CN113975394A - let-7b-5p在预防和治疗乳腺癌中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了let‑7b‑5p在预防和治疗乳腺癌中的应用。本发明通过ENCORI数据库研究发现let‑7b‑5p在乳腺癌组织中表达水平显著低于正常的组织，let‑7b‑5p低表达暗示乳腺癌患者的不良预后。采用体外细胞法分析了let‑7b‑5p及其靶基因对乳腺癌细胞的影响，结果表明，let‑7b‑5p直接靶向糖酵解关键酶HK2，可与HK2 3’UTR互补结合，let‑7b‑5p抑制乳腺癌细胞中HK2的表达、通过靶向HK2抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移、乳酸含量和ATP含量。因此，let‑7b‑5p可以作为乳腺癌早筛、预防和/或治疗的一个靶标。本发明具有重要的应用价值。

Description

let-7b-5p在预防和治疗乳腺癌中的应用
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及let-7b-5p在预防和治疗乳腺癌中的应用。
背景技术
乳腺癌是全球女性常见的恶性肿瘤之一。尽管现今的药物靶向性和治疗手段都有突破性的提高，但乳腺癌患者的复发、侵袭转移现象依旧常见。因此，早发现、早治疗可以减缓乳腺癌患者的发展进程，从而延长乳腺癌患者的生存期。
现今，人们越来越重视探索与癌症复发、转移与之相关的潜在分子标记物用于早期诊断。miRNA是一类内源基因编码长度约为19-24nt的非编码单链RNA分子。由于miRNA能够识别特定的目标信使RNA（messenger RNA，mRNA），并在转录后水平通过促进靶mRNA的降解和/或抑制翻译过程，发挥调控基因表达的作用，进而调控蛋白的表达，所以它与动物体内的生物过程息息相关。研究表明，miRNA与多种肿瘤发生有着密切的关系，它可能像癌基因或抑癌基因一样在肿瘤发生、发展过程中发挥重要的调控作用。当miRNA的行为异常时会导致疾病的发生，如miRNA-122是肝癌细胞发病的肿瘤标志物。此外，miRNA不仅存在于组织和细胞中，还稳定地存在于外周血及体液当中。所以在众多癌症的筛查、诊断及治疗过程中，miRNA是一个重要的生物指标。
发明内容
本发明的目的是预防和/或治疗乳腺癌。
本发明首先保护抑制HK2蛋白活性和/或表达量的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能可为预防和/或治疗乳腺癌。
本发明还保护抑制HK2蛋白活性和/或表达量的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能可为抑制乳腺癌细胞的增殖和/或迁移。
本发明还保护抑制HK2蛋白活性和/或表达量的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能可为抑制乳腺癌细胞的糖酵解。
本发明还保护抑制HK2基因表达量的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能可为预防和/或治疗乳腺癌。
本发明还保护抑制HK2基因表达量的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能可为抑制乳腺癌细胞的增殖和/或迁移。
本发明还保护抑制HK2基因表达量的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能可为抑制乳腺癌细胞的糖酵解。
上述任一所述抑制HK2蛋白活性和/或表达量的物质具体可为let-7b-5p； let-7b-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
上述任一所述抑制HK2基因表达量的物质可为let-7b-5p；let-7b-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明还保护let-7b-5p、HK2蛋白或HK2基因作为药物靶点在制备产品中的应用；所述产品的功能可为如下B1）-B5）中的至少一种：
B1）预防乳腺癌；
B2）治疗乳腺癌；
B3）抑制乳腺癌细胞的增殖；
B4）抑制乳腺癌细胞的迁移；
B5）抑制乳腺癌细胞的糖酵解。
上述任一所述抑制乳腺癌细胞的糖酵解可表现为A1）和/或A2）：
A1）抑制乳腺癌细胞的乳酸含量；
A2）抑制乳腺癌细胞的ATP含量。
上述任一所述HK2蛋白的Gene ID为3099。
上述任一所述HK2基因的Genebank号为NM_000189。
本发明还保护let-7b-5p在乳腺癌早筛中的应用。
上述任一所述应用用于非疾病的诊断与治疗。
本发明通过ENCORI数据库研究发现let-7b-5p在乳腺癌组织中表达水平显著低于正常组织，let-7b-5p低表达暗示乳腺癌患者的不良预后。采用体外细胞法分析了let-7b-5p及其靶基因对乳腺癌细胞的影响，结果表明，let-7b-5p直接靶向糖酵解关键酶HK2，可与HK2 3’UTR互补结合，let-7b-5p抑制乳腺癌细胞中HK2的表达、通过靶向HK2抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移、乳酸含量和ATP含量。因此，let-7b-5p可以作为乳腺癌早筛、预防和/或治疗的一个靶标。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为数据库分析let-7b-5p在乳腺癌和正常组织中的表达及患者预后。
图2为荧光酶素活性检测let-7b-5p对HK2靶序列的调控作用。**p<0.01，与3’ UTRWT组相比。
图3为let-7b-5p抑制乳腺癌细胞中HK2的表达。**p<0.01，与各自NC组相比较。
图4为let-7b-5p抑制乳腺癌细胞的增殖。**p<0 .01，与各自NC组相比。
图5为let-7b-5p抑制乳腺癌细胞的迁移。
图6为let-7b-5p通过靶向HK2抑制乳腺癌细胞的乳酸含量和ATP含量。**p<0.01，与NC组相比。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中，let-7b-5p的核苷酸序列为：UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU（SEQ IDNO：1）。let-7b-5p mimics的核苷酸序列为5’-UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU-3’（SEQ ID NO：1）。NC的核苷酸序列为5’-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3’（SEQ ID NO：2）。let-7b-5p mimics和NC的序列均由上海吉玛生物科技有限公司合成。
下述实施例中的乳腺癌细胞为MDA-MB-231细胞和ZR75-1细胞，均为美国ATCC细胞库的产品。乳腺癌细胞在含有10%（v/v）胎牛血清的DMEM培养基中恒温培养。恒温培养条件为5%CO2、37℃。
采用SPSS16.0统计软件进行数据的统计学分析。计量资料以x±s表示。组间数据差异采用双侧样本的Student's t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。
实施例1、ENCORI数据库分析
在ENCORI数据库分析网站（网址为https://starbase.sysu.edu.cn/）的Pan-Cancer页面下，分别进入miRNA Differential Expression和miRNA Survival Analysis版块，对let-7b-5p进行乳腺癌VS.正常组织的差异表达分析及在乳腺癌中的生存分析。
实验结果见图1（A为let-7b-5p在乳腺癌组织与正常组织中的表达，B为乳腺癌患者总生存期分析）。结果表明，let-7b-5p在乳腺癌组织中表达水平显著低于正常的组织，let-7b-5p低表达暗示乳腺癌患者的不良预后。
实施例2、荧光酶素活性检测let-7b-5p对HK2（Gene ID：3099）的靶向结合作用
1、构建HK2 3’-UTR荧光素酶活性载体
（1）通过NCBI网站获取HK2（Genebank号为：NM_000189）的3’-UTR序列，根据HK23’-UTR序列，设计并合成上游引物：5’-CGGAATTCAACCCCTGAAATCGGAAGGGACTT-3’（下划线为限制性内切酶EcoRI的识别位点）和下游引物：5’-CCGCTCGAGGCTTTGCCATTCACTCACCCTGAA-3’（下划线为限制性内切酶XhoI的识别位点）。以ZR75-1基因组为模板，采用上游引物和下游引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即HK2 3’-UTR（即HK2基因野生型3’UTR）。
（2）用限制性内酶切EcoRI和XhoI双酶切荧光素酶报告基因pCDNA3.0-Luc 载体，回收载体骨架。pCDNA3.0-Luc载体为将pCDNA3.0载体的限制性内切酶HindIII和BamHI之间的DNA小片段替换为Luciferase荧光素酶标签得到的重组质粒。
（3）将步骤（1）得到的PCR扩增产物用限制性内酶切EcoRI和XhoI双酶切，回收酶切产物；将该酶切产物和步骤（2）回收的载体骨架进行连接，得到pCDNA3.0-Luc HK2 3'-UTR荧光素酶报告基因载体，以下简称pCDNA3.0-LucHK2wt报告载体。
（4）根据let-7b-5p的核苷酸序列，在HK2 3’-UTR寻找到其潜在结合位点处，设计突变引物。利用定点突变试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司）对HK2 3’-UTR结合位点进行定点突变，具体为：以步骤（1）得到的PCR扩增产物为模板，采用5’-AGAAAGCAAGACTTCGCCTGTGGGAAGAGAAG-3’（下划线为结合位点的突变序列）和5’-GCGAAGTCTTGCTTTCTATGACTAGTCAGTATCTTCCCT-3’（下划线为结合位点的突变序列）进行PCR扩增，得到PCR扩增产物（即HK2基因突变的3’UTR）。
（5）将步骤（4）得到的PCR扩增产物用限制性内酶切EcoRI和XhoI双酶切，回收酶切产物；将该酶切产物和步骤（2）回收的载体骨架进行连接，得到pCDNA3.0-Luc HK2 3’-UTR突变的荧光素酶报告基因载体，以下简称pCDNA3.0-LucHK2mut报告载体。
2、细胞转染
将荧光报告载体（pCDNA3.0-LucHK2wt报告载体或pCDNA3.0-LucHK2mut报告载体）与目的序列（let-7b-5p mimics或NC）共转染至乳腺癌细胞（MDA-MB-231细胞或ZR75-1细胞），48h后裂解细胞，采用双荧光素酶检测试剂盒（威格拉斯生物技术(北京)有限公司）检测荧光素酶活性。以3’UTR WT组（即pCDNA3.0-LucHK2wt报告载体和NC共转染至乳腺癌细胞）的荧光素酶活性作为1，计算其它组的荧光素酶相对活性。
检测结果见图2。结果表明，转染HK2基因野生型3’UTR的组别，过表达let-7b-5p后能够下调HK2 3’UTR的荧光素酶活性（P<0.01）；而转染HK2基因突变的3’UTR的组别，过表达let-7b-5p后荧光素酶活性没有发生明显变化。由此可见，let-7b-5p可与HK2 3’UTR互补结合，let-7b-5p靶向结合HK2。
实施例3、let-7b-5p抑制乳腺癌细胞中HK2的表达
1、采用Lipofectamine3000（Invitrogen）将let-7b-5p mimics或NC转染至乳腺癌细胞（MDA-MB-231细胞或ZR75-1细胞），得到转染的乳腺癌细胞。
2、完成步骤1后，采用RIPA裂解液裂解转染的乳腺癌细胞，之后提取总蛋白；之后分别采用HK2抗体（Cell Signaling Technology）和β-actin抗体（Santa CruzBiotechnology）作为一抗Western blot检测HK2蛋白和β-actin蛋白，β-actin为内参。
Western blot检测HK2蛋白表达水平的结果见图3中A的上图。
3、完成步骤1后，先用Trizol（美国Invitrogen公司）提取转染的乳腺癌细胞的总RNA；之后利用miRNAcDNA第一链合成试剂盒（天根生化科技(北京)有限公司）对转染的乳腺癌细胞总RNA中的miRNA进行反转录，得到转染的乳腺癌细胞miRNA的cDNA。
4、完成步骤3后，采用实时荧光定量PCR试剂盒（普洛麦格(北京)生物技术有限公司）对转染的乳腺癌细胞miRNA的cDNA进行实时荧光定量PCR反应检测，并结合2-△△Ct法分析let-7b-5p的相对表达量（内参为U6）。
检测let-7b-5p的引物为5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’和5’-TGAGGTAGTAGGTTGTGTGG-3’。
检测U6的引物为5’-CGCGCTTCGGCAGCACATATACT-3’和5’-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3’。
实时荧光定量PCR检测let-7b-5p的相对表达水平的结果见图3中A的下图。
5、完成步骤1后，先用Trizol（美国Invitrogen公司）提取转染的乳腺癌细胞的总RNA；之后利用反转录试剂盒（天根生化科技(北京)有限公司）对转染的乳腺癌细胞的总RNA进行反转录，得到转染的乳腺癌细胞的cDNA。采用实时荧光定量PCR试剂盒（普洛麦格(北京)生物技术有限公司）对转染的乳腺癌细胞的cDNA进行实时荧光定量PCR反应检测，并结合2-△△Ct法分析HK2基因的相对表达量（内参为β-actin基因）。
检测HK2基因的引物为5’-GCCATCCTGCAACACTTAGGGCTTGAG-3’和5’-GTGAGGATGTAGCTTGTAGAGGGTCCC-3’。
检测β-actin基因的引物为5’-TCGTGCGTGACATTAAGGAG-3’和5’-ATGCCAGGGTACATGGTGGT-3’。
实时荧光定量PCR检测HK2基因的相对表达水平的结果见图3中B。
结果表明，转染let-7b-5p mimics的MDA-MB-231细胞与ZR75-1细胞中HK2 mRNA与HK2蛋白表达水平较NC组发生了显著降低。由此可见，let-7b-5p抑制乳腺癌细胞中HK2的表达。
实施例4、let-7b-5p抑制乳腺癌细胞的增殖
1、构建HK2真核表达载体
（1）以人源HK2（Genebank号为：NM_000189）的核苷酸序列为模板，采用5'-CGGGATCCATGATTGCCTCGCATCTGCTT-3'（下划线为限制性内酶切BamHI的识别位点）和5'-CGGAATTCCTATCGCTGTCCAGCCTCA-3'（下划线为限制性内酶切EcoRI的识别位点）组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
（2）用限制性内酶切BamHI和EcoRI双酶切真核表达载体pCDNA3-FLAG（军事医学，2018, 42 (7): 510-511），回收载体骨架。
（3）将步骤（1）得到的PCR扩增产物用限制性内酶切BamHI和EcoRI双酶切，回收酶切产物；将该酶切产物和步骤（2）回收的载体骨架进行连接，得到pCDNA3.0-FLAG HK2真核表达载体，即HK2真核表达载体。
2、细胞转染
（1）采用Lipofectamine3000（Invitrogen）将NC、let-7b-5p mimics或“let-7b-5pmimics和HK2真核表达载体”转染至乳腺癌细胞（MDA-MB-231细胞或ZR75-1细胞），得到转染的乳腺癌细胞。
（2）将步骤（1）得到的转染的乳腺癌细胞铺于96孔板，每孔接种约3000个细胞，常规培养至贴壁，之后用Cell Counting Kit-8（Dojindo）于450nm检测OD值。CCK-8溶液浓度为10%。连续检测5天，绘制生长曲线。
生长曲线见图4。结果表明，转染let-7b-5p mimics的乳腺癌细胞增殖倍数显著低于NC（P<0.05）；与转染let-7b-5p mimics相比，转染“let-7b-5pmimics和HK2真核表达载体”的乳腺癌细胞增殖倍数显著增加（P<0.05）；转染NC和“转染let-7b-5pmimics和HK2真核表达载体”的乳腺癌细胞增殖倍数无显著性差异。上述结果表明，let-7b-5p抑制乳腺癌细胞的增殖（准确的说，let-7b-5p通过靶向HK2抑制乳腺癌细胞的增殖），HK2会回复let-7b-5p对乳腺癌细胞的增殖抑制作用。
实施例5、let-7b-5p抑制乳腺癌细胞的迁移
采用细胞划痕实验分析let-7b-5p对乳腺癌细胞的迁移的影响。具体步骤如下：
1、采用Lipofectamine3000（Invitrogen）将NC、let-7b-5p mimics或“let-7b-5pmimics和实施例4步骤1构建的HK2真核表达载体”转染至乳腺癌细胞（MDA-MB-231细胞或ZR75-1细胞），得到转染的乳腺癌细胞。
2、将步骤1得到的转染的乳腺癌细胞加入到6孔板，过夜培养；之后用10μL的枪头在单层细胞上划横线，PBS洗3次，洗去脱落的细胞，此时（即为第0h）显微镜下拍照并计算划痕的宽度；之后培养24h，取出，此时（即为第24h）显微镜下拍照并计算划痕的宽度。
观察结果见图5。结果表明，转染let-7b-5p mimics的乳腺癌细胞迁移显著低于NC（P<0.05）；与转染let-7b-5p mimics相比，转染“let-7b-5p mimics和HK2真核表达载体”的乳腺癌细胞迁移显著提高（P<0.01）；转染NC和“转染let-7b-5p mimics和HK2真核表达载体”的乳腺癌细胞迁移无显著性差异。上述结果表明，let-7b-5p抑制乳腺癌细胞的迁移（准确的说，let-7b-5p通过靶向HK2抑制乳腺癌细胞的迁移），HK2会回复let-7b-5p对乳腺癌细胞的迁移抑制效果。
实施例6、let-7b-5p通过靶向HK2抑制乳腺癌细胞的乳酸含量和ATP含量
1、采用Lipofectamine3000（Invitrogen）将NC、let-7b-5p mimics或“let-7b-5pmimics和实施例4步骤1构建的HK2真核表达载体”转染至乳腺癌细胞（MDA-MB-231细胞或ZR75-1细胞），得到转染的乳腺癌细胞。
2、将步骤1得到的转染的乳腺癌细胞铺种于12孔板，用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养10小时后，更换为不含血清的培养基，孵育1h后收集上清，利用乳酸检测试剂盒（Biovision）检测乳酸含量。以转染NC的乳腺癌细胞的乳酸含量作为1，计算转染let-7b-5pmimics和“转染let-7b-5p mimics和HK2真核表达载体”的相对乳酸含量。
3、取步骤1得到的转染的乳腺癌细胞1×106个，利用ATP检测试剂盒（Biovision）检测ATP含量。以转染NC的乳腺癌细胞的ATP含量作为1，计算转染let-7b-5p mimics和“转染let-7b-5p mimics和HK2真核表达载体”的相对ATP含量。
检测结果见图6。结果表明，转染let-7b-5p mimics的乳腺癌细胞乳酸含量和ATP含量显著低于NC（P<0.01）；与转染let-7b-5p mimics相比，转染let-7b-5p mimics和HK2真核表达载体的乳腺癌细胞的乳酸含量和ATP含量均显著提高（P<0.01）。上述结果表明，let-7b-5p抑制乳腺癌细胞的乳酸含量和ATP含量（即抑制乳腺癌细胞的糖酵解），准确的说，let-7b-5p通过靶向HK2抑制乳腺癌细胞的乳酸含量和ATP含量，HK2会回复let-7b-5p对乳腺癌细胞的乳酸含量和ATP含量的抑制效果。
上述结果表明，HK2是let-7b-5p的靶基因，HK2在乳腺癌患者肿瘤组织中表达量显著高于正常组织；let-7b-5p通过靶向HK2抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移、乳酸含量和ATP含量。因此，let-7b-5p及其靶基因HK2基因是预防或治疗乳腺癌的靶标。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> let-7b-5p在预防和治疗乳腺癌中的应用
<160>2
<170> PatentIn version 3.5
<210>1
<211>22
<212>RNA
<213>Artificial sequence
<400>1
ugagguagua gguugugugg uu 22
<210>2
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial sequence
<400>2
uuguacuaca caaaaguacu g 21

Claims (10)

1.抑制HK2蛋白活性和/或表达量的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为预防和/或治疗乳腺癌。
2.抑制HK2蛋白活性和/或表达量的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为抑制乳腺癌细胞的增殖和/或迁移。
3.抑制HK2蛋白活性和/或表达量的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为抑制乳腺癌细胞的糖酵解。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述抑制乳腺癌细胞的糖酵解表现为A1）和/或A2）：
A1）抑制乳腺癌细胞的乳酸含量；
A2）抑制乳腺癌细胞的ATP含量。
5.抑制HK2基因表达量的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为预防和/或治疗乳腺癌。
6.抑制HK2基因表达量的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为抑制乳腺癌细胞的增殖和/或迁移。
7.抑制HK2基因表达量的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为抑制乳腺癌细胞的糖酵解。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述抑制乳腺癌细胞的糖酵解表现为A1）和/或A2）：
A1）抑制乳腺癌细胞的乳酸含量；
A2）抑制乳腺癌细胞的ATP含量。
9.根据权利要求1至8任一所述的应用，其特征在于：所述抑制HK2蛋白活性和/或表达量的物质或所述抑制HK2基因表达量的物质为let-7b-5p；
let-7b-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
10.let-7b-5p、HK2蛋白或HK2基因作为药物靶点在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下B1）-B5）中的至少一种：
B1）预防乳腺癌；
B2）治疗乳腺癌；
B3）抑制乳腺癌细胞的增殖；
B4）抑制乳腺癌细胞的迁移；
B5）抑制乳腺癌细胞的糖酵解；
let-7b-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
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