CN113968872A - 苯基取代类acc抑制剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药化学领域，涉及苯基取代类ACC抑制剂的制备方法，具体地，涉及式(I)的(R)‑3‑(1‑(2‑(2‑甲氧基苯基)‑2‑((四氢‑2H‑吡喃‑4‑基)氧基)乙基)‑5‑甲基‑6‑(噁唑‑2‑基)‑2,4‑二氧代‑1,2‑二氢噻吩并[2,3‑d]嘧啶‑3(4H)‑基)苯甲酸或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的制备方法，

Description

苯基取代类ACC抑制剂的制备方法

技术领域

本发明属于医药化学领域，具体涉及(R)-3-(1-(2-(2-甲氧基苯基)-2-((四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)乙基)-5-甲基-6-(噁唑-2-基)-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸(又名(R)-3-(1-(2-(2-甲氧基苯基)-2-((四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)乙基)-5-甲基-6-(噁唑-2-基)-2,4-二氧代-1,4-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(2H)-基)苯甲酸)的制备方法。

背景技术

乙酰辅酶A羧化酶(ACC)是催化乙酰辅酶A反应生成丙二酰辅酶A的生物素酶，该催化反应是制约脂肪酸合成第一阶段的限速步骤。在哺乳动物中，ACC以两种组织特异性同功酶的形式存在，其中ACC1主要存在于脂质生成组织，如肝脏和脂肪，而ACC2主要存在于氧化组织，如肝脏、心脏和骨胳肌。ACC1和ACC2是由独立基因编码，虽然呈现不同的细胞分布，但二者共有75％的总体氨基酸序列一致性。在肝脏中，脂肪酸(FA)的合成和伸长是通过ACC1催化乙酰辅酶A生成的丙二酰基辅酶A，从而促使三酸甘油酯形成和极低密度脂蛋白(VLDL)产生。在合成脂肪酸能力有限的心脏和骨胳肌中，由ACC2形成的丙二酰基辅酶A发挥调控FA氧化的功能[Tong L,Harwood HJ Jr.J Cell Biochem.2006,99(6):1476-1788.]。

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和非酒精性脂肪肝炎(NASH)被认为是肝脏代谢异常的两种表现，是目前最为常见的慢性肝病，而且其发病率正在逐年攀升。其中NASH可能会进一步发展为肝硬化和肝癌，可能引起由肝脏疾病引起的死亡。目前该类疾病缺乏有效的治疗策略，现有治疗药物仍然是以噻唑烷二酮类为代表的胰岛素增敏剂和抗氧化剂(如维生素E)，此外包括降脂药物、血管紧张素受体拮抗剂、多不饱和脂肪酸等，治疗效果非常有限。在目前的多项研究中，ACC1和ACC2被认为是有望治疗NAFLD和NASH的药物作用靶点[Geraldine Harriman,Jeremy Greenwood,Sathesh Bhat,et al.Proc Natl Acad SciU.S.A.2016,113(13):E1796-E1805.]。

对于靶向ACC途径的药物研究已有一定进展和研究基础，通过抑制ACC1和ACC2可以抑制肝脏细胞内脂肪的从头(de novo)合成，该治疗方案可显著降低肝脏脂肪含量和硬化程度，同时较早降低肝纤维化标志物水平。另有研究表明，对ACC1和ACC2同时抑制可降低肿瘤组织中重新产生FA的能力，具有抑制肿瘤细胞生长的作用[Svensson RU,Parker SJ,Eichner LJ,et al.Nat Med.2016,22(10):1108-1119.]。不过，仍然需要开发更优异的ACC抑制剂，以便获得活性更优且安全性更高的药物，从而用于治疗ACC介导的事件相关的疾病，如纤维化疾病、代谢性疾病、肿瘤和增生性疾病。

发明内容

本发明的发明人发现了一种苯基取代类ACC抑制剂，其化合物结构如下式(I)所示，化学名称为(R)-3-(1-(2-(2-甲氧基苯基)-2-((四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)乙基)-5-甲基-6-(噁唑-2-基)-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸(以下简称“式(I)化合物”)：

本发明的发明人研究发现，式(I)化合物或其水合物、溶剂合物或结晶对ACC具有好的抑制活性，非常有希望成为疗效更高、副作用更小的ACC表达相关疾病，例如纤维化疾病、代谢性疾病、癌症或者组织增生类疾病的治疗剂。

众所周知，对于人类用药，出于安全性因素要求，国内和国际管理机构对原料药(API)中未确证或毒性未定杂质的限度规定非常低。原料药中的杂质可能是由于自身的降解而产生的，也可能来源于制备方法，例如，包括未反应的起始原料、起始原料中包含的杂质的化学衍生物、合成副产物等。因此，需要对式(I)化合物或其衍生物的制备方法进行研究，以获得反应条件温和，工艺稳定，纯化容易，易于操作，有利于工业化大生产的制备式(I)化合物或其药学可接受的盐、异构体、溶剂合物或结晶的方法。

本发明的一个目的是提供式(I)所示的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的制备方法，包括使式(II)的化合物发生酯水解的步骤，其中R¹选自羧基保护基，

在一些优选的实施方案中，本发明提供的本发明的式(I)的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的制备方法，其中R¹选自烷基和硅烷基；进一步优选地，R¹选自C_1-6烷基、-Si(C_1-6烷基)₃和-Si(苯基)₃；进一步优选地，R¹选自甲基、乙基、丙基、三甲基硅烷基和三苯基硅烷基。

在一些优选的实施方案中，本发明提供的式(I)所示的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的制备方法，其中所述的制备方法包括在碱性试剂存在下使式(II)的化合物发生酯水解的步骤，优选地，所述的碱性试剂选自氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、三乙胺、二乙胺、二异丙基乙胺、1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)、溴化钾、溴化钠和溴化锂中的一种或多种。

在一些具体的实施方案中，本发明提供的式(I)所示的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的制备方法，其中所述的制备方法包括使用反应溶剂，优选地，所述的反应溶剂为四氢呋喃(THF)、甲醇、乙醇、乙腈、丙酮和水中的一种或多种，进一步优选为四氢呋喃(THF)、甲醇和水中的一种或多种。

本发明的发明人考察了其它条件相同时，仅反应溶剂不同时化合物(II)的剩余量及化合物(I)生成量，具体数据见表1，

表1

在一些优选的实施方案中，根据本发明的式(I)的化合物的制备方法，其中式(II)的化合物和氢氧化锂的摩尔比为约1:0.9至1:10，优选为约1:1至1:5，进一步优选为约1:1至1:3。

在一些具体的实施方案中，本发明的式(I)的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的制备方法，其进一步包括使式(III)的化合物与式(IV)的化合物反应生成式(II)的化合物的步骤，其中R¹具有上文所述的定义，R²选自卤素，R³选自有机锡试剂，

在一些优选的实施方案中，本发明提供的本发明的式(II)的化合物的制备方法，其中R¹选自烷基和硅烷基；进一步优选地，R¹选自C_1-6烷基、-Si(C_1-6烷基)₃和-Si(苯基)₃；进一步优选地，R¹选自甲基、乙基、丙基、三甲基硅烷基和三苯基硅烷基；R²选自氟、氯、溴和碘；R³选自有机锡试剂，优选为三丁基甲锡烷基；

在一些实施方案中，根据本发明的式(II)的化合物的制备方法，其中所述的制备方法包括在催化剂存在下使式(III)的化合物与式(IV)的化合物反应生成式(II)的化合物的步骤，优选地，其中所述的催化剂选自四(三苯基膦)钯(Pd(PPh₃)₄)和三(二亚苄基丙酮)二钯(Pd₂(dba)₃)。

在一些实施方案中，根据本发明的式(II)的化合物的制备方法，其中所述的制备方法包括在膦配体存在下使式(III)的化合物与式(IV)的化合物反应生成式(II)的化合物的步骤，优选地，其中所述的膦配体选自三苯基膦、三(邻-甲苯基)膦、三(2-呋喃基)膦、1,2-二(二苯基膦基)乙烷(dppe)、1,4-二(二苯基膦基)丁烷(dppb)，2,3-二(二苯基膦基)丁烷(Chiraphos)、4,5-二(二苯基膦基)-9,9-二甲基呫吨(Xantphos)、1,2-二(2,5-二甲基磷杂环戊烷基)苯(Me-DuPhos)、二苯基膦基)二茂铁基]乙基二环己基膦(Josiphos)、二(二苯基膦基)甲烷(dppm)、1,3-二(二苯基膦基)丙烷(dppp)、1,2-二(二环己基膦基)乙烷(dcpe)、三环己基膦、三丁基膦、三叔丁基膦、三(五氟苯基膦)、三(2,4,6-三甲基苯基)膦、2,2'-二(二苯基膦基)-1,1'-联萘(binap)、(2-联苯)二-叔丁基膦、(2-联苯)二环己基膦、2-二叔丁基膦基-2’,4’,6’-三异丙基联苯("叔丁基XPhos")、2-二环己基膦基-2’,6’-二甲氧基联苯("Sphos")、2-二环己基膦基-2’-(N,N-二甲基氨基)联苯("DavePhos")、2-二环己基磷-2',4',6'-三异丙基联苯(XPhos)和2-二环己基磷-2',6'-二异丙氧基-1,1'-联苯(RuPhos)；优选地，所述的配体选自2-二环己基磷-2',6'-二异丙氧基-1,1'-联苯(Ruphos)、2-二环己膦基-2'-(N,N-二甲胺)-联苯(Davephos)、2-二环己基磷-2',4',6'-三异丙基联苯(XPhos)、2-(二叔丁基膦)联苯(Johnphos)、4,5-双二苯基膦-9,9-二甲基氧杂蒽(Xantphos)、2-二-叔丁基膦基-2’,4’,6’-三异丙基联苯("叔丁基XPhos")和2-二环己基磷-2',6'-二异丙氧基-1,1'-联苯(RuPhos)；优选地，所述的配体选自2-二环己基磷-2',4',6'-三异丙基联苯(XPhos)和2-二环己基磷-2',6'-二异丙氧基-1,1'-联苯(RuPhos)和2-二-叔丁基膦基-2’,4’,6’-三异丙基联苯("叔丁基XPhos")。

在一些优选的实施方案中，根据本发明的式(II)的化合物的制备方法，其中式(III)的化合物和式(IV)的化合物的摩尔比为约1:0.7至1:1.5，优选为约1:1至1:1.3，进一步优选为约1:1.1。

在一些实施方案中，根据本发明的式(II)的化合物的制备方法，其中所述的制备方法包括使用反应溶剂，其中所述的反应溶剂为1,4-二氧六环、四氢呋喃和2-甲基四氢呋喃中的一种或多种。

在一些具体的实施方案中，本发明的式(I)的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的制备方法，其进一步包括使式(V)的化合物与式(VI)的化合物反应生成式(III)的化合物的步骤，其中，X为离去基团，R¹、R²具有上文所述的定义，

在一些优选的实施方案中，本发明提供本发明的式(III)的化合物的制备方法，其中，X选自卤素和羟基的活性酯基；更进一步优选地，X选自氟、氯、溴、碘、羧酸酯基、磺酸酯基、磷酸酯基和硼酸酯基；更进一步优选地，X选自氟、氯、溴、碘、甲磺酸酯基、三氟甲磺酸酯基、苯磺酸酯基、甲苯磺酸酯基、对溴苯磺酸酯基和对硝基苯磺酸酯基。

在一些具体的实施方案中，本发明提供本发明的式(III)的化合物的制备方法，其中所述的制备方法包括在缚酸剂存在下使式(V)的化合物与式(VI)的化合物反应生成式(III)的化合物的步骤，优选地，其中所述的缚酸剂选自醇盐碱、碱金属醇盐和碳酸盐碱；进一步优选地，所述缚酸剂选自叔丁醇钾、叔丁醇钠、叔戊醇钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸铯、碳酸氢铯、磷酸钾和磷酸氢二钾。在一些优选的实施方案中，所述缚酸剂选自碳酸钾和碳酸氢钾。

在一些优选的实施方案中，根据本发明的式(III)的化合物的制备方法，其中式(V)的化合物和式(VI)的化合物的摩尔比为约0.9:1至2:1，优选为约1:1至1.5:1，进一步优选为1.1:1至1.5:1。

在一些具体的实施方案中，根据本发明的式(III)的化合物的制备方法，其中所述的制备方法包括使用溶剂，其中所述的溶剂为极性溶剂；优选地，所述溶剂为非质子溶剂；进一步优选地，所述溶剂选自1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和N,N-二甲基苯胺(DMA)。

在一些具体的实施方案中，本发明提供的式(III)所示的化合物的制备方法，其中，反应温度为约40℃至约150℃，优选为约50℃至约120℃，更进一步优选为约60℃至约100℃。

在一些具体的实施方案中，本发明提供式(5)的化合物，

在一些具体的实施方案中，本发明提供本发明的式(5)的化合物的制备方法，包括如下步骤：

1)式(5-1)的化合物与N,N'-羰基二咪唑(CDI)和式(5-2)的化合物在二氯甲烷中发生反应制得式(5-3)的化合物；

2)式(5-3)的化合物和叔丁醇钾在溶剂1,4-二氧六环中发生反应，环合制得式(5-4)的化合物；

3)式(5-4)的化合物的羧基与乙醇发生缩合反应，生成式(5-5)的化合物；

4)式(5-5)的化合物在N,N-二甲基乙酰胺(DMA)中与N-溴代琥珀酰亚胺反应，得到式(5)的化合物。

在一些具体的实施方案中，本发明提供本发明的式(6)的化合物的制备方法，包括如下步骤：

1)式(6-1)的化合物与式(6-2)的化合物在四氢呋喃中发生反应制得式(6-3)的化合物；

2)式(6-3)的化合物和式(6-4)的化合物在氢化钠的作用下发生反应制得式(6-5)的化合物；

3)式(6-5)的化合物在四正丁基氟化铵(TBAF)的作用下制得式(6-6)的化合物；

4)式(6-6)的化合物和式(6-7)的化合物在催化酶的作用下制得式(6-8)的化合物；

5)式(6-8)的化合物在氢氧化锂的作用下发生水解制得式(6-9)的化合物；

6)式(6-9)的化合物和甲基磺酰氯(MsCl)在三乙胺的作用下制得式(6-10)的化合物；

7)式(6-10)的化合物在溴化钠的作用下制得式(6)的化合物。

在一些具体的实施方案中，本发明提供式(I)的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的制备方法，其中所述方法包括如下步骤：

1)式(5)的化合物与式(6)的化合物发生反应制得式(3)的化合物；

2)式(3)的化合物和式(4)的化合物发生反应制得式(2)的化合物；

3)式(2)的化合物在碱性试剂的作用下发生水解，反应生成式(I)的化合物；

其中，步骤3)所述的碱性试剂具有上文所述的定义。

在一些优选的实施方案中，本发明提供式(I)的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的一种精制方法，其中所述方法包括将式(I)的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶溶解在溶剂中，加入活性炭，抽滤，降温析晶；进一步优选地，本发明提供式(I)的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的一种精制方法，其中所述方法包括将式(I)的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶溶解在溶剂中，加入金属清除剂、活性炭，抽滤，降温析晶；其中所述溶剂优选选自乙腈、水、碳原子数小于6的醇类和碳原子数小于6的酮类中的一种或几种，更优选选自乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、仲丁醇、异丙醇、丙酮和水中的一种或几种。

本发明的发明人发现，本发明提供的式(I)化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的制备方法有较高的收率及纯度，反应条件温和，纯化容易，工艺稳定，易于操作，能够满足工业规模的生产和应用。

术语说明

除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。

本发明的“离去基团”，具有本领域的通常含义，是指可以容易地置换的基团，当形成新键时，由分子发生置换反应的分子上的活性官能团。具有此功能的基团是本领域技术人员众所周知的，其具体实例可进一步参考本领域常见的有机合成手册。例如，所述离去基团可以是卤素原子、氨基、烷氧基、酰氧基、芳氧基、杂芳氧基、烷基磺酰氧基、芳基磺酰氧基、羟基、羟基的活性酯，例如羧酸酯、磺酸酯、磷酸酯或硼酸酯。

本发明的“羧基保护基”是指本领域已知的适当的用于氨基保护的基团，例如，所述的羧基保护基可以是(C_1-10烷基或芳基)三硅烷基，例如三甲基硅基、三乙基硅基、三异丙基硅基、叔丁基二甲基硅基、叔丁基二苯基硅基等；可以是C_1-10烷基或取代烷基，例如甲基、叔丁基、烯丙基、三苯甲基、苄基、甲氧基甲基、乙氧基乙基、2-四氢吡喃基(THP)等；可以是(C_1-10烷基或芳基)酰基，例如甲酰基、乙酰基、三氟乙酰基、苯甲酰基等；可以是(C_1-6烷基或C_6-10芳基)磺酰基，例如甲磺酰基、乙磺酰基、苯甲磺酰基等；可以是(C_1-6烷氧基或C_6-10芳基氧基)羰基，例如甲氧羰基、乙氧羰基、苄氧羰基、2-联苯基-2-丙氧羰基、笏甲氧羰基、苯氧羰基、叔丁氧羰基；也可以是C_1-6烷氧基或C_6-10芳基氧基，例如甲氧基、乙氧基、苯氧基、三甲基硅基乙氧基等。

本发明的“烷基”是指直链或支链的饱和烃基。合适的烷基为取代或未取代的C_1-10烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、环丁基、正戊基、异戊基、环戊基、环己基、正己基等。

本发明的“烷氧基”是指-O-烷基。根据本发明，合适的烷氧基为C_1-10烷氧基，如C_1-8烷氧基、C_1-7烷氧基、C_1-6烷氧基、C_1-5烷氧基、C_1-4烷氧基、C_1-3烷氧基，包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、异丁氧基、仲丁氧基等。

本发明的“卤素”是指氟、氯、溴、碘。

本发明的“芳基”是指可以包含单环或多稠环例如二环或三环的芳香环的芳香系，其中至少稠合的环的一部分形成共轭的芳香系，其为5至50元环，优选约6至约12元环。合适的芳基包括但不限于苯基、萘基、联苯基、蒽基、四氢萘基、芴基、茚满基、亚联苯基和苊基。

本发明的“杂芳基”是指芳族单环或多稠环如二环或三环的至少有一个碳原子被杂原子替代的芳香性基团，所述的杂原子为O、S、N。合适的杂芳基包括但不限于咪唑基、苯并咪唑基、咪唑并吡啶基、喹唑啉酮基、吡咯基、咪唑酮基、呋喃基、噻吩基、吡唑基、噁唑基、噻唑基、异噁唑基、异噻唑基、噁二唑基、三唑基等。

本发明的“盐”可以是任何盐，尤其是指药学上可接受的盐。在本文中，“药学上可接受的盐”是指本发明所述的化合物与本发明的“酸”或“酸性试剂”形成的药学上可接受的盐，本发明的“酸”或“酸性试剂”可选自盐酸、氢溴酸、磷酸、氨基磺酸、硝酸、对甲基苯磺酸、苯磺酸、对氨基苯磺酸、硫酸、乙酸、乙二酸、苯乙酸、丙酸、丙二酸、三氟乙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、抗坏血酸、双羟萘酸、羟基马来酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、2-乙酰氧基苯甲酸、反丁烯二酸、乙烷二磺酸、草酸、羟乙磺酸、柠檬酸、D-葡萄糖酸、乳酸、L-苹果酸、琥珀酸、L-酒石酸、富马酸、α-酮戊二酸、马尿酸、马来酸、D-酒石酸、甲烷磺酸或其类似物。本发明化合物的“药学上可接受的盐”能由包含酸性或碱性部分的本发明化合物经常规的化学方法合成，通常，碱性化合物的盐类能通过例子交换色谱法制备，或将游离碱与化学计量或过量的所期望的成盐无机或有机酸在适宜的溶剂或溶剂的各种组合中进行反应来制备。类似的，酸性化合物的盐类可通过与适宜的无机或有机碱进行反应来形成。

本发明“碱性试剂”是指能够使羟基或氨基去质子化的化合物。碱的实例包括但不限于，与醇溶剂组合的(C_1-6烷基)氧化物((C_1-6烷基)OM)，其中(C_1-6烷基)氧化物包括但不限于MeO-、EtO-、n-PrO-、i-PrO-、t-BuO-、i-AmO-(异戊氧基)等，且其中M是碱金属阳离子，例如Li⁺、Na⁺、K⁺等。醇溶剂包括(C_1-6烷基)OH，例如，诸如甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、叔丁醇、异戊醇等。还可以使用非烷氧基碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢化钠、六甲基二甲硅基胺钠、六甲基二甲硅基胺锂、二异丙基酰胺锂、氢化钙、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸铯、DBU(1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯)、DBN(1,5-二氮杂双环[4.3.0]壬-5-烯)、格氏试剂例如(C_1-6烷基)Mg(卤素)，其包括但不限于甲基氯化镁、甲基溴化镁、叔丁基氯化镁、叔丁基溴化镁等。

术语“溶剂合物”是指通过与溶剂分子配位形成固态或液态的配合物的本发明化合物的形式。水合物是溶剂合物的特殊形式，其中与水发生配位。在本发明范围内，溶剂合物优选是水合物。

术语“结晶”是指本发明所述的化合物形成的各种固体形态，包括晶型、无定形。

本发明化合物中的“氢”、“碳”、“氧”包括其所有同位素。同位素应理解为包括具有相同原子数但具有不同质量数的那些原子。举例来说，氢的同位素包括氕、氚和氘，碳的同位素包括¹³C和¹⁴C，氧的同位素包括¹⁶O和¹⁸O等。

具体实施方式

下面代表性的实施例是为了更好地说明本发明，而非用于限制本发明的保护范围。以下实施例中使用的材料如无特殊说明均为商购获得。

实施例1：(R)-3-(1-(2-(2-甲氧基苯基)-2-((四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)乙基)-5-甲基-6-(噁唑-2-基)-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸的制备

步骤1：2-(3-(3-(乙氧羰基)苯基)脲基)-4-甲基噻吩-3-羧酸乙酯的制备

在100L反应釜中，加入二氯甲烷(79.5kg)、2-氨基-4-甲基噻吩-3-羧酸乙酯(6.0kg)和N,N'-羰基二咪唑(5.777kg)，氮气保护，20-25℃反应过夜。反应结束后，在25℃下加入三乙胺(3.605kg)和3-氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸盐(9.309kg)，20-25℃反应过夜。反应结束后，将反应液分批缓慢加入至庚烷中，加完反应液搅拌0.5～1h，离心，水漂洗；湿品用水打浆，10-20℃打浆2h，离心，水漂洗。固体经70±5℃鼓风干燥，得到标题化合物，共9.68kg，收率79.40％。

步骤2：3-(5-甲基-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸的制备

在100L反应釜中，加入1,4-二氧六环(33.08kg)和2-(3-(3-(乙氧羰基)苯基)脲基)-4-甲基噻吩-3-羧酸乙酯(3.2kg)，升温并控制温度50±5℃，搅拌至2-(3-(3-(乙氧羰基)苯基)脲基)-4-甲基噻吩-3-羧酸乙酯全部溶解后加入叔丁醇钾(2.38kg)，50±5℃反应0.5h。反应结束后，加入纯化水，反应0.5h，停止反应，缓慢分批次加入盐酸，调节pH至2～3，35±5℃析晶1h以上，然后15±5℃析晶8h以上，离心，水漂洗得固体。在另外两个100L反应釜中重复以上投料量、反应步骤和后处理步骤。将三次得到的固体合并，70℃鼓风干燥8h以上，得到标题化合物，共7.00kg，收率90.90％。

步骤3：3-(5-甲基-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸乙酯的制备

在100L反应釜中，加入N,N-二甲基甲酰胺(39.7kg)、3-(5-甲基-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸(6.98kg)和N,N'-羰基二咪唑(5.62kg)，氮气保护，35±5℃反应2h。向反应液中加入无水乙醇，35±5℃反应过夜。反应结束后，将反液缓慢分批加入水中，加完15±5℃搅拌3h以上。离心，水漂洗，70℃鼓风干燥8h以上。得到标题化合物，共6.62kg，收率96.79％。

步骤4：3-(6-溴-5-甲基-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸乙酯的制备

在100反应釜中，加入N,N-二甲基乙酰胺(41.38kg)和3-(5-甲基-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸乙酯(2.945kg)，固体溶解后降温至-20℃，滴加N-溴代丁二酰亚胺(1.587kg)的N,N二甲基乙酰胺(13.79kg)溶液，维持温度不高于-20℃，滴加完毕后维持温度搅拌0.5h。反应结束后，升温至固体溶解，滴加纯化水，控温不高于30℃，滴加完毕，10-15℃析晶3h以上，离心，水漂洗得固体。在另外一个100L反应釜中重复以上投料量、反应步骤和后处理步骤。将两次得到的固体合并，70℃鼓风干燥8h以上，得到标题化合物粗品，共6.105kg，收率83.92％。

在100L反应釜中，加入1,4-二氧六环(33.08kg)和3-(6-溴-5-甲基-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸乙酯粗品(3.05kg)，升温至85℃，固体溶解后滴加纯化水(13.70kg)，滴加完毕后维持温度搅拌15～30min，趁热过滤，滤液15±5℃析晶1h，离心，水漂洗；湿品甲醇回流打浆1h，15±5℃析晶1h，离心，甲醇漂洗得固体。在另外一个100L反应釜中重复以上投料量、反应步骤和后处理步骤。将两次得到的固体合并，70℃鼓风干燥8h以上，得到标题化合物，共5.05kg，收率82.80％。

步骤5：(R)-3-(6-溴-1-(2-(2-甲氧基苯基)-2-((四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)乙基)-5-甲基-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸乙酯的制备

在50L立式夹套反应釜中，加入1-甲基-2-吡咯烷酮(29.390kg)、3-(6-溴-5-甲基-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸乙酯(2.859kg)、(R)-4-(2-溴-1-(2-甲氧基苯基)乙氧基)四氢-2H-吡喃(2.000kg)和碳酸钾(1.450kg)，开启搅拌，氮气保护，开启加热，控制温度为120℃-130℃。反应完全后，把反应液降温至25±5℃。加入甲基叔丁基醚、水，搅拌20-30min后静止分层，除去水层，保留有机层。合并有机层，加入水(28.600kg)，搅拌，静止分层，除去水层，保留有机层。在另外的50L反应釜中重复以上投料量、反应步骤和后处理步骤。将得到的两份有机层合并，减压浓缩，乙醇漂洗得固体，固体经50±5℃鼓风干燥，得到标题化合物，共2.530kg，收率61.87％。ESI-MS[M+H]⁺m/z:643.1。

步骤6：(R)-3-(1-(2-(2-甲氧基苯基)-2-((四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)乙基)-5-甲基-6-(噁唑-2-基)-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸乙酯的制备

在10L四口反应瓶中，加入1,4-二氧六环(6.460kg)、(R)-3-(6-溴-1-(2-(2-甲氧基苯基)-2-((四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)乙基)-5-甲基-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸乙酯(1.250kg)、2-二环己基磷-2',4',6'-三异丙基联苯(0.557kg)、三(二亚苄基丙酮)二钯(0.267kg)和2-(三正丁基锡基)噁唑(0.769kg)，用氮气置换3-5次，开启加热搅拌，回流30min，停止反应。反应液在60-100℃时过滤，除去固体，收集滤液。在另外的10L四口反应瓶中重复以上投料量、反应步骤和后处理步骤。将得到的两份滤液合并，减压浓缩。乙醇漂洗得固体，固体在50±5℃下鼓风干燥，得标题化合物粗品2.090kg。

在50L反应釜中，加入甲醇(4.100kg)、乙酸乙酯(4.680kg)和以上步骤得到的粗品(2.085kg)，加热回流搅拌，温度为70±5℃时，加入巯基硅胶(0.100kg)，搅拌30min后趁热抽滤，将滤液转移50L反应釜中，降温至0-10℃，析晶4小时以上后过滤，滤饼用甲醇(0.395kg)淋洗，得固体，固体经60±5℃鼓风干燥12小时以上，得标题化合物1.310kg，收率53.30％。ESI-MS[M+H]⁺m/z:632.2。

步骤7：(R)-3-(1-(2-(2-甲氧基苯基)-2-((四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)乙基)-5-甲基-6-(噁唑-2-基)-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸的制备

将甲醇(4.27kg)和四氢呋喃(14.4kg)加入到100L反应釜中，加入(R)-3-(1-(2-(2-甲氧基苯基)-2-((四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)乙基)-5-甲基-6-(噁唑-2-基)-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸乙酯(2.156kg)，搅拌溶解后，加入氢氧化锂(0.131kg)的水(5.390kg)溶液，控制温度0～10℃，滴加结束后，室温搅拌反应。反应完全后，将反应液降温至0-5℃，加入盐酸(1.08kg)，调节pH至1-2，将析出的固体离心过滤，滤饼用水(5.000kg)洗，60±5℃鼓风干燥12小时以上。得标题化合物，共2.025kg，收率98.4％。

步骤8：(R)-3-(1-(2-(2-甲氧基苯基)-2-((四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)乙基)-5-甲基-6-(噁唑-2-基)-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸的精制

将乙醇(13.880kg)加入到100L反应釜中，加入以上步骤制得的(R)-3-(1-(2-(2-甲氧基苯基)-2-((四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)乙基)-5-甲基-6-(噁唑-2-基)-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸(1.000kg)，加热搅拌溶解，加入

Thiol(0.050kg)继续搅拌20min，再加入活性炭(0.050kg)继续搅拌20min后过滤。将滤液转移到50L反应釜中，降温至10℃，搅拌析晶，过滤得固体。70±5℃鼓风干燥，得标题化合物0.825kg，收率82.5％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ13.11(s,1H),8.25(s,1H),8.04(d,1H),7.83(d,1H),7.67(t,1H),7.52(t,2H),7.42(s,1H),7.32(t,1H),7.04(dd,2H),5.35-5.32(m,1H),4.17-4.14(m,1H),4.04-3.98(m,1H),3.80(s,3H),3.62-3.59(m,2H),3.44-3.41(m,1H),3.31-3.24(m,2H),2.79(s,3H),1.72-1.65(m,2H),1.30-1.24(m,2H)。ESI-MS[M+H]⁺m/z:604.2。

实验例1：体外乙酰基-CoA羧化酶(ACC)抑制实验

1实验材料

1.1化合物

对照化合物为专利WO2013/071169实施例I-181中公开的化合物ND-630(其为目前临床中最有希望的用于此类疾病的药物)，化学名为(2-[1-[2-(2-甲氧基苯基)-2-(氧杂环己烷-4-基氧基)乙基]-5-甲基-6-(1,3-噁唑-2-基)-2,4-二氧代-1H,2H,3H,4H-噻吩并[2,3-d]嘧啶-3-基]-2-甲基丙酸)，参照专利WO2013/071169中描述的方法制备并通过氢谱和质谱鉴定。

化合物准备：以上实施例1制备的本发明的化合物和对照化合物，每个化合物用DMSO配制成10mM备用，实验时从1000nM开始3倍稀释依次为1000nM、333.3nM、111.1nM、37.1nM、12.3nM、4.12nM、1.37nM、0.46nM、0.15nM、0.05nM。

1.2主要试剂

HEPES缓冲液购自Invitrogen公司；MgCl₂、柠檬酸钾缓冲溶液、DTT、乙酰基-CoA和NaHCO₃购自Sigma公司；BRIJ-35购自MERCK公司；ACC1和ACC2酶均购自BPS生物公司；ADP-Glo^TM激酶试剂盒购自Promega公司。

1.3耗材和仪器：

96孔聚丙烯板购自Nunc公司；振荡器购自QILINBEIER公司；离心机购自Eppendorf公司；384孔白板和Envision 2104读板器购自Perkin Elmer公司。

2实验方法

2.1.试剂配制

1×反应缓冲液(pH＝7.4)配制：用HEPES(1M)、MgCl₂(1M)、BRIJ-35(10％)、柠檬酸钾缓冲溶液(1M)、BSA(10mg/mL)和DTT(500mM)的储备液配制酶活反应缓冲液：包含HEPES(50mM)、MgCl₂(2mM)、BRIJ-35(0.01％)、柠檬酸钾缓冲溶液(2mM)、BSA(50μg/mL)和DTT(2mM)。

2.2.ACC酶活实验

1)ACC1酶活测试

将4.5μL 2.2×的ACC1酶(2nM)工作液加入384孔板中；然后加入0.5μL的不同浓度的化合物，室温孵育15min。

用2.1中配制的缓冲液配制2×的底物(40μM ATP，20μM乙酰CoA，60mM NaHCO3)；向384孔板中加入5μL的2×底物，室温孵育30min；然后加入10μL ADP-Glo试剂，室温孵育40min，终止反应；最后加入20μL酶检测试剂，室温孵育40min，用Envision 2104仪器读取荧光值信号(RLU)。

2)ACC2酶活测试

将4.5μL 2.2×的ACC2酶(1.1nM)工作液加入384孔板中；然后加入0.5μL的不同浓度的化合物，室温孵育15min。

用2.1中配制的缓冲液配制2×的底物(40μM ATP，40μM乙酰CoA，24mM NaHCO₃)；向384孔板中加入5μL的2×底物，室温孵育30min；然后加入10μL ADP-Glo试剂，室温孵育40min，终止反应；最后加入20μL酶检测试剂，室温孵育40min，用Envision 2104仪器读取荧光值信号(RLU)。

3实验数据处理

阴性对照组：含5％DMSO的溶媒；阳性对照组：含100nM的ND-630。求取各浓度以及阳性和阴性对照的数据的平均值，并且计算标准差。由下式计算抑制百分比：抑制率(100％)＝100×(RLU_阴性对照-RLU_化合物)/(RLU_阴性对照-RLU_阳性对照)。抑制率数据用非线性回归方程式拟合计算各化合物的IC₅₀，非线性回归方程为Y＝最低值+(最高值-最低值)/(1+10^{((LogIC50 -X)×HillSlope)})，其中X为化合物浓度的对数，Y为抑制百分比(100％)。

4实验结果

表2

以上实验结果表明，本发明的化合物对ACC1和ACC2均具有好的抑制活性。

实验例2：大鼠肝脏分布评价

1.实验材料

1.1动物

雄性SD大鼠，SPF级，购自上海西普尔必凯实验动物有限公司；220-250g，许可证号：SCXK(沪)2013-0016。实验前给予2-3天适应期。给药前禁食8～12h，给药2h后给水，4h后给食。

1.2供试化合物

实施例1的本发明式(I)的化合物和对照化合物ND-630。

1.3仪器

API 4000型三重四级杆液质联用仪、Analyst QS A01.01色谱工作站均购自美国AB SCIEX公司；Milli-Q超纯水器购自Millipore公司；CF16R XII台式高速冷冻离心机购自Hitachi公司；Qilinbeier Vortex-5振荡器购自德国IKA公司；电热恒温水浴锅购自常州国华电器有限公司；电动移液器购自美国Thermo公司；微量分析天平购自上海梅特勒有限公司。

2.实验方法

2.1供试药物配制

称取供试化合物6mg(以游离碱计)，加入至20mL乙醇-PEG400-生理盐水(10:30:60)中，涡旋2min，超声3min，配制浓度为0.3mg/mL的供试品溶液，用于口服给药；取供试品溶液100μL用甲醇定容至10ng/mL，同时配制等浓度的对照品，HPLC上进样检测供试品及对照品溶液浓度，计算供试品准确度。

2.2样品采集

单次口服给予SD大鼠供试化合物3mg/kg，给药体积为10mL/kg，大鼠给药后，分别于0.25h、1h和4h颈动脉取血，安乐死取肝脏，立即收集肝脏和血液(用肝素钠抗凝)，置于冰上。

2.3肝脏样品处理和分析

称取0.4g肝脏，剪碎，于2mL 75％甲醇-水中匀浆,将匀浆液离心(离心条件：8000rpm/min，5min，4℃)，转移上清液冻存，进样前复溶、离心，取上清，用LC-MS/MS分析上清样品中化合物的含量。

2.4血浆样品处理和分析

采集后的全血样品置于冰盒中，于30min以内离心(离心条件：8000rpm/min，5min，4℃)并转移上层血浆100μL，加300μL甲醇沉淀，振荡、离心，加入流动相稀释，取上清，用LC-MS/MS分析上清样品中化合物的含量。

3实验结果

表3

化合物在肝脏中的浓度越高，治疗肝脏疾病的效价越高，同等剂量下疗效越好，而肝脏/血浆比越高，表明供试化合物的靶器官选择性越强，化合物的安全性可能越好。从以上结果可以看出，本发明的化合物在肝脏中有较高的分布，肝脏选择性及靶向性良好(肝/血比＞50)，因此，本发明化合物有望成为更优效更安全的治疗脂肪肝、非酒精性脂肪肝肝炎(NASH)等代谢性肝脏疾病的药物。

实验例3：体外人肝脏星状细胞LX-2激活抑制实验

1实验材料

1.1化合物制备

实施例1的本发明式(I)的化合物和对照化合物ND-630，每个化合物用DMSO配制成60mM，备用。

1.2细胞株

人肝星状细胞LX-2，由徐列明教授在美国西奈山医学院肝病中心建立，上海肝病研究所细胞库保存。

1.3主要试剂

DMEM培养基、FBS、胰酶、磷酸盐缓冲液(DPBS)和青霉素-链霉素双抗购自美国GIBCO公司；重组人TGF-β1细胞因子(PeproTech公司，货号：100-21)；TransZOL Up PlusRNA抽提试剂盒(全式金，货号：ER501-01)；cDNA逆转录试剂盒(全式金，货号：AH341-01)；5×SYBR Green qPCR试剂盒(QuantiNovaTM，货号：154045739)。

1.4耗材和仪器：

CKX41倒置显微镜，日本Olympus公司产品，多功能酶标仪，美国MolecularDevices公司产品，Thermo Nano Drop 2000核酸定量分析仪，ABI 9700PCR扩增仪，ABI7500PCR荧光定量，Thermo高速离心机(MEGAFUGE8)；全自动制冰机(雪科，IMS-30)。

2实验方法

2.1.试剂配制

将本发明实施例的化合物和对照化合物DMSO母液用培养基依次稀释到30μM、10μM、3μM。按照PeproTech试剂盒说明书将TGF-β1用试剂盒配制的10mM的枸橼酸缓冲液溶解至1μg/mL，备用。

2.2.LX-2细胞处理

LX-2细胞传代后以的2×10⁵个/mL密度接种于6孔培养板内，每孔含10％FBS的DMEM 2mL，5％CO₂培养箱内37℃培养，记为Day1。24h后(Day2)，融合度达到70-80％，吸弃旧培养液，换以无血清的DMEM对细胞作低血清饥饿处理。于Day3吸弃旧培养液，加入培养液或含有不同浓度药物的培养液继续温育培养，分为对照组(无血清DMEM培养液)，TGFβ1组，TGFβ1+化合物组，TGFβ1工作浓度10ng/mL。药物作用24h后(Day4)，吸弃细胞上清，预冷1×PBS洗涤细胞1次，用于抽提总RNA。

2.3.总RNA抽提

2.3.1样品前处理：于细胞培养6孔板中每孔加入1mL的TransZOL Up试剂，水平放置片刻，使裂解液均匀分布于细胞表面并裂解细胞，使用移液枪吹打细胞使得细胞完全脱落，将裂解液转移至2mL RNase free离心管中，反复吹吸直至裂解液无明显沉淀。

2.3.2抽提步骤：根据TransZOL Up总RNA抽提试剂盒说明书进行操作。

2.4.总RNA浓度及纯度测定

取2μL总RNA置于NanoVue分光光度计检测A260nm波长吸光度，算出RNA浓度。RNA样品的纯度根据260nm及280nm吸光值比值(A260/A280)计算，比值在1.8～2.1范围，说明RNA无污染也无降解，方可用于后续试验。

2.5.cDNA的合成

将提取的RNA按照等质量稀释到相应的浓度为0.1μg～0.5μg(Total RNA≤1μg)之间，实验各个样本逆转录体系中总RNA的质量为～500ng。

按照逆转录试剂盒说明书(TransScriptⅡAll-in-One First-Strand cDNASynthese kit,Lot:AH341-1)，进行如下操作。合成的cDNA-70℃保存备用。

将以上体系轻轻混匀，以上体系液体放入ABI 9700PCR仪器中，设置如下程序：50℃×15min→85℃×5s→4℃×10min，将获得的cNDA贮存于-20℃或者立即使用。

2.6.Real-time PCR反应

所用Real-Time PCR引物：

PCR样本体系：

加样后轻轻混匀，离心，将PCR管置于PCR仪中，设置程序如下。

PCR仪器循环设置：

每样本设2个复孔，PCR仪器设定程序，计算目的基因相对表达量。

3实验数据处理

Real Time PCR结果的阈值由Real Time PCR detector system自动设置，按如下方法计算Col1A1基因的相对含量。

ΔCt(药物处理组Col1A1基因)＝Avg.Ct(药物处理组Col1A1基因)-Avg.Ct(药物处理组GAPDH基因)；

ΔCt(TGF组Col1A1基因)＝Avg.Ct(TGF组Col1A1基因)-Avg.Ct(TGF组GAPDH基因)；

ΔCt(对照组Col1A1基因)＝Avg.Ct(对照组Col1A1基因)-Avg.Ct(对照组GAPDH基因)；

ΔΔCt＝ΔCt(TGF组/药物处理组Col1A1基因)–ΔCt(对照组Col1A1基因)的平均值；Col1A1基因的相对含量计算公式：RQ＝2^-ΔΔCt

相对定量的结果由ABI 7500实时定量荧光PCR仪器自动分析所得。

4实验结果

表4 Col1A1基因的相对含量计算

化合物	抑制率(％)
		实施例1	82.11
ND-630	42.06

Collagen 1是肝纤维化形成过程的关键的信号因子，其表达由Col1A1基因含量所代表。实验结果表明，本发明的化合物对TGF-β1诱导的LX-2细胞的Collagen 1基因的表达具有显著的抑制活性。与ND-630相比，本发明的化合物对肝细胞纤维化形式的抑制活性更强，可用于ACC介导的纤维化疾病、增生性疾病等。

实验例4 HFD-CCL4诱导的NASH及肝纤维化药效评价

先用高脂饮食(HFD)诱导动物肝脏脂肪变性，在此基础上再用四氯化碳(CCL4)诱导肝脏炎症、坏死，发生肝纤维化，该模型与人NASH疾病发生过程以及病理现象类似。本项实验目的是在HFD-CCL4诱导的C57BL/6小鼠的NASH模型中评价本发明的化合物的药效，以ND-630作为对照化合物。HFD-CCL4诱导10周，药物干预4周，观察药物对NASH及肝纤维化的治疗作用。

1.实验材料

1.1仪器

脱水机Leica HistoCore PEARL；石蜡包埋机Leica HistoCore Arcadia C&H；石蜡切片机Leica RM2235；自动染色剂Leica ST5020；扫描仪HAMAMATSU NANO Zoomer S210；SR染色分析软件Visiopharm VIS 6.6.0.2516。

1.2动物

C57BL/6小鼠(雄性，18-20g)购于北京维通利华有限公司。实验动物饲养所有实验操作都经过KCI动物使用和福利委员会(IACUC)批准。小鼠饲养条件如下：温度20–25℃，湿度40％–70％，昼夜明暗交替时间12小时/12小时。每周换2次垫料。

2.实验方法

2.1化合物配制本发明实施例1的式(I)化合物和ND-630采用PEG200:0.2MNa₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液(35:65)溶液稀释至0.3mg/mL，1mg/mL，3mg/mL，备用给药，现配现用。

2.2动物造模

HFD-CCL4诱导C57BL/6小鼠NASH模型：动物在KCI实验动物中心SPF屏障内进行3-7天的适应性饲养后，动物更换HFD饲料饲养，饲养周期为10周。HFD饲养第6周结束时，根据动物体重将HFD组随机分组，每组10只，口服给予CCL4(一周三次，上午9-10点)，并持续4周。详细建模方法根据KCI已建立的方法建立HFD-CCL4诱导的雄性C57BL/6小鼠NASH模型，造模剂为Olive Oil+CCL4溶液(由KCI配制)。其余10只动物给予正常维持饲料伴随饲养作为正常对照动物。

动物分为正常对照组、HFD-CCL4模型组(模型组)和化合物组(本发明实施例1的式(I)化合物组、ND-630组)。

2.3化合物的给药方案

HFD饲养第6周结束后开始灌胃给予本发明实施例1的式(I)化合物和ND-630，每日一次，持续4周，第10周结束给药。本发明实施例1的式(I)化合物组和ND-630组的剂量均为30mg/kg/d。

2.4实验样本收集

末次给药结束后翌日即CCL4最后一次给予48h后各组动物禁食六小时，按照KCI标准操作规程将动物进行安乐死。根据KCI动物解剖实验操作规程将动物进行解剖，动物经低温PBS全身灌流后，采集肝脏，将部分动物肝脏(固定选择每个动物左侧同一肝叶)液氮迅速冷冻，-80℃低温保存。余下动物肝脏经福尔马林后固定(肝脏与固定液的体积比例为1:10)，进行相关病理相关检测。

2.5苏木素-伊红染色

肝左叶经10％福尔马林固定后，用石蜡包埋，制成5μm切片，用于苏木素-伊红(haematoxylin-eosin,H&E)染色。苏木素-伊红染色反映组织炎症，脂肪沉积，空泡变性和组织纤维化的程度，对病变程度进行半定量分析。

2.6天狼猩红染色

肝组织制成5μm切片，干燥2h，复水后用天狼猩红(北京海德创业，货号26357)室温染色30min，再脱水封片，用于图像分析。用Aperio ScanScope CS2(莱卡)，200×倍数扫描病理切片，再在Aperio ImageScope程序中打开扫描的图片，去除血管，剩下目标图像用Color Deconvolution v9分析算法。使用软件将被染为红色的纤维化部分识别为阳性信号，并计算出纤维化的百分率。

3.统计学分析

数据以均值±标准误表示。显著性分析采用学生t-test,one way ANOVA或者twoway ANOVA及post-hoc Dunnett′s test。

4.实验结果

4.1肝脏脂肪变性

实验动物给予高脂饮食10周，与正常对照组比，模型组肝脏脂肪变性程度显著加深。实施例1的化合物组(30mg/kg/d)较模型组脂肪变性明显消失，与正常对照组无差异，明显优于ND-630组(30mg/kg/d)。实验结果见表5。

表5肝脏脂肪变性

由此可见，本发明的化合物对HFD-CCL4诱导的小鼠NASH模型有一定的治疗作用；在组织病理上，与模型组相比可有效降低肝脏脂肪变性。

尽管以上已经对本发明作了详细描述，但是本领域技术人员理解，在不偏离本发明的精神和范围的前提下可以对本发明进行各种修改和改变。本发明的权利范围并不限于上文所作的详细描述，而应归属于权利要求书。

Claims (10)

1.一种式(I)的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的制备方法，包括使式(II)的化合物发生酯水解的步骤，其中R¹选自羧基保护基，

2.根据权利要求1所述的式(I)的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的制备方法，其R¹选自烷基和硅烷基。

3.根据权利要求2所述的式(I)的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的制备方法，其中所述的制备方法包括在碱性试剂存在下使式(II)的化合物发生酯水解的步骤，优选地，所述的碱性试剂选自氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、三乙胺、二乙胺、二异丙基乙胺、1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)、溴化钾、溴化钠和溴化锂中的一种或多种。

4.根据权利要求1所述的式(I)的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的制备方法，其进一步包括使式(III)的化合物与式(IV)的化合物反应生成式(II)的化合物的步骤，其中R¹选自羧基保护基，R²选自卤素，R³选自有机锡试剂，

5.根据权利要求4所述的式(I)的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的制备方法，其中所述的制备方法包括在催化剂存在下使式(III)的化合物与式(IV)的化合物反应生成式(II)的化合物的步骤，优选地，其中所述的催化剂选自四(三苯基膦)钯(Pd(PPh₃)₄)和三(二亚苄基丙酮)二钯(Pd₂(dba)₃)。

6.根据权利要求4或5所述的式(I)的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的制备方法，其中所述的制备方法包括在膦配体存在下使式(III)的化合物与式(IV)的化合物反应生成式(II)的化合物的步骤，优选地，其中所述的膦配体选自三苯基膦、三(邻-甲苯基)膦、三(2-呋喃基)膦、1,2-二(二苯基膦基)乙烷(dppe)、1,4-二(二苯基膦基)丁烷(dppb)，2,3-二(二苯基膦基)丁烷(Chiraphos)、4,5-二(二苯基膦基)-9,9-二甲基呫吨(Xantphos)、1,2-二(2,5-二甲基磷杂环戊烷基)苯(Me-DuPhos)、二苯基膦基)二茂铁基]乙基二环己基膦(Josiphos)、二(二苯基膦基)甲烷(dppm)、1,3-二(二苯基膦基)丙烷(dppp)、1,2-二(二环己基膦基)乙烷(dcpe)、三环己基膦、三丁基膦、三叔丁基膦、三(五氟苯基膦)、三(2,4,6-三甲基苯基)膦、2,2'-二(二苯基膦基)-1,1'-联萘(binap)、(2-联苯)二-叔丁基膦、(2-联苯)二环己基膦、2-二-叔丁基膦基-2’,4’,6’-三异丙基联苯("叔丁基XPhos")、2-二环己基膦基-2’,6’-二甲氧基联苯("Sphos")、2-二环己基膦基-2’-(N,N-二甲基氨基)联苯("DavePhos")、2-二环己基磷-2',4',6'-三异丙基联苯(XPhos)和2-二环己基磷-2',6'-二异丙氧基-1,1'-联苯(RuPhos)。

7.根据权利要求6所述的式(I)的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的制备方法，其中式(III)的化合物和式(IV)的化合物的摩尔比为约0.7:1至1.2:1，优选为约0.9:1至1.1:1，进一步优选为约1:1。

8.根据权利要求1所述的式(I)的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的制备方法，其进一步包括使式(V)的化合物与式(VI)的化合物反应生成式(III)的化合物的步骤，其中X为离去基团，R¹选自羧基保护基，R²选自卤素，

9.根据权利要求8所述的式(I)的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的制备方法，其中X选自卤素和羟基的活性酯基。

10.根据权利要求8所述的式(I)的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的制备方法，其中所述的制备方法包括在缚酸剂存在下使式(V)的化合物与式(VI)的化合物反应生成式(III)的化合物的步骤，优选地，其中所述的缚酸剂选自醇盐碱、碱金属醇盐和碳酸盐碱。