CN113995750A - 基于维生素c水凝胶的肿瘤免疫治疗用药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于维生素C水凝胶的肿瘤免疫治疗用药物组合物，涉及免疫药物技术领域。本发明所述的肿瘤免疫治疗用药物组合物将维生素C水凝胶首次用于递送免疫调节药物，实现了高浓度富集与可持续的释放。所述的维生素C水凝胶通过包载多种免疫调节药物能够实现维生素C水凝胶与免疫调节药物功能的协同，其疗效显著优于单组分的VitC水凝胶和免疫调节药物。其中，VitC能够促进DCs的成熟，增加了NK细胞与肿瘤杀伤性T细胞的肿瘤内浸润，装载的免疫调节药物可以进一步削弱免疫抑制的肿瘤微环境增加T细胞的肿瘤内浸润。该维生素C水凝胶的肿瘤免疫治疗用药物组合物可以高效抑制原发瘤和远端瘤的生长与转移。

Description

基于维生素C水凝胶的肿瘤免疫治疗用药物组合物
技术领域
本发明涉及免疫药物技术领域，尤其涉及一种基于维生素C水凝胶的肿瘤免疫治疗用药物组合物。
背景技术
水凝胶是一种极具吸引力的药物递送系统，具有局部高浓度、持续释放、长期滞留和副作用小的特点。通过弱动态非共价相互作用自组装的超分子水凝胶，其结构和理化性质灵活可调控，有利于实现更有效和安全的治疗。通常情况下，带有交联纳米纤维的自组装超分子水凝胶表现出快速的凝胶-溶胶相变和自愈合特性，可以以非入侵的方式直接注射到目标部位。在治疗效果方面，水凝胶可以包载具有不同性质(如大小和电荷)的生物活性物质应用于局部，已被证明是引发局部或全身治疗反应有效且安全的策略。近年来，设计既能实现优异的治疗效果，又能在其他治疗药物的输送中发挥重要作用的“自我递送”超分子治疗水凝胶受到广泛关注。与传统的给药系统相比，自递送水凝胶表现出许多独特的优势，包括辅料含量小、药物装载量大、与包载物功能的协调等，是非常有前景的药物递送系统。
维生素C(VitC)作为一种生物安全性高、价格低廉的天然活性小分子，正成为一种有吸引力的肿瘤免疫疗法候选者。相关文献已证明了VitC在大多数免疫细胞中保持高水平，并调节多种免疫反应，细胞内VitC作为生物合成、基因调节单加氧酶和双加氧酶的酶辅助因子，能够调节细胞表型、生长和生存途径。例如，高剂量的VitC已被证明可以上调内源性逆转录病毒，从而引起免疫原性肿瘤表型，并引发淋巴瘤的病毒防御反应。此外，联合VitC与免疫检查点阻断抗体，如抗细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(抗CTLA4)、抗程序化死亡1(抗PD-1)或抗程序化死亡配体1(抗PD-L1)，可以诱导针对多种肿瘤的持久的抗肿瘤免疫反应。然而，由于VitC的亲水特性，它在体内通常表现为快速排泄。VitC的这些独特功能，如激活免疫细胞，只有在非常高的局部浓度下才能发挥作用。因此，为了达到理想的治疗效果，通常要高频率地静脉注射大剂量的VitC，这给患者带来极大的痛苦与不便。此外，仅VitC一种治疗药物并不能完全消除恶性肿瘤。因此，开发新剂型的VitC基免疫药物，以维持病灶部位较高的局部浓度，实现肿瘤免疫治疗增效，具有十分重要的意义。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于维生素C水凝胶的肿瘤免疫治疗用药物组合物。
本发明的第一个目的是提供一种肿瘤免疫治疗用药物组合物，包括免疫调节药物和维生素C水凝胶载药系统，所述的维生素C水凝胶载药系统包载所述的免疫调节药物；所述免疫调节药物为小分子免疫调节药物或大分子免疫调节药物。
进一步地，所述小分子免疫调节药物为免疫激动剂或免疫检查点抑制剂；所述大分子免疫调节药物为免疫检查点阻断抗体。
进一步地，所述免疫激动剂为胸腺肽、长春碱或环磷酰胺。
进一步地，所述免疫检查点抑制剂为1-环己基-2-(5H-咪唑并[5,1-A]异吲哚-5-基)乙醇或吲哚莫德。
进一步地，所述免疫检查点阻断抗体为程序性死亡受体(PD-1)抗体、程序性死亡配体-1(PD-L1)抗体。
进一步地，所述的肿瘤免疫治疗用药物组合物，所述免疫调节药物与维生素C水凝胶具有协同的免疫治疗功能；所述协同的免疫治疗功能明显优于两种单组分药物简单叠加的肿瘤治疗效果。
进一步地，所述免疫调节药物和维生素C水凝胶的质量比为1：10-100。
进一步地，所述药物通过直接填充病灶或注射瘤周的方式进行给药。
进一步地，所述药物的给药剂量可依据实际情况进行调整。优选地，所述药物的给药剂量为0.5-5mg/kg。
本发明的第二个目的是提供一种肿瘤免疫治疗用药物组合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)预处理的维生素C两亲分子通过自组装得到维生素C水凝胶；
(2)将免疫调节药物装载到步骤(1)所述的维生素C水凝胶上，得到所述肿瘤免疫治疗用药物组合物。
进一步地，在步骤(1)中，所述预处理是将维生素C通过修饰不同长度的碳链得到所述维生素C两亲分子。
进一步地，所述不同长度的碳链的碳原子个数为8-18。
进一步地，在步骤(1)中，所述维生素C两亲分子的浓度为10-100mg/mL。
进一步地，在步骤(1)中，所述自组装的温度为60-80℃。
本发明的第三个目的是提供一种基于维生素C水凝胶的药物组合物在肿瘤免疫治疗中的应用。
进一步地，所述药物的给药体积不超过肿瘤体积的1/3-1/2。
进一步地，所述肿瘤为黑色素肿瘤、大肠癌肿瘤、乳腺癌肿瘤或宫颈癌肿瘤。
进一步地，所述药物组合物在具体应用时，原发瘤的肿瘤大小范围为50-150mm3，远端瘤的肿瘤大小范围为15-50mm3。
本发明的的原理是：通过肿瘤微环境敏感键将亲水性的VitC与疏水性的烷基链进行修饰，合成VitC两亲性化合物。在非共价氢键和疏水相互作用的驱动下，VitC两亲性化合物自组装成具有剪切稀化和自修复特性的可注射水凝胶。局部应用的VitC水凝胶可以作为VitC的贮库，在肿瘤环境中持续释放VitC。这种VitC水凝胶还能有效的装载小分子与大分子的免疫调节药物，装载药物的VitC水凝胶表现出协同的免疫治疗效果，其疗效显著优于单组分的免疫调节药物和VitC水凝胶，显著地促进了DCs的成熟，显著增加了NK细胞与肿瘤杀伤性T细胞的肿瘤内浸润，免疫调节药物与VitC水凝胶的协同诱导了全身的免疫监视，极大的抑制肿瘤的生长。
本发明的技术方案相比现有技术具有以下优点：
(1)本发明所述的药物组合物中的维生素C水凝胶首次用于递送免疫调节药物，既实现了高浓度富集与可持续的释放，又实现灵活、高效的药物装载与响应性释放。
(2)本发明所述的药物组合物中的维生素C水凝胶可以包载多种免疫调节药物，能够实现维生素C水凝胶与免疫调节药物功能的协同，其疗效显著优于单组分的免疫调节药物和VitC水凝胶，高效抑制原发瘤和远端瘤的生长。
(3)本发明所述的药物组合物中的维生素C水凝胶的协同机制为VitC能够促进DCs的成熟，增加了NK细胞与肿瘤杀伤性T细胞的肿瘤内浸润，装载的免疫调节药物可以进一步削弱免疫抑制的肿瘤微环境增加T细胞的肿瘤内浸润。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚地理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中：
图1为本发明实施例1中Step1合成路线及光谱表征图；其中，a为酯酶敏感的VitC两亲分子的合成路线图，b为产物VitC两亲分子的磁共振氢谱图，c为高分辨质谱图。
图2为本发明实施例1中Step2的VitC水凝胶的组装行为随浓度的变化图；其中，a为透射电子显微镜图，b为流变测试图。
图3为本发明装载STING激动剂(SA)的VitC水凝胶(SA@VitC水凝胶)测试图；其中，a为装载STING激动剂的维生素C水凝胶(SA@VitC水凝胶)中STING激动剂(SA)与VitC的释放曲线图，b为装载小分子荧光染料吲哚菁绿(ICG)的VitC水凝胶(ICG@VitC水凝胶)在Tranwell皿中的荧光强度随时间变化的折线图。
图4为本发明实施例4水凝胶体内降解与药物的释放行为图；其中，a(左)为小鼠背部注射凝胶后不同时间解剖该部位组织的离体图，a(右)为VitC水凝胶在小鼠背部注射后不同时间点的相对残留量的折线图，b为游离ICG和ICG@VitC水凝胶的小鼠肿瘤荧光成像的强度分析图。
图5为本发明实施例5的小鼠肿瘤体积变化图和小鼠生存曲线图；其中，a为注射SA@VitC水凝胶小鼠体内肿瘤体积随时间变化图，b为注射SA@VitC水凝胶小鼠生存曲线图，c为注射aPDL1@VitC水凝胶的肿瘤体积随时间变化图，d为注射aPDL1@VitC水凝胶小鼠生存曲线图。
图6为本发明实施例6的免疫机制分析结果；其中，a为治疗后第3天淋巴结中CD80+CD86+DC的代表性流式细胞术分析图(左)和统计图(右)，b、c分别为治疗后第6天肿瘤浸润NK(CD45+CD49b+)，CD4+(CD3+CD4+CD8-)和CD8+(CD3+CD4-CD8+)T细胞的代表性流式细胞术分析图(左)和统计图(右)，d为血清中肿瘤坏死因子α和干扰素γ的浓度变化图。
图7为本发明实施例7的小鼠原发瘤和转移瘤的体积随时间的变化图；其中，a为原发瘤体积随时间的变化图，b为远端瘤体积随时间的变化图。
图8为本发明实施例8肿瘤内免疫细胞的变化图；其中，a、b和c分别为远端瘤中浸润的NK细胞，CD8+T细胞，IFNγ+CD8+T细胞的代表性流式细胞术分析图(左)和统计图(右)。
图9为本发明实施例9流式细胞术和酶联免疫吸附分析图；其中，a为游离VitC对BMDCs共刺激分子的成熟度图(左)和肿瘤坏死因子α浓度图(右)，b为游离VitC对CD8+T分化的影响图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。其中，说明书和权利要求书中所使用的缩写的含义如表1所示：
表1
Figure BDA0003311195820000051
Figure BDA0003311195820000061
实施例1
一种基于维生素C水凝胶的肿瘤免疫治疗用药物组合物及其制备方法，具体步骤如下：
Step1：酯酶敏感的VitC两亲分子的合成
首先将VitC(2g，11.4mmol)加入丙酮(15mL)中搅拌溶解，冰浴下加入乙酰氯(0.04mL，0.57mmol)于室温搅拌反应24h，将反应液过滤并用冰丙酮洗涤，取该步收集的固体产物1(0.6g，2.78mmol)与碳酸钾粉末(1.13g，8.15mmol)溶于丙酮(10mL)中，滴加苄基溴(0.87mL，7.36mmol)并回流4h。减压蒸馏除去溶剂，将产物用适量的水与乙醚处理并过滤，得到白色固体产物：化合物2。取化合物2(0.3g，0.76mmol)溶解在乙腈(15mL)中，然后滴加盐酸溶液(2mL，2M)，继续搅拌反应3h。减压除去溶剂，将产物用乙酸乙酯溶解，有机层依次用水和饱和食盐水洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩，得到黄色油状的化合物3。在0℃下将二苄基VitC衍生物3(1g，2.8mmol)和三乙胺(1mL)溶解在二氯甲烷(30mL)中。随后逐滴加入异氰酸十二烷基酯(0.65g，3.07mmol)，将反应混合物在室温下搅拌过夜。然后，除去溶剂并通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/己烷＝1/3)进一步纯化，得到呈黄色油状的VitC衍生物4(1.02g，64.1％产率)。
接着，将VitC衍生物4(280mg，0.5mmol)溶解在15mL的乙酸乙酯/己烷＝1/4的混合溶液中。在加入10％Pd/C(14mg)之后，将混合物在室温下在氢气氛围中搅拌过夜。接下来，通过过滤去除Pd/C并去除溶剂得到白色粉末状VitC两亲分子(135mg，69.6％产率)，合成路线及产物(VitC两亲分子)光谱表征见图1。
图1a为酯酶敏感的VitC两亲分子的合成路线。试剂和条件：(a)丙酮，乙酰氯，室温，24h；(b)苄基溴、碳酸钾、丙酮，回流，4h；(c)盐酸(2mol/L)，乙腈，30℃，3h；(d)异氰酸十二烷基酯，三乙胺，二氯甲烷，室温，过夜；(e)10％Pd/C、H2、乙酸乙酯/甲醇＝1/4，室温，过夜；图1b为核磁共振氢谱(1H-NMR)；图1c为高分辨质谱。特征峰与目标VitC两亲分子的对应，表明成功合成了VitC两亲分子。
Step2：VitC水凝胶的制备与表征
将25mg的VitC两亲化合物溶解在500mL的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中60-80℃下VitC两亲化合物的自组装构筑超分子水凝胶。通过透射电子显微镜(TEM)观察水凝胶的微观结构。然后，通过流变分析评估了这种自支撑水凝胶的机械性能，测试储能模量(G')与损耗模量(G")在动态频率扫描范围内的变化规律，证明了水凝胶的粘弹性特性。此外，从注射器中推出的超分子水凝胶可以快速恢复到其原始形状和结构，该可注射水凝胶具有剪切稀化和自修复的特性，结果见图2。
图2a是水凝胶的透射电子显微镜图片，该水凝胶具有纤维状的微观结构，纤维纠缠形成自支撑的水凝胶；图2b为水凝胶的流变测试，右下角为可注射凝胶的照片。水凝胶的弹性模量(G')远高于粘性模量(G")，并在动态频率扫描范围内相互依赖，证明了水凝胶的粘弹性特性；右下角的图片为注射后的水凝胶，其恢复了初始的水凝胶结构，表明该水凝胶具有剪切稀化和自修复的特性。
尝试将不同浓度的VitC两亲分子在不同的温度下进行成胶行为验证，发现在低于60℃时，不能成胶，推测原因/可能的理由为VitC两亲分子氢键作用较强，不能完全溶解进行组装，当逐渐升高反应温度，高于80℃时，VitC两亲分子氢键被破坏，VitC两亲分子溶解度增加，有利于组装成水凝胶结构。
Step3：免疫调节药物的装载与体外释放
通过VitC水凝胶装载干扰素基因激动剂(STING agonist-4,SA)制备复合水凝胶(SA@VitC水凝胶)。将SA的单体溶液(0.5mg，50μL)加入VitC水凝胶中(0.5mL)，轻弹混合溶液，其逐渐固化形成SA@VitC水凝胶。
实施例2
一种基于维生素C水凝胶的肿瘤免疫治疗用药物组合物及其制备方法，具体步骤如下：
基本步骤同实施例1，将Step3中的SA的单体溶液更换成ICG的溶液(1mg/mL)，得到ICG@VitC水凝胶。
将实施例1制备的SA@VitC水凝胶置于50mL含酯酶(Esterase,5U/L)的PBS溶液中，不同时间点取溶液进行高效液相色谱分析SA与VitC的浓度，并补充等体积新鲜的含有酯酶的PBS溶液，绘制SA和VitC的释放曲线。此外，选用荧光染料吲哚菁绿(ICG)作为模型药物进行更直观的表征。将实施例2制备的ICG@VitC水凝胶至于Transwell皿中，下层加入酯酶溶液，孵育不同时间，利用小动物活体成像仪进行荧光测试，结果见图3。
图3a是SA@VitC水凝胶中SA与VitC的释放曲线。在酯酶的存在下，SA与VitC显示出明显加快的释放速率与接近于线性的释放行为；图3b是ICG@VitC水凝胶在Tranwell皿中的荧光强度变化图。与PBS处理的凝胶对比，酯酶处理的ICG@VitC水凝胶显示出更强的荧光信号，表明酶处理ICG的释放较多，证明了VitC水凝胶的酶响应性。
实施例3
一种基于维生素C水凝胶的肿瘤免疫治疗用药物组合物及其制备方法，具体步骤如下：
基本同实施例1，区别在于，Step3中将免疫检查点阻断抗体(aPDL1)的溶液(0.2mg，50μL)加入VitC水凝胶中(0.5mL)，轻弹混合溶液，其逐渐固化形成复合水凝胶(aPDL1@VitC水凝胶)。
实施例4
基于VitC水凝胶的药物组合物体内降解与药物的释放行为
首先研究水凝胶体内的降解行为，将VitC水凝胶(100μL)注射于Balb/c小鼠背部皮下组织，于不同时间点解剖小鼠，并记录残留水凝胶的重量。接下来研究模型药物ICG在体内的释放行为，将实施例2制备的装载荧光染料的ICG@VitC水凝胶(25μL)与等量的游离ICG溶液(25μL)以瘤内注射的方式注射于皮下CT26肿瘤，通过小动物成像观察染料随时间的释放，结果见图4。
图4a是皮下注射的VitC水凝胶在小鼠背部的降解情况。图4a(左)是小鼠背部组织的离体照片，图4a(右)是水凝胶随时间的降解曲线，残留水凝胶的重量与时间呈近线性关系，说明水凝胶在体内被逐渐降解；图4b是注射游离ICG和ICG@VitC水凝胶的小鼠肿瘤荧光成像的强度分析图。注射后第7天，肿瘤内ICG@VitC水凝胶的ICG荧光信号依然明显，而游离ICG注射的肿瘤内ICG信号在第一天迅速减弱，最终的残留量极低，表明VitC水凝胶在瘤内具有长期的滞留与缓释药物的能力。综合凝胶的讲解行为和荧光分子模拟药物释放实验的数据，说明该VC水凝胶能在组织内缓慢讲解，并引起装载的免疫调节药物的缓释。
实施例5
基于VitC水凝胶的药物组合物对CT26皮下肿瘤的免疫治疗效果
首先，将1×106个CT26细胞(50μL)皮下注射于Balb/c白鼠后臀部建立皮下肿瘤模型，待肿瘤体积生长至100mm3左右，将25μL的PBS溶液，游离SA，VitC水凝胶，实施例1制备的SA@VitC水凝胶分别注射于瘤内，记录小鼠肿瘤体积随时间的变化，并分析小鼠的存活率；此外，将25μL的PBS溶液，游离免疫检查点阻断抗体(aPDL1)，VitC水凝胶，实施例3制备的aPDL1@VitC水凝胶分别注射于不同组别小鼠的瘤内，观察小鼠肿瘤的生长，各组别小鼠肿瘤体积变化结果见图5。
图5a，c是每组小鼠肿瘤体积随时间变化图；图5b，d是不同组小鼠生存曲线，肿瘤体积超过1000mm3判定为死亡。与PBS组相比，VitC水凝胶本身可以抑制肿瘤的生长并延长小鼠的存活时间，说明局部高浓度的VitC具有一定的抗肿瘤作用。此外，负载了STING激动剂的VitC水凝胶显示出协同的治疗效果，其疗效显著优于单组分的STING激动剂和VitC水凝胶，极大程度地抑制了肿瘤的生长并显示出100％的存活率。该结果说明SA@VitC水凝胶在降解过程中可持续释放SA和VitC，释放的VitC可能调节免疫微环境以促进SA诱导的免疫反应。此外，没有观察到明显的体重下降，表明SA@VitC水凝胶局部治疗没有引起明显的副作用。除此之外，包载aPDL1的VitC水凝胶aPDL1@VitC水凝胶，同样显示出协同的治疗效果，其疗效显著优于单组分的STING激动剂和VitC水凝胶，极大程度地抑制了肿瘤的生长并显示出100％的存活率。综上，维生素C水凝胶可以包载小分子免疫激动剂SA和大分子的免疫检查点抗体aPDL1，装载的药物能够实现与VitC功能的协同，其肿瘤抑制效果与存活率显著优于单组分的免疫调节药物和VitC水凝胶。
实施例6
基于VitC水凝胶的药物组合物对CT26皮下肿瘤的免疫治疗效果的评价
通过流式细胞术分析免疫细胞的变化。首先在治疗后的第3天取小鼠的瘤周淋巴结制备单细胞悬液研究树突状细胞(DCs,CD80+CD86+)的成熟。然后，在治疗后的第6天，取小鼠的肿瘤组织单细胞悬液分析肿瘤内自然杀伤(NK,CD45+CD49b+)细胞的变化，研究CD8+T(CD3+CD4-CD8+)细胞与CD4+T(CD3+CD4+CD8-)细胞肿瘤内的浸润情况。此外，在治疗后的第6天测量血清中的肿瘤坏死因子α(TNFα)和干扰素-γ(IFNγ)浓度的变化，结果见图6。
图6a为治疗后第3天淋巴结中CD80+CD86+DC的代表性流式细胞术分析图像(左)和统计图(右)。与对照组相比，VitC水凝胶本身可以促进DC成熟，负载SA的VitC水凝胶表现出显著增强的效果；图6b，c与d分别为治疗后第6天肿瘤浸润NK(CD45+CD49b+)，CD4+(CD3+CD4+CD8-)和CD8+(CD3+CD4-CD8+)T细胞的代表性流式细胞术分析图像(左)和统计图(右)。与其它三组的小鼠对比，利用VitC水凝胶和SA@VitC水凝胶处理的肿瘤中，肿瘤细胞中NK，CD4+T与CD8+T的百分比明显增加，表明VitC水凝胶具有增效免疫治疗的效果。G1，PBS溶液；G2，SA；G3，VitC水凝胶；G4，SA@VitC水凝胶。
实施例7
基于VitC水凝胶的药物组合物对CT26转移瘤免疫治疗的疗效
首先，将1×106个CT26细胞(50μL)皮下注射于Balb/c白鼠右侧后臀部建立原发瘤，3天后1×106个CT26细胞(50μL)皮下注射于Balb/c白鼠左侧后臀部建立转移瘤，4天后，将25μL的PBS溶液，游离SA，VitC水凝胶，SA@VitC水凝胶分别注射于原发瘤，每两天测量两侧肿瘤的体积，记录小鼠原发瘤和转移瘤的体积随时间的变化，结果见图7。
图7为治疗后原发瘤(a)与远端瘤(b)体积随时间的变化图。VitC水凝胶不仅抑制了原发肿瘤的生长，还抑制了远端肿瘤的发展。在VitC水凝胶的协同作用下，SA能够在肿瘤内长期滞留并持续释放，给予SA@VitC水凝胶的小鼠的原发瘤和转移瘤的生长均被显著抑制，表明了SA@VitC水凝胶可以触发针对远端瘤的全身保护性免疫反应，表明出SA和VitC水凝胶协同的肿瘤抑制效果。
实施例8
基于VitC水凝胶的药物组合物对CT26转移瘤免疫治疗的评价
按照实施例7中的方法建立转移瘤模型，将25μL的PBS溶液，游离SA，VitC水凝胶，SA@VitC水凝胶分别注射于原发瘤，第6天取远端瘤制备单细胞悬液进行流式细胞术实验分析肿瘤内免疫细胞的变化，结果见图8。
图8a，b和c分别是远端肿瘤中浸润的NK细胞，CD8+T细胞，IFNγ+CD8+T细胞的代表性流式细胞术分析图像(左)和统计图(右)。与对照组对比，SA、VitC水凝胶和SA@VitC水凝胶处理的小鼠的远端瘤中浸润的NK细胞，CD8+T细胞，IFNγ+CD8+T细胞的比例增加，其中SA@VitC水凝胶组的效果明显大于SA、VitC水凝胶，进一步证明了协同的免疫治疗效果。该结果也表明局部应用的VitC基水凝胶可以触发针对远端瘤的全身保护性免疫反应。
实施例9
基于VitC水凝胶的药物组合物免疫治疗的机制分析
首先，在体外研究游离的VitC对两种重要的免疫DCs和CD8+T细胞的影响。树突细胞(BMDCs)从小鼠骨髓提取衍生，CD8+T通过分选的小鼠CD8 T细胞并进行离体刺激获取。将以上两种免疫细胞分别与1mM VitC一起孵育24h后，离心收集上清液和细胞用于流式细胞术和酶联免疫吸附分析，探究VitC水凝胶诱导免疫反应的可能机制，结果见图9。
图9a是游离VitC对BMDCs的影响。与VitC共孵育的BMDCs显示出共刺激分子(CD80、CD86)表达的明显上调(左图)和肿瘤坏死因子α(TNFα)浓度的增加(右图)，表明VitC能够刺激BMDCs的活化；图9b是游离VitC对CD8+T的影响。VitC能够刺激CD8+T IFNγ的分泌，说明VitC能够通过增加IFNγ的分泌来增加CD8+T细胞的肿瘤杀伤能力。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (10)

1.一种肿瘤免疫治疗用药物组合物，其特征在于，包括免疫调节药物和维生素C水凝胶载药系统，所述的维生素C水凝胶载药系统包载所述的免疫调节药物；所述免疫调节药物为小分子免疫调节药物和/或大分子免疫调节药物。
2.如权利要求1所述的肿瘤免疫治疗用药物组合物，其特征在于，所述小分子免疫调节药物为免疫激动剂或免疫检查点抑制剂；所述大分子免疫调节药物为免疫检查点阻断抗体。
3.如权利要求1所述的肿瘤免疫治疗用药物组合物，其特征在于，所述免疫调节药物与维生素C水凝胶具有协同的免疫治疗功能；所述协同的免疫治疗功能明显优于两种单组分药物简单叠加的肿瘤治疗效果。
4.如权利要求1所述的肿瘤免疫治疗用药物组合物，其特征在于，所述免疫调节药物和维生素C水凝胶的质量比为1：10-100。
5.如权利要求1所述的肿瘤免疫治疗用药物组合物，其特征在于，所述药物通过直接填充病灶或瘤周注射的方式进行给药，所述药物的给药剂量为0.5-5mg/kg。
6.一种权利要求1-5任一项所述的肿瘤免疫治疗用药物组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)预处理的维生素C两亲分子通过自组装得到维生素C水凝胶；
(2)将免疫调节药物装载到步骤(1)所述的维生素C水凝胶上，得到所述肿瘤免疫治疗用药物组合物。
7.如权利要求6所述的肿瘤免疫治疗用药物组合物的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述预处理是将维生素C通过修饰不同长度的碳链得到所述维生素C两亲分子。
8.如权利要求7所述的肿瘤免疫治疗用药物组合物的制备方法，其特征在于，所述不同长度的碳链的碳原子个数为8-18。
9.如权利要求6所述的肿瘤免疫治疗用药物组合物的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述维生素C两亲分子的浓度为10-100mg/mL。
10.如权利要求6所述的肿瘤免疫治疗用药物组合物的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述自组装的温度为60-80℃。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1274580A (zh) * 1999-05-20 2000-11-29 杭州阳光文化用品有限公司 稳定型缓释维生素c制剂及其生产方法
CN107802887A (zh) * 2017-11-06 2018-03-16 中山大学 一种温敏性水凝胶复合物及其促进被搭载细胞存活和/或组织修复的方法与应用
CN111557912A (zh) * 2020-06-04 2020-08-21 江南大学 一种脂肪酸基vc脂质体的制备方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1274580A (zh) * 1999-05-20 2000-11-29 杭州阳光文化用品有限公司 稳定型缓释维生素c制剂及其生产方法
CN107802887A (zh) * 2017-11-06 2018-03-16 中山大学 一种温敏性水凝胶复合物及其促进被搭载细胞存活和/或组织修复的方法与应用
CN111557912A (zh) * 2020-06-04 2020-08-21 江南大学 一种脂肪酸基vc脂质体的制备方法

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