20%至35%或20%至30%的如下氨基酸的任何组合构成:K和R;
(13)所述穿梭剂由5%至10%的如下氨基酸的任何组合构成:D和E;
(14)所述穿梭剂中A和L残基的百分比(A+L%)与所述穿梭剂中K和R残基的百分比(K+R)之间的差小于或等于9%、8%、7%、6%或5%;以及
(15)所述穿梭剂由15%至40%、20%至35%或20%至30%的如下氨基酸的任何组合构成:Q、Y、W、P、I、S、G、V、F、E、D、C、M、N、T和H。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法,其中所述穿梭剂包含富含组氨酸的结构域,任选地其中所述富含组氨酸的结构域:
(i)朝向所述穿梭剂的N末端和/或C末端定位;
(ii)是包含至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%或至少90%组氨酸残基的至少3、至少4、至少5或至少6个氨基酸的延伸段;和/或包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8或至少9个连续组氨酸残基;或
(iii)(i)和(ii)二者。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法,其中所述穿梭剂包含富含丝氨酸和/或甘氨酸残基的柔性接头结构域。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法,其中所述穿梭剂包含以下氨基酸序列或由其组成:
(a)[X1]-[X2]-[接头]-[X3]-[X4](式1);
(b)[X1]-[X2]-[接头]-[X4]-[X3](式2);
(c)[X2]-[X1]-[接头]-[X3]-[X4](式3);
(d)[X2]-[X1]-[接头]-[X4]-[X3](式4);
(e)[X3]-[X4]-[接头]-[X1]-[X2](式5);
(f)[X3]-[X4]-[接头]-[X2]-[X1](式6);
(g)[X4]-[X3]-[接头]-[X1]-[X2](式7);或
(h)[X4]-[X3]-[接头]-[X2]-[X1](式8),
其中:
[X1]选自:2[Φ]-1[+]-2[Φ]-1[ζ]-1[+]-;2[Φ]-1[+]-2[Φ]-2[+]-;1[+]-1[Φ]-1[+]-2[Φ]-1[ζ]-1[+]-;以及1[+]-1[Φ]-1[+]-2[Φ]-2[+]-;
[X2]选自:-2[Φ]-1[+]-2[Φ]-2[ζ]-;-2[Φ]-1[+]-2[Φ]-2[+]-;-2[Φ]-1[+]-2[Φ]-1[+]-1[ζ]-;-2[Φ]-1[+]-2[Φ]-1[ζ]-1[+]-;-2[Φ]-2[+]-1[Φ]-2[+]-;-2[Φ]-2[+]-1[Φ]-2[ζ]-;-2[Φ]-2[+]-1[Φ]-1[+]-1[ζ]-;以及-2[Φ]-2[+]-1[Φ]-1[ζ]-1[+]-;
[X3]选自:-4[+]-A-;-3[+]-G-A-;-3[+]-A-A-;-2[+]-1[Φ]-1[+]-A-;-2[+]-1[Φ]-G-A-;-2[+]-1[Φ]-A-A-;或-2[+]-A-1[+]-A;-2[+]-A-G-A;-2[+]-A-A-A-;-1[Φ]-3[+]-A-;-1[Φ]-2[+]-G-A-;-1[Φ]-2[+]-A-A-;-1[Φ]-1[+]-1[Φ]-1[+]-A;-1[Φ]-1[+]-1[Φ]-G-A;-1[Φ]-1[+]-1[Φ]-A-A;-1[Φ]-1[+]-A-1[+]-A;-1[Φ]-1[+]-A-G-A;-1[Φ]-1[+]-A-A-A;-A-1[+]-A-1[+]-A;-A-1[+]-A-G-A;以及-A-1[+]-A-A-A;
[X4]选自:-1[ζ]-2A-1[+]-A;-1[ζ]-2A-2[+];-1[+]-2A-1[+]-A;-1[ζ]-2A-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-1[ζ]-A-1[ζ]-A-1[+];-2[+]-A-2[+];-2[+]-A-1[+]-A;-2[+]-A-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-2[+]-1[ζ]-A-1[+];-1[+]-1[ζ]-A-1[+]-A;-1[+]-1[ζ]-A-2[+];-1[+]-1[ζ]-A-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-1[+]-2[ζ]-A-1[+];-1[+]-2[ζ]-2[+];-1[+]-2[ζ]-1[+]-A;-1[+]-2[ζ]-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-1[+]-2[ζ]-1[ζ]-A-1[+];-3[ζ]-2[+];-3[ζ]-1[+]-A;-3[ζ]-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-1[ζ]-2A-1[+]-A;-1[ζ]-2A-2[+];-1[ζ]-2A-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-2[+]-A-1[+]-A;-2[+]-1[ζ]-1[+]-A;-1[+]-1[ζ]-A-1[+]-A;-1[+]-2A-1[+]-1[ζ]-A-1[+];以及-1[ζ]-A-1[ζ]-A-1[+];并且
[接头]选自:-Gn-;-Sn-;-(GnSn)n-;-(GnSn)nGn-;-(GnSn)nSn-;-(GnSn)nGn(GnSn)n-;以及-(GnSn)nSn(GnSn)n-;
其中:
[Φ]是氨基酸,其为:Leu、Phe、Trp、Ile、Met、Tyr或Val,优选Leu、Phe、Trp或Ile;
[+]是氨基酸,其为:Lys或Arg;
[ζ]是氨基酸,其为:Gln、Asn、Thr或Ser;
A是氨基酸Ala;
G是氨基酸Gly;
S是氨基酸Ser;并且
n是从1至20、1至19、1至18、1至17、1至16、1至15、1至14、1至13、1至12、1至11、1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至1至4或1至3的整数。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法,其中所述穿梭剂包含以下氨基酸序列或由其组成:SEQ ID NO:1至50中任一个的氨基酸序列;与SEQ ID NO:1至50中任一个相差不多于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸(例如,排除任何接头结构域)的氨基酸序列;或与SEQ ID NO:1至50中任一个至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同(例如,排除任何接头结构域计算的)的氨基酸序列。
12.根据权利要求1至10中任一项所述的方法,其中所述穿梭剂包含以下氨基酸序列或由其组成:SEQ ID NO:1至50、58至78、80至107、109至139、141至146、149至161、163至169、171、174至234、236至240、242至260、262至285、287至294、296至300、302至308、310、311、313至324、326至332、338至342、或344中任一个的氨基酸序列;与SEQ ID NO:1至50、58至78、80至107、109至139、141至146、149至161、163至169、171、174至234、236至240、242至260、262至285、287至294、296至300、302至308、310、311、313至324、326至332、338至342、或344中任一个相差不多于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸(例如,排除任何接头结构域)的氨基酸序列;与SEQ ID NO:1至50、58至78、80至107、109至139、141至146、149至161、163至169、171、174至234、236至240、242至260、262至285、287至294、296至300、302至308、310、311、313至324、326至332、338至342、或344中任一个至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同(例如,排除任何接头结构域计算的)的氨基酸序列。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法,其中所述穿梭剂包含内体渗漏结构域(ELD)和/或细胞穿透结构域(CPD)。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法,其中:
(i)所述ELD是或来自:内体溶解肽;抗菌肽(AMP);线性阳离子α-螺旋抗菌肽;杀菌肽-A/蜂毒肽杂交(CM)肽;pH依赖性膜活性肽(PAMP);肽两亲物;源自流感血凝素(HA)的HA2亚基的N末端的肽;CM18;白喉毒素T结构域(DT);GALA;PEA;INF-7;LAH4;HGP;H5WYG;HA2;EB1;VSVG;假单胞菌毒素;蜂毒肽;KALA;JST-1;C(LLKK)3C;G(LLKK)3G;或其任何组合;
(ii)所述CPD是或来自:细胞穿透肽或来自细胞穿透肽的蛋白质转导结构域;TAT;PTD4;穿膜肽;pVEC;M918;Pep-1;Pep-2;Xentry;精氨酸延伸段;转运素;SynB1;SynB3;或其任何组合;或
(iii)(i)和(ii)二者。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法,其中所述穿梭剂是环肽和/或包含一种或多种D-氨基酸。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法,其中在适合于评估所述靶真核细胞中的负荷转导的真核细胞系模型(例如,HeLa)中,所述穿梭剂使碘化丙啶或其他膜不可渗透的荧光DNA嵌入剂的转导效率相比于缺乏所述穿梭剂的相应阴性对照增加至少3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10倍,和/或能够实现碘化丙啶或其他膜不可渗透的荧光DNA嵌入剂的至少10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%或60%的转导效率(例如,如通过流式细胞术所测定)。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法,其中在适合于评估所述靶真核细胞中的负荷转导的真核细胞系模型(例如,HeLa)中,所述穿梭剂使GFP-NLS的转导效率相比于缺乏所述穿梭剂的相应阴性对照增加至少3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10倍,和/或能够实现GFP-NLS的至少7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%或60%的转导效率(例如,如通过流式细胞术所测定)。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法,其中所述穿梭剂还包含对一个或多个氨基酸的化学修饰,其中所述化学修饰不破坏所述合成肽穿梭剂的转导活性。
19.根据权利要求18所述的方法,其中所述化学修饰是在所述穿梭剂的N和/或C末端。
20.根据权利要求18或19所述的方法,其中所述化学修饰是添加乙酰基基团(例如,N末端乙酰基基团)、半胱酰胺基团(例如,C末端半胱酰胺基团)或脂肪酸(例如,C4-C16脂肪酸,优选N末端)。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法,所述方法是体外方法,如用于治疗和/或诊断目的。
22.根据权利要求1至20中任一项所述的方法,所述方法是体内方法,如用于治疗和/或诊断目的。
23.根据权利要求22所述的方法,所述方法包括所述非蛋白质负荷和所述合成肽穿梭剂的局部、肠内/胃肠道(例如,口服)或肠胃外施用。
24.一种用于将非蛋白质负荷转导至靶真核细胞中的组合物,所述组合物包含用药学上合适的赋形剂配制的合成肽穿梭剂,其中与不存在所述合成肽穿梭剂的情况相比,所述组合物中的所述合成肽穿梭剂的浓度足以在施用后增加所述非蛋白质负荷向所述靶真核细胞中的转导效率和胞质溶胶和/或细胞核递送。
25.根据权利要求24所述的组合物,所述组合物还包含所述非蛋白质负荷。
26.一种用于疗法的组合物,所述组合物包含与有待于通过合成肽穿梭剂转导至靶真核细胞中的非蛋白质负荷一起配制的所述合成肽穿梭剂,其中与不存在所述合成肽穿梭剂的情况相比,所述组合物中的所述合成肽穿梭剂的浓度足以在施用后增加所述非蛋白质负荷向所述靶真核细胞中的转导效率和胞质溶胶和/或细胞核递送。
27.根据权利要求24至26中任一项所述的组合物,其中:
(a)所述合成肽穿梭剂是根据权利要求1或5至20中任一项所述的;
(b)所述非蛋白质负荷是根据权利要求2至4中任一项所述的;
(c)所述组合物用于根据权利要求21至23中任一项所述的体外或体内方法中;或
(d)(a)至(c)的任何组合。
28.一种用于根据权利要求1至23中任一项所述的方法的试剂盒,所述试剂盒包含根据权利要求1或5至20中任一项所述的合成肽穿梭剂以及根据权利要求2至4中任一项所述的非蛋白质负荷。
29.根据权利要求1至23中任一项所述的方法、根据权利要求24至27中任一项所述的组合物或根据权利要求28所述的试剂盒,其中所述靶真核细胞是动物细胞、哺乳动物细胞、人细胞、干细胞、原代细胞、免疫细胞、T细胞、NK细胞、树突状细胞、上皮细胞、皮肤细胞或胃肠道细胞。
30.一种对蛋白质和非蛋白质负荷二者均具有转导活性的合成肽穿梭剂,所述穿梭剂包含以下氨基酸序列或由其组成:SEQ ID NO:19至50中任一个的氨基酸序列;与SEQ IDNO:19至50中任一个相差不多于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸(例如,排除任何接头结构域)的氨基酸序列;或与SEQ ID NO:19至50中任一个至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同(例如,排除任何接头结构域计算的)的氨基酸序列。
31.根据权利要求30所述的合成肽穿梭剂,所述合成肽穿梭剂是根据权利要求5至20中任一项所述的穿梭剂。
32.一种在靶真核细胞中对蛋白质和非蛋白质负荷二者均具有转导活性的合成肽穿梭剂,所述穿梭剂是:
(1)长度为至少17、18、19或20个氨基酸的肽,所述肽包含
(2)两亲性α-螺旋基序,其具有
(3)带正电的亲水外表面和疏水外表面,
其中遵守以下参数(4)至(15)中的至少五个:
(4)基于每圈具有3.6个残基的α-螺旋的开放圆柱形表示,所述疏水外表面包含由空间上相邻的L、I、F、V、W和/或M氨基酸组成的高疏水核心,所述氨基酸占所述肽的氨基酸的12%至50%;
(5)所述肽具有3.5至11的疏水力矩(μ);
(6)所述肽在生理pH下具有至少+4的预测净电荷;
(7)所述肽具有8至13的等电点(pI);
(8)所述肽由35%至65%的如下氨基酸的任何组合构成:A、C、G、I、L、M、F、P、W、Y和V;
(9)所述肽由0%至30%的如下氨基酸的任何组合构成:N、Q、S和T;
(10)所述肽由35%至85%的如下氨基酸的任何组合构成:A、L、K或R;
(11)所述肽由15%至45%的如下氨基酸的任何组合构成:A和L,前提是所述肽中存在至少5%的L;
(12)所述肽由20%至45%的如下氨基酸的任何组合构成:K和R;
(13)所述肽由0%至10%的如下氨基酸的任何组合构成:D和E;
(14)所述肽中A和L残基的百分比(A+L%)与所述肽中K和R残基的百分比(K+R)之间的差小于或等于10%;以及
(15)所述肽由10%至45%的如下氨基酸的任何组合构成:Q、Y、W、P、I、S、G、V、F、E、D、C、M、N、T和H,
其中在适合于评估所述靶真核细胞中的负荷转导的真核细胞系模型(例如,HeLa)中,所述穿梭剂使碘化丙啶或其他膜不可渗透的荧光DNA嵌入剂的转导效率相比于缺乏所述穿梭剂的相应阴性对照增加至少3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10倍,和/或能够实现碘化丙啶或其他膜不可渗透的荧光DNA嵌入剂的至少10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%或60%的转导效率(例如,如通过流式细胞术所测定)。
33.根据权利要求32所述的合成肽穿梭剂,其中在适合于评估所述靶真核细胞中的负荷转导的真核细胞系模型(例如,HeLa)中,所述穿梭剂使GFP-NLS的转导效率相比于缺乏所述穿梭剂的相应阴性对照增加至少3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10倍,和/或能够实现GFP-NLS的至少7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%或60%的转导效率(例如,如通过流式细胞术所测定)。
34.根据权利要求32或33所述的合成肽穿梭剂,其中:
(a)所述穿梭剂遵守参数(4)至(15)中的至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少十一个,或遵守其全部;
(b)所述穿梭剂是具有17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸的最小长度和40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、60、65、70、80、90、100、110、120、130、140或150个氨基酸的最大长度的肽;
(c)所述两亲性α-螺旋基序具有在3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0的下限与9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9或11.0的上限之间的疏水力矩(μ);
(d)所述两亲性α-螺旋基序包含带正电的亲水外表面,基于连续氨基酸之间的旋转角为100度的α-螺旋和/或每圈具有3.6个残基的α-螺旋,所述带正电的亲水外表面包含:(i)在螺旋轮投影时的至少两个、三个或四个相邻的带正电的K和/或R残基;和/或(ii)在螺旋轮投影时的包含三至五个K和/或R残基的六个相邻残基的区段;
(e)所述两亲性α-螺旋基序包含疏水外表面,基于连续氨基酸之间的旋转角为100度的α-螺旋和/或每圈具有3.6个残基的α-螺旋,所述疏水外表面包含:(i)在螺旋轮投影时的至少两个相邻L残基;和/或(ii)在螺旋轮投影时的包含选自L、I、F、V、W和M的至少五个疏水残基的十个相邻残基的区段;
(f)所述疏水外表面包含高疏水核心,所述高疏水核心由空间上相邻的L、I、F、V、W和/或M氨基酸组成,所述氨基酸占所述穿梭剂的氨基酸的从12.5%、13%、13.5%、14%、14.5%、15%、15.5%、16%、16.5%、17%、17.5%、18%、18.5%、19%、19.5%或20%至25%、30%、35%、40%或45%;
(g)所述穿梭剂具有在4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0的下限与9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.1、10.2、10.3、10.4或10.5的上限之间的疏水力矩(μ);
(h)所述穿梭剂具有在+4、+5、+6、+7、+8、+9至+10、+11、+12、+13、+14或+15之间的预测净电荷;
(i)所述穿梭剂具有10至13的预测pI;或
(j)(a)至(i)的任何组合。
35.根据权利要求32至34中任一项所述的合成肽穿梭剂,其中所述穿梭剂遵守以下参数中的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个或全部:
(8)所述穿梭剂由36%至64%、37%至63%、38%至62%、39%至61%或40%至60%的如下氨基酸的任何组合构成:A、C、G、I、L、M、F、P、W、Y和V;
(9)所述穿梭剂由1%至29%、2%至28%、3%至27%、4%至26%、5%至25%、6%至24%、7%至23%、8%至22%、9%至21%或10%至20%的如下氨基酸的任何组合构成:N、Q、S和T;
(10)所述穿梭剂由36%至80%、37%至75%、38%至70%、39%至65%或40%至60%的如下氨基酸的任何组合构成:A、L、K或R;
(11)所述穿梭剂由15%至40%、20%至40%、20%至35%或20%至30%的如下氨基酸的任何组合构成:A和L;
(12)所述穿梭剂由20%至40%、20%至35%或20%至30%的如下氨基酸的任何组合构成:K和R;
(13)所述穿梭剂由5%至10%的如下氨基酸的任何组合构成:D和E;
(14)所述穿梭剂中A和L残基的百分比(A+L%)与所述穿梭剂中K和R残基的百分比(K+R)之间的差小于或等于9%、8%、7%、6%或5%;以及
(15)所述穿梭剂由15%至40%、20%至35%或20%至30%的如下氨基酸的任何组合构成:Q、Y、W、P、I、S、G、V、F、E、D、C、M、N、T和H。
36.根据权利要求32至35中任一项所述的合成肽穿梭剂,其中所述穿梭剂:
(i)包含根据权利要求8所述的富含组氨酸的结构域;
(ii)包含根据权利要求9所述的柔性接头结构域;
(iii)是根据权利要求10至14中任一项所述的穿梭剂;或
(iv)(i)至(iii)的任何组合。
37.根据权利要求32至36中任一项所述的合成肽穿梭剂,所述合成肽穿梭剂还包含对一个或多个氨基酸的化学修饰,其中所述化学修饰不破坏所述合成肽穿梭剂的转导活性。
38.根据权利要求37所述的合成肽穿梭剂,其中所述化学修饰是在所述穿梭剂的N和/或C末端。
39.根据权利要求37或38所述的合成肽穿梭剂,其中所述化学修饰是添加乙酰基基团(例如,N末端乙酰基基团)、半胱酰胺基团(例如,C末端半胱酰胺基团)或脂肪酸(例如,C4-C16脂肪酸,优选N末端)。
40.根据权利要求32至39中任一项所述的合成肽穿梭剂,其中所述穿梭剂包含以下氨基酸序列或由其组成:SEQ ID NO:1至50、58至78、80至107、109至139、141至146、149至161、163至169、171、174至234、236至240、242至260、262至285、287至294、296至300、302至308、310、311、313至324、326至332、338至342、或344中任一个的氨基酸序列;与SEQ ID NO:1至50、58至78、80至107、109至139、141至146、149至161、163至169、171、174至234、236至240、242至260、262至285、287至294、296至300、302至308、310、311、313至324、326至332、338至342、或344中任一个相差不多于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸(例如,排除任何接头结构域)的氨基酸序列;或与SEQ ID NO:1至50、58至78、80至107、109至139、141至146、149至161、163至169、171、174至234、236至240、242至260、262至285、287至294、296至300、302至308、310、311、313至324、326至332、338至342、或344中任一个至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同(例如,排除任何接头结构域计算的)的氨基酸序列。
41.一种在靶真核细胞中对蛋白质和非蛋白质负荷二者均具有转导活性的合成肽穿梭剂,其中所述穿梭剂包含以下氨基酸序列或由其组成:(a)SEQ ID NO:1至50、58至78、80至107、109至139、141至146、149至161、163至169、171、174至234、236至240、242至260、262至285、287至294、296至300、302至308、310、311、313至324、326至332、338至342、或344中任一个的氨基酸序列;或(b)与SEQ ID NO:1至50、58至78、80至107、109至139、141至146、149至161、163至169、171、174至234、236至240、242至260、262至285、287至294、296至300、302至308、310、311、313至324、326至332、338至342、或344中任一个仅相差保守氨基酸取代(例如,相差不多于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守氨基酸取代,优选排除任何接头结构域)的氨基酸序列,其中在适合于评估所述靶真核细胞中的负荷转导的真核细胞系模型(例如,HeLa)中,穿梭剂使碘化丙啶或其他膜不可渗透的荧光DNA嵌入剂的转导效率相比于缺乏所述穿梭剂的相应阴性对照增加至少3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10倍;和/或能够实现碘化丙啶或其他膜不可渗透的荧光DNA嵌入剂的至少10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%或60%的转导效率(例如,如通过流式细胞术所测定)。
42.根据权利要求41所述的合成肽穿梭剂,所述合成肽穿梭剂是根据权利要求32至39中任一项所述的合成肽穿梭剂。
43.一种在靶真核细胞中具有蛋白质负荷转导活性的合成肽穿梭剂,其中所述穿梭剂包含以下氨基酸序列或由其组成:(a)SEQ ID NO:52、57、79、108、140、147、148、173、241、261、286、295、301、309、312、325、333-337或343中任一个的氨基酸序列;或(b)与SEQ IDNO:52、57、79、108、140、147、148、173、241、261、286、295、301、309、312、325、333-337或343中任一个仅相差保守氨基酸取代(例如,相差不多于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守氨基酸取代,优选排除任何接头结构域)的氨基酸序列,其中在适合于评估所述靶真核细胞中的负荷转导的真核细胞系模型(例如,HeLa)中,穿梭剂使GFP-NLS的转导效率相比于缺乏所述穿梭剂的相应阴性对照增加至少3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10倍,和/或能够实现GFP-NLS的至少7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%或30%的转导效率(例如,如通过流式细胞术所测定)。
44.根据权利要求41至43中任一项所述的合成肽穿梭剂,其中每个保守氨基酸取代选自同一氨基酸类别内的氨基酸,所述氨基酸类别是:脂肪族:G、A、V、L和I;含羟基或硫/硒:S、C、U、T和M;芳香族:F、Y和W;碱性:H、K和R;酸性及其酰胺:D、E、N和Q。
45.一种在靶真核细胞中对蛋白质和/或非蛋白质负荷具有转导活性的合成肽穿梭剂变体,所述合成肽穿梭剂变体与根据权利要求32至44中任一项所述的合成肽穿梭剂相同,不同的是至少一个氨基酸被替代为含有与被替代氨基酸具有相似生理化学特性(例如,结构、疏水或电荷)的侧链的相应合成氨基酸,其中与不存在所述穿梭剂变体的情况相比,所述穿梭剂变体增加所述负荷在所述靶真核细胞中的转导效率。
46.根据权利要求45所述的合成肽穿梭剂变体,其中所述合成氨基酸替代:
(a)用以下任一种替代碱性氨基酸:α-氨基甘氨酸、α,γ-二氨基丁酸、鸟氨酸、α,β-二氨基丙酸、2,6-二氨基-4-己炔酸、β-(1-哌嗪基)-丙氨酸、4,5-脱氢-赖氨酸、δ-羟基赖氨酸、ω,ω-二甲基精氨酸、高精氨酸、ω,ω'-二甲基精氨酸、ω-甲基精氨酸、β-(2-喹啉基)-丙氨酸、4-氨基哌啶-4-甲酸、α-甲基组氨酸、2,5-二碘组氨酸、1-甲基组氨酸、3-甲基组氨酸、菠菜素、4-氨基苯丙氨酸、3-氨基酪氨酸、β-(2-吡啶基)-丙氨酸或β-(3-吡啶基)-丙氨酸;
(b)用以下任一种替代非极性(疏水)氨基酸:脱氢丙氨酸、β-氟丙氨酸、β-氯丙氨酸、β-碘丙氨酸、α-氨基丁酸、α-氨基异丁酸、β-环丙基丙氨酸、氮杂环丁烷-2-甲酸、α-烯丙基甘氨酸、炔丙基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、β-(2-噻唑基)-丙氨酸、硫代脯氨酸、3,4-脱氢脯氨酸、叔丁基甘氨酸、β-环戊基丙氨酸、β-环己基丙氨酸、α-甲基脯氨酸、戊氨酸、α-甲基缬氨酸、青霉胺、β,β-二环己基丙氨酸、4-氟脯氨酸、1-氨基环戊烷甲酸、哌可酸、4,5-脱氢亮氨酸、别异亮氨酸、正亮氨酸、α-甲基亮氨酸、环己基甘氨酸、顺式八氢吲哚-β-2-甲酸、β-(2-噻吩基)-丙氨酸、苯基甘氨酸、α-甲基苯丙氨酸、高苯丙氨酸、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸、β-(3-苯并噻吩基)-丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、4-溴苯丙氨酸、4-叔丁基苯丙氨酸、α-甲基色氨酸、β-(2-萘基)-丙氨酸、β-(1-萘基)-丙氨酸、4-碘苯丙氨酸、3-氟苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、4-甲基色氨酸、4-氯苯丙氨酸、3,4-二氯-苯丙氨酸、2,6-二氟-苯丙氨酸、n-in-甲基色氨酸、1,2,3,4-四氢去甲哈尔满-3-甲酸、β,β-二苯丙氨酸、4-甲基苯丙氨酸、4-苯基苯丙氨酸、2,3,4,5,6-五氟-苯丙氨酸或4-苯甲酰基苯丙氨酸;
(c)用以下任一种替代极性不带电的氨基酸:β-氰基丙氨酸、β-脲基丙氨酸、高半胱氨酸、别苏氨酸、焦谷氨酸、2-氧代噻唑烷-4-甲酸、瓜氨酸、硫代瓜氨酸、高瓜氨酸、羟脯氨酸、3,4-二羟基苯丙氨酸、β-(1,2,4-三唑-1-基)-丙氨酸、2-巯基组氨酸、β-(3,4-二羟基苯基)-丝氨酸、β-(2-噻吩基)-丝氨酸、4-叠氮基苯丙氨酸、4-氰基苯丙氨酸、3-羟基甲基酪氨酸、3-碘酪氨酸、3-硝基酪氨酸、3,5-二硝基酪氨酸、3,5-二溴酪氨酸、3,5-二碘酪氨酸、7-羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸、5-羟色氨酸、甲状腺原氨酸、β-(7-甲氧基香豆素-4-基)-丙氨酸或4-(7-羟基-4-香豆素基)-氨基丁酸;和/或
(d)用以下任一种替代酸性氨基酸:γ-羟基谷氨酸、γ-亚甲基谷氨酸、γ-羧基谷氨酸、α-氨基己二酸、2-氨基庚二酸、α-氨基辛二酸、4-羧基苯丙氨酸、磺基丙氨酸、4-膦酰基苯丙氨酸或4-磺甲基苯丙氨酸。
47.根据权利要求32至46中任一项所述的合成肽穿梭剂或合成肽穿梭剂变体,所述合成肽穿梭剂或合成肽穿梭剂变体用于增加蛋白质和/或非蛋白质负荷(例如,治疗活性蛋白质和/或非蛋白质负荷)向靶真核细胞中的转导效率的体外或体内方法中,其中所述合成肽穿梭剂或合成肽穿梭剂变体在一定浓度下使用,与不存在所述合成肽穿梭剂或合成肽穿梭剂变体的情况相比,所述浓度足以增加所述负荷向所述靶真核细胞中的转导效率和胞质溶胶和/或细胞核递送。
48.根据权利要求32至47中任一项所述的合成肽穿梭剂或合成肽穿梭剂变体,所述合成肽穿梭剂或合成肽穿梭剂变体用于疗法中,其中所述合成肽穿梭剂或合成肽穿梭剂变体将治疗活性蛋白质和/或非蛋白质负荷转导至靶真核细胞的胞质溶胶和/或细胞核,其中所述合成肽穿梭剂或合成肽穿梭剂变体在一定浓度下使用,与不存在所述合成肽穿梭剂的情况相比,所述浓度足以增加所述负荷向所述靶真核细胞中的转导效率。
49.一种用于蛋白质和/或非蛋白质负荷转导的体外或体内方法,所述方法包括使靶真核细胞与所述负荷和一定浓度的根据权利要求32至46中任一项所述的合成肽穿梭剂或合成肽穿梭剂变体接触,与不存在所述合成肽穿梭剂的情况相比,所述浓度的所述合成肽穿梭剂或合成肽穿梭剂变体足以增加所述负荷向所述靶真核细胞中的转导效率。
50.根据权利要求49所述的体外或体内方法,所述体外或体内方法是用于治疗和/或诊断目的的方法。
51.一种用于疗法的组合物,所述组合物包含与有待于通过合成肽穿梭剂转导至靶真核细胞中的蛋白质和/或非蛋白质负荷一起配制的根据权利要求32至46中任一项所述的合成肽穿梭剂或合成肽穿梭剂变体,其中与不存在所述合成肽穿梭剂的情况相比,所述组合物中的所述合成肽穿梭剂或合成肽穿梭剂变体的浓度足以在施用后增加所述负荷向所述靶真核细胞中的转导效率和胞质溶胶递送。
52.根据权利要求51所述的组合物,所述组合物被配制用于局部、肠内/胃肠道(例如,口服)或肠胃外施用。
53.一种试剂盒,所述试剂盒包含根据权利要求32至46中任一项所述的合成肽穿梭剂或合成肽穿梭剂变体,以及有待于通过所述合成肽穿梭剂或合成肽穿梭剂变体转导的蛋白质和/或非蛋白质负荷。
54.根据权利要求32至48中任一项所述的合成肽穿梭剂或合成肽穿梭剂变体、根据权利要求49或50所述的体外或体内方法、根据权利要求51或52所述的组合物或根据权利要求53所述的试剂盒,其中所述靶真核细胞是动物细胞、哺乳动物细胞、人细胞、干细胞、原代细胞、免疫细胞、T细胞、NK细胞、树突状细胞、上皮细胞、皮肤细胞或胃肠道细胞。
55.根据权利要求32至48或54中任一项所述的合成肽穿梭剂或合成肽穿梭剂变体、根据权利要求49或50或54所述的体外或体内方法、根据权利要求51、52或54所述的组合物或根据权利要求53或54所述的试剂盒,其中所述非蛋白质负荷是根据权利要求2至4中任一项所述的。
56.一种用于产生预期在靶真核细胞中对目的负荷具有转导活性的候选合成肽穿梭剂的方法,所述方法包括合成如下肽,所述肽是:
(1)长度为至少17、18、19或20个氨基酸的肽,所述肽包含
(2)两亲性α-螺旋基序,其具有
(3)带正电的亲水外表面和疏水外表面,
其中遵守以下参数(4)至(15)中的至少五个:
(4)基于每圈具有3.6个残基的α-螺旋的开放圆柱形表示,所述疏水外表面包含由空间上相邻的L、I、F、V、W和/或M氨基酸组成的高疏水核心,所述氨基酸占所述肽的氨基酸的12%至50%;
(5)所述肽具有3.5至11的疏水力矩(μ);
(6)所述肽在生理pH下具有至少+4的预测净电荷;
(7)所述肽具有8至13的等电点(pI);
(8)所述肽由35%至65%的如下氨基酸的任何组合构成:A、C、G、I、L、M、F、P、W、Y和V;
(9)所述肽由0%至30%的如下氨基酸的任何组合构成:N、Q、S和T;
(10)所述肽由35%至85%的如下氨基酸的任何组合构成:A、L、K或R;
(11)所述肽由15%至45%的如下氨基酸的任何组合构成:A和L,前提是所述肽中存在至少5%的L;
(12)所述肽由20%至45%的如下氨基酸的任何组合构成:K和R;
(13)所述肽由0%至10%的如下氨基酸的任何组合构成:D和E;
(14)所述肽中A和L残基的百分比(A+L%)与所述肽中K和R残基的百分比(K+R)之间的差小于或等于10%;以及
(15)所述肽由10%至45%的如下氨基酸的任何组合构成:Q、Y、W、P、I、S、G、V、F、E、D、C、M、N、T和H,
其中在适合于评估所述靶真核细胞中的负荷转导的真核细胞系模型(例如,HeLa)中,所述穿梭剂使碘化丙啶或其他膜不可渗透的荧光DNA嵌入剂的转导效率相比于缺乏所述穿梭剂的相应阴性对照增加至少3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10倍,和/或能够实现碘化丙啶或其他膜不可渗透的荧光DNA嵌入剂的至少10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%或60%的转导效率(例如,如通过流式细胞术所测定)。
57.根据权利要求56所述的方法,其中所述候选合成肽穿梭剂是根据权利要求32至46中任一项所述的合成肽穿梭剂或合成肽穿梭剂变体。
58.一种用于鉴定、选择或限定预期在靶真核细胞中对蛋白质和非蛋白质负荷二者均具有转导活性的合成肽穿梭剂的体外或体内方法,所述方法包括:提供适合于评估所述靶真核细胞中的负荷转导的模型真核细胞或模型生物体;提供候选合成肽穿梭剂(例如,根据权利要求5至20或32至46中任一项所述);以及测量所述候选合成肽穿梭剂将碘化丙啶或其他膜不可渗透的荧光DNA嵌入剂转导至所述模型真核细胞或模型生物体中的转导活性(例如,负荷转导效率,如通过流式细胞术),其中当在所述模型真核细胞或模型生物体中,碘化丙啶或其他膜不可渗透的荧光DNA嵌入剂的转导活性(例如,转导效率)相比于缺乏所述候选合成肽穿梭剂的相应阴性对照增加至少3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10倍,和/或发生所述碘化丙啶或其他膜不可渗透的荧光DNA嵌入剂的至少10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%或60%的转导效率(例如,如通过流式细胞术所测定)时,预期所述候选穿梭剂在所述靶真核细胞中对蛋白质和非蛋白质负荷二者均具有转导活性。
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