CN113975388A - 一种聚多巴胺修饰黑磷纳米复合材料和制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明适用于医药材料制备技术领域,提供了一种聚多巴胺修饰黑磷纳米复合材料和制备方法,其中,聚多巴胺修饰黑磷纳米复合材料包括如下重量份的组分:聚多巴胺修饰黑磷纳米片20‑28份、二氢卟吩e6 15~25份、硝普钠8~15份、三苯基膦10~20份、叶酸聚乙二醇8~12份。本发明提供了一种对人体损伤小、治疗效果好的聚多巴胺修饰黑磷纳米复合材料及其制备方法。
Description
技术领域
本发明涉及医药材料制备技术领域,尤其是涉及一种聚多巴胺修饰黑磷纳米复合材料和制备方法。
背景技术
肿瘤细胞内环境具有极端特征,如高糖含量和缺氧,使肿瘤细胞的代谢不同于正常细胞。肿瘤细胞与正常细胞的代谢差异通过为肿瘤细胞自身的生长提供了所需的生物大分子等导致肿瘤的发生和存活。同时,细胞代谢的改变构成了治疗过程中的主要障碍,并且肿瘤对放疗、化疗、光动力疗法(PDT)和免疫疗法等治疗干预具有很强的抵抗力。
光热疗法(PTT)和PDT是新兴的肿瘤治疗策略。PTT治疗中超过50℃的高温能够直接完全杀死癌细胞。然而,PTT由于具有强烈的热辐射导致其应用受到限制,这是由于,强烈的辐射会导致显著的非特异性热扩散,并导致周围正常组织的附带损伤,给患者造成无法忍受的热痛或引起炎症等发生导致情况不可避免地恶化。
PDT的光毒性以及其对正常组织的无创性特点使其已成为肿瘤治疗领域的研究热点,但PDT与PTT和其他治疗策略类似,也受到健康组织和肿瘤组织之间难以区分的限制,例如区分难度高的活性氧(ROS)输送系统,从而极大降低了的治疗效果。
综上所述,本发明存在的技术问题如下:
1.现有技术中由于肿瘤细胞代谢异于正常细胞,致使肿瘤细胞在体内快速生长,从而使得现有的干预治疗方法难以抑制肿瘤细胞的生长;
2.现有技术中的光热疗法在治疗过程中要求超过50℃的高温,能够直接杀死癌细胞,但同时也杀死了癌细胞周围正常身体组织,从而导致患者疼痛难忍,或产生炎症使得病情发生不可避免的恶化;
3.现有技术中的光动力疗法在治疗过程中存在ROS输送系统难以区分的缺点,从而极大影响了治疗效果。
发明内容
本发明的目的是提供一种人体损伤小、治疗效果好的聚多巴胺修饰黑磷纳米复合材料及其制备方法。
本发明第一方面提供了一种聚多巴胺修饰黑磷纳米复合材料,包括如下重量份的组分:聚多巴胺修饰黑磷纳米片20~28份、二氢卟吩e6 15~25份、硝普钠8~15份、三苯基膦10~20份、叶酸聚乙二醇8~12份。
进一步的,所述聚乙二醇叶酸为硫基聚乙二醇叶酸或磷基聚乙二醇叶酸。
进一步的,所述聚多巴胺修饰黑磷纳米片包括如下重量份的组分:多巴胺6~14份、黑磷纳米片3~5份。
本发明第二方面提供了一种聚多巴胺修饰黑磷纳米复合材料的制备方法,包括如下步骤:
步骤S10:混合第一溶液和第二溶液,得到混合溶液,所述第一溶液包括二氢卟吩e6 15~25份、硝普钠8~12份,所述第二溶液包括三苯基膦10~20份;
步骤S20:将聚多巴胺修饰黑磷纳米片溶液逐滴加入混合溶液中,并搅拌,离心并洗涤后,得到复合溶液;
步骤S30:将复合溶液和聚乙二醇叶酸混合,搅拌后离心,并洗涤,得到聚多巴胺修饰黑磷纳米复合材料。
进一步的,所述第一溶液的制备步骤包括:将二氢卟吩e6 15~25份和硝普钠8~12份溶解在二甲基亚砜中,并在室温下经活化剂活化2~6小时。
进一步的,所述第二溶液的制备步骤包括:将三苯基膦10~20份溶解在二甲基亚砜中,并在室温下经活化剂活化2~6小时。
进一步的,所述步骤S20和所述步骤S30中的洗涤为至少三次洗涤,所述步骤S20和所述步骤S30中均采用洗涤剂进行洗涤,所述洗涤剂为乙醇、磷酸盐缓冲盐溶液、超纯水中的一种或多种。
进一步的,所述聚多巴胺修饰黑磷纳米片溶液的制备步骤包括:将盐酸多巴胺加入黑磷纳米片中,室温搅拌,经离心和多次洗涤后,得到聚多巴胺修饰黑磷纳米片;将聚多巴胺修饰黑磷纳米片分散到磷酸盐缓冲盐溶液,得到聚多巴胺修饰黑磷纳米片溶液。
本发明第三方面提供了一种聚多巴胺修饰黑磷纳米片制剂,通过所述的制备方法制备得到。
本发明第四方面提供了所述聚多巴胺修饰黑磷纳米片制剂在肿瘤级联气体/温和光热/光动力协同治疗的药物中的应用。
综上所述,本发明至少具有以下技术效果:
1.本发明通过将硝普钠负载到聚多巴胺修饰黑磷纳米复合材料上,由聚多巴胺修饰黑磷纳米复合材料将硝普钠运输至生物体内产生抗癌气体分子,从而通过高浓度的气体对癌细胞产生抗肿瘤效果;
2.本发明通过将三苯基膦负载到聚多巴胺修饰黑磷纳米复合材料上,由聚多巴胺修饰黑磷纳米复合材料将三苯基膦运输至生物体内,通过三苯基膦靶向线粒体,将负载由三苯基膦和硝普钠的聚多巴胺修饰黑磷纳米复合材料运输至线粒体内并产生抗肿瘤作用,通过硝普钠产生的气体进行气体疗法,同时采用光热疗法,同时或先后作用并杀死肿瘤细胞,由于气体疗法和光热疗法的级联作用,有效降低了光热温度,使得光热温度低于45℃,有效降低了人体在治疗过程中的损伤,有效避免了炎症的产生,加快了患者的康复速度,具有良好的治疗效果;
3.本发明通过将三苯基膦和硝普钠负载到聚多巴胺修饰黑磷纳米复合材料上,为气体疗法与其他治疗方法进行结合治疗提供了良好的给药平台,为多种抗癌治疗提供了具有操作性的前提条件,为多种抗癌治疗技术的发展做出卓越贡献。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对本发明实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明中气体治疗/低温光热治疗/光动力治疗协同治疗中BCS的作用示意图;
图2(a)是本发明中BP NSs的SEM图像;图2(b)是本发明中BP@PDA的SEM图像;图2(c)是本发明中BCS的SEM图像;
图3(a)是本发明中BP NSs的DLS测定;图3(b)是本发明中BP@PDA的DLS测定;图3(c)是本发明中BCS的DLS测定;
图4是本发明中BCS、BP NSs、BP@PDA、PDA、SNP、Ce6、TPP、FA的吸收光谱;
图5是本发明中BCS、BP NSs、BP@PDA、PDA、SNP、Ce6、FA的红外光谱;
图6是本发明中BCS、BP NSs、BP@PDA、SNP、Ce6材料的荧光光谱;
图7是本发明中BP NSs、BP@PDA、PDA、SNP、Ce6、TPP、FA、BCS和BP@PDA-Ce6&SNP-TPP的zeta电位;
图8是本发明中BP NSs的XRD图;
图9(a)是本发明中不同时间PBS和DMEM全培养中BCS NP的照片;图9(b)是本发明中BCS、BP NSs、BP@PDA的降解速率曲线;图9(c)是本发明中在PBS和DMEM全培养中不同时间的BCS粒径大小;
图10(a)是本发明中BCS在不同pH值的PBS溶液中Ce6的累积释放量;图10(b)本发明中BCS在不同pH值的PBS溶液中SNP的累积释放量;
图11是本发明中在是否存在硫醇或是否激光照射情况下BCS中NO的累计释放量;
图12是本发明中不同材料的光热曲线;
图13(a)是本发明中不同激光功率密度下BCS的光热曲线;图13(b)是不同浓度BCS的光热曲线;
图14是本发明中BCS的光热性能;
图15是本发明中不同纳米粒子的紫外可见光谱;
图16是本发明中经辐照处理后BCS的SEM图;
图17是本发明中BCS在激光照射不同时间下的荧光光谱;
图18是本发明中BP@PDA在激光照射不同时间下的荧光光谱;
图19是本发明中不同纳米颗粒在不同时间下的吸光度;
图20是本发明中不同时间下ONOO-的含量;
图21是本发明中经BCS处理后的不同孵育时间下癌细胞的荧光图像;
图22(a)是本发明中不同抑制剂存在下BCS处理癌细胞的荧光图像;图22(b)是本发明中不同抑制剂的细胞摄取量;
图23是本发明中HeLa细胞线粒体的BCS共聚焦图像;
图24(a)是本发明中H1299细胞的NO荧光强度;图24(b)是本发明中HeLa细胞的NO荧光强度;
图25是本发明中不同处理后细胞内NO的浓度;
图26是本发明中不同处理后HeLa细胞的Bio-TEM图像;
图27是本发明中细胞内NADPH/DNDP+的含量;
图28是本发明中不同处理后单线氧探针染色荧光图;
图29(a)是本发明中不同处理后ATP的含量;图29(b)是本发明中不同处理组经AO染色后的荧光强度;
图30是本发明中线粒体膜电位的JC-1染色示意图;
图31是本发明中钙黄绿素AM/CoCl2测定线粒体通透性转换孔统计结果;
图32是本发明中CLSM染色标记线粒体结构变化示意图;
图33是本发明中不同处理组处理后线粒体的线粒体活性;
图34是本发明中不同细胞在不同浓度内Ga2+的浓度;
图35是本发明中AO染色标记示意图;
图36是本发明中罗丹明B累计统计结果;
图37(a)是本发明中不同处理组在不同浓度下的组织蛋白酶B的活性;图37(b)是本发明中不同处理组在不同浓度下的酸性磷酸酶的活性
图38是本发明中不同浓度BCS的溶血结果;
图39是本发明中不同材料的细胞毒性;
图40是本发明中不同处理下的细胞成活率;
图41是本发明中钙黄绿素染色的示意图;
图42是本发明中不同细胞经不同处理后的流式细胞术结果;
图43是本发明中western blotting的结果示意图;
图44是本发明中动物实验设计示意图;
图45是本发明中小鼠注射BCS后不同时间的荧光图像;
图46是本发明中注射BCS 12小时后小鼠各器官肿瘤靶向效率的统计图;
图47是本发明中注射BCS 12小时后小鼠各器官的荧光图像;
图48是本发明中注射BCS 12小时后肿瘤切片中纳米材料的染色标记图;
图49是本发明中小鼠经激光照射不同时间后的热成像图;
图50是本发明中小鼠经不同处理后肿瘤部位温度变化统计图;
图51是本发明中小鼠经不同处理后的存活曲线;
图52是本发明中小鼠经不同处理后的肿瘤体积生长曲线;
图53是本发明中小鼠经不同处理后的体重变化统计图;
图54是本发明中治疗终点肿瘤照片;
图55是本发明中小鼠径不同处理后的肿瘤重量统计图;
图56是本发明中不同处理后的ROS染色标记示意图和TUNEL染色标记示意图;
图57是本发明中不同处理后小鼠切片的免疫组化示意图;
图58(a)是本发明中经不同治疗后WBC的血常规统计图;图58(b)是本发明中经不同治疗后RBC的血常规统计图;图58(c)是本发明中经不同治疗后HGB的血常规统计图;图58(d)是本发明中经不同治疗后HCT的血常规统计图;图58(e)是本发明中经不同治疗后MCV的血常规统计图;图58(f)是本发明中经不同治疗后MCH的血常规统计图;图58(g)是本发明中经不同治疗后MCHC的血常规统计图;图58(h)是本发明中经不同治疗后PLT的血常规统计图;
图59(a)是本发明中经不同治疗后ALT的血生化统计图;图59(b)是本发明中经不同治疗后AST的血生化统计图;图59(c)是本发明中经不同治疗后GLB的血生化统计图;图59(d)是本发明中经不同治疗后TP的血生化统计图;图59(e)是本发明中经不同治疗后ALB的血生化统计图;图59(f)是本发明中经不同治疗后TBIL的血生化统计图;图59(g)是本发明中经不同治疗后UREA的血生化统计图;图59(h)是本发明中经不同治疗后CREA的血生化统计图;
图60是本发明中主要器官的染色示意图。
具体实施方式
以下的说明提供了许多不同的实施例、或是例子,用来实施本发明的不同特征。以下特定例子所描述的元件和排列方式,仅用来精简的表达本发明,其仅作为例子,而并非用以限制本发明。
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明,应当理解,此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明,并不用于限定本发明。
同时,在本文未明确给出试剂来源的情况下,此类试剂可根据分子生物学中应用的质量/纯度标准从任何分子生物学试剂提供商处获得。
实施例1
如图1所示,本发明实施例1提供了一种聚多巴胺修饰黑磷纳米复合材料,包括如下重量份的组分:聚多巴胺修饰黑磷纳米片20~28份、二氢卟吩e6 15~25份、硝普钠8~15份、三苯基膦10~20份、叶酸聚乙二醇8~12份。
二氢卟吩e6用作光敏剂,有助于PDT发挥更好的光动力治疗效果。
申请人在实际研究和治疗过程中,经过大量试验和研究发现:低于45℃的轻度PTT能够降低对正常细胞的损伤,并具有较好的治疗性效果治疗效果,但上述轻度PTT的治疗效率较底。因此,申请人结合PDT治疗对温度限制较底的特点,研制出一种既能够降低PTT治疗中的温度,又能够通过PDT治疗进一步诱导肿瘤细胞死亡,从而在提高治疗效率和治疗效果的同时,能够降低高温对人体组织的伤害,极大降低了患者炎症发生的几率,加快了患者的康复速度。
PDT的可调光毒性以及其对正常组织的无创性已成为肿瘤治疗领域的研究热点,通常,光照射的能量通过光敏剂(PS)转移到周围的溶解氧(O2),产生治疗性活性氧,从而导致氧化应激爆发,并对生物成分(如蛋白质和DNA)造成不可逆的损害,最终诱导细胞死亡。因此,本申请人提出了新的药物方案,能够利用PTT、PDT和气体疗法的优势,并避免了上述缺点。
叶酸聚乙二醇具有稳定的针对癌细胞的靶向选择性,能够使所述聚多巴胺修饰黑磷纳米复合材料选择定位到癌细胞。
硝普钠通过细胞酶的催化作用与肿瘤细胞中过度表达的硫醇化合物发生反应,适用于一氧化氮供体,通过将硝普钠负载到聚多巴胺修饰黑磷纳米复合材料上,由聚多巴胺修饰黑磷纳米复合材料将硝普钠运输至生物体内产生抗癌气体,从而通过高浓度的气体对癌细胞产生抗肿瘤效果。
将NO与其他活性氧结合可形成用于动态治疗的其他类型的活性氧,将过氧阴离子与NO结合生成过氧亚硝基阴离子(ONOO-),这是一种更强大的氧化剂,可诱导关键生物分子的过度氧化、硝化和亚硝基化,从而导致细胞死亡。然而,由于NO供体的半衰期短、扩散速率高、扩散距离短以及靶向效率极低,其治疗效果仅限于其产生部位周围。因此,气体疗法结合NO与其他新疗法,如光疗、放疗等,可以实现更好的协同癌症治疗效果。
当硝普钠的重量组分低于4份时,NO对癌细胞增殖、血管内稳态、神经元活动、免疫反应产生的作用小,从而难以抑制癌细胞的增殖,更无法导致癌细胞死亡;当硝普钠的重量组分高于6份时,NO浓度过高,从而对人体产生一定毒性,从而使机体产生一定的耐药性,激活免疫系统,并导致正常细胞死亡,使得治疗效果呈现下降趋势。
线粒体是不可或缺的双层膜结构的细胞器,为各种细胞活动提供动力,如细胞迁移和信号转导,以维持转化表型、增殖、存活、氧化还原、多药耐药和免疫调节等。因此,线粒体被认为是许多疾病(如各种癌症)细胞生命周期的调节枢纽。线粒体中的活性氧(ROS)在线粒体功能和癌细胞存活中起着关键作用。线粒体ROS的失衡将导致致命的后果,如ATP供应的抑制、氧化还原的干扰导致氧化应激爆发、线粒体DNA(mtDNA)的突变和促凋亡因子的释放。因此,靶向线粒体中的ROS水平可作为一种新的、可行的癌症治疗策略。
三苯基膦能够实现对线粒体的靶向定位,通过将三苯基膦负载到聚多巴胺修饰黑磷纳米复合材料上,由聚多巴胺修饰黑磷纳米复合材料将三苯基膦运输至生物体内,通过三苯基膦和叶酸聚乙二醇的共同作用靶向癌细胞线粒体,将负载由三苯基膦和硝普钠的聚多巴胺修饰黑磷纳米复合材料运输至线粒体内并产生抗肿瘤作用,通过硝普钠产生的气体进行气体疗法,同时采用光热疗法,同时或先后作用并杀死肿瘤细胞,由于气体疗法和光热疗法的级联作用,有效降低了光热温度,使得光热温度低于45℃,有效降低了人体在治疗过程中的损伤,有效避免了炎症的产生,加快了患者的康复速度,具有良好的治疗效果。
当三苯基膦的重量组分低于10份时,对线粒体的靶向作用有限,能够杀死的癌细胞数量有限,杀死癌细胞的速率小于癌细胞的生长速度,无法产生显著的治疗效果;当三苯基膦的重量组分高于15份时,由于癌细胞数量有限,当所有癌细胞均被靶向作用之后,剩余的三苯基膦会靶向正常细胞的线粒体,从而导致正常细胞受损。
通过硝普钠与气体治疗平台的结合,可加速治疗剂的释放,显著的释放出NO和ROS,从而形成更大的级联氧化剂,同时由于三苯基膦的靶向作用,精准的使得ROS作用于线粒体,则将导致线粒体分解和功能障碍,导致线粒体的能量供应不足,并通过线粒体诱导癌细胞死亡。这是由于,线粒体功能的阻断会阻碍细胞呼吸和三磷酸腺苷(ATP)的供应,同时也会干扰线粒体和溶酶体之间的通讯,并破坏细胞成分。同时,在治疗过程中适当升高温度,则对治疗效果有一定的良性影响。
通过将三苯基膦和硝普钠负载到聚多巴胺修饰黑磷纳米复合材料上,为气体疗法与其他治疗方法进行结合治疗提供了良好的给药平台,为多种抗癌治疗提供了具有操作性的前提条件,为多种抗癌治疗技术的发展做出卓越贡献。
进一步的,所述叶酸聚乙二醇为叶酸聚乙二醇硫基或叶酸聚乙二醇磷基。
进一步的,所述聚多巴胺修饰黑磷纳米片包括如下重量份的组分:多巴胺6~14份、黑磷纳米片3~5份。
聚多巴胺(PDA)具有较高的光热转换效率、良好的生物相容性、表面丰富的官能团以及较强的吸附性,有助于提高低温光热治疗(mPTT)中的光热转换效率,并赋予聚多巴胺修饰黑磷纳米复合材料良好的生物相容性,同时有助于二氢卟吩e6、三苯基膦、硝普钠和叶酸聚乙二醇的负载,进一步加强了聚多巴胺修饰黑磷纳米复合材料的稳定性。
同时,聚多巴胺(PDA)结合黑磷纳米片、二氢卟吩e6、三苯基膦、硝普钠和叶酸聚乙二醇得到聚多巴胺修饰黑磷纳米复合材料,并将所述复合材料应用于气体疗法(GT)、mPTT和PDT三种疗法级联的治疗过程中,使得级联GT/mPTT/PDT产生了良好的协同治疗作用,为纳米复合材料在治疗肿瘤方面提供了新的研究方向。
以下结合试验对实施例1中得到的聚多巴胺修饰黑磷纳米复合材料的性能和治疗效果进行说明,应当理解,此处所描述的试验例仅用于说明和解释本发明的技术效果,并不用于限定本发明。
试验例1-1
试验例1-1用于对实施例1中聚多巴胺修饰黑磷纳米复合材料的表征特性进行论证,包括如图2(a)、图2(a)、图2(b)所示的SEM电镜图;如图3(a)、图3(b)和图3(c)所示的DLS粒径分布图;如图4所示的吸收光谱;如图5所示的红光光谱;如图6所示的荧光光谱;如图7所示的zeta电位图。
为了确定黑磷纳米片(BP NPs),聚多巴胺修饰黑磷纳米片(BP@PDA)和聚多巴胺修饰黑磷纳米复合材料(BCS)的光稳定性,用0.2~0.7W·cm-2、600~700nm的光照射溶液10~30min,然后用紫外-可见光谱表征辐照后的的吸光度,并用扫描电镜SEM对其进行SEM成像。
采用蔡司扫描电子显微镜拍摄扫描电子显微镜(SEM)图像;扫描电子显微镜(SEM)分析结果表明,BP NSs、BP@PDA、BCS具有典型的层状纳米结构。图2(a)为BPNSs的SEM电镜图、图2(b)为BP@PDA的SEM电镜图、图2(c)为BCS的SEM电镜图。
如图3(a)、图3(b)和图3(c)所示的DLS粒径分布图动态光散射(DLS)分析显示BPNSs直径为161.27nm。经聚多巴胺(PDA)包覆、二氢卟吩e6(Ce6)、硝普钠(SNP)、三苯基膦(TPP)共负载、聚乙二醇叶酸(FA)改性后,BP@PDA和BCS的粒径大小分别增加到192.08nm和217.5nm。
采用日立的UV-vis-NIR Spectrophotometer光谱仪进行紫外-可见光谱表征,得到如图4所示的吸收光谱。紫外-可见吸收光谱测定的SNP药物含量达到14.4%。
采用尼科莱特的iS50 FTIR光谱仪作为傅里叶变换红外光谱仪(FTIR),得到如图5所示的红光光谱。
采用日立U-4600型荧光光度计获得如图6所示的荧光光谱。荧光光谱测定的Ce6药物含量达到3.61%,
上述结果表明PDA被成功地包被在BP NSs上,得到BP@PDA;Ce6和SNP被共负载在BP@PDA上,得到BP@PDA-Ce6&SNP,并通过TPP和FA对BP@PDA-Ce6&SNP进行了修改,最终得到BCS。BCS的发射峰向Ce6红移了2nm。
采用Rigaku的SmartLab型X射线衍射仪获得XRD图谱,如图7所示,XRD图谱显示BPNSs为正交晶体结构的纳米片,表明BP NSs的制备成功。
通过马尔文公司的ZETASIZER Nano Series测量zeta电位大小,如图8所示。zeta电位分析显示,在BP NSs涂有PDA、共载Ce6、SNP、TPP并用FA改性后,zeta电位从-29.3mV变为-21.5mV,所有这些都表明BCS具有良好的溶液分散性,zeta电位略有增加。此外,PDA涂层提高了BP的负表面电位,并且BP@PDA促进Ce6、SNP、TPP等阳性分子的储存。
在磷酸盐缓冲溶液和10%FBS的全DMEM培养基中,在不同的时间间隔内进一步检查纳米颗粒的稳定性。BP@PDA和BCS在两种类型的培养基中在7天内表现出缓慢的降解率,而BP NSs在相同条件下的降解率达到91.9,如图9(a)、图9(b)和图9(c)所示。此外,BCS的DLS分析显示,在完整的DMEM培养基中培养7天,但在PBS中,尺寸略有增加,这是由于蛋白质通过静电吸附或共价键附着在纳米颗粒表面所致。上述所有这些结果证实BCS已成功制备用于进一步GT、mPTT和PDT协同治疗(GT/mPTT/PDT级联协同治疗)。
试验例1-2
试验例1-2用于验证实施例1中BCS的释药行为,通过在不同物理条件下的Ce6和SNP释放行为研究BCS的释药行为,在pH为7.4和pH为5.4的PBS中,Ce6或SNP的释放曲线相似,如图10(a)和图10(b)所示,显示培养12小时后pH敏感药物的释放。pH7.4和pH5.4 PBS溶液中Ce6的百分比分别为88.99%和92.04%,pH7.4和pH5.4 PBS溶液中SNP的百分比分别为56.84%和59.93%。pH值的降低表明在带正负电荷的分子之间静电作用的减少,具有良好的药物释放性能。在近红外(NIR)激光照射处理(600~700nm,0.2~0.8W·cm-2,8~12min)后,释放率提高至95.37%和96.87%,显示出NIR能够控制BCS的释药行为。
Griess试验探索了BCS在体外产生NO的肿瘤物理响应性释放特性。肿瘤细胞中含有大量巯基的分子,如谷胱甘肽(GSH)(0.5~10mM,正常值:20μM)和半胱氨酸(Cysteine)(2~10mM,正常值:2~20μM),可从SNP中产生NO。
将BCS添加到含有GSH或Cysteine的溶液中,会迅速增加NO含量,并使不含GSH或Cysteine的溶液中的NO含量发生轻微变化,如图11所示。在含Cysteine的溶液中分别放置12和24小时后,GSH溶液中NO含量分别为28.27和36.46μM,表明与不同pH缓冲液中的释放行为类似,近红外激光照射也促进了NO的生成。由于癌细胞中的硫醇含量高于细胞外部和正常细胞的硫醇含量,因此,硫醇所依赖的NO的生成,表明BCS通过GT和NIR激光联合控制从而实现增强释放是可行的。
通过荧光光谱仪检测Ce6释放,Griess法检测NO含量检测SNP释放。简而言之,用5~15mL的PBS溶液透析0.5~1.5mL的BCS,并以36~38℃和45~55rpm的速度将其置于台式浓缩器中,收集溶液,并在默认时间点用新鲜PBS替换。为了量化Ce6的释放,在不同时间收集定体积的溶液,用荧光光谱仪在410nm的激发和650nm的发射下测量,记录650nm处的荧光强度以计算Ce6的释放速率。为了检测SNP的释放率,在不同的时间点收集固定容积的溶液作为Ce6检测样本,然后添加Cysteine或GSH以完全释放SNP中的NO,再通过Griess试验测量NO浓度并鉴定SNP浓度和释放率。
Griess试验具体指用含有GSH(4~8mM)或Cysteine(0.2~0.3mM)或PBS(设为对照)的2~3mL PBS缓冲液透析0.3~0.7mL BCS,并在36~38℃温度下,以45~55rpm的速度置于台式浓缩器中。使用Multiskan Sky微孔板分光光度计在默认的不同时间点分析悬浮液。根据Griess试剂盒测定的NO标准曲线计算NO浓度。对于光诱导的NO释放,在NIR照射后收集透析液,并用Griess分析法进行分析。
试验例1-3
试验例1-3用于对实施例1中复合材料的光热性能进行论证,由试验例3的试验结果可以看出,BCS作为BP NSs或BP量子点表现出从UV到NIR的宽吸收,这意味着BCS能够在660nm NIR激光照射下充当光热转换制剂,因此,仔细研究了BCS的光热性质。
首先,在近红外激光的照射下,将对照溶液、BP NSs,BP@PDA、Ce6、SNP、TPP、FA、BCS的温度分别从27.2℃增加到32℃、32.4℃、36.1℃、30.6℃、30.1℃、30.0℃和42.0℃,对照溶液为PBS,如图12所示为近红外激光(660nm,0.5w·cm-2)下BCS纳米颗粒不同材料的光热曲线,表明了聚多巴胺修饰黑磷纳米复合材料在mPTT中的潜在应用。
然后,检查溶液温度随不同激光功率强度和纳米颗粒浓度的变化,如图13(a)所示以660nm和ddH2O为对照,研究了不同激光功率密度下BCS纳米颗粒的光热曲线,图13(b)所示展示了不同浓度BCS子在660nm激光照射下的光热曲线,可以看出,溶液温度取决于激光功率强度和BCS的剂量。同时,也观察到最高溶液温度达到5min后,随着NIR激光照射时间的延长,溶液温度没有进一步显著增加。
最后,通过如图14所示的温度监测,展示了BCS的光热稳定性;如图15所示的紫外可见光谱,展示了近红外辐射下不同纳米粒子的紫外可见光谱;如图16所示的SEM图,展示了经0.5W·cm-2强度的辐照处理后的BCS图,结果表明BCS具有优异的光稳定性。
试验例1-4
试验例1-4用于论证实施例1中复合材料活性氧的产生:将H1299细胞和HeLa细胞与不同浓度的BCS一起培养6小时,然后将细胞辐照或不辐照再分别培养12小时,然后用含有5μM 4-氨基甲基-2′、7′-二荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)的新鲜无血清培养基替换培养基,在黑暗中培养30分钟。然后,应用荧光分光光度计和CLSM(超高分辨率激光共聚焦显微镜,LSM880)进行活性氧分析。
其中,HeLa细胞和H1299细胞来自中国科学院(中国上海)细胞库。HeLa细胞为宫颈腺癌细胞,H1299细胞为肺癌细胞。HeLa细胞和H1299细胞在37℃、5%CO2、含1%青霉素链霉素和10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM、Gibco)中培养。
采用660nm近红外激光照射BCS和BP@PDA,分别如图17、图18所示。可以看出,BCS在525nm处DCFH-DA的荧光强度显著增强,表明525nm处的活性氧生成显著增加,但BP@PDA却没有增加。
如图19所示,DPBF在410nm处的吸光度,未显示出显著的变化BP@PDA,然而,经660nm激光照射后,BCS的吸光度显著降低。这表明BCS具有Ce6的1O2的良好生成率,这是由于实验中使用的BP NSs浓度较低,当BCS暴露于NIR激光时,O2 -的生成增加,并且O2 -的生成有利于显著的ONOO-生成。同时,从图20中可以看出,Cysteine或GSH溶液经过NIR激光照射10min时,ONOO-荧光强度约为对照组(Control组)的20倍,并且几乎是未加NIR激光照射的Cysteine或GSH溶液中Control组的5倍。综上所述,这些结果表明BCS纳米颗粒在近红外激光照射下具有mPTT和PDT效应。
试验例1-5
试验例1-5用于探索癌细胞中BCS产生NO的途径:用多种抑制剂之一探索了细胞摄取和内吞途径,包括甲基-β-环糊精(MβCD)、蔗糖和5-(N,N-二甲基)-阿米洛利盐酸盐(阿米洛利),或在HeLa细胞中使用Ce6荧光作为指示剂用4℃处理。如图21所示,用BCS处理不同孵育时间的癌细胞的荧光图像,BCS在短时间内被癌细胞内吞。延长潜伏期后,荧光强度增强,表明BCS因其纳米尺寸而容易被细胞内化。图22(a)中的荧光图像和图22(b)中示意图显示,细胞内吞作用是主要的细胞摄取途径,而膜穿透途径在BCS摄取中所占比例较小,如其他2D纳米材料中所述,提示包被PDA并与药物共掺的BCS不会改变细胞内吞途径。
试验例1-6
试验例1-6用于探索实施例1中BCS的线粒体靶向能力:使用共焦成像跟踪共定位到线粒体的Ce6荧光信号。将BCS处理后的HeLa细胞孵育6h,然后用Mito-Tracker对线粒体进行染色,用NO荧光探针(DAF-FM DA)标记NO。如图23所示,可以看出Ce6仅与线粒体共定位,显著增加了Pearson相关指数,约为0.91,揭示了BCS对HeLa细胞线粒体具有靶向特异性。
然后,通过评估DAF-FM DA强度来检测BCS和NIR激光照射是否产生NO,图24(a)和图24(b)中的荧光强度评估表明,在使用BCS处理的H1299细胞和HeLa细胞中很容易产生NO。因此,发现BCS能够靶向线粒体并有利于NO的生成。
实施例2
本发明实施例2提供了一种聚多巴胺修饰黑磷纳米复合材料的制备方法,包括如下步骤:
步骤S10:混合第一溶液和第二溶液,得到混合溶液,所述第一溶液包括二氢卟吩e6 15~25份、硝普钠8~15份,所述第二溶液包括三苯基膦10~20份;
步骤S20:将聚多巴胺修饰黑磷纳米片溶液逐滴加入混合溶液中,并搅拌,离心并洗涤后,得到复合溶液;
步骤S30:将复合溶液和聚乙二醇叶酸混合,搅拌后离心,并洗涤,得到聚多巴胺修饰黑磷纳米复合材料。
上述结果表明PDA被成功地包被在BP NSs上,得到BP@PDA;Ce6和SNP被共负载在BP@PDA上,得到BP@PDA-Ce6&SNP;并通过TPP对BP@PDA-Ce6&SNP进行修改,得到BP@PDA-Ce6&SNP-TPP;再通过TPP和FA对BP@PDA-Ce6&SNP-TPP进行修改,最终得到BCS(BP@PDA-Ce6&SNP-TPP&FA)。
步骤S10中,所述第一溶液和所述第二溶液的混合方式为等体积混合,混合后再搅拌20~60分钟,直至完全混合。
步骤S20中,在滴加聚多巴胺修饰黑磷纳米片溶液的同时搅拌混合溶液,有助于更加均匀的复合;当聚多巴胺修饰黑磷纳米片溶液滴加完成后,可继续搅拌15~30小时,直至聚多巴胺修饰黑磷纳米片溶液与混合溶液完全复合。
步骤S30中将复合溶液和聚乙二醇叶酸混合后搅拌4~8小时。
步骤S20和步骤S30中的离心速度均为10000~18000rpm,离心时间为10~20分钟。
进一步的,所述第一溶液的制备步骤包括:将二氢卟吩e6 15~25份和硝普钠8~15份溶解在二甲基亚砜中,并在室温下经活化剂活化2~6小时。
进一步的,所述第二溶液的制备步骤包括:将三苯基膦10~20份溶解在二甲基亚砜中,并在室温下经活化剂活化2~6小时。
第一溶液和第二溶液中的活化剂为1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)中的一种或多种。
进一步的,所述步骤S20和所述步骤S30中的洗涤为至少三次洗涤,所述步骤S20和所述步骤S30中均采用洗涤剂进行洗涤,所述洗涤剂为乙醇、磷酸盐缓冲盐溶液、超纯水中的一种或多种。
磷酸盐缓冲盐溶液(phosphate buffered saline,PBS)一般作为溶剂,具有溶解保护试剂的作用。它是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液,主要成分为Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl,由于Na2HPO4和KH2PO4有二级解离,缓冲的pH值范围很广,而NaCl和KCl主要作用为增加盐离子浓度。
进一步的,所述聚多巴胺修饰黑磷纳米片溶液的制备步骤包括:将盐酸多巴胺加入黑磷纳米片中,经离心和多次洗涤后,得到聚多巴胺修饰黑磷纳米片;将聚多巴胺修饰黑磷纳米片分散到磷酸盐缓冲盐溶液,得到聚多巴胺修饰黑磷纳米片溶液。
将6~14份盐酸多巴胺加入到3~5份黑磷纳米片,经离心和多次洗涤之后得到聚多巴胺修饰黑磷纳米片;将聚多巴胺修饰黑磷纳米片分散到磷酸盐缓冲盐溶液(PBS),得到聚多巴胺修饰黑磷纳米片溶液。
所述黑磷纳米片的制备步骤包括:采用砂浆研磨法对分散在N-甲基吡咯烷酮中的散装黑磷晶体BP进行研磨,研磨15~45分钟,得到黑磷溶液;在0~10℃下对黑磷粉溶液进行至少两次超声处理,超声时间为10~14小时,超声频率为20~30kHz,得到超声后的黑磷溶液;对黑磷溶液进行多次离心,多次冲洗后,得到黑磷纳米片。
实施例3
本发明实施例3提供了一种聚多巴胺修饰黑磷纳米片制剂,通过所述的制备方法制备得到。
实施例4
本发明实施例4提供了所述聚多巴胺修饰黑磷纳米片制剂在肿瘤级联气体/温和光热/光动力协同治疗的药物中的应用。
以下结合试验对实施例4中所述聚多巴胺修饰黑磷纳米片制剂在肿瘤级联气体/温和光热/光动力协同治疗的药物中的应用进行说明,应当理解,此处所描述的试验例仅用于说明和解释本发明的技术效果,并不用于限定本发明。
试验例4-1
试验例4-1用于论证聚多巴胺修饰黑磷纳米片制剂在体外光动力疗法上的治疗效果:线粒体是一种活性氧发生器和调节细胞命运的生物传感器,上述试验例中的研究表明,由于PDA、FA和TPP的靶向效率,共同使得BCS定位于线粒体。
因此,在对癌细胞进行不同处理(包括1O2,O2 -)后,评估细胞氧化应激的变化。首先,分析试剂盒测量癌细胞内的NO含量,如图25所示。在用不同浓度的BCS处理癌细胞并用NIR激光照射后,NO浓度以NIR激光照射依赖的方式显示出一定的剂量,在H1299和HeLa细胞中,用50μg·mL-1加NIR激光照射培养的NO浓度分别达到13.40和12.50μM,过高的NO浓度对正常细胞具有一定毒性;同时,由于近红外激光照射可诱导温度升高,从而提高NO合成相关酶的活性。
图26中N为细胞核,M为健康线粒体,DM为受损线粒体。
细胞内NADPH/NADP+的检测:通过将H1299细胞和HeLa细胞接种在孔板上20~28小时,然后将细胞与BCS一起培养6小时,照射10分钟或不培养12小时,然后收集总细胞,根据制造商的产品说明书,使用带有WST-8的NADPH/NADP+分析试剂盒测量细胞内NADPH/NADP+比率。简单地说,用NADPH/NADP+提取缓冲液裂解细胞,通过离心获得实验样品,在450nm处用G6PDH和微孔板读取器评估NADPtotal浓度。在60℃温度下加热30min后,用G6PDH评估NADP+作为NADPtotal。同时,还制备了一系列标准品,并进行了比色测定。然后使用导出的标准曲线计算样品中NADP+和NADPtotal的浓度,并计算NADPH的浓度,NADPH的计算公式如下:
[NADP+]=[NADPtotal]-[NADPH]
[NADP+]/[NADPH]=([NADPtotal]-[NADPH])/[NADPH]
如图27所示,经BCS处理和NIR激光照射后,NADPH/NADP+的比率明显增加。
如图28所示,对不同处理组进行单线氧探针染色得到的荧光图。发现1O2(如图26所示、如图27所示)和O2 -(如图28所示)的生成显著快速增加,表明BCS的近红外激光照射可有效诱导ROS生成。此外,发现O2 -与NO相互作用,形成ONOO-,它是一种比1O2和O2 -更具氧化活性的分子,能够导致DNA断裂、过度氧化、硝化和蛋白质硝化,抑制细胞呼吸并诱导细胞凋亡。同时,如图29(a)所示为不同处理后ATP含量的统计图,表明经过BCS和NIR的作用细胞呼吸和ATP的产生受到显著抑制。如图29(b)所示为不同处理后AO染色555nm/490nm的相对荧光强度,发现GSH含量和SOD酶活性(细胞氧化还原的关键成分)显著降低。上述结果证明,BCS和NIR激光照射的癌细胞可导致氧化应激的爆发,导致线粒体的破坏和功能障碍。
试验例4-2
试验例4-2用于论证实施例1中BCS对线粒体的靶向作用。线粒体不仅是细胞的能量供应站,而且对细胞内离子渗透压的变化高度敏感,在细胞质中拥有对外部刺激反应最强烈的氧化还原微环境。因此,探讨了BCS和近红外激光照射后癌细胞线粒体的破坏和功能障碍。
首先,使用JC-1荧光探针研究癌细胞线粒体膜电位(MMP)的变化。将HeLa和H1299细胞以一定细胞密度接种在培养板中20~28小时,然后将细胞与BCS一起培养4~8小时并照射固定时间或不照射,然后用含有一定浓度的无血清培养基替换培养基JC-1,然后在黑暗中再培养15~25分钟。接下来,移除培养基,用PBS洗涤细胞三次,得到癌细胞线粒体膜电位,如图30所示。可以看出,JC-1聚集体的减少表明MMP的减少,并且表明H1299和HeLa细胞中BCS剂量和NIR激光照射依赖性减少,这意味着BCS和NIR激光照射的处理破坏了线粒体的结构。
线粒体通透性转换孔(mPTP)也通过钙黄绿素AM和CoCl2进行评估。具体的,将H1299细胞和HeLa细胞接种在细胞孔的孔板上,培养20~28小时,然后用不同浓度的BCS处理。培养4~8h后,用NIR激光照射细胞8~12min,再培养10~15h,然后用钙黄绿素和CoCl2在36~38℃温度下,在完全DMEM培养中染色25~35min,然后用PBS洗涤三次,得到线粒体膜通透性(MPTP)图,如图31所示。可以看出用BCS处理癌细胞并用NIR激光照射显著增强线粒体膜的通透性。
同时,采用生物透射电镜(bio-TEM)和免疫荧光技术研究了BCS对细胞器超微结构的影响。将HeLa细胞与BCS共同孵育4~8h,在辐照和不辐照的条件下,再培养10~15h,用4%戊二醛固定,并包埋在树脂中。其中,bio-TEM也证实了线粒体的破坏,单独使用BCS后,线粒体嵴部分消失,与正常细胞相比,随着BCS含量和激光照射的增加,线粒体结构最为破裂。线粒体破坏也通过丝裂原追踪红染色得到证实,如图32所示,红色为线粒体,蓝色为细胞核,经过与Control组进行对比,BCS加NIR激光照射诱导了线粒体破坏,其特征是结构和聚集断裂和缩短。
通过将HeLa细胞和H1299细胞接种于培养板中20~30小时,然后将细胞与BCS孵育4~8小时并照射一定时间或不照射,然后收集总细胞,并在细胞线粒体分离试剂盒的指示下分离线粒体,将分离的线粒体悬浮于PBS中,在35~38℃黑暗中用10μM的JC-1进行染色15~25min,然后用预冷发PBS洗涤线粒体三次,用时间扫描荧光分光光度计测定JC-1(Ex:485nm,Em:590nm)的荧光。使用JC-1染色法从癌细胞中分离线粒体,然后使用荧光光谱仪在时间扫描上显示,如图33所示,发现在增加纳米颗粒含量和NIR激光照射后,激活的线粒体急剧减少。
此外,线粒体是细胞有氧呼吸的第二和第三阶段点,是主要ATP的来源,通过检测还原型辅酶Ⅱ/烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH/NADP)+和ATP的含量以评估线粒体的功能障碍。
具体的,细胞ATP水平的检测通过将HeLa细胞和H1299细胞接种于培养皿中20~28小时,然后用含有不同浓度BCS(0μg·mL-1、1μg·mL-1、5μg·mL-1、10μg·mL-1、20μg·mL-1和50μg·mL-1)的新鲜培养基替换细胞培养物并再培养6小时,然后用NIR(0.5W·cm-2,10分钟)或非NIR(0.5W·cm-2,10分钟)照射细胞,在供应商手册的指导下收集细胞并用ATP分析试剂盒处理,同时,使用FilterMax F5平板阅读器检测并记录生物的发光。
同时,如图34所示,表明线粒体的破坏和功能障碍与钙稳态的失衡有关,其中,相对荧光强度为PBS处理细胞检测值的百分比。具体的,用荧光染料Fluo-4 AM(Beyotime,中国)检测H1299细胞和HeLa细胞内Ca2+浓度。将H1299和HeLa细胞接种在孔板上20~28小时,然后用不同浓度的BCS处理。孵育6h后,用NIR激光(660nm,0.5W·cm-2)照射细胞10min,再孵育12h,然后用3μM Fluo-4 AM在37℃无血清DMEM培养中染色30min,然后用PBS洗涤三次。荧光分光光度计在激发波长488nm和发射波长526nm处检测荧光强度。
此外,溶酶体与线粒体相似,是一种独立的细胞间细胞器,对生物分子的降解和循环反应灵敏。然而,线粒体和溶酶体之间的紧密相互作用和沟通是细胞命运的主要点。因此,还通过BCS和NIR激光照射研究了线粒体受损后溶酶体的完整性和功能。具体的,将H1299细胞和HeLa细胞在孔板中培养20~28小时,然后用不同浓度的BCS处理4~8小时并用NIR激光照射。然后,使用吖啶橙(以下简称AO,1%,m/v)处理上述细胞8~12分钟,并用预冷PBS洗涤三次,使用倒置荧光显微镜进行成像,并在荧光分光光度计(日立,F-4600)上检测荧光强度(绿色,Ex:490nm,Em:528nm;红色,Ex:555nm,Em:617nm),溶酶体膜通透性计算为绿/红比。
如图29(b)、图35和图36所示,AO染色和罗丹明B累积试验的溶酶体膜通透性(LMP)测定结果显示,550/490nm荧光的比率降低,罗丹明B的累积增加,表明用BCS和NIR激光照射处理的癌细胞显示溶酶体膜通透性增加,显著恶化溶酶体的完整性。同时,如图37(a)和图37(b)所示,组织蛋白酶B和酸性磷酸酶的溶酶体酶活性测定表明,BCS和NIR激光照射治疗癌细胞后,溶酶体的功能障碍超过BCS和Control,与酸性磷酸酶相比,气体疗法对组织蛋白酶B的抑制作用较小。
综上所述,GT/mPTT/PDT级联协同治疗破坏了线粒体和溶酶体的结构和功能。
试验例4-3
试验例4-3为了确定BCS纳米复合材料的体外抗肿瘤效率和毒性,将细胞接种在6孔板中,并与BCS一起培养4~8小时后,接受NIR照射(0.5W·cm-2)。在CCK-8试剂盒、钙黄绿素AM/PI试剂盒和膜联蛋白V-FITC试剂盒的手动指导下,分别进行CCK-8检测、活细胞和死细胞染色以及流式细胞术检测,然后,继续培养12小时。
基于BCS与级联GT/mPTT/PDT协同治疗产生良好的ROS生成效率和线粒体功能障碍的事实,使得其成为治疗癌症的良好平台。然而,BCS是否能够应用于纳米医学的前提是还需要具有良好的生物相容性和生物安全性。
因此,通过血液相容性试验以评估预先制备的BCS对癌细胞的生物相容性。如图38所示,计算不同浓度BCS下红细胞(RBC)的溶血率,可以看出,随着BCS浓度的增加,没有明显的红色,表明BCS在所有浓度下都不会引起显著的溶血。同时,发现最大浓度(100μg/mL)下的溶血率仅为7.43%,表明BCS引起的溶血程度可忽略不计。上述血样取自野生型小鼠(C57BL/6),通过5ml PBS稀释1ml血样,然后通过离心从血清中分离红细胞(RBC)。用PBS洗涤六次后,用8毫升PBS稀释红细胞。然后用不同浓度的BCS溶液(0、1、5、10、20、50和100μg/mL)处理红细胞,并将ddH2O和PBS设置为阳性和阴性对照,以评估溶血能力。在37℃下以150rpm的速度培养并放置在台式浓缩器中3h后,以10000rpm的速度离心混合物10min。最后,通过微孔板读取器记录570nm处上清液的吸光度,以计算溶血百分比。
同时,通过对细胞毒性的检测验证BCS对癌细胞的生物安全性。具体的,将HL-7702细胞、HeLa细胞和H1299细胞培养在孔板上,其中,HL-7702细胞来自中国科学院(中国上海)细胞库,HL-7702是来源于肝组织的正常细胞系。将细胞培养在5%CO2和95%湿度的湿室中,温度为37℃。细胞在孔板中汇合至60-65%后,用200μL新培养基替换培养基,该培养基含有不同浓度的BCS(0μg·mL-1、1μg·mL-1、5μg·mL-1、10μg·mL-1、20μg·mL-1和50μg·mL-1),同时,为每个样本设置六个倍数,并用样本处理细胞24小时和48小时。然后将10μL CCK-8和90μL无血清培养基轻轻混合并添加到每个孔中,在37℃下培养2小时。通过测量FilterMax F5在450nm波长处的吸光度来评估细胞活力。细胞毒性的计算公式如下:
细胞活力(%)=(治疗组平均绝对值/Control平均绝对值)×100%
其中,Control为空白对照组。如图39(a)、图39(b)和图39(c)所示,使用CCK-8细胞计数试剂盒评估细胞中预先制备的NPs的细胞毒性。结果表明:BP@PDA、Ce6对HL-7701、H1299和HeLa细胞没有明显的细胞毒性,SNP对H1299和HeLa细胞的细胞毒性增强,但对HL-7701细胞没有毒性。
如图40(a)所示,BCS导致细胞存活率下降,SNP和BCS细胞存活率下降均归因于NO供体SNP与噻唑类化合物反应形成S-亚硝基硫醇(RSNO),然后在细胞酶的催化下产生NO,高含量的NO导致细胞存活率降低。然后,在H1299细胞和HeLa细胞中,通过CCK-8分析、钙黄绿素AM/PI共染色分析和流式细胞术分析,评估与BCS在体外的协同治疗效果。如图40(b)所示,当用不同浓度的BCS处理细胞时,在没有激光照射的情况下,细胞存活率随着浓度的增加而降低,约40%的处理细胞在50μg/mL下被杀死,表明NO具有良好的气体治疗效果;在激光照射(660nm,0.5W·cm-2,10min)后,约50%的BCS处理的癌细胞在10μg/mL下被杀死,而几乎所有的癌细胞在50μg/mL下被杀死,这表明BCS在近红外激光照射下具有极好的治疗效果。
如图41所示的钙黄绿素AM/PI共染色,和如图42所示的流式细胞术,共同表明了激光照射下BCS具有良好的治疗效果。
同时,如图43中蛋白质印迹法(western blotting)的结果显示B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、小鼠单克隆抗体(Cox-IV)、肌动蛋白(β-actin)、的表达减少,而相比于半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3),切割半胱氨酸蛋白酶-3(Cleaved Caspase-3)、兔抗人单克隆抗体(Bax)的表达增加,表示了癌细胞的凋亡。由于线粒体的破坏,许多细胞色素C(Cyto-C)被释放到细胞质中,这是对细胞凋亡的反应。重组兔单抗(Tom20)的结果表明用近红外激光照射BCS也导致线粒体数量显著减少。同时,BCS与近红外激光照射的协同治疗优于单独的气体治疗。因此,BCS在体外对癌细胞具有良好的杀伤效果。
试验例4-4
BCS体外研究结果的成功,进一步鼓励了对肿瘤进行GT/mPTT/PDT级联治疗的体内研究。具体的,雌性BALB/c小鼠(5-6周龄)购自GemPharmatech Co.Ltd.,所有动物均被饲养在中国药科大学动物中心的无特定病原体(SPF)实验室中,温度为22±1℃,湿度为40-50%,光环境和暗环境下循环12小时,可自由饮水和标准实验室食物。
试验例4-4对BCS对体内肿瘤靶向性进行研究。具体试验步骤如下:当HeLa荷瘤小鼠的肿瘤体积达到150~250mm3时,为小鼠静脉注射BCS,然后将小鼠置于IVIS成像系统中,以便在0h、1h、6h和12h分别观察荧光图像。12小时后,麻醉小鼠,采集肿瘤和主要器官(肝、心、肺、脾和肾)以分析荧光分布。同时,收集肿瘤并冷冻。肿瘤冰冻切片用大鼠FITC标记的抗CD31抗体染色,细胞核用DAPI染色,通过CLSM捕获图像。
如图44所示,建立HeLa肿瘤的BALB/c裸鼠模型,以研究BCS的体内靶向能力和生物分布。静脉注射BCS(5mg·kg-1,100μL)并通过小动物成像系统在不同时间间隔成像。如图45所示,注射1小时后与刚注射时的荧光相比,肿瘤开始显示强荧光,并且在肿瘤部位长时间显示聚焦荧光,同时通过尾静脉注射BCS后12小时,在肿瘤部位观察到最强的荧光信号。
HeLa荷瘤小鼠随机分为四组,每组6只:PBS(Control)、Control+NIR激光照射组、BCS照射组和BCS+NIR激光照射组。每只小鼠分别静脉注射100μL PBS或BCS。12h后,小鼠接受10min的辐射(660nm,0.5w·cm-2),得到如图46所示的HeLa肿瘤小鼠切除器官和肿瘤的辐射效率,其中,He表示心脏,Lv表示肝脏,Sp表示脾脏,Lu表示肺,Ki表示肾脏,Tu表示肿瘤,同时,每2天测量一次小鼠体重和肿瘤大小。
两周后,处死小鼠,采集主要器官(心、肝、脾、肺和肾),进行组织切片和成像;肿瘤进行H&E染色分析;并采集血液进行血液生化分析。
然后,收集死后的小鼠器官进行荧光成像,如图47所示。可以看出,与其他器官相比,通过荧光强度的定量测量证实了肿瘤中积累了较多的BCS,表明BCS具有良好的靶向能力。此外,在静脉注射BCS 12小时后,在HeLa荷瘤小鼠的冰冻肿瘤切片中评估了BCS与血小板-内皮细胞粘附分子(CD31)抗体标记的内皮细胞的共定位,其中,DAPI为4',6-二脒基-2-苯基吲哚,如图48所示,BCS为红色,皮内细胞为绿色,细胞核为蓝色,结果依然表明BCS对肿瘤具有良好的靶向性。
试验例4-5
试验例4-5用于研究BCS对体内肿瘤的光热效应,具体实验步骤如下:选择HeLa肿瘤BALB/c裸鼠,当荷瘤体积达到约240mm3(n=6/组)时,根据小鼠体重和肿瘤体积分为如下四组:1、Control;2、Control+NIR激光器;3、BCS;4、BCS+NIR激光器。然后,第3组和第4组向荷HeLa肿瘤裸鼠静脉注射BCS(5mg·kg-1,100μL),Control和BCS+NIR组也静脉注射等量(100μL)PBS。注射后12小时,将第2组和第4组的荷瘤小鼠麻醉,并用密度为0.5W·cm-2的660nm激光照射肿瘤的整个区域10分钟。用红外热成像照相机记录照射后不同时间点肿瘤的相应红外热图像和温度变化同时监测体内的光热效应。
如图49和图50所示,在近红外激光照射下,注射BCS的小鼠的肿瘤温度在10分钟内从30.2℃升高到41.2℃,适合于温和的肿瘤消融。相反,经PBS和NIR激光照射的小鼠的体温出现轻微变化,升高至37.1℃。
近红外激光照射后,通过记录生存率、肿瘤大小变化和体重来评估持续治疗效果。首先,从如图51所示的各小组小鼠的存活曲线中可以看出,Control组在两周内观察到自然死亡,其余组没有其他死亡;
其次,从如图52所示的各小组小鼠肿瘤体积生长曲线中可以看出,在静脉注射BCS+NIR激光照射的小鼠中,肿瘤体积在14天后从约240mm3缓慢下降至74mm3,计算得到BCS+NIR小组中的肿瘤生长抑制率(TGI)=-79.95%,并且BCS小组中的肿瘤体积也从约240mm3缓慢下降至90mm3,计算得到BCS小组中的TGI=-55.63%,结果表明,BCS治疗可显著抑制肿瘤,而NIR激光照射可增强肿瘤的抑制效果;其中,TGI的计算公式为:TGI=(VC-VT)/VC×100%,其中,VT为治疗后的肿瘤体积,VC为Control的肿瘤体积;相反,Control组和Control+NIR组的肿瘤显示从240mm3快速增长至约1400mm3(图7h,Control组、Control+NIR组的TGI分别为498.08%和475.98%)。同时,如图53所示,发现不同治疗对体重无明显影响。在治疗结束时,麻醉小鼠并分离肿瘤,如图54中的治疗终点的肿瘤解剖图片和图55中的肿瘤重量测量证实了BCS和附加NIR激光照射的良好抗肿瘤效果。
此外,还使用各种方法鉴定了GT/mPTT/PDT级联协同治疗效应。如图56所示,使用DHE探针和TUNEL凋亡检测试剂盒检测肿瘤冰冻切片的ROS和细胞凋亡,红色为ROS,蓝色为DAPI,绿色为凋亡细胞,结果显示,使用BCS和附加NIR激光照射后,ROS生成增加且细胞凋亡增加。同时,如图57所示,肿瘤切片的H&E染色表明,相比于第1组和第2组,第3组和第4组的肿瘤组织疏松,并对凋亡蛋白具有更加显著的表达,如Ki67和Bcl-2的表达降低,Caspase-3的表达增强,其中,Ki67用于增殖蛋白标记物的免疫组化染色(IHC);Bcl-2用于凋亡蛋白标记物的IHC染色;Caspase-3用于凋亡蛋白标记物的IHC染色。这些结果表明,用BCS级联GT/mPTT/PDT疗法具有良好的治疗效果。
试验例4-6
与此同时,生物安全性是纳米药物在体内的重要指标。将16只健康的BALB/c小鼠随机分为4组,进行不同处理,进行系统的生物安全性研究。在注射不同注射液后14天进行血液学、血液生化和组织学分析,并与Control组的小鼠进行比较。测量的血液学指标包括白细胞(WBC)、红细胞、血红蛋白(HGB)、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白(MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)、血小板(PLT)和红细胞压积(HCT)。
如图58(a)、58(b)、58(c)、58(d)、58(e)、58(f)、58(g)和58(h)所示,评估血常规参数,包括白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)、红细胞压积(HCT)、平均红细胞体积(MCV)、红细胞平均血红蛋白量(MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)、血小板(PLT)。
结果显示,在健康小鼠中,参考间隔内,不同组得到的结果没有显著区别。
如图59(a)、59(b)、59(c)、59(d)、59(e)、59(f)、59(g)和59(h)所示,评估血液生化参数,包括丙氨酸转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、球蛋白(GLB)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、总胆红素(TBIL)、尿素酶(UREA)、肌酐(CREA)和。血液生化参数与血液学评估相似,四组之间没有明显的数据差异。
然后,采用免疫组织化学H&E染色法测定小鼠主要器官(心、肝、脾、肾和肺)的组织学变化,如图60所示,采用H&E染色法对主要器官进行染色,可以看出四组器官切片中均未发现明显的器官损伤或病变。因此,BCS具有良好的GT/mPTT/PDT级联协同治疗效果和生物安全性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种聚多巴胺修饰黑磷纳米复合材料,其特征在于,包括如下重量份的组分:聚多巴胺修饰黑磷纳米片20~28份、二氢卟吩e6 15~25份、硝普钠8~15份、三苯基膦10~20份、叶酸聚乙二醇8~12份。
2.如权利要求1所述的一种聚多巴胺修饰黑磷纳米复合材料,其特征在于,所述聚乙二醇叶酸为硫基聚乙二醇叶酸或磷基聚乙二醇叶酸。
3.如权利要求1所述的一种聚多巴胺修饰黑磷纳米复合材料,其特征在于,所述聚多巴胺修饰黑磷纳米片包括如下重量份的组分:多巴胺6~14份、黑磷纳米片3~5份。
4.一种聚多巴胺修饰黑磷纳米复合材料的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤S10:混合第一溶液和第二溶液,得到混合溶液,所述第一溶液包括二氢卟吩e6 15~25份、硝普钠8~15份,所述第二溶液包括三苯基膦10~20份;
步骤S20:将聚多巴胺修饰黑磷纳米片溶液逐滴加入混合溶液中,并搅拌,离心并洗涤后,得到复合溶液;
步骤S30:将复合溶液和聚乙二醇叶酸混合,搅拌后离心,并洗涤,得到聚多巴胺修饰黑磷纳米复合材料。
5.如权利要求4所述的一种聚多巴胺修饰黑磷纳米复合材料的制备方法,其特征在于,所述第一溶液的制备步骤包括:将二氢卟吩e6 15~25份和硝普钠8~15份溶解在二甲基亚砜中,并在室温下经活化剂活化2~6小时。
6.如权利要求4所述的一种聚多巴胺修饰黑磷纳米复合材料的制备方法,其特征在于,所述第二溶液的制备步骤包括:将三苯基膦10~20份溶解在二甲基亚砜中,并在室温下经活化剂活化2~6小时。
7.如权利要求4所述的一种聚多巴胺修饰黑磷纳米复合材料的制备方法,其特征在于,所述步骤S20和所述步骤S30中的洗涤为至少三次洗涤,所述步骤S20和所述步骤S30中均采用洗涤剂进行洗涤,所述洗涤剂为乙醇、磷酸盐缓冲盐溶液、超纯水中的一种或多种。
8.如权利要求4-7任一项所述的一种聚多巴胺修饰黑磷纳米复合材料的制备方法,其特征在于,所述聚多巴胺修饰黑磷纳米片溶液的制备步骤包括:将盐酸多巴胺加入黑磷纳米片中,经离心和多次洗涤后,得到聚多巴胺修饰黑磷纳米片;将聚多巴胺修饰黑磷纳米片分散到磷酸盐缓冲盐溶液,得到聚多巴胺修饰黑磷纳米片溶液。
9.一种聚多巴胺修饰黑磷纳米片制剂,其特征在于,通过权利要求4-8任一项所述的制备方法制备得到。
10.一种利用权利要求9所述的聚多巴胺修饰黑磷纳米片制剂在肿瘤级联气体/低温光热/光动力协同治疗的药物中的应用。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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