CN113969316A - 染色体不稳定性评分的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及染色体不稳定性评分在制备泛癌种骨转移癌患者生存期判断指标试剂/试剂盒中的应用。本发明通过对部分骨转移癌患者的外周血cfDNA测序，发现外周血CIN score与骨转移癌患者预后显著相关。并通过更大样本量进行了前瞻性验证：对临床上肺癌患者、肾癌患者、肝癌患者、乳腺癌患者、前列腺癌患者、甲状腺癌患者、未知原发灶骨转移癌人群的血浆采集和检测中发现，CIN score与患者生存时间显著相关，CIN score越高，患者生存时间越短，相反CIN score越低，患者生存时间越长。

Description

染色体不稳定性评分的应用
技术领域
本发明涉及医学生物检测技术领域，尤其涉及染色体不稳定性评分的应用。
背景技术
随着肿瘤发病率的日益增高，人类的健康和生命面临巨大挑战，恶性肿瘤除具有生长迅速、侵袭性生长的特征外，其转移、治疗后易复发的特点更是治疗失败并最终致死的主要原因。骨转移是最常见的转移病灶之一，是诸多组织器官恶性肿瘤的共同转归。因此，对发生骨转移的患者合理有效地选择治疗方案显得尤为关键。骨转移被认为是肿瘤发展的晚期阶段，然而，由于个体肿瘤基因特征等方面的差异，不同骨转移患者的转归相差甚远，通过传统评分评估生存期少于6个月的患者进行随访后发现传统评分体系在此部分人群中误差较大，其中有相当一部分患者生存期超过1年。由于耽误了治疗时机，此部分患者往往在严重的神经功能受损如瘫痪，或剧烈疼痛中存活。而转移灶出现后的积极治疗不但可以通过手术，改善患者的生存质量，还可以通过更积极的治疗手段使患者的疾病进展得到控制，从而延长生存期。针对不同的骨转移癌患者如何选择合适的术式和治疗原则成为一大临床难题，转移癌患者治疗方式的选择是基于对患者疾病发展转归的预判。因此如何开发有效简便的评估方法对于准确筛选出预后良好的患者并进行积极治疗有着不容小觑的意义。
如何将迅速发展的二代测序、人工智能等技术和大数据库与骨转移癌的诊治相结合，切实地提高骨转移癌的诊疗效率，对准确选择治疗方案、提高骨转移癌患者的诊疗效率、延长骨转移癌患者的整体生存期、节约医疗资源都有着不容小觑的意义。要实现这一目的的先决条件也是最有效的途径即是如何开发准确有效的预后判断指标。目前临床上常用的对于骨转移癌预后判断的模型有若干种：如Tomita评分、Tokuhashi评分(Tokuhashi Y,Matsuzaki H,Toriyama S et al(1990)Scoring system for the preoperativeevaluation of metastatic spine tumor prognosis.Spine 15:1110-1113)、SPRING模型(
Figure BDA0003306742300000011
MS1,Gerds TA,et al.External Validation and Optimization of theSPRING Model for Prediction of Survival After Surgical Treatment of BoneMetastases of the Extremities.Clin Orthop Relat Res.2018Aug；476(8):1591-1599.)、Karnofsky表现评分(Karnofsky DA,Abelmann WH,Kraver LF.The use ofnitrogen mustards in the palliative treatment of carcinoma with particularreference to bronchogenic carcinoma.Cancer.1948；1:634-669.)、Enkaoua评分等。这些评分体系都是基于患者的临床表现或生化指标并结合医生临床经验做出的主观判断综合给出的，缺乏准确量化独立的客观物理指标，临床相关性原理相对比较宏观，同时缺失对患者当前疾病状态和过去治疗影响等因素的考虑。因此，如何在无侵入性损伤的基础上准确根据患者当前的病理状态评估患者的生存预后至关重要。
随着精准医疗概念的普及和相关技术成本的降低，近年来，外周血循环肿瘤DNA(ctDNA)相关的液体活检备受关注，因其具备无损伤、实时反映体内肿瘤状况等优势，在肿瘤诊断、预后判断、精准治疗等方面被广泛研究(N Engl J Med.2018Nov 1；379(18):1754-1765.doi:10.1056/NEJMra1706174.Application ofCell-free DNA Analysis to CancerTreatment.Corcoran RB1,Chabner BA1.)(Krebs M.G.,Metcalf R.L.,Carter L.,BradyG.,Blackhall F.H.,Dive C.Molecular Analysis of Circulating Tumour Cells-Biology and Biomarkers.Nat.Rev.Clin.Oncol.2014；11:129–144.)。2014年AaronNewman等人在《Nature Medicine》上发表文章阐述了外周血ctDNA高深度测序作为非侵入性活检的临床应用潜力，提出了“高深度肿瘤个体化图谱”即CAPP-Seq的概念(CAncerPersonalized Profiling by deep Sequencing)该篇报导针对非小细胞肺癌(NSCLC)进行研究，发现在NSCLC的II–IV期可以100％检测到肺癌突变特征的ctDNA，在I期肺癌中检出率为50％，特异性达到96％，并证实了ctDNA的含量与肿瘤体积具有显著相关性，且相比较影像学能够更早更敏感地发现肿瘤的改变，因此推断ctDNA在监测多种恶性肿瘤和肿瘤个体化治疗中的巨大潜力。(A.M.,Bratman S.V.,et al.An Ultrasensitive Method forQuantitating Circulating Tumor DNA with Broad Patient Coverage.Nat.Med.2014；20:548–554.)。
随着二代测序技术的普及，其成本近年来大幅度降低，因此借助高通量高深度测序手段完全可以实现对ctDNA的准确检测。目前的研究尚未见以cfDNA(循环DNA)作为骨转移癌预后判断的指标，也尚未有用于评估骨转移癌患者血浆cfDNA模型的试剂盒来针对骨转移癌患者进行综合治疗前的预后判断并提供个体化治疗方案选择的可量化指标和客观依据。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，寻找判断骨转移癌预后的独立客观可量化物理指标，并提供一个以客观可量化物理指标为基础的骨转移癌患者预后判断试剂或试剂盒的应用，提供染色体不稳定性评分(CIN score)的应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
本发明的第一方面是提供染色体不稳定性评分在制备泛癌种骨转移癌患者生存期判断指标试剂中的应用。
本发明的第二方面是提供染色体不稳定性评分在制备泛癌种骨转移癌患者生存期判断指标试剂盒中的应用。
优选地，所述染色体不稳定性评分的计算方法包括：
Figure BDA0003306742300000031
Figure BDA0003306742300000032
比对人参考基因组，计算患者外周血中cfDNA某个碱基区间的覆盖度，该覆盖度减去参照者外周血中cfDNA对应碱基区间覆盖度的平均值后，除以参照者外周血中cfDNA对应碱基区间覆盖度的标准差，即得患者外周血中cfDNA某个碱基区间的相对覆盖度；计算各个碱基区间相对覆盖度与对应碱基区间长度的乘积，所有乘积绝对值加和以2为底数的对数即为所述染色体不稳定性评分。
优选地，各个碱基区间的长度均为200K。
优选地，所述染色体不稳定性评分的cutoff值为12.0。
优选地，所述泛癌种骨转移癌为肺癌、乳腺癌、小肠癌、食道癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、脑癌、淋巴癌、内分泌系统肿瘤、鼻咽癌或前列腺癌。
优选地，所述应用包括：抽提患者外周血中cfDNA，构建文库并进行二代测序，计算所述染色体不稳定性评分。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明通过对部分骨转移癌患者的外周血cfDNA测序，发现外周血CIN score与骨转移癌患者预后显著相关。并通过更大样本量进行了前瞻性验证：对临床上肺癌患者、肾癌患者、肝癌患者、乳腺癌患者、前列腺癌患者、甲状腺癌患者、未知原发灶骨转移癌人群的血浆采集和检测中发现，CIN score与患者生存时间显著相关，CIN score越高，患者生存时间越短，相反CIN score越低，患者生存时间越长。
本发明可用于对发生骨转移癌的患者进行准确的预后生存期评估，本发明通过对骨转移癌患者群外周血游离DNA测序，准确评估患者疾病的发展阶段和生存期，为准确选择治疗方式，提高转移癌的治疗效率提供量化指标，最大限度地改善患者生存质量、延长患者生存期、降低死亡率。
本发明在对大量转移癌血浆标本进行的检测中，发现了CIN score是判断转移癌恶性程度及生存期的独立风险因素之一，并进行了临床标本的采集和验证，证实了CINscore与患者生存期长短具有明显的统计学意义。说明通过CIN score的一系列复杂算法，可以用于提前判断转移癌患者的生存期。
本发明中的计算方法和标准阈值针对转移癌患者外周血中cfDNA的CIN score情况对患者预后进行准确评估，作为量化物理指标，其特异性和灵敏度显著高于目前临床上广泛使用的以多项临床症状结合医生经验为基础的评分系统，可以在转移癌被发现时即进行实时检测和评估，不仅提高了诊断的准确性，而且对传统评估体系漏诊的患者进行积极、及时、适当的治疗有着重大意义。该计算方法与标准阈值在制备检测转移癌患者预后评测试剂或工具中应用。可对于正常人群进行肿瘤早期筛查和诊断。
附图说明
图1是骨转移癌患者外周血游离DNA染色体异构情况的图谱；
图2中左图为生存期小于6个月的ROC/生存曲线图，右图为生存期小于12个月的ROC/生存曲线图；
图3为根据评估阈值对骨转移癌患者绘制生存曲线。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。
实施例
为寻找能够判断骨转移癌患者预后的独立相关因素，对骨转移癌患者外周血进行cfDNA提取与二代测序后，绘制出骨转移癌患者外周血游离DNA染色体异构情况的图谱，如图1所示，主要变异集中在1q+，3q+，5p+，6p+，7+(EGFR)，8q+(MYC)，12+，1p-，3p-，4-，8p-，13-，17p-(TP53)；通过选取一部分骨转移癌患者进行验证，长期(2年)随访其生存情况，并与CIN等因素进行关联分析，开发了一系列计算公式算法，最终确定了CIN score评测指标是骨转移癌预后相关的独立风险因素。随后对临床上骨转移癌患者进行前瞻性验证实验，抽取外周血并抽提cfDNA进行测序，对前述确定的计算公式与阈值进行验证。
本实施例首先利用商品化的试剂盒Amp Genomic DNA Kit(TIANGEN)和QIAseqcfDNA Extraction kit(Qiagen)从受检者外周血血浆中提取总cfDNA，应用NEBnext UltraII进行建库，使用8bp的adaptor连接入DNA片段并进行PCR扩增，于Illumina HiSeq X-ten测序平台上对纯化后的文库进行二代测序。将获得的测序原始数据与人类基因组进行比对分析。利用软件samtools mpileup计算基因组的覆盖度。根据染色体结构变异程度及变异数目利用公式综合计算出CIN score：
Figure BDA0003306742300000051
Figure BDA0003306742300000052
根据前期对转移癌患者大数据的计算结果得出的cutoff值作为试剂盒中的标准数值，并与测得的个体数据进行比对，即可预测个体生存期。
验证用血浆样品从上海长征医院住院部与门诊采集，67例骨转移癌患者，提取患者外周血cfDNA后通过二代测序结果根据计算公式确定患者的CIN score。CIN score的计算方法包括：
比对人参考基因组，计算患者外周血中cfDNA某个碱基区间的覆盖度，该覆盖度减去参照者外周血中cfDNA对应碱基区间覆盖度的平均值后，除以参照者外周血中cfDNA对应碱基区间覆盖度的标准差，即得患者外周血中cfDNA某个碱基区间的相对覆盖度；计算各个碱基区间相对覆盖度与对应碱基区间长度的乘积，所有乘积绝对值加和以2为底数的对数即为所述染色体不稳定性评分。
经过长期随访，通过患者预后生存期确定CIN score的cutoff阈值，并根据阈值将患者划分为CIN score高值组与CIN score低值组。提示CIN score可以对转移癌患者的预后生存时间进行有效评测。
纳入标准如下：
1、2015年11月到2018年9月在本医院诊断为骨转移癌的患者，前提是从医疗记录中，可获得所有与肿瘤相关的历史数据以明确诊断者和进行评估者；
2、在本院新诊断为骨转移癌的患者(包括已知原发灶与未知原发灶患者)；
排除标准如下：
1、排除其它原发性骨肿瘤患者；
2、排除其它骨相关事件非癌症转移患者。
表1发现集(Discovery group)与验证集(Validation group)患者基本情况表
Figure BDA0003306742300000061
Figure BDA0003306742300000071
对符合上述标准的患者进行血样采集，抽取外周血8mL，置于EDTA抗凝管中，两次离心后取上清，取2mL进行cfDNA抽提，抽提步骤包括：
1、准备15mL离心管，加入200μL QIAGEN Proteinase K至离心管底；
2、加入2mL血浆至上述15mL离心管中；
3、加入1.6mL Buffer ACL(含有1μg Carrier RNA)，涡旋混匀30s；
4、60℃孵育30min；
5、待冷却后加入3.6mL Buffer ACB，涡旋混匀30s；
6、将上述混匀的产物放在冰上冰浴5min；
7、准备24孔底座，接上真空泵，在底座上分别插入支架和QIAamp Mini吸附柱，在吸附柱上插入20mL导管(Tube Extenders)；
8、用移液枪小心的将第6步管中的溶液加入到吸附柱里，打开真空泵开关，让溶液通过吸附柱；
9、向吸附柱中加入600μL Buffer ACW1，打开真空泵开关，让溶液通过吸附柱；
10、向吸附柱中加入750μL Buffer ACW2，让溶液通过吸附柱；
11、向吸附柱中加入750μL无水乙醇，让溶液通过吸附柱；
12、盖上吸附柱盖子，分别将吸附柱和支架从底座上取下来。将吸附柱装入洁净的2mL收集管中，14000rpm离心3min，丢弃收集管；
13、将吸附柱装入一个新的洁净的2mL收集管中，打开盖子，室温放置10min；
14、随后放入56℃的金属浴中，烘干1min；
15、向吸附柱的中间悬空小心的先加入30μL NF-Water，室温放置5min；
16、12000rpm离心1min，保留收集管约30μL cfDNA溶液；
17、再向吸附柱的中间悬空小心的加入30μL NF-Water，室温放置5min；
18、12000rpm离心1min，保留收集管约55μL cfDNA溶液。冻存-80℃冰箱。
建库步骤包括：
步骤1：DNA片段末端修复
1.将下列试剂加入到样品中(总体积30μL)：
NEBNext Ultra II End Prep Reaction Buffer 3.5μL
NEBNext Ultra II End Prep Enzyme Mix 1.5μL
2.使用移液器充分吹打混匀并离心；
3.将混合物放于PCR仪中，PCR条件如下：
20℃ 30分钟
65℃ 30分钟
4℃ ∞
步骤2：连接接头
1.按照下列顺序依次将试剂加入到步骤2的反应液中：
Figure BDA0003306742300000091
2.充分混匀并离心；
3.将其放于PCR仪中，20℃15分钟；
磁珠纯化(AMPure XP beads DNA Purification kit)
(1)将纯化用磁珠室温放置30分钟备用；
(2)磁珠涡旋混匀，每个样品中加入43μL磁珠(加每个样品前都要再次混匀磁珠)。用200μL移液器吸打10次，混匀样品。样品室温混合5分钟；
(3)样品放在磁力架上，室温静置5分钟，直到液体变清澈；
(4)配制80％乙醇(注：每次都要新鲜配制)；
(5)用200μL移液器移除上清液(注意：不要搅动磁珠)，并立刻加入200μL80％乙醇，吹打两次，磁力架上静置1分钟；
(6)将乙醇吸出后，再次加入200μL 80％乙醇，吹打两次，磁力架上静置30秒；
(7)吸干样品中的液体，在磁力架上晾干10分钟；
(8)加入8.5μL无核酸酶水，取下样品管，枪头吹打至磁珠全部混匀；
(9)室温放置2分钟后，再次放置在磁力架上5分钟，直到液体变清澈；
(10)吸出7.5μL液体至PCR管中。
步骤3：PCR扩增修饰后的DNA片段
(1)在步骤3的PCR管中混合下列试剂：
Figure BDA0003306742300000092
Figure BDA0003306742300000101
(2)PCR反应条件：
Figure BDA0003306742300000102
磁珠纯化(AMPure XP beads DNA Purification kit)
(1)将纯化用磁珠室温放置30分钟备用；
(2)磁珠涡旋混匀，每个样品中加入22.5μL磁珠(加每个样品前都要再次混匀磁珠)。用200μL移液器吸打10次，混匀样品。样品室温混合5分钟；
(3)样品放在磁力架上，室温静置5分钟，直到液体变清澈；
(4)配制80％乙醇(注意：每次都要新鲜配制)；
(5)用200μL移液器移除上清液(注意：不要搅动磁珠)，并立刻加入200μL80％乙醇，吹打两次，磁力架上静置1分钟；
(6)将乙醇吸出后，再次加入200μL 80％乙醇，吹打两次，磁力架上静置30秒；
(7)吸干样品中的液体，在磁力架上晾干10分钟；
(8)加入33μL无核酸酶水，取下样品管，枪头吹打至磁珠全部混匀；
(9)室温放置2分钟后，再次放置在磁力架上5分钟，直到液体变清澈；
(10)吸出30μL液体至新的低吸附1.5mL管中；
(11)DNA的保存(DNA Storage)
(12)提取完的DNA，按DNA序号对应的孔位收盒；4℃可以短期(不超过两周)保存；若要长期保存，需置于-20℃。
对样品进行测序前质量控制与定量后，进行二代测序，对测序原始数据进行初步整理并分析，随后进行CIN score的计算；计算结果与试剂盒中已知cutoff值进行比对，预判检测样品所属患者的预后生存期。
根据前述实验方法，选取213例骨转移癌患者(经免疫组化检测明确为非原发性骨肿瘤或原发病灶的转移性癌症/肿瘤患者)外周血血浆标本进行cfDNA抽提，建库并进行测序，通过CIN score检测划分为CIN score高值组与CIN score低值组，长期随访并给出生存时间，绘制生存曲线(如图2所示)，可明确CIN score高值组的患者平均生存期较CIN score低值组显著缩短，同时与Tokuhashi评分进行比较可发现，Tokuhashi评分高者CIN score普遍较低，而其中同样存在CIN score较高者，此部分患者生存时间与Tokuhashi评分预测生存时间有较大偏差；而Tokuhashi评分低者，X’score值偏高，但其中X’score值较低者占比较高，此部分患者的生存时间被Tokuhashi评分定义为生存期短于6个月，但实际生存期显著高于6个月(图3)。
以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。

Claims (7)

1.染色体不稳定性评分在制备泛癌种骨转移癌患者生存期判断指标试剂中的应用。
2.染色体不稳定性评分在制备泛癌种骨转移癌患者生存期判断指标试剂盒中的应用。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述染色体不稳定性评分的计算方法包括：
Figure FDA0003306742290000011
Figure FDA0003306742290000012
比对人参考基因组，计算患者外周血中cfDNA某个碱基区间的覆盖度，该覆盖度减去参照者外周血中cfDNA对应碱基区间覆盖度的平均值后，除以参照者外周血中cfDNA对应碱基区间覆盖度的标准差，即得患者外周血中cfDNA某个碱基区间的相对覆盖度；计算各个碱基区间相对覆盖度与对应碱基区间长度的乘积，所有乘积绝对值加和以2为底数的对数即为所述染色体不稳定性评分。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，各个碱基区间的长度均为200K。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述染色体不稳定性评分的cutoff值为12.0。
6.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述泛癌种骨转移癌为肺癌、乳腺癌、小肠癌、食道癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、脑癌、淋巴癌、内分泌系统肿瘤、鼻咽癌或前列腺癌。
7.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述应用包括：抽提患者外周血中cfDNA，构建文库并进行二代测序，计算所述染色体不稳定性评分。
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