CN113957088A

CN113957088A - 细胞间通讯系统的人工设计与应用

Info

Publication number: CN113957088A
Application number: CN202010706100.1A
Authority: CN
Inventors: 娄春波; 杜沛; 张浩千; 赵会伟; 陶勇; 项延会; 钱珑
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2020-07-21
Filing date: 2020-07-21
Publication date: 2022-01-21

Abstract

本发明涉及细胞间通讯系统的全新设计方法、根据该方法设计的细胞间通讯系统及其用途。具体而言，本发明的细胞间通讯系统由信号发送元件和信号接收元件组成，所述信号发送元件和所述信号接收元件位于不同的细胞；其中，所述信号发送元件为信号分子生物合成基因表达盒；所述信号接收元件包含别构转录因子表达盒以及诱导型启动子；其中，所述别构转录因子与所述信号分子相互作用，所述诱导型启动子包含与所述别构转录因子相互作用的操纵序列；其中，所述信号分子选自于2,4‑二乙酰基间苯三酚(DAPG)、对香豆酰基‑高丝氨酸内酯(pC)、异戊酰基‑高丝氨酸内酯(IV)、水杨酸盐(Sal)、次甲霉素呋喃(MMF)以及柚皮素(NG)中的一种或多种。

Description

细胞间通讯系统的人工设计与应用

技术领域

本发明涉及生物工程和基因工程领域。更具体而言，本发明提供了细胞间通讯系统的全新(de novo)设计方法、根据该方法设计并经实验验证的细胞间通讯系统、该系统在构建多细胞信号网络和工程化的多细胞组织中的用途。

背景技术

细胞-细胞通讯对于诸如分工、协作和发育为组织等多细胞的群体行为而言至关重要。介导此类信息传输和信号交流功能的细胞间信号系统在原核和真核生物中均广泛存在。例如，原核细胞的群体感应系统借助分泌信号分子对群体中各单细胞的行为进行协调，以响应环境形成生物膜、实现生物发光或控制毒力因子的表达。多细胞生物中的多种胞间信号转导系统参与细胞命运分化、形态发生以及协调多重免疫反应等复杂过程。这些生物体中天然存在的大量不同种类的信号系统为细胞间通讯系统的工程化提供了多种可能。

本领域已报道了在单细胞群体中借助数种工程化的细胞间通讯系统搭建基因线路，以实现简单的多细胞功能，包括形成空间图案、猎物-捕食者生态系统、同步振荡器、生物计算器、无抗生素病原体控制和诱导自主代谢等。这些体系绝大多数基于已经充分表征的细菌群体感应系统。在该系统中，以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)和酰基载体蛋白为底物生成的信号分子酰基高丝氨酸内酯(AHL)扩散出膜，并被另一细胞中的别构转录因子所感应[1]。大量研究表明，基于AHL的多通道通讯系统在信号水平和启动子水平上均存在广泛的串扰 (crosstalk)，这可能是由于这些系统中各信号分子和/或别构转录因子的结构过于相似导致。已尝试采用多种策略(例如启动子的理性设计[6]或别构转录因子的定向进化[7])来消除串扰。除AHL信号外，还基于酵母肽信息素和一些内源信号分子构建工程化的细胞间通讯系统[3-5]。然而，由于这些系统中信号分子的完整生物合成途径尚不清楚或难以转化至另一物种[2-3]，其模块化和转用性仅局限于少数特定细胞类型，或者必须在培养基中补充其必需前体才能在宿主细胞中合成该信号分子。

在本发明中，根据全新理念筛选潜在的细胞间通讯系统，并对信号发送和信号接收元件进行理性设计，构建了能够实现跨物种高灵敏多重正交信号通讯的细胞间信号通讯系统。

发明内容

在第一方面，本发明提供了一种细胞间通讯系统，所述细胞间通讯系统由信号发送元件和信号接收元件组成，其中，所述信号发送元件和所述信号接收元件位于不同的细胞；其中，

信号分子选自于2,4-二乙酰基间苯三酚(DAPG)、对香豆酰基-高丝氨酸内酯(pC)、异戊酰基-高丝氨酸内酯(IV)、水杨酸盐(Sal)、次甲霉素呋喃(MMF)以及柚皮素(NG) 中的一种或多种；

所述信号发送元件为信号分子生物合成基因表达盒；

所述信号接收元件包含别构转录因子表达盒以及诱导型启动子；其中，所述别构转录因子与所述信号分子相互作用，所述诱导型启动子包含与所述别构转录因子相互作用的操纵序列；

其中，所述DAPG生物合成基因为PhlD、PhlA、PhlB以及PhlC的编码序列；所述与DAPG相互作用的别构转录因子为PhlF；所述PhlF的操纵序列为SEQ ID NO：34；

其中，所述pC生物合成基因为TAL、4CL以及RpaI的编码序列；所述与pC相互作用的别构转录因子为RpaR；所述RpaR的操纵序列为SEQ ID NO：35；

其中，所述IV生物合成基因为支链α-酮酸脱氢酶复合物(Branched Chainα-ketoacid dehydrogenase complex)BCDH以及BjaI的编码序列；所述与IV相互作用的别构转录因子为BjaR；所述BjaR的操纵序列为SEQ ID NO：36；

其中，所述Sal生物合成基因选自于异分支酸-丙酮酸裂合酶和异分支酸合酶的编码序列、水杨酸合成酶的编码序列或二者的组合；所述与Sal相互作用的别构转录因子为NahR；所述NahR的操纵序列为SEQ ID NO：37；

其中，所述MMF生物合成基因为MmfL、MmfH以及MmfP的编码序列；所述与MMF 相互作用的别构转录因子为MmfR；所述MmfR的操纵序列为SEQ ID NO：38；

其中，所述NG生物合成基因为TAL、4CL、查尔酮合酶A和查尔酮异构酶1的编码序列；所述与NG相互作用的别构转录因子为FdeR；所述FdeR的操纵序列为SEQ ID NO：39。

在第二方面，本发明提供了一种多细胞基因线路，所述基因线路包含存在于不同细胞的信号发送元件和信号接收元件，从而借助信号分子将各细胞偶联；其中，所述信号分子选自于2,4-二乙酰基间苯三酚(DAPG)、对香豆酰基-高丝氨酸内酯(pC)、异戊酰基-高丝氨酸内酯(IV)、水杨酸盐(Sal)、次甲霉素呋喃(MMF)以及柚皮素(NG)中的一种或多种；所述信号发送元件为信号分子生物合成基因表达盒；所述信号接收元件包含别构转录因子表达盒以及诱导型启动子；其中，所述别构转录因子与所述信号分子相互作用，所述诱导型启动子包含与所述别构转录因子相互作用的操纵序列。

在第三方面，本发明提供了第一方面的细胞间通讯系统在人工构建多细胞信号网络、多细胞基因线路和/或多细胞组织中的用途。

有益效果

合成生物学借助生物模块标准化和概念抽象对细胞进行“编程”，允许人工设计的基因网络执行各种任务。近年来，随着合成生物学的快速发展，逐渐建立了网络结构与功能之间的联系，因此基因线路(circuit)和通路(pathway)的可预测性大大提高，从而对胞内蛋白节点、通路甚至网络的精准和动态控制成为可能。然而，当出于构建更复杂的网络或实现信号的空间分布和控制的目的，将单细胞功能扩展至包含多个细胞的人工组织和系统时，由于目前已知的信号系统的正交性和模块化程度均不完善，能够实现的多细胞功能非常有限。

为解决目前多重信号通讯系统中模块种类稀少、模块化程度低、信号间串扰以及跨物种转用性差等问题，本发明根据全新的设计理念，以不同物种间通用的胞内代谢物作为前体，选择了一组结构各异的信号分子，并对其核心生物合成基因表达盒进行全新设计，成功构建了跨物种多通道胞间信号通讯系统，其中，作为细胞间通讯媒介的六种信号分子彼此不存在信号水平串扰。相较于目前最为常见的以细菌AHL分子进行信号传输的细胞间通讯系统，本发明系统在信号和启动子水平的串扰均较低。在优选的实施方式中，通过定向进化的方式提高了别构转录因子的响应灵敏度，降低了宿主细胞的代谢负担。此外，还通过对核心启动子和操纵子序列组合优化，扩大了诱导曲线的动态范围(即，最大诱导倍数)，提高了系统的信噪比。特别地，本发明系统所采用的六种信号通讯模块与本领域已报道的基于群体感应的C4、C8、3OC6和3OC12通讯模块均不存在信号水平的串扰，能够将本发明的系统与已知的这些基于群体感应的信号系统组合使用，构建复杂的逻辑门，进而实现逻辑的存储与输出，因此扩展了本领域可用的细胞间通讯模块及工具盒。作为示例，我们构建了双通道、三通道和四通道的多细胞基因线路以及包含七个或非门/同向器(NOR/buffer)且具有与门和异或门逻辑的细胞通讯网络，实现网络的时空调控、群体内空间图案的形成以及生物计算功能。这也是本领域首次实现利用四种细胞间正交信号构建生物计算器。可将本发明的多通道信号通讯系统用于更复杂的基因线路，构建工程化的人体组织或其他治疗用途的多细胞系统。

特别地，本发明的细胞间通讯系统还能够以模块化的方式转用至真核细胞，实现原核生物、单细胞真核生物以及高等哺乳动物细胞(例如人细胞系)间的跨物种甚至跨生物界通讯。之前已有研究者试图将细菌AHL通讯系统转用至哺乳动物细胞。然而，由于哺乳动物中脂肪酸合酶(FAS)以多结构域的II型脂肪酸合酶复合体的形式存在，AHL通讯系统的必要前体酰基载体蛋白被锁定于该复合体内，不能被用于AHL分子的生物合成，因此难以基于 AHL信号在体外实现组织和器官的重构。在本发明的设计中，pC和IV信号系统使用天然氨基酸(L-酪氨酸和L-亮氨酸)作为前体，而Sal、DAPG、MMF和NG信号系统均由胞内通用代谢物合成，因此不存在上述无游离前体的问题。就这一点而言，在本发明的系统中，在不补充前体的情况下也能够由信号发送元件合成信号分子，即，本发明的信号通讯系统为完整通讯系统。与之前报道的基于多巴胺和组胺[2]的系统相比，本发明的细胞通讯系统也具有更好的跨物种、甚至跨生物界细胞间通讯的能力。本发明的系统可用于在哺乳动物细胞中设计开发多层基因线路和逻辑门，以产生复杂多细胞行为、构建人造组织或用于智能治疗 (smart therapy)的人细胞系等。

附图说明

图1显示根据本发明的设计，由中心代谢途径出发合成信号分子DAPG、pC、IV、Sal、MMF、NG、SCB1、尿酸、A因子、吡喃酮、C4、C8、3OC6和3OC12的生物合成途径，以及与上述信号分子相互作用的别构转录因子。

图2显示本发明的细胞间通讯系统的表征和优化。(a)大肠杆菌体系下各信号发送元件以及信号接收元件的构建。发送器细胞中包含信号发送元件，从而表达并向外分泌信号分子。插图示出HPLC-MS测定的由发送器细胞表达(上)以及化学方法合成(下)的信号分子浓度的定量结果。将不同比例的发送器细胞加入至接收器细胞进行诱导后借助流式细胞术测定剂量响应曲线(右图)，数字为该诱导曲线的动态范围。发送器细胞中的启动子Pc为组成型启动子J23111。(b)本发明的细胞间通讯系统在不同宿主细胞中的性能。示意图标出信号分子、发送器细胞和接收器细胞的类型。293T为人HEK-293T细胞系，S.cere为酿酒酵母细胞， E.coli为大肠杆菌细胞。将不同比例的发送器细胞加入至接收器细胞进行诱导并借助流式细胞术对诱导曲线进行测定，数字为该诱导曲线的动态范围。对于293T接收器细胞，以相同质粒上组成型表达的红色荧光强度对报告子黄色荧光强度进行归一化。(c)在以大肠杆菌作为发送器和接收器的体系下，由化学合成的信号分子进行诱导以及由发送器细胞培养基进行诱导的EC50。(d)在以大肠杆菌作为发送器和接收器的体系下，利用发送器细胞培养基对包含野生型或经定向进化的别构转录因子的接收器进行诱导获得的EC50。所述经定向进化的别构转录因子分别为带有D128G和D154G突变的PhlF；以及带有H57Q、Q168R和V216A 突变的NahR。所给出的数据均为三次重复实验的平均荧光值，误差线对应于各测量的标准差。

图3显示本发明的细胞间通讯系统的正交性。(a)-(d)为对本发明系统的信号正交性进行表征。(a)示出原理图，当发送器细胞分泌的信号分子A仅激活相应的接收器时，不存在信号水平串扰；当该信号分子还激活其它接收器时，存在信号水平串扰。(b)热度图给出不同种类的发送器与接收器(10×10)共培养后借助流式细胞术对诱导强度的倍数变化进行测定的结果。(c)其中彼此完全正交的8个信号通道。(d)借助平板扩散法对于信号正交性进行定性表征。将能够稳定表达RFP的发送器细胞接种于平板正中，并在其周围排布十种报告子为sfGFP的接收器细胞。数字1-10标示对应的接收器细胞。下划线标出的数字标示发送器细胞类型。结果图为TxRed、FITC通道以及明场的叠加图。当该信号分子能够激活接收器细胞中的启动子时，接收器细胞中绿色荧光表达。(e)-(g)为对本发明系统的启动子正交性进行表征。(e)示出原理图，当信号分子A仅激活相应的诱导型启动子P_A，则无启动子水平串扰。当该信号分子还激活存在于相同细胞中的诱导型启动子P_B(例如通过与B通路的别构转录因子相互作用)时，存在启动子水平串扰。(f)构建包含各诱导型启动子与各别构转录因子组合(10×10)的杂合接收器细胞，利用别构转录因子的相应信号分子进行诱导。热度图示出流式细胞术测定的诱导强度的倍数变化。(g)DAPG、pC、IV、Sal、MMF、 NG、3OC6和3OC12的启动子水平正交性。所有结果为三次流式细胞重复实验的平均荧光值。

图4为由多通道细胞间基因线路形成的空间图案。(a)双通道、三通道和四通道网络的信号传导模式示意图。双通道线路包含正交的两个通道，各节点(菌株)均含有一种信号的接收元件和另一信号的发送元件。例如，菌株A合成的信号分子A能够激活菌株B中的报告子，同时菌株B合成的信号分子B能够激活菌株A中的报告子。三通道和四通道线路中，各节点(菌株)均包含一种信号的接收元件用于接收来自上游的信号，以及另一种信号的发送元件用于发送信号到下游节点，此外相邻的节点表达一种通道的信号发送元件和信号接收元件。例如，菌株A合成的信号分子A能够激活菌株B中的报告子，同时菌株B合成的信号分子B能够激活菌株C中的报告子。(b)以DAPG、Sal、pC、IV和3OC6通讯系统中的两种构建的十种双通道线路的平板结果。示意图表明当两个正交信号系统彼此激活时，将在两个菌落中产生梯度图案。(c)pC-Sal-DAPG三通道串联线路以及3OC6-Sal-DAPG三通道串联线路的平板结果。(d)pC-DAPG-3OC6-Sal四通道串联线路的平板结果。(b)-(d)中的实验图为FITC通道以及明场的叠加图。比例尺为0.5cm。

图5为以pC、DAPG、Sal和3OC6通讯系统构建的具有AND+XOR逻辑门的四通道三输入七节点通讯网络。(a)为该网络的线路图。(b)为三输入AND+XOR逻辑门的真值表。 (c)为在平板体系下添加各输入信号组合实现的输出。(b)-(c)中的实验图为FITC通道以及明场的叠加图。比例尺为0.5cm。

具体实施方式

在生物体中，由跨膜受体或内源感应因子(例如别构转录因子)将外源信号传导入细胞，并触发下游应答程序，从而对外源刺激进行应答。在外源信号来自其它细胞或组织的情况下，这一信号传导机制可实现细胞间的信息交流并据此调控单个细胞的行为，来实现多细胞组织和器官所需的自组织功能。在合成生物学领域，通常在单个细胞中构建模块化的基因线路，来执行特定功能(例如重金属离子回收、次生代谢产物生成等)。然而，当基因线路复杂(例如包含多层逻辑门)时，由于负载量限制和信号串扰等问题，难以在单个细胞中构建实现特定功能所需的完整基因线路。本领域已报道在不同细胞中构建各功能元件，并利用小分子作为“电线”，耦连并协调各功能元件，从而构建模块化多细胞基因线路。具体而言，将信号分子的生物合成基因表达盒作为信号发送元件整体置于一种细胞，使得信号发送细胞表达信号分子体内合成所需的全部酶。另一方面，将该信号分子的传感机制作为信号接收元件置于另一种细胞。因此，由信号发送细胞合成分泌的信号分子被信号接收细胞感应时触发下游应答程序，实现群体内各细胞的分工协作。在本文中，包含信号发送元件的细胞也称为信号发送器、信号发送细胞或发送器细胞；包含信号接收元件的细胞也称为信号接收器、信号接收细胞或接收器细胞。考虑到本发明中元件的模块化，由某一种信号的发送元件和接收元件组成的信号通讯系统也可称为该信号的通讯模块。

在本领域中，最常用于细胞间信号传导的系统为革兰氏阴性菌的群体感应信号系统。在该系统中，由自诱导物合成酶LuxI和别构转录因子LuxR介导信号的传递。LuxI在体内催化以S-腺苷甲硫氨酸和酰基载体蛋白为底物生成信号分子酰基高丝氨酸内酯(N-acyl homoserine lactone，AHL)的反应，该信号分子可自由扩散穿过细胞膜；别构转录因子LuxR 能够与扩散进入细菌内的AHL结合而调控下游基因的转录。已在革兰氏阴性菌中鉴定出10 余种具有不同碳链长度和取代基的AHL衍生物，常见的有N-丁酰基-L-高丝氨酸内酯(C4)、 N-己酰基-L-高丝氨酸内酯(C6)、3-氧代-己酰基-L-高丝氨酸内酯(3OC6)、N-辛酰基-L-高丝氨酸内酯(C8)、3-氧代-辛酰基-L-高丝氨酸内酯(3OC8)、N-癸酰基-L-高丝氨酸(C10) 和3-氧代-十二烷酰基-L-高丝氨酸内酯(3OC12)。由于这些系统中各信号分子和/或相应的别构转录因子的结构过于相似，难以将其共同用于多重信号通讯系统。

基于此，本发明的发明人首次提出，可通过如下标准筛选跨物种多通道通讯系统的信号分子：(i)该信号分子无细胞毒性，并可自由穿过各种细胞的细胞膜(即，无需另外的表达载体)；(ii)相应的别构转录因子对该信号分子的响应具有较高的灵敏度；(iii)该信号分子生物合成所需前体为在原核和真核细胞内均常见的胞内代谢物，并优选存在于中心代谢途径；(iv)为了不增加宿主细胞的代谢负担，该信号分子最简生物合成通路的酶总数最好少于5种。通过对KEGG数据库和文献的检索，我们初步选出了10种候选信号小分子(图1，浅灰色示出的通路为中心代谢途径)，并成功地对其中六种的信号发送元件和信号接收元件进行了模块化。将相应的信号发送元件和信号接收元件置于不同的细胞中，能够有利地实现细胞间通讯。

在本发明中，信号发送元件的功能在于对信号分子进行体内合成，信号接收元件的功能在于对进入胞内的信号分子进行感应并触发下游基因的转录。其中，信号接收元件包含与所述信号分子相互作用的别构转录因子(aTF)以及与所述别构转录因子相互作用的诱导型启动子，其工作原理为本领域所公知。别构转录因子作为信号受体，其结构包含与信号小分子 (诱导物)结合的结构域以及与启动子操纵序列结合的结构域。别构转录因子与小分子的结合造成构象改变，使得由该启动子控制的下游基因转录增强或降低。在本领域中，别构转录因子也称为调控蛋白。其中，与DNA的结合触发或增强目标基因转录的别构转录因子称为激活因子，反之称为阻遏蛋白。诱导型启动子包含能够与别构转录因子相互作用的操纵序列。操纵序列一般位于靶基因的转录起始位点附近，或者空间上与转录起始位点邻近。本文中，术语“操纵位点”和“操纵序列”可互换使用。不希望被理论所限地，在本发明中，诱导型启动子可包含一对以上操纵序列，该操纵位点对可同时位于转录起始位点的上游或下游，或分别位于转录起始位点的两侧。

术语“启动子”指的是驱动核酸序列表达或转录的DNA区域，位于所述基因转录起始位点的同义链上游。在启动子处RNA聚合酶以及调控蛋白或转录因子能够与DNA结合。启动子一般包含转录调控区域(诱导型启动子)、RNA聚合酶识别区域和转录起始位点。本领域已知的是，将编码序列可操作地连接至诱导型启动子的下游，并在所需要的时机添加诱导物，可动态开启或关闭该基因的转录。术语“最小启动子”指的是能够起始转录的最小转录控制单元，例如仅包含RNA聚合酶识别区域和转录起始位点的启动子核心区域。在本发明中，可将至少一个操纵位点添加至最小启动子的上游和/或下游，构造开关性能优异的诱导型启动子。不希望被理论所限地，多个操纵位点有利于阻遏蛋白的多聚化，因此能够提高启动子的开关性能。

本文使用的术语“表达盒(expression cassette)”是指由一个或多个基因及控制该基因表达的序列组成的DNA片段，从而该基因编码的蛋白能够在期望的宿主细胞中表达。本领域已知的是，表达盒中包含的控制表达的序列任选包含启动子序列、3’非编码区、转录终止位点以及多聚腺苷酸(真核细胞)等。在本发明中，包含启动子和编码序列的表达盒可被整合至基因组或存在于质粒载体。

如果核酸分子(如DNA)包含含有转录和翻译调控信息的核苷酸序列、而且这样的序列“可操作地连接”至编码多肽的核苷酸序列，则该核酸分子(如DNA)被称为“能够表达”所述多肽。可操作的连接是调控DNA序列与旨在被表达的DNA序列通过“允许基因以可回收的量表达为肽或蛋白”的方式相连接的连接。基因表达所需的调控区的性质可因生物体种类而不同，这在本领域中是公知的。

信号发送元件和信号接收元件的设计

天然生物系统的代谢调控中存在大量别构转录因子，它们识别并结合信号分子从而调控下游基因的转录活性。考虑到信号通讯系统的跨物种转用性，本发明选取衍生自中心代谢途径的信号分子，以便能够以通用中间产物(例如氨基酸代谢或中心碳代谢的中间产物)作为起始物合成信号分子。特别地，能够借助生物信息学方法针对多种生物中此类信号分子的生物合成通路进行挖掘，重建和拼装信号发送元件。

本发明的细胞间通讯系统提供了多达六种新的细胞间信号通讯模块，如表1所示，各通讯模块均包含信号发送元件和信号接收元件，所述信号发送元件和信号接收元件分别位于信号发送细胞和信号接收细胞。所述信号发送元件包含信号分子生物合成基因表达盒，因此信号发送细胞能够表达催化该信号分子生物合成所需的酶，从而在胞内合成信号小分子。由于该信号分子具有自由穿过细胞膜能力，由此生成的小分子能够扩散进入细胞培养基，进而穿过例如信号接收细胞的细胞膜。另一方面，所述信号接收元件包含与所述信号分子相互作用的别构转录因子和诱导型启动子。在本发明中，别构转录因子与信号分子的结合触发由诱导型启动子控制的下游基因的转录。通过这样的方式，以信号分子作为载体，实现不同细胞间的信号交流及多细胞基因线路的组装。鉴于本发明信号模块间的正交性，一种细胞内可包含一种或多种信号的信号发送元件和其它一种或多种信号的信号接收元件。在本发明中，信号发送细胞与信号接收细胞仅为针对特定信号而言，即，一种信号的信号发送细胞可同时为另一信号的信号接收细胞，例如逻辑线路中的中间节点。

表1工程化细胞间通讯系统模块

表1中编号给出对应基因的物种来源。其中，信号发送元件和信号接收元件的序列如表 2所示。

表2信号发送元件和信号接收元件序列

在一些实施方式中，采用2,4-二乙酰基间苯三酚(DAPG)作为信号分子。其中，所述DAPG生物合成由聚酮合酶PhlD以及2,4-二乙酰基间苯三酚合成蛋白PhlA、PhlB以及PhlC催化，响应于所述DAPG的别构转录因子为PhlF。优选地，所述PhlD、PhlA、PhlB、PhlC 以及PhlF蛋白均来自于荧光假单胞菌。优选地，所述PhlD、PhlA、PhlC、PhlB以及PhlF 蛋白的编码序列分别为来自荧光假单胞菌的phlD基因、phlACB操纵子以及phlF基因。

在一些实施方式中，采用对香豆酰基-高丝氨酸内酯(pC)作为信号分子。本领域已知的是，在与植物共生的池沼红假单胞菌中存在的pC合成途径并不完整[8-9、20]，因此需在培养基中添加外源起始物才能实现pC的生物合成。而在本发明中，利用酪氨酸解氨酶TAL、 4-香豆酸辅酶A连接酶4CL以及对香豆酰基-高丝氨酸内酯合成酶RpaI催化由酪氨酸合成对香豆酰基-高丝氨酸内酯。响应于pC的RpaR为LuxR家族转录调控因子。优选地，所述TAL 来自于球形红细菌；所述4CL、RpaI和RpaR来自于池沼红假单胞菌。优选地，所述TAL 的编码序列为来自球形红细菌的tal基因；所述4CL、RpaI和RpaR的编码序列分别为来自池沼红假单胞菌的4cl、rpaI和rpaR基因。

在一些实施方式中，采用异戊酰基-高丝氨酸内酯(IV)作为信号分子。在本发明中，由支链α-酮酸脱氢酶复合物BCDH和异戊酰-高丝氨酸内酯合成酶BjaI催化由支链氨基酸 (异亮氨酸)合成IV。响应于IV的别构转录因子为转录激活蛋白BjaR。优选地，所述支链α-酮酸脱氢酶复合物BCDH来自于阿维链霉菌；所述异戊酰-高丝氨酸内酯合成酶BjaI来自于日本慢生根瘤菌。优选地，所述支链α-酮酸脱氢酶复合物BCDH的编码序列为来自阿维链霉菌的IpdA1-bdkFGH操纵子[10、21]；所述异戊酰-高丝氨酸内酯合成酶BjaI以及转录激活蛋白BjaR的编码序列分别为日本慢生根瘤菌的bjaI和bjaR基因。

在一些实施方式中，采用水杨酸盐(Sal)作为信号分子。在自然界中水杨酸盐可被恶臭假单胞菌的别构转录因子NahR所识别。结合水杨酸盐的NahR能够与P_sal启动子相互作用，激活萘分解代谢操纵子，因此该恶臭假单胞菌能够以水杨酸盐作为碳源[13]。根据对KEGG数据库的分析，我们找到两种可能的水杨酸盐生物合成途径，二者均以莽草酸途径的共同前体(分支酸盐)作为起始物。在一些实施方式中，借助异分支酸-丙酮酸裂合酶和异分支酸合酶由分支酸衍生物合成水杨酸盐[14]。在另一些实施方式中，由水杨酸合成酶催化上述反应[15]。在其它实施方式中，发送器细胞同时表达异分支酸-丙酮酸裂合酶、异分支酸合酶和水杨酸合成酶。优选地，所述异分支酸-丙酮酸裂合酶和异分支酸合酶来自于铜绿假单胞菌。优选地，所述水杨酸合成酶来自小肠结肠炎耶尔森菌。优选地，所述异分支酸-丙酮酸裂合酶和所述异分支酸合酶的编码序列为来自铜绿假单胞菌的pchBA双基因操纵子。优选地，所述水杨酸合成酶的编码序列为来自小肠结肠炎耶尔森菌的irp9。所述NahR的编码序列为来自恶臭假单胞菌的nahR基因。

在一些实施方式中，采用次甲霉素呋喃(MMF)作为信号分子。其中，借助2-烷基-4-羟甲基呋喃-3-羧酸生物合成蛋白MmfL、MmfH以及MmfP催化由磷酸二羟丙酮生成次甲霉素呋喃，响应于所述MMF的别构转录因子为TetR/AcrR家族转录调控因子MmfR。优选地，所述MmfL、MmfH、MmfP以及MmfR蛋白均来自于天蓝色链霉菌。优选地，所述MmfL、 MmfH以及MmfP蛋白的编码序列为来自天蓝色链霉菌的mmfLHP操纵子。所述MmfR的编码序列为来自天蓝色链霉菌的mmfR基因。

在一些实施方式中，采用柚皮素(NG)作为信号分子。在本发明中，首先由酪氨酸解氨酶TAL、4-香豆酸辅酶A连接酶4CL以丙二酸单酰辅酶A作为前体从酪氨酸合成通路合成对香豆酰辅酶A，随后由查尔酮合酶A和查尔酮异构酶1(chalcone flavonone isomerase1) 催化从对香豆酰辅酶A合成柚皮素。响应于所述MMF的别构转录因子为LysR家族转录调控因子FdeR。优选地，所述TAL来自于球形红细菌；所述4CL来自于池沼红假单胞菌；所述查尔酮合酶来自高等植物矮牵牛；所述查尔酮异构酶来自紫花苜蓿；所述FdeR来自水稻内生固氮菌Herbaspirillum seropedicae。优选地，所述TAL的编码序列为来自球形红细菌的tal基因；所述4CL编码序列为来自池沼红假单胞菌的4cl基因；所述查尔酮合酶A的编码序列为来自矮牵牛的chs基因；所述查尔酮异构酶的编码序列为来自紫花苜蓿的chi基因。FdeR的编码序列为来自Herbaspirillum seropedicae的fdeR。

此外，如实施例所展示的，本发明系统中的六种信号与已报道的C4、C8、3OC6和3OC12 信号均不存在信号水平的串扰，可将本发明的各通讯模块与C4、C8、3OC6或3OC12信号通讯模块组合使用。其相应的信号发送元件和信号接收元件如表1和表2所示。本领域已对这些模块进行了表征。

本领域技术人员能够理解的是，就本发明的信号发送元件和信号接收元件而言，也可采用与催化上述信号分子生物合成的酶以及别构转录因子基本同源的蛋白。术语“基本同源” 是指蛋白序列水平至少95％、至少98％或至少99％相同。同源序列可以是不同物种中的功能相同的编码序列。本发明的基因或蛋白的同源物可由本领域技术人员容易地确定。

考虑不同物种(特别是原核和真核生物)中启动子结构的差异，本领域技术人员能够理解的是，将本发明的信号发送元件和信号接收元件转化至其它宿主中时，需要对启动子进行适应性调整。例如，可对生物合成通路和调控蛋白表达盒中的启动子进行调整。就原核细胞而言，不同的物种通常对-10区域序列具有不同的偏好，由此可能影响转录效率。因此对新宿主中-10区域的调整能够提高转录强度。而在将原核生物的启动子转用至真核细胞时，需要对启动子进行适应性设计，来适应真核细胞中的转录起始机制。可依据物种类型对驱动信号分子生物合成基因表达的启动子和驱动aTF表达的启动子分别进行选择，来调整信号小分子和aTF的生成量。例如，在大肠杆菌中可利用P_Tet、P_New、J23100、J23111、J23119、病毒来源的PA1以及PN25启动子控制信号分子的生物合成和/或别构转录因子表达；在酿酒酵母中可以利用P_gal、P_adh或P_tet启动子控制信号分子的生物合成和/或别构转录因子表达；在哺乳动物细胞中可利用CMV1或CMV3G等控制信号分子的合成和/或别构转录因子表达。上述启动子均为本领域惯用的组成型或诱导型启动子。此外，还可选择组织特异性启动子或诱导型启动子。就信号接收元件中的诱导型启动子而言，如上所述，可将操纵序列与如上或其它物种特异性最小启动子进行组合，以便在新的宿主中表达本发明的信号接收元件。

在优选的实施方式中，通过对调控蛋白进行定向突变来改善信号应答的灵敏度。特别地， PhlF可包含D128G突变，NahR可包含Q168R突变。

细胞间通讯系统的用途

由于本发明系统的正交性、模块化、可调性和可组合性，易于将该系统用于对多细胞基因网络进行构建、调整或功能性整合；借助细胞间的多重信号通讯，对网络功能进行精确控制，以便形成具有功能的人工组织，或者对天然组织或器官的功能进行重建或扩充。

在一些实施方式中，所述多细胞基因网络可作为传感器、开关、计数器、定时器、变换器或触发器。在一些实施方式中，所述多细胞基因网络包含选自于如下的一种或多种逻辑门：与门(AND gate)、非门(NOT gate)、或门(OR gate)、或非门(NOR gate)、与非门(NAND gate)、异或门(XOR gate)、异与门(XAND gate)、蕴含门(IMPLY)、蕴含非门(NIMPLY)、同向器(BUF)，或其组合。将生物元件设计为执行逻辑功能的合成基因线路的方法为本领域所知晓，例如参见WO2014093852。术语“基因线路”、“基因网络”、“合成基因网络”或 “合成基因线路”在本文中可互换使用，是指任何工程化的组合物，所述组合物包含至少一种核酸材料或构建体，并可以执行包括但不限于如下功能：传感、逻辑功能和调节功能。核酸材料或构建体可以是自然发生的或合成的。一般地，需要输入来激活合成生物线路，由该生物线路执行计算并产生输出。合成基因网络的一些实例包括可操作地连接至启动子的核酸。所述基因线路也可不包含额外的输入(环路)。

本发明的细胞间多重信号通讯系统的发送元件和接收元件均能够转化至另一物种，并在新的宿主物种中表达相应的蛋白并执行相应运算。因此，本发明的细胞间多重信号通讯系统可用于实现原核细胞间、真核细胞间以及原核-真核细胞间的信号传输，例如细菌-细菌、细菌-酵母、细菌-哺乳动物细胞以及哺乳动物细胞间的信号传导。可将本发明的多通道细胞间信号通讯系统用于疾病模型(例如共生菌、细菌或真菌感染模型)的构建。

本文所述各方面的实施方式可由如下编号的段落说明：

1.一种细胞间通讯系统，所述细胞间通讯系统由信号发送元件和信号接收元件组成，其中，所述信号发送元件和所述信号接收元件位于不同的细胞；其中，

所述信号发送元件为信号分子生物合成基因表达盒；

其中，所述IV生物合成基因为支链α-酮酸脱氢酶复合物BCDH以及BjaI的编码序列；所述与IV相互作用的别构转录因子为BjaR；所述BjaR的操纵序列为SEQ ID NO：36；

2.如段落1所述的系统，其中，所述PhlD以及PhlF的编码序列分别为荧光假单胞菌的phlD基因以及phlF基因；所述PhlA、PhlB、PhlC的编码序列为荧光假单胞菌的phlACB 操纵子。

3.如段落2所述的系统，其中，所述PhlF具有D128G突变。

4.如段落1所述的系统，其中，所述TAL的编码序列为球形红细菌的tal基因；所述4CL、RpaI和RpaR的编码序列分别为池沼红假单胞菌的4cl、rpaI和rpaR基因。

5.如段落1所述的系统，其中，所述支链α-酮酸脱氢酶复合物BCDH的编码序列为阿维链霉菌的IpdA1-bdkFGH操纵子；所述BjaI和BjaR的编码序列分别为日本慢生根瘤菌的bjaI和bjaR基因。

6.如段落1所述的系统，其中，所述异分支酸-丙酮酸裂合酶和异分支酸合酶的编码序列为铜绿假单胞菌的pchBA双基因操纵子；所述水杨酸合成酶的编码序列为小肠结肠炎耶尔森菌的irp9基因；所述NahR的编码序列为恶臭假单胞菌的nahR基因。

7.如段落6所述的系统，其中，所述NahR具有Q168R突变。

8.如段落1所述的系统，其中，所述MmfL、MmfH以及MmfP的编码序列为天蓝色链霉菌的mmfLHP操纵子；所述MmfR的编码序列为天蓝色链霉菌的mmfR基因。

9.如段落1所述的系统，其中，所述TAL的编码序列为球形红细菌的tal基因；所述4CL的编码序列为池沼红假单胞菌的4cl基因；所述查尔酮合酶A的编码序列为矮牵牛的chs基因；所述查尔酮异构酶1的编码序列为紫花苜蓿的chi基因；所述FdeR的编码序列为Herbaspirillum seropedicae的fdeR基因。

10.如段落1-9中任一项所述的系统，其中，所述细胞间通讯系统还包含3-氧代-己酰基 -L-高丝氨酸内酯(3OC6)的信号发送元件和信号接收元件，其中，所述3OC6生物合成基因为LuxI的编码序列；所述与3OC6相互作用的别构转录因子为LuxR；所述LuxR的操纵序列为SEQ ID NO：41。

11.如段落1-10中任一项所述的系统，其中，所述细胞间通讯系统还包含3-氧代-十二烷酰基-L-高丝氨酸内酯(3OC12)的信号发送元件和信号接收元件，其中，所述3OC12生物合成基因为LasI的编码序列；所述与3OC12相互作用的别构转录因子为LasR；所述LasR 的操纵序列为SEQ ID NO：43。

12.如段落1-11中任一项所述的系统，其中，所述细胞间通讯系统具有1、2、3、4、5、6、7或8个通道。

13.如段落1-12中任一项所述的系统，其中，所述信号发送元件和所述信号接收元件各自独立地存在于原核细胞或真核细胞。

14.如段落13所述的系统，其中，所述原核细胞选自于大肠杆菌细胞或Pseudomonas entomophila细胞。

15.如段落14所述的系统，其中，所述表达盒中的启动子选自于P_Tet、P_New、J23100、J23111、J23119、PA1或PN25。

16.如段落13所述的系统，其中，所述真核细胞为酵母细胞。

17.如段落16所述的系统，其中，所述表达盒中的启动子选自于P_gal、P_adh或P_tet。

18.如段落13所述的系统，其中，所述真核细胞为哺乳动物细胞。

19.如段落18所述的系统，其中，所述哺乳动物细胞为人细胞。

20.如段落18所述的系统，其中，所述哺乳动物细胞为永生化细胞、原代细胞或干细胞。

21.如段落18所述的系统，其中，所述表达盒中的启动子选自于CMV1或CMV3G启动子。

22.如段落21所述的系统，其中，所述别构转录因子为融合有VTR3的融合蛋白。

23.一种多细胞基因线路，所述基因线路包含存在于不同细胞的信号发送元件和信号接收元件，从而借助信号分子将各细胞偶联；其中，所述信号分子选自于2,4-二乙酰基间苯三酚(DAPG)、对香豆酰基-高丝氨酸内酯(pC)、异戊酰基-高丝氨酸内酯(IV)、水杨酸盐(Sal)、次甲霉素呋喃(MMF)以及柚皮素(NG)中的一种或多种；

所述信号发送元件为信号分子生物合成基因表达盒；

24.如段落23所述的基因线路，其中，所述PhlD以及PhlF的编码序列分别为荧光假单胞菌的phlD基因以及phlF基因；所述PhlA、PhlB、PhlC的编码序列为荧光假单胞菌的phlACB操纵子。

25.如段落24所述的基因线路，其中，所述PhlF具有D128G突变。

26.如段落23所述的基因线路，其中，所述TAL的编码序列为球形红细菌的tal基因；所述4CL、RpaI和RpaR的编码序列分别为池沼红假单胞菌的4cl、rpaI和rpaR基因。

27.如段落23所述的基因线路，其中，所述支链α-酮酸脱氢酶复合物BCDH的编码序列为阿维链霉菌的IpdA1-bdkFGH操纵子；所述BjaI和BjaR的编码序列分别为日本慢生根瘤菌的bjaI和bjaR基因。

28.如段落23所述的基因线路，其中，所述异分支酸-丙酮酸裂合酶和异分支酸合酶的编码序列为铜绿假单胞菌的pchBA双基因操纵子；所述水杨酸合成酶的编码序列为小肠结肠炎耶尔森菌的irp9基因；所述NahR的编码序列为恶臭假单胞菌的nahR基因。

29.如段落28所述的基因线路，其中，所述NahR具有Q168R突变。

30.如段落23所述的基因线路，其中，所述MmfL、MmfH以及MmfP的编码序列为天蓝色链霉菌的mmfLHP操纵子；所述MmfR的编码序列为天蓝色链霉菌的mmfR基因。

31.如段落23所述的基因线路，其中，所述TAL的编码序列为球形红细菌的tal基因；所述4CL的编码序列为池沼红假单胞菌的4cl基因；所述查尔酮合酶A的编码序列为矮牵牛的chs基因；所述查尔酮异构酶1的编码序列为紫花苜蓿的chi基因；所述FdeR的编码序列为Herbaspirillum seropedicae的fdeR基因。

32.如段落23-31中任一项所述的基因线路，其中，所述基因线路还包含3-氧代-己酰基 -L-高丝氨酸内酯(3OC6)的信号发送元件和信号接收元件，其中，所述3OC6生物合成基因为LuxI的编码序列；所述与3OC6相互作用的别构转录因子为LuxR；所述LuxR的操纵序列为SEQ ID NO：41。

33.如段落23-32中任一项所述的系统，其中，所述基因线路还包含3-氧代-十二烷酰基 -L-高丝氨酸内酯(3OC12)的信号发送元件和信号接收元件，其中，所述3OC12生物合成基因为LasI的编码序列；所述与3OC12相互作用的别构转录因子为LasR；所述LasR的操纵序列为SEQ ID NO：43。

34.如段落23-33中任一项所述的基因线路，其中，所述基因线路具有1、2、3、4、5、6、7或8个通道。

35.如段落23-34中任一项所述的基因线路，其中，所述基因线路包含如下的一种或多种逻辑门：与门、非门、或门、或非门、与非门、异或门、异与门、蕴含门、蕴含非门、同向器，或其组合。

36如段落23-35中任一项所述的基因线路，其中，所述基因线路执行选自于如下的一种或多种功能：传感器、开关、计数器、定时器、变换器或触发器。

37如段落23-36中任一项所述的基因线路，其中，所述基因线路的各节点独立地选自于原核细胞或真核细胞。

38.如段落37所述的基因线路，其中，所述原核细胞选自于大肠杆菌细胞或Pseudomonas entomophila细胞；所述真核细胞为酵母细胞或哺乳动物细胞。

39.如段落38所述的基因线路，其中，所述哺乳动物细胞为人细胞。

40.如段落39所述的基因线路，其中，所述哺乳动物细胞为永生化细胞、原代细胞或干细胞。

41.如段落37所述的基因线路，其中，所述基因线路为细菌线路、细菌-酵母细胞线路、细菌-哺乳动物细胞线路、酵母细胞-哺乳动物细胞线路或哺乳动物细胞线路。

42.段落1-22中任一项所述的细胞通讯系统或段落23-42中任一项所述的基因线路在实施细菌-细菌、细菌-酵母、细菌-哺乳动物细胞、酵母-哺乳动物以及哺乳动物细胞间信号传导方面的用途。

43.段落1-22中任一项所述的细胞通讯系统或段落23-42中任一项所述的基因线路在构建人造组织、人造器官或疾病模型方面的用途。

44.段落1-22中任一项所述的细胞通讯系统或段落23-42中任一项所述的基因线路在智能治疗方面的用途。

实施例

信号发送元件和/或信号接收元件的设计理念

对于DAPG、pC、IV、Sal、MMF和NG发送器和接收器(图2a)，基于如下理念进行设计优化。

Sal信号：已报道推定的恶臭假单胞菌启动子P_sal(SEQ ID NO：54)在大肠杆菌中具有活性[28]。本发明的发明人发现，同时表达异分支酸-丙酮酸裂合酶(AEO73196.1)和异分支酸合酶(WP_003114686.1)，或者仅表达水杨酸合成酶(WP_005168693.1)的Sal发送器细胞均能激活具有P_sal诱导型启动子的接收器细胞(图2a)。

DAPG信号：本领域已报道利用P_phlF(SEQ ID NO：53)来对TetR家族阻遏蛋白进行筛选[29]。我们在大肠杆菌中异源表达荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的phlACBD 基因簇。共培养实验表明，DAPG接收器能够被DAPG发送器激活。

NG信号：已报道P_fdeA启动子(SEQ ID NO：55)在大肠杆菌中具有活性[31]。在本发明中将其作为信号接收元件中的诱导型启动子。该接收器在1mM NG诱导下能够产生165 倍的荧光强度改变。根据我们的设计，NG的合成首先需要由酪氨酸解氨酶TAL和4-香豆酸辅酶A连接酶4CL从酪氨酸合成通路合成对香豆酰辅酶A。此外，NG信号发送元件还应含有编码来自高等植物矮牵牛(Petunia X hybrid)和紫花苜蓿(Medicago sativa)的chs和chi基因，从而能够使用丙二酸单酰辅酶A作为前体合成NG(图1)。共培养实验表明，NG接收器能够被NG发送器激活。

IV诱导系统：我们发现注释的日本根瘤菌推定bjaI启动子(P_bjaI-ptv，SEQ ID NO：1)对IV诱导的响应灵敏度较低。为提高灵敏度，我们对该启动子进行重新设计。虽然发现BjaR操纵序列具有与LuxR操纵序列[21]相似的倒置重复序列，然而并不知晓BjaR的功能是激活因子还是阻抑蛋白。基于BjaR是阻抑蛋白的假设，我们将两个BjaR操纵序列插入至P_lux*启动子骨架的中心和近端，构建了P_bja*启动子(SEQ ID NO：2)。另外，将两个BjaR操纵序列插入至EsaR类型启动子，构建了P_bja-mut2启动子(SEQ ID NO：3)。利用化学合成的IV 对P_bja系列启动子的诱导曲线进行测定发现，P_bja-mut2启动子的灵敏度与P_bjaI-ptv启动子几乎相同，而P_bja*启动子对于IV诱导具有较高的应答灵敏度。

pC诱导系统：与BjaI类似，来自池沼红假单胞菌的RpaI启动子(P_rpaI-ptv，SEQ IDNO： 4)对PC诱导的响应灵敏度较低。由于RpaR是LuxR类型的转录激活蛋白，我们猜测RpaR的工作模式与LuxR类似，因此基于公开的RpaR通用结合序列[22]，采取与构建P_bja*启动子类似的方式设计P_rpa*启动子(SEQ ID NO：5)。另外，鉴于P_rpaI-ptv与大肠杆菌在-10区不相容，通过将P_rpaI-ptv的-10区突变为TACTTT而保持P_rpaI-ptv其它部分不变，构建P_bpa-mut2启动子(SEQ ID NO：6)。灵敏度检测结果表明，P_rpa-mut2启动子的灵敏度与P_rpaI-ptv启动子几乎相同，而P_rpa*启动子对于pC诱导具有较高的响应灵敏度。

MMF诱导系统：MmfR是TetR家族阻遏蛋白，其识别MmfR的操纵序列已被报道[23]。我们通过对MmfR操纵序列的2个核苷酸进行随机化设计了16种操纵序列，并将其插入P_tac启动子，得到12种启动子(SEQ ID NO：7-18)。在0和0.01mM IPTG诱导的MmfR(启动子为Ptac)条件下，该12种启动子下游报告基因的荧光强度改变的倍数为0-33倍。将性能最好的P_mmf5命名为P_mmf。

此外，对已有的基于AHL的四种诱导系统进行如下优化。

C8诱导系统：已报道推定的洋葱伯克氏菌(Burkholderia cenocepacia)的C8诱导型cepI 启动子在大肠杆菌中具有活性[24]，然而C8接收器的动态范围较小。我们将CepO与P_lux*启动子的核心区域组合，获得动态范围为150的启动子P_cep*(SEQ ID NO：19)，作为模块化的诱导系统与其它细胞通讯系统组合使用。

3OC6诱导系统：将来自费氏弧菌(Vibrio fischeri)的P_lux[25]启动子的-10区由TAGAGT 换成TACTTT，这类改进的启动子P_lux*(SEQ ID NO：20)由于降低了本底表达而表现出较高的动态范围。3OC6诱导下P_lux*的动态范围为185。

C4诱导系统：本领域已经报道将P_lux的操纵序列替换为铜绿假单胞菌来源的rhlA操纵序列(针对RhlR)，来构建C4诱导型启动子P_rhl*-catLVA[26]。我们将P_rhl*-catLVA启动子的-10 区换成TACTTT来降低本底表达，得到P_rhl*(SEQ ID NO：21)，C4诱导下P_rhl*的动态范围为124。

3OC12诱导系统：通过将与LasR特异性结合的LasI操纵序列[27]插入至P_lux*启动子设计了响应于3OC12的诱导型启动子P_las*(SEQ ID NO：22)，3OC12诱导下P_las*的动态范围为82。

各发送器质粒和接收器质粒的构建详见方法部分。

各通讯系统的表征

首先，借助两种策略对接收器细胞中各诱导型启动子响应于由相应发送器细胞分泌的不同浓度的信号分子的动态范围进行定量测定：(i)以不同的初始比例将发送器细胞添加至接收器细胞，构建共培养体系；或者(ii)用新鲜培养基以不同比例稀释过夜培养的发送器细胞的上清液，并在其中加入接收器细胞；随后通过流式细胞术测定接收器细胞中GFP的荧光强度，并根据该接收器中GFP的强度随发送器细胞浓度的改变计算诱导的动态范围。两种方法所得到的定量结果基本一致。如图2a所示，各接收器细胞中的诱导型启动子均被由发送器细胞产生的信号分子显著激活。对于DAPG、Sal、pC、IV、NG和MMF信号通讯系统，其动态范围为10倍至1380倍(图2a)。此外，如图2a所示，本发明中通过两种策略构建的Sal发送元件均能够有效产生水杨酸。

对于所述诱导型启动子的灵敏度，用希尔方程对诱导曲线进行拟合来计算半最大有效浓度，即EC50值。如图2c所示，当添加化学合成的小分子作为诱导物时，pC-RpaR、IV-BjaR、 Sal-NahR、DAPG-PhlF和NG-FdeR诱导体系的EC50分别为4×10^-10mol/L、3×10^-8mol/L、 6×10^-6mol/L、1.7×10^-5mol/L和5.1×10^-5mol/L。不希望被理论所限，较低的EC50值对应于较高的灵敏度，因此对宿主细胞的代谢负担也较小。进而，借助高效液相色谱-质谱(HPLC-MS) 技术对发送器细胞培养物上清液中的信号分子进行定量(图2a中的HPLC-MS图)，以通过该方式测定的由发送器细胞生成的信号分子的量相对于诱导强度做图，对所得诱导曲线拟合获得的EC50值与使用化学合成信号分子测得的EC50一致(表3、图2c)。由于无法利用化学方法合成MMF，因此无法对MMF-MmfR诱导体系信号分子的浓度进行定量。

表3：根据由化学合成的小分子以及发送器上清培养液分别对接收器进行激活测得的剂量响应曲线计算得到的EC10、EC50和EC90

细胞间通讯系统的改进

在本发明中，已通过将不同的核心启动子序列与核糖体结合位点(RBS)进行组合(下文方法部分)，使得信号分子的产生效率增加10-1000倍，从而优化发送器细胞的信号分子生物合成能力。

此外，能够通过定向进化提高本发明的信号通讯系统的灵敏度。作为实例，我们对DAPG-PhlF和Sal-NahR诱导体系中的别构转录因子编码基因(phlF和nahR)进行了随机突变，并通过流式细胞术基于添加/不添加信号分子的条件下的报告子(P_phlF–sfgfp和P_sal–sfgfp) 荧光对菌株进行正选择和负选择。在3-6轮的筛选后，测定选出的六种PhlF突变体和三种 NahR突变体的EC50值。筛选获得的六种PhlF突变体分别为：具有D128G点突变；同时具有D128G和Q181R突变；同时具有D128G和T24A突变；同时具有D128G和D154G突变；同时具有K127N和V194A突变；以及具有E132D点突变。经筛选获得的三种NahR突变体分别为：同时具有H57Q、Q168R和V216A突变；同时具有H57Q、Q168R和V267D 突变；同时具有I25V和Q168R突变。令人惊讶的发现，D128G突变存在于四种选出的PhlF 突变体中，该突变能够将DAPG-PhlF的EC50降低约10倍(图2d)。对于NahR突变体而言，Q168R突变对NahR诱导系统性能的改进而言是必要的，能够将其EC50值降低约15 倍(图2d)。这些结果均表明，单一位点突变足以改变别构转录因子响应诱导物的性能，可通过进一步的定向进化和筛选提高本发明通讯系统的灵敏度。

细胞通讯系统的正交性

当基因线路中同时存在多个信号传导通路时，需保证各信号通路正交，在信号传感以及启动子应答水平不存在相互干扰。在本领域中将这两种水平的串扰分别定义为信号串扰和启动子串扰[28]。我们对本发明构建的六种信号通讯模块和已报道的四种基于AHL的信号通讯模块的正交性进行了表征。

为检验信号水平的串扰，对本发明全新构建的六种信号通讯模块及四种基于AHL的模块共十种信号发送器和十种信号接收器进行配对共培养，测量各发送器-接收器对中诱导型启动子的诱导表达和非特异性表达(图3a)。正如本领域所知晓的，基于群体感应的C4、 3OC6、C8和3OC12信号通讯模块中特异性诱导和非特异性诱导的应答差别不大，彼此存在较强信号串扰(非特异性诱导最大诱导倍数为49.7倍，平均为18.5倍)(图3b)[8、16-17]。此外，3OC12发送器与C4或3OC6接收器在信号水平正交，而与C8信号接收元件不具正交性。新构建的六种信号通讯模块彼此表现出良好的正交性(非特异性诱导最大为5.4倍，平均为1.7倍)，且与基于AHL的四种信号通讯模块间也不存在串扰。该良好的正交性可能是由于这些信号分子的化学结构存在较大差异。如图3c所示，由于本发明构建的DAPG、 Sal、pC、IV、NG、MMF与3OC6和3OC12这八种信号模块间均不存在信号水平串扰，可将本发明的系统与基于AHL的信号通讯系统3OC6和3OC12组合使用。可通过平板扩散实验对该正交性进行可视化。在琼脂平板上将十种信号接收器菌落置于一种信号发送器菌落四周。当发送器合成的信号分子被接收器识别并传感时，能够激活报告子sfGFP的表达。可借助多通道荧光成像仪观测报告子是否表达GFP荧光。如图3d所示，各信号发送元件均能特异性激活对应的信号接收元件中的诱导型启动子。当存在信号串扰时，多于一个接收器细胞表达GFP(例如，发送器2同时激活接收器1和2)。该结果与液体培养基中的结果(图3b) 一致。

对于启动子水平的串扰，我们将十种别构转录因子与十种诱导型启动子-报告子基因盒两两配对转化入同一细胞，得到100种杂合接收器(图3e)。通过在培养基中外加与别构转录因子对应的信号分子，检测这些别构转录因子是否还会响应于其它信号分子而激活诱导型启动子，进而表达下游报告子。如图3f所示，本发明构建的六种通讯系统在启动子水平存在良好的正交性(最高2倍、平均1.7倍的非特异性诱导)，而传统的脂肪酸AHL信号系统大都存在严重串扰(最高377倍、平均67.3倍非特异性诱导)。此外，如图3f所示，RpaR 和LuxR均能结合彼此的应答性启动子，因此RpaR-P_rpa*和LuxR-P_lux*不能存在于基因线路中的同一细胞。然而在细胞间信号通讯中，当将这两种信号的接收元件置于不同细胞，可容易地避免这一问题。

跨物种细胞间通讯系统

为对本发明的细胞间通讯系统的转用性进行验证，我们将本发明的细胞间通讯系统从大肠杆菌转用至其它模式生物细胞，例如酿酒酵母细胞和人细胞系。作为人细胞间通讯的示例，将pC-RpaR系统的发送和接收元件分别转化至HEK-293T细胞。对于接收元件，将VTR3 激活结构域[18]融合到RpaR作为别构转录因子，并将两个RpaR操纵位点置于最小CMV启动子的上游来构建P_rpaO-CMV1启动子。结果表明，由HEK-293T发送器合成的pC信号对 HEK-293T接收器中R_paO-CMV1启动子激活的动态范围为10(图2b)。如图2b所示，发明人还构建了酵母细胞-大肠杆菌、人细胞-大肠杆菌和酵母细胞-酵母细胞通讯系统。在这些系统中，发送器细胞合成的信号分子均成功激活了接收器细胞中的诱导型启动子，这表明本发明系统的模块化和转用性潜力。

空间分布模型的构建

可基于本发明细胞间通讯系统的正交性构建多通道基因线路。就双通道信号线路而言，构建两种菌株，使得第一菌株含有第一信号的发送元件和第二信号的接收元件，第二菌株含有第一信号的接收元件和第二信号的发送元件(图4a)。将两种菌株接种于平板时，由于信号小分子自由扩散，在两个菌落间形成两种信号的浓度梯度，从而这两种菌株可彼此激活。将第一菌株和第二菌株分别以1.5cm的直径接种于平板，如图4b所示，其中七种双通道基因线路(Sal-pC、Sal-DAPG、Sal-IV、Sal-3OC6、pC-3OC6、DAPG-IV以及3OC6-IV)形成明显的菌落内荧光梯度，而三种(pC-DAPG、pC-IV和3OC6-DAPG)梯度不明显。

基于同样的原理，我们利用pC-Sal-DAPG和3OC6-Sal-DAPG信号系统构建了两种三通道的发送-接收线路，并利用pC-Sal-DAPG-3OC6构建了四通道发送-接收线路，成功实现三角形或四边形激活功能(图4c-d)。

复杂逻辑门的构建

如图5a所示，我们构建了包含3个输入的XOR+AND逻辑门基因线路。该基因线路使用四种正交信号系统，由七种大肠杆菌菌落执行计算节点的功能。首先按照如[19]所述的方式对具有NOR门(细胞1和细胞6)或同向器(细胞7)的菌株进行空间排布。上游的前三个NOR门(细胞1、细胞2和细胞3)组合为AND门，另外的三个NOR门(细胞4、细胞 5和细胞6)以及同向器(细胞7)组成XOR门线路[19]。各NOR门配置为由响应上游输入信号的启动子控制lambda型阻遏蛋白CI的表达，并由lambda启动子(Pr)控制下游gfp 基因和另一信号的发送元件[19]。将构建的AND门或NOR门的各节点菌株以执行XOR或 AND功能的空间分布方式接种于琼脂平板，二者均成功地执行了其逻辑运算功能并给出正确输出值。随后将二者进行组合(图5)，将七种节点菌株接种于琼脂平板来执行逻辑运算。该基因线路不仅最终输出与真值表完全相同，各中间节点均给出正确的计算结果。这是首次成功构建同时具有四通道的多细胞逻辑线路。

方法

微生物菌株和培养条件

作为宿主的大肠杆菌(Escherichia coli)为DH5α菌株(fhuA2 lac(del)U169phoA glnV44 Φ80′lacZ(del)M15 gyrA96 recA1 relA1 endA1 thi-1hsdR17)，购自北京全式金生物技术有限公司(货号：CD201-02)；酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为WP125菌株(W303 MATa rtTA far1Δhis3 trp1 leu2 ura3)，构建自酿酒酵母W303菌株。W303菌株购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)。对于大肠杆菌，在37℃、96孔板中利用LB培养基或M9 基础培养基进行震荡培养(1000rpm)。所述M9基础培养基含有6.8g/L Na₂HPO₄、3g/L KH₂PO₄、0.5g/L NaCl、1g/L NH₄Cl、2mM MgSO₄、100μM CaCl₂、0.4％葡萄糖、0.2％酪蛋白氨基酸、340mg/L硫胺素(维生素B1)。对于酵母细胞，在500mL培养瓶中加入50mL YPD 培养基，在30℃下进行振荡培养(225rpm)。所述YPD培养基含有1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖。

如无特别说明，全部培养基以如下的浓度加入抗生素：100μg/ml氨苄青霉素、50μg/ml 卡那霉素和/或25μg/ml氯霉素。对于P_tac启动子，培养基中添加0.1mM或1mM异丙基-β-D- 硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导。对于P_tet启动子时，培养基中添加200ng/ml脱水四环素(aTc)进行诱导。

大肠杆菌发送元件和接收元件的构建

大肠杆菌菌株全部基于大肠杆菌DH5α菌株构建，使用RGP和PTP系列质粒(序列分别为CN107344962A中SEQ ID NO：31以及SEQ ID NO：33)进行程序化组装。该RGP质粒整合有p15A复制起始位点和AmpR，其中AmpR上的BsaI位点已被突变消除；两个BsaI 位点位于lacZα片段的侧翼，从而在消化后从质粒上移除识别位点。此外，RGP质粒第2306 至2361碱基为P_tac启动子以及RBS；第1091至2173碱基为LacI的CDS。借助Golden Gate 克隆方法，可以将LacZα片段替换为任意基因，从而构建RGP系列质粒。具体而言，对于构建用于接收器中表达aTF(调控蛋白基因)的质粒，将LacZα片段(第2444至2565碱基) 替换为各调控蛋白基因编码序列。所述调控蛋白序列在表2中给出。各编码序列为对表2中相应aTF编码序列化学合成获得。就发送器质粒的构建而言，用各生物合成基因表达盒替换 LacZα片段。其中，各生物合成完整通路所需的酶如表1和表2所示。生物合成通路中酶的各编码序列为对表1中菌株基因组相应序列扩增或对表2中的编码序列化学合成获得。需要说明的是，实验中phlA片段为直接扩增自荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)2p24菌株phlACBD基因簇[35]，bdkFGH片段为来自阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)MA-4680 菌株[10]。经测序，扩增获得的phlA、bdkF以及bdkG片段序列分别为SEQ ID NO：31-SEQ ID NO：33，与NCBI蛋白库给出的序列有微小差别。本领域技术人员理解的是，该小于1％的不一致性可能来自于细菌个体差别。就启动子而言，构建了由组成型的J23110、J23111、 J23119(iGEM parts registry)、PA1或PN25启动子控制的生物合成基因表达盒，以及由诱导型启动子P_tet启动子或P_new启动子控制的生物合成基因表达盒。由P_tet启动子控制的表达盒中还含有TetR阻遏蛋白表达盒(启动子为J23101，iGEM part registry)。TetR基因序列如文献[29]所述。由P_new启动子控制的表达盒中还含有CymR阻遏蛋白表达盒(启动子为J23106，iGEM part registry)。CymR基因序列为CN107344962A的SEQ ID NO：10。同一表达盒中的基因之间还可任选包含20-40bp的RBS(核糖体结合位点)作为间隔。

PTP质粒整合有pSC101复制起始位点和CmR。此外，PTP同样具有位于lacZα片段的侧翼的两个BsaI位点，能够通过Golden Gate克隆方法插入任意启动子以替代lacZα片段，表达报告基因sfGFP(sfGFP编码序列如CN107344962A所述)。各启动子DNA片段通过化学合成制备。就接收器细胞而言，用诱导型启动子替代lacZα片段。所述诱导型启动子的序列为表4中SEQ ID NO：1-22以及SEQ ID NO：53-55。就发送器而言，将PTP质粒质粒上的sfGFP编码序列替换为mRFP1基因(iGEM part：BBa_J04450)，并用J23119启动子(SEQ ID NO：27)替换lacZα片段，来标记发送器。实施例涉及的全部启动子在表4中给出。

发送器菌株由一个带有生物合成基因表达盒的RGP质粒和一个带有mRFP1基因的PTP 质粒共转化得到，具有氨苄青霉素和氯霉素抗性；接收器菌株由一个带有调控蛋白基因表达盒的RGP质粒和一个带有sfGFP报告基因的PTP质粒共转化得到，同样具有氨苄青霉素和氯霉素抗性。在发送器和接收器细胞中RGP和PTP质粒可以共存。另外由于抗性相同，能够对发送器细胞和接收器细胞进行共培养。

表4实施例涉及的启动子

空间分布模型和复杂逻辑门菌株构建

就复杂逻辑门而言，细胞4-6各含有一个接收输入的PTP系列质粒和一个进行输出的 RGP系列质粒，其中PTP系列质粒的抗性基因被修改为卡那霉素抗性。通过Golden gate方法将各PTP系列质粒上的LacZα替换为两种调控蛋白的表达盒以及响应于两种上游信号的诱导型启动子，并将质粒上的sfGFP替换为lambda型阻遏蛋白CI(SEQ ID NO：52)编码序列。如图5所示，对于细胞4-6而言，上游信号分别为Ara+Sal、Ara+pC、pC+Sal，所述响应于两种上游信号的诱导型启动子为将响应于各信号的启动子串联而成。响应于阿拉伯糖的启动子为P_bad(SEQ ID NO：57)，其调控蛋白为AraC(SEQ ID NO：58)。另一方面，RGP 系列质粒上的LacZα被替换为一个由Pr启动子控制的下游生物合成基因和sfGFP报告子表达的表达盒。其中，Pr启动子(SEQ ID NO：51)受CI蛋白调控。即，每一个NOR门的输入信号取决于串联启动子上的两种启动子响应的小分子信号类型，输出信号决定于Pr启动子控制的发送元件合成的小分子信号类型。就细胞1-3而言，通过Golden gate方法将各PTP 系列质粒上的LacZα替换为调控蛋白的表达盒以及响应于一种输入信号的诱导型启动子，并将质粒上的sfGFP替换为lambda型阻遏蛋白CI编码序列。对于RGP系列质粒的改造方式与上述相同。全部输入信号和输出信号如图5所述。此外，细胞7即为DAPG接收器。

就空间分布模型而言，通过Golden gate方法将各PTP系列质粒上的LacZα替换为与上游信号对应的调控蛋白的表达盒以及响应于上游输入信号的诱导型启动子，并将RGP系列质粒上的LacZα替换为下游生物合成基因的表达盒，来接收上游信号并输出下游信号，各信号在图4中标出。

酿酒酵母发送元件和接收元件的构建

酿酒酵母WP125菌株[5]基因组上整合有rtTA编码序列，其表达产物可以有效抑制P_tet07启动子表达，可使用aTc对P_tet07进行诱导。此外，WP125菌株基因组整合有his3、trp1、leu2、 ura3突变基因，可以使用组氨酸、色氨酸、亮氨酸、尿嘧啶进行营养缺陷筛选。发送器和接收器质粒分别基于酵母pNH603[5]和pNH604[5]质粒构建，二者分别带有his3基因和trp1基因的5’UTR和3’UTR，以及AmpR。

对于DAPG接收器，通过将PhlF操纵序列与酿酒酵母P_gal启动子组合，设计了DAPG诱导型启动子。已知P_gal启动子(也称为P_gal1-10启动子)分别驱动P_gal10和P_gal1端的上游和下游的基因表达(addgene质粒pJH131(#48260)，[36])。因此，我们在P_gal1启动子的TATA 框和转录起始位点间插入两个PhlF操纵序列，设计了P_phlF-Y启动子。同时，由P_Gal10启动子驱动PhlF融合蛋白的表达，实现超敏应答。具体而言，借助Gibson assembly方法在pSB1K3 质粒(iGEM part registry)Biobrick区域的XbaI和SpeI酶切位点之间完成以下组装：将phlF基因(AAF20928.1)组装到P_gal1-10启动子(SEQ ID NO：56)的P_gal10端，将yEGFP报告基因组装到另一端的P_phlF-Y启动子(SEQ ID NO：30)之后，并在phlF基因和yEGFP基因的末尾组装Tadh1终止子。所述Tadh1终止子为来自白色假丝酵母(Candida albicans)菌株 SC5314-P0染色体5A(CP025154.1)1108749～1109443bp区段[5]。完成以上组装后，将XbaI 和SpeI酶切位点之间的片段通过Gibson assembly转移到pNH603质粒的his3基因的5’UTR 和3’UTR之间，获得酵母DAPG接收器质粒。最后，将该质粒转化到酵母W125菌株 (CN105624146A)，借助组氨酸营养缺陷筛选接收器菌株。结果显示，在培养基中含有2％半乳糖的情况下，无DAPG诱导时P_phlF-Y启动子的活性被PhlF紧密抑制。合成的DAPG小分子以及大肠杆菌DAPG发送器均可激活酿酒酵母DAPG接收器(图2b)。

对于Sal发送器，借助Gibson assembly方法在pSB1K3质粒Biobrick区域的XbaI和SpeI 酶切位点之间完成以下3个组装：将pchB基因(AEO73196.1)、pchA基因(WP_003114686.1) 或irp9基因(WP_005168693.1)分别组装到P_tet07启动子(SEQ ID NO：44)之后，然后在上述各基因的末尾组装Tadh1终止子。完成以上组装后，对3个质粒上XbaI和SpeI酶切位点之间的片段分别进行PCR扩增，然后借助Gibson assembly将带有pchB基因或irp9基因的片段连接到pNH603质粒his3基因的5’UTR和3’UTR之间，将带有pchA基因的片段连接到pNH604质粒trp1基因的5’UTR和3’UTR之间，完成3个发送器质粒构建。最后，将pchB质粒和pchA质粒先后转化进入酵母WP125菌株，并先后使用组氨酸和色氨酸进行营养缺陷筛选，从而获得基因组上带有P_tet07控制表达的pchB和pchA基因的发送器菌株。另外，单独将irp9质粒转化进入WP125菌株，使用组氨酸营养缺陷筛选基因组上带有P_tet07控制表达的irp9的酵母发送器菌株。在对两种菌株培养约4天后收集培养液，与大肠杆菌 Sal接收器共同孵育。结果显示大肠杆菌接收器能够被两种酿酒酵母Sal发送器分别激活(图 2b)。

哺乳动物基因、细胞培养、转化和稳定细胞系产生

在以人细胞为宿主的实施方式中，我们以人胚胎肾细胞系HEK-293T作为宿主，构建了 pC通讯系统的信号发送元件和信号接收元件。就pC发送器而言，将tal、4cl和rpaI与报告基因分别插入至两个慢病毒载体，并通过慢病毒转染和荧光分选筛选出稳定细胞系。具体而言，哺乳动物pC发送器的两个质粒均基于慢病毒质粒pHAGE-EF1aL-hAAT-W(addgene #24527)构建。通过Gibson assembly，将本发明大肠杆菌pC发送器的4cl基因与mTourquoise2[37]报告基因通过P2A短肽(SEQ ID NO：49)相连，插入 pHAGE-EF1aL-hAAT-W质粒，替换其中的hAAT基因，构建第一发送器质粒。将本发明大肠杆菌pC发送器的rpaI基因、tal基因与iRFP报告基因通过P2A和T2A(SEQ ID NO：50) 短肽相连，插入pHAGE-EF1aL-hAAT-W质粒，替换其中的hAAT基因，构建第二发送器质粒。慢病毒载体pHAGE-EF1aL-hAAT-W已包含组成型表达的pEF1α启动子，从而能表达全部插入的基因。

在37℃、100％湿度和5％CO₂的培养条件下，将人胚胎肾细胞系293T(HEK-293T，ATCC：CRL-11268)接种于高葡萄糖的DMEM完全培养基(Gibco，添加有4.5g/L葡萄糖、 10％FBS(Life-Technologies)和0.045单位/ml盘尼西林)进行培养。在6孔板的各孔中接种8.5×10⁵个细胞(2ml培养基)培养1天后，利用第一和第二发送器质粒对宿主细胞进行共转染，所述发送器质粒为按照Lentiviral production(addgene)方法制备并溶于1ml培养基(https://www.addgene.org/protocols/lentivirus-production/)。培养48小时后将各孔中的细胞富集至1mL新鲜培养基，并利用BD FACSAria IIIu流式细胞仪(BD Biosciences)检测lexa Fluor 700和BV421通道荧光(iRFP和mTourquoise2)，收集双阳性细胞作为稳定表达细胞系，即pC发送器细胞系。

就pC接收器而言，首先将别构转录因子RpaR与VTR3激活结构域融合来构建真核转录激活因子[18]，所述VTR3是衍生自VPR(VP64-P65-rta)[32]的激活结构域。该VTR3-RpaR能够与RpaR操纵序列结合从而识别pC信号。通过将两个RpaR操纵序列分别插入至 miniCMV[33]或TRE3G核心启动子的上游，获得P_rpaO-CMV1(SEQ ID NO：45)以及P_rpaO-TRE3G启动子(SEQID NO：46)；并在下游分别连接Citrine黄色荧光蛋白编码序列作为报告基因。该包含VTR3-RpaR激活蛋白以及P_rpaO-CMV1或P_rpaO-TRE3G启动子-报告基因的质粒还组成型表达mCherry红色荧光蛋白，以便对质粒转染进行内部监控。具体而言，基于pcDNA3.1(+) 质粒(Invitrogen，catalog#V790-20)构建哺乳动物pC接收器质粒。利用Gibson assembly 按照以下顺序将各元件组装到该质粒上：P_rpaO-CMV1启动子或P_rpaO-TRE3G启动子；Citrine报告基因[39]；hEF1α启动子(来自人克隆RP11-505P4 6号染色体DNA(NCBI登录号AL603910.6) 的114743-113562bp区段)；VRT3-RpaR调控蛋白编码序列(SEQ ID NO：47)；EF1启动子 (SEQID NO：48)；mCherry报告基因[40]。其中，每个蛋白编码序列之后都带有poly(A) 序列。获得两个分别带有P_rpaO-CMV1启动子或P_rpaO-TRE3G启动子的接收器质粒。

利用优化的聚乙烯亚胺(1mg/ml PEI“max”，Polysciences，德国)实施瞬时转染。将约1.5×10⁵个293T细胞接种于12孔板培养1天。随后，制备转染混合物，使得200μl转染混合物含有1.6μg质粒、4.8μl PEI试剂和余量的无血清DMEM。将转染混合物加入各孔中孵育约10分钟，然后逐滴加入到培养有293T细胞的12孔板中。转染3小时后，将培养基替换为带有不同浓度化学合成pC的新鲜DMEM完全培养基。再培养48小时后收集细胞，用流式细胞仪测试细胞的荧光值。由化学合成的pC对包含P_rpaO-CMV1启动子以及包含 P_rpaO-TRE3G启动子的接收器细胞进行诱导的动态范围分别为48和238。

为检测293T细胞间的通讯，在对稳定的发送器细胞系进行培养48小时后收集无细胞培养液，同时将接收器质粒瞬时转入293T细胞，在转染后3小时将等量的接收器细胞与新收集的发送器培养液共同孵育。对接收器细胞培养48小时后离心并于PBS缓冲液中重悬，利用流式细胞术对群体的黄色和红色荧光进行分析。考虑到接收器质粒为瞬时转染，将黄色荧光和红色荧光的比例定义为读出值。利用Matlab软件对流式细胞术数据进行分析。如图2b 所示，含有P_rpaO-CMV1或P_rpaO-TRE3G启动子的293T接收器细胞均能够被由293T发送器细胞合成的pC信号分子激活。

利用化学合成的小分子进行诱导

对于微生物细胞，利用LB培养基(大肠杆菌)或YPD培养基(酵母)将过夜培养的接收器细胞稀释200倍。培养3小时后，在混合有相应信号分子的M9培养基(大肠杆菌) 或LB培养基(酵母)中将培养物再次稀释200倍，反应12小时(大肠杆菌)或24小时(酵母)后利用流式细胞术对荧光进行测量。

对于人细胞，如上所述对接收器质粒进行瞬时转染3小时后加入含有信号分子的新鲜培养基，培养48小时后收集细胞并进行荧光分析。

信号通讯

利用发送器细胞上清液激活：对于大肠杆菌发送器细胞，在M9培养基(对于P_tet系列启动子，补充有200ng/ml aTc)中对发送器细胞过夜培养12小时。对于酵母发送器细胞，在含有50ml YPD培养基的500ml培养瓶中对发送器细胞培养96小时(对于P_tet系列启动子，补充有200ng/ml aTc)，并在24h、48h、和72h分别向培养瓶中补充5ml 20％葡萄糖。对于人细胞系发送器细胞，在10cm平皿上对293T发送器细胞培养48h，培养基为补充有0.5g/L 酪氨酸的DMEM完全培养基。培养结束后收集无细胞培养液(对于微生物细胞，离心后收集)，用0.2μm无菌过滤器对上清液进行过滤，并用等体积的新鲜M9培养基(接收器为大肠杆菌时)、YPD培养基(接收器为酵母时)或DMEM完全培养基(接收器为293T细胞时)稀释。在与接收器培养物混合之前，用相同稀释剂进一步进行2倍或10倍连续稀释。对于293T细胞接收器，在转染后3小时加入稀释后的发送器培养上清液，并将转染剂替换为新鲜培养基。对于酵母和大肠杆菌接收器，将200倍稀释的相应上清液与接收器培养物混合。在进行流式细胞术分析前孵育12小时(大肠杆菌)、24小时(酵母)或48小时(293T 细胞)。

发送器-接收器共培养激活：对于在LB中过夜培养的大肠杆菌发送器和接收器细胞，分别用M9培养基稀释200倍，再次培养3小时。在与接收器细胞等体积混合前，用对照细胞 (仅包含RFP报告子，不带有信号发送元件)对接收器细胞进行2倍或10倍连续稀释。以1:200的比例将发送器-接收器混合物接种于含有抗生素和诱导剂(IPTG或aTc)的新鲜M9培养基中。共培养12小时后收集细胞，借助流式细胞术进行荧光分析。

流式细胞术测定和数据分析

利用带有HTS的BD LSRII流式细胞仪(BD Biosciences)测定全部样本的荧光。使用 FlowJo(TreeStar Inc.)程序对大肠杆菌和酵母细胞数据进行分析，基于单独的发送器细胞 (RFP+)和接收器细胞(RFP-)的红色荧光强度设门。将RFP-群体的平均FITC作为各样品的输出值(图2-图3)。利用Matlab 2018b(The MathWorks Inc.)对293T细胞的流式细胞数据进行分析。用相同细胞中的红色荧光对黄色荧光进行归一化，将黄色荧光和红色荧光的比例定义为各细胞的输出值。对于全部样品，减掉背景自发荧光。本文示出的全部流式细胞数据为至少三次重复的平均值，S.D.为各次测量的标准差。

细胞间通讯系统灵敏度的定量拟合

为了确定各细胞间通讯模块的灵敏度和动态范围，利用如下的希尔方程对实验测得的各发送-接收应答曲线进行拟合。

其中，y是接收器的输出荧光强度，y_min为输出的最小值，y_max为输出的最大值。拟合得到的K为当输出值为半最大值时的输入信号浓度，即EC50理论值。该诱导曲线的动态范围为y_max/y_min。为了计算细胞通讯系统的灵敏度，将流式细胞术测得的发送-接收应答曲线拟合至该希尔方程，并计算EC10和EC90(即，输出荧光为最大值的10％以及90％时的输入)。利用HPLC-MS对发送器细胞生成的信号分子进行定量

在5ml M9培养基中对大肠杆菌发送器细胞过夜培养后离心，收集发送器培养上清液。用0.2μm的无菌过滤器对上清液进行过滤。随后在Biocool FD-1D-80真空冷冻干燥机(Biocool)中冻干至完全干燥，并利用500μl甲醇复溶。利用Agilent Eclipse plus C18反相柱(2.1×100mM，3.5μm)对水杨酸进行定量，利用Phenomenex Synerg Hydro-RP 80A LC柱(2×150mM，4μm，Phenomenex)对其它小分子进行定量。将各柱接入Agilent 1200HPLC 仪(Agilent Technologies)。设定流速0.4ml/min、梯度洗脱模式在25℃对样品中的分子进行分离。移动相A和B分别为8/92乙酸/水以及乙腈。梯度洗脱的条件为：25％的B洗脱 5min，25-100％线性梯度的B洗脱5min，100％的B洗脱3min，100％-25％线性梯度的B洗脱1min，随后25％的B洗脱2min。将流出相导入AB SCIEX Qtrap 4500质谱仪(AB Sciex LLC)，该质谱仪配置有电喷雾电离(ESI)源和多重反应监测(MRM)。对于不同的分子，分别用负电和正电模式对电离源进行操作，具体参数如表5所示。首先利用HPLC-MS方法对一系列浓度梯度的化学合成的小分子进行测定，做出标准曲线，并根据标准曲线计算发送器细胞的信号分子生成量。

表5 HPLC-CMS/MRM参数

调控蛋白的定向进化

基于P_phlF启动子的激活机制，我们认为DAPG接收器的灵敏度较低与PhlF阻遏蛋白相关。P_phlF启动子可被PhlF阻抑蛋白有效抑制，但显然PhlF从DNA解离所需的DAPG量非常高。而NahR是转录激活蛋白，也是别构转录因子。因此，我们认为能够通过对这些调控因子的序列进行突变来进一步改进DAPG和NG应答的灵敏度。

在实验中，通过对完整蛋白序列进行定向进化来优化调控因子。首先通过易错PCR创建PhlF和NahR全序列文库。对于PTP质粒，利用Golden gate方法[34]在LacZα的上游插入J23111启动子调控的PhlF或NahR突变文库片段，并将LacZα替换为诱导型启动子P_phlF或P_sal，从而能够由J23111启动子控制突变体的表达，并由该转录调控蛋白相应的启动子控制报告子sfGFP的表达。将这些带有突变文库的质粒转化至大肠杆菌。在LB培养基中培养16h后在M9培养基中稀释，并再次培养4-6h。利用流式细胞术对荧光信号进行负选择。对于经负选择的克隆，再次在LB培养基中培养16h后在补充有诱导物的M9培养基中培养，借助流式细胞术选出比野生型荧光强度更强的克隆。随后实施三轮培养-正选择，每轮培养中将诱导物浓度降低50％(即，三轮培养中诱导物浓度分别为最初的50％、25％和12.5％)，并选出荧光强度与原始诱导物浓度下野生型荧光强度相当或荧光强度更强的突变体。对于每轮选出的突变体，借助流式细胞术对灵敏度进行测定。

平板扩散实验

利用补充有全部M9成分、诱导剂IPTG和aTc的LB培养基作为实验用琼脂平板。各菌株在LB培养基中过夜培养16h，随后利用新鲜LB培养基稀释500倍(正交实验)或10 倍(多通道基因线路实验)。可根据其生长和信号分子合成速度对稀释倍数进行适应性调整。随后将1μl(正交实验)或30μl(多通道基因线路实验)菌液接种至平板，形成直径0.5cm (正交实验)或1.5cm(多通道基因线路实验)的菌落。在37℃培养24小时，并利用多通道荧光成像仪拍摄明场和荧光图像。

AND-XOR逻辑线路

利用补充有全部M9成分、三种诱导剂(10mM阿拉伯糖、100ng/ml aTc、0.1M异丙基苯甲酸(cumate))的LB培养基作为实验用琼脂平板。各菌株在LB培养基中过夜培养16h，随后利用新鲜LB培养基稀释100倍，再次培养6-8h至OD600达到0.6-0.8。可根据其生长和信号分子合成速度对稀释倍数进行适应性调整。随后将3μl菌液接种至平板，形成直径 0.5cm的菌落，将各菌落排布为等边三角形或四边形，各菌落间的距离为10mm。接种后在 37℃培养12小时，并利用多通道荧光成像仪拍摄明场和荧光图像。最后用枪头刮取全部菌株，在1ml PBS(含有2mg/ml卡那霉素)中稀释，进行流式细胞分析。

IV的化学合成

根据式I合成IV。在0℃将L-高丝氨酸内酯氢溴酸盐(50mg)溶于3mL CH₂Cl₂(DCM)，然后加入Et₃N(70mg)。将混合物搅拌混合30分钟后，在5分钟的时长内滴加异戊酰氯(40mg)。使反应混合物升温至室温，并将溶液搅拌4小时。随后减压浓缩并在乙酸乙酯中溶解，并依次用1M碳酸氢钠溶液、1M硫酸氢钾钠和饱和氯化钠溶液萃取。用无水硫酸钠干燥后，通过旋转蒸发除去溶剂，并借助硅胶柱色谱法纯化粗产物，得到异戊酰基高丝氨酸内酯(45mg)，收率约88％。

参考文献

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SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 细胞间通讯系统的人工设计与应用

<160> 58

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 65

<212> DNA

<213> 日本慢生根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum）

<400> 1

tactgggaaa tttcccaata tcgaacctgc ctcttttcgc agaggctgcc ccccattgag 60

gctga 65

<210> 2

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 2

tactgggaaa tttcccaatt ttacgcaaga aaatggtttg ttactttcga ataaa 55

<210> 3

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 3

tttacgctgg gaaatttccc aatactttcg aataaatact gggaaatttc ccaata 56

<210> 4

<211> 69

<212> DNA

<213> 池沼红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris）

<400> 4

acctgtccga tcggacagta gttaggttcc cgttcgcacc tgcactgttc ccgcctgcag 60

acccactgc 69

<210> 5

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 5

acctgtccga tcggacagtt ttacgcaaga aaatggtttg ttactttcga ataaa 55

<210> 6

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 6

acctgtccga tcggacagta gttaggttcc cgttcgcacc tgcactactt tcgcctgcag 60

acccactgc 69

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 7

ttgacaaacc ttcgggaagg tatgatactc gaatag 36

<210> 8

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 8

ttgacaaacc ttcgggaagg tctgatactc gaatag 36

<210> 9

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 9

ttgacaaacc ttcgggaagg tgtgatactc gaatag 36

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 10

ttgacatacc ttcgggaagg tatgatactc gaatag 36

<210> 11

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 11

ttgacatacc ttcgggaagg tttgatactc gaatag 36

<210> 12

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 12

ttgacacacc ttcgggaagg tatgatactc gaatag 36

<210> 13

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 13

ttgacacacc ttcgggaagg tttgatactc gaatag 36

<210> 14

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 14

ttgacacacc ttcgggaagg tctgatactc gaatag 36

<210> 15

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 15

ttgacagacc ttcgggaagg tatgatactc gaatag 36

<210> 16

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 16

ttgacagacc ttcgggaagg tttgatactc gaatag 36

<210> 17

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 17

ttgacagacc ttcgggaagg tctgatactc gaatag 36

<210> 18

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 18

ttgacagacc ttcgggaagg tgtgatactc gaatag 36

<210> 19

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 19

accctgtaag agttaccagt ttacgcaaga aaatggtttg ttactttcga ataaa 55

<210> 20

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 20

acctgtagga tcgtacaggt ttacgcaaga aaatggtttg ttactttcga ataaa 55

<210> 21

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 21

tcctgtgaaa tctggcagtt ttacgcaaga aaatggtttg ttactttcga ataaa 55

<210> 22

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 22

aactagcaaa tgagatagat ttacgcaaga aaatggtttg ttactttcga ataaa 55

<210> 23

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 23

tccctatcag tgatagagat tgacatccct atcagtgata gagataatga gcac 54

<210> 24

<211> 88

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 24

aaatcataaa aaatttattt gctttgtggc ggataacaat tataatagat tcaacaaaca 60

gacaatctgg tctgtttgta tttactag 88

<210> 25

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 25

tttacggcta gctcagtcct aggtacaatg ctagc 35

<210> 26

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 26

ttgacggcta gctcagtcct aggtatagtg ctagc 35

<210> 27

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 27

ttgacagcta gctcagtcct aggtataata ctagt 35

<210> 28

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 28

ttatcaaaaa gagtattgac ttaaagtcta acctatagga tacttacagc catcgagagg 60

gacacggcga 70

<210> 29

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 29

tcataaaaaa tttatttgct ttcaggaaaa tttttctgta taatagattc ataaatttga 60

gagaggagtt 70

<210> 30

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 30

tataaatgca aaaactgatg atacgaaacg taccgtatcg ttaaggtgat gatacgaaac 60

gtaccgtatc gttaaggtaa taaaagtatc aacaaaaaat 100

<210> 31

<211> 360

<212> PRT

<213> 荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）

<400> 31

Met Asn Lys Val Gly Ile Val Ser Tyr Gly Ala Gly Ile Pro Val Cys

1 5 10 15

Arg Leu Lys Val Asp Asp Val Ile Gln Val Trp Lys Asn Thr Asp Leu

20 25 30

Ser Leu Val Lys Gly Gln Leu Gly Val Ile Glu Arg Ala Val Leu Gln

35 40 45

Pro Asp Glu Asp Val Ile Thr Leu Gly Val Leu Ala Ala Gln Arg Ala

50 55 60

Leu Asp Lys Ala Pro Pro Cys Ser Leu Glu Ala Leu Tyr Leu Gly Thr

65 70 75 80

Cys Thr Asn Pro Tyr Asp Ser Arg Ala Ser Ala Ala Ile Ile Leu Glu

85 90 95

Met Leu Gly Cys Gly Tyr Asp Ala Phe Cys Ala Asp Val Gln Phe Ala

100 105 110

Gly Lys Ser Gly Thr Ser Ala Leu Gln Ile Ala Tyr Ala Leu Val Ala

115 120 125

Ser Gly Met Val Gly Asn Ala Leu Ala Val Gly Ala Asp Thr Ile Asn

130 135 140

Arg Asn Thr Ala Pro Gly Asp Leu Thr Glu Ser Tyr Ala Gly Ala Gly

145 150 155 160

Ala Ala Ala Leu Leu Leu Gly Thr Glu Asn Val Ile Ala His Phe Asp

165 170 175

Ala Ser Phe Ser Cys Ala Ala Asp Val Ala Asp Asn Ile Arg Pro Gln

180 185 190

Gly Asp Arg Tyr Ile Arg Ser Gly Met Gly Leu Gly Ser Asp Lys Asn

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Ser Ile Gly Leu Glu Asp Gln Thr Arg Arg Ala Ala Ser Gly Leu Met

210 215 220

Ala Lys Ile His Ala Gln Ala Asp Asp Phe Asp Tyr Val Val Phe Gln

225 230 235 240

Gln Asn Leu Val Ser Thr Pro Tyr Ser Leu Gly Lys His Leu Gly Phe

245 250 255

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260 265 270

Ala Gly Ala Ala Ser Pro Leu Leu Gly Leu Val Asn Val Leu Asp Gln

275 280 285

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290 295 300

Gly Ser Asp Ala Ile Ala Leu Thr Val Thr Asp Ala Ile Glu Ala Tyr

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Gln Lys Thr Asn Val Pro Leu Arg Thr Gln Leu Glu Asp Lys Tyr Tyr

325 330 335

Val Asp Tyr Gly Thr Ser Ile Lys Tyr Glu Phe Lys Tyr Leu Arg Pro

340 345 350

Asp Tyr Ala Leu Thr Ala Tyr Leu

355 360

<210> 32

<211> 407

<212> PRT

<213> 阿维链霉菌（Streptomyces avermitilis）

<400> 32

Met Arg Arg Thr Val Glu Ser Thr Ala Ala Arg Lys Pro Arg Arg Ser

1 5 10 15

Ala Gly Thr Lys Ser Ala Ala Ala Lys Arg Thr Ser Pro Gly Ala Lys

20 25 30

Lys Ser Pro Ser Thr Thr Gly Ala Glu His Glu Leu Ile Gln Leu Leu

35 40 45

Thr Pro Asp Gly Arg Arg Val Lys Asn Pro Glu Tyr Asp Ala Tyr Val

50 55 60

Ala Asp Ile Thr Pro Glu Glu Leu Arg Gly Leu Tyr Arg Asp Met Val

65 70 75 80

Leu Ser Arg Arg Phe Asp Ala Glu Ala Thr Ser Leu Gln Arg Gln Gly

85 90 95

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100 105 110

Gly Ser Gly Arg Ala Thr Arg Asp Asp Asp Tyr Val Phe Pro Thr Tyr

115 120 125

Arg Glu His Gly Val Ala Trp Cys Arg Gly Val Asp Pro Thr Asn Leu

130 135 140

Leu Gly Met Phe Arg Gly Val Asn Asn Gly Gly Trp Asp Pro Asn Ser

145 150 155 160

Asn Asn Phe His Leu Tyr Thr Ile Val Ile Gly Ser Gln Thr Leu His

165 170 175

Ala Thr Gly Tyr Ala Met Gly Ile Ala Lys Asp Gly Ala Asp Ser Ala

180 185 190

Val Ile Ala Tyr Phe Gly Asp Gly Ala Ser Ser Gln Gly Asp Val Ala

195 200 205

Glu Ser Phe Thr Phe Ser Ala Val Tyr Asn Ala Pro Val Val Phe Phe

210 215 220

Cys Gln Asn Asn Gln Trp Ala Ile Ser Glu Pro Thr Glu Lys Gln Thr

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Arg Val Pro Leu Tyr Gln Arg Ala Gln Gly Tyr Gly Phe Pro Gly Val

245 250 255

Arg Val Asp Gly Asn Asp Val Leu Ala Cys Leu Ala Val Thr Lys Trp

260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

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Leu Arg Leu Arg Thr Tyr Leu Glu Ala Ser Asn His Ala Asp Glu Gly

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Gln Phe Ala Ala Tyr Gln Ala Ser Phe Thr Thr Glu Pro Asp Gly Gly

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Ser Ala Ala Gly Gln Gly Gly

405

<210> 33

<211> 325

<212> PRT

<213> 阿维链霉菌（Streptomyces avermitilis）

<400> 33

Met Ala Glu Lys Met Ala Ile Ala Lys Ala Ile Asn Glu Ser Leu Arg

1 5 10 15

Lys Ala Leu Glu Ser Asp Pro Lys Val Leu Ile Met Gly Glu Asp Val

20 25 30

Gly Lys Leu Gly Gly Val Phe Arg Val Thr Asp Gly Leu Gln Lys Asp

35 40 45

Phe Gly Glu Glu Arg Val Ile Asp Thr Pro Leu Ala Glu Ser Gly Ile

50 55 60

Val Gly Thr Ala Ile Gly Leu Ala Leu Arg Gly Tyr Arg Pro Val Val

65 70 75 80

Glu Ile Gln Phe Asp Gly Phe Val Phe Pro Ala Tyr Asp Gln Ile Val

85 90 95

Thr Gln Leu Ala Lys Met His Ala Arg Ala Leu Gly Lys Ile Lys Leu

100 105 110

Pro Val Val Val His Ile Pro Tyr Gly Gly Gly Ile Gly Ala Val Glu

115 120 125

His His Ser Glu Ser Pro Glu Ala Leu Phe Ala His Val Ala Gly Leu

130 135 140

Lys Val Val Ser Pro Ser Asn Ala Leu Asp Ala Tyr Trp Met Met Gln

145 150 155 160

Gln Ala Ile Gln Ser Asp Asp Pro Val Ile Phe Phe Glu Ser Lys Arg

165 170 175

Arg Tyr Trp Asp Lys Gly Glu Val Asn Val Glu Ala Ile Pro Asp Pro

180 185 190

Leu His Lys Ala Arg Val Val Arg Glu Gly Thr Asp Leu Thr Leu Ala

195 200 205

Ala Tyr Gly Pro Met Val Lys Val Cys Gln Glu Ala Ala Ala Ala Ala

210 215 220

Glu Glu Glu Gly Lys Ser Leu Glu Val Val Asp Leu Arg Ser Met Ser

225 230 235 240

Pro Ile Asp Phe Asp Ala Val Gln Ala Ser Val Glu Lys Thr Arg Arg

245 250 255

Leu Val Val Val His Glu Ala Pro Val Phe Leu Gly Thr Gly Ala Glu

260 265 270

Ile Ala Ala Arg Ile Thr Glu Arg Cys Phe Tyr His Leu Glu Ala Pro

275 280 285

Val Leu Arg Val Gly Gly Tyr His Ala Pro Tyr Pro Pro Ala Arg Leu

290 295 300

Glu Glu Glu Tyr Leu Pro Gly Leu Asp Arg Val Leu Asp Ala Val Asp

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Arg Ser Leu Ala Tyr

325

<210> 34

<211> 30

<212> DNA

<213> 荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）

<400> 34

atgatacgaa acgtaccgta tcgttaaggt 30

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 池沼红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris）

<400> 35

acctgtccga tcggacagtt 20

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 日本慢生根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum）

<400> 36

tactgggaaa tttcccaatt 20

<210> 37

<211> 32

<212> DNA

<213> 恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）

<400> 37

cgcaatattc atgttgatga tttattatat at 32

<210> 38

<211> 18

<212> DNA

<213> 天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）

<400> 38

ataccttcgg gaaggtat 18

<210> 39

<211> 61

<212> DNA

<213> Herbaspirillum seropedicae

<400> 39

tggtcaatgt attgatgccg tccatatcat gaatcaaaac aatccatttg atcaatatca 60

a 61

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）

<400> 40

tcctgtgaaa tctggcagtt 20

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> 费氏弧菌（Vibrio fischeri）

<400> 41

acctgtagga tcgtacaggt 20

<210> 42

<211> 22

<212> DNA

<213> 洋葱伯克氏菌（Burkholderia cenocepacia）

<400> 42

accctgtaag agttaccagt tt 22

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）

<400> 43

aactagcaaa tgagatagat 20

<210> 44

<211> 727

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 44

taattcgcgc cacttctaaa taagcgaatt tcttatgatt tatgattttt attattaaat 60

aagttataaa aaaaataagt gtatacaaat tttaaagtga ctcttaggtt ttaaaacgaa 120

aattcttgtt cttgagtaac tctttcctgt aggtcaggtt gctttctcag gtatagcatg 180

aggtcgctct tattgaccac acctctaccg gcagatccgc tagggataac agggtaatat 240

agatcaattc ctcgatcgag tttaccactc cctatcagtg atagagaaaa gtgaaagtcg 300

agtttaccac tccctatcag tgatagagaa aagtgaaagt cgagtttacc actccctatc 360

agtgatagag aaaagtgaaa gtcgagttta ccactcccta tcagtgatag agaaaagtga 420

aagtcgagtt taccactccc tatcagtgat agagaaaagt gaaagtcgag tttaccactc 480

cctatcagtg atagagaaaa gtgaaagtcg agtttaccac tccctatcag tgatagagaa 540

aagtgaaagt cgagctcggt accctatggc atgcatgtgc tctgtatgta tataaaactc 600

ttgttttctt cttttctcta aatattcttt ccttatacat taggtccttt gtagcataaa 660

ttactatact tctatagaca cgcaaacaca aatacacaca ctaaattacc cggatcaatt 720

cgggatg 727

<210> 45

<211> 206

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 45

ggtaccacct gtccgatcgg acagttgata tcacctgtcc gatcggacag ttctcgagag 60

ctcggtaccc gggtcgaggt aggcgtgtac ggtgggaggc ctatataagc agagctcgtt 120

tagtgaaccg tcagatcgcc tggagacgcc atccacgctg ttttgacctc catagaagac 180

accgggaccg atccagcctc cgcggc 206

<210> 46

<211> 204

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 46

ggtaccacct gtccgatcgg acagttgata tcacctgtcc gatcggacag ttctcgagag 60

cctcggtacc cgggtcgagg taggcgtgta cggtgggcgc ctataaaagc agagctcgtt 120

tagtgaaccg tcagatcgcc tggagcaatt ccacaacact tttgtcttat accaactttc 180

cgtaccactt cctaccctcg taaa 204

<210> 47

<211> 574

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 47

Met Gly Ser Gly Arg Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met

1 5 10 15

Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser

20 25 30

Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu

35 40 45

Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Ile Asn Ser Ala Leu Leu Gln Leu

50 55 60

Gln Phe Asp Asp Glu Asp Leu Gly Ala Leu Leu Gly Asn Ser Thr Asp

65 70 75 80

Pro Ala Val Phe Thr Asp Leu Ala Ser Val Asp Asn Ser Glu Phe Gln

85 90 95

Gln Leu Leu Asn Gln Gly Ile Pro Val Ala Pro His Thr Thr Glu Pro

100 105 110

Met Leu Met Glu Tyr Pro Glu Ala Ile Thr Arg Leu Val Thr Gly Ala

115 120 125

Gln Arg Pro Pro Asp Pro Ala Pro Ala Pro Leu Gly Ala Pro Gly Leu

130 135 140

Pro Asn Gly Leu Leu Ser Gly Asp Glu Asp Phe Ser Ser Ile Ala Asp

145 150 155 160

Met Asp Phe Ser Ala Leu Leu Ser Gln Ile Ser Ser Gly Ser Gly Ser

165 170 175

Gln Pro Leu Asp Pro Ala Pro Ala Val Thr Pro Glu Ala Ser His Leu

180 185 190

Leu Glu Asp Pro Asp Glu Glu Thr Ser Gln Ala Val Lys Ala Leu Arg

195 200 205

Glu Met Ala Asp Thr Val Ile Pro Gln Lys Glu Glu Ala Ala Ile Cys

210 215 220

Gly Gln Met Asp Leu Ser His Pro Pro Pro Arg Gly His Leu Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Thr Thr Leu Glu Ser Met Thr Glu Asp Leu Asn Leu Asp Ser

245 250 255

Pro Leu Thr Pro Glu Leu Asn Glu Ile Leu Asp Thr Phe Leu Asn Asp

260 265 270

Glu Cys Leu Leu His Ala Met His Ile Ser Thr Gly Leu Ser Ile Phe

275 280 285

Asp Thr Ser Leu Phe Ala Lys Gly Thr Ser Arg Ala Asp Pro Lys Lys

290 295 300

Lys Arg Lys Val Glu Ala Ser Gly Ser Lys Gly Arg Ala Asp Pro Lys

305 310 315 320

Lys Lys Arg Lys Val Glu Ala Ser Gly Ser Gly Arg Ile Val Gly Glu

325 330 335

Asp Gln Leu Trp Gly Arg Arg Ala Leu Glu Phe Val Asp Ser Val Glu

340 345 350

Arg Leu Glu Ala Pro Ala Leu Ile Ser Arg Phe Glu Ser Leu Ile Ala

355 360 365

Ser Cys Gly Phe Thr Ala Tyr Ile Met Ala Gly Leu Pro Ser Arg Asn

370 375 380

Ala Gly Leu Pro Glu Leu Thr Leu Ala Asn Gly Trp Pro Arg Asp Trp

385 390 395 400

Phe Asp Leu Tyr Val Ser Glu Asn Phe Ser Ala Val Asp Pro Val Pro

405 410 415

Arg His Gly Ala Thr Thr Val His Pro Phe Val Trp Ser Asp Ala Pro

420 425 430

Tyr Asp Arg Asp Arg Asp Pro Ala Ala His Arg Val Met Thr Arg Ala

435 440 445

Ala Glu Phe Gly Leu Val Glu Gly Tyr Cys Ile Pro Leu His Tyr Asp

450 455 460

Asp Gly Ser Ala Ala Ile Ser Met Ala Gly Lys Asp Pro Asp Leu Ser

465 470 475 480

Pro Ala Ala Arg Gly Ala Met Gln Leu Val Ser Ile Tyr Ala His Ser

485 490 495

Arg Leu Arg Ala Leu Ser Arg Pro Lys Pro Ile Arg Arg Asn Arg Leu

500 505 510

Thr Pro Arg Glu Cys Glu Ile Leu Gln Trp Ala Ala Gln Gly Lys Thr

515 520 525

Ala Trp Glu Ile Ser Val Ile Leu Cys Ile Thr Glu Arg Thr Val Lys

530 535 540

Phe His Leu Ile Glu Ala Ala Arg Lys Leu Asp Ala Ala Asn Arg Thr

545 550 555 560

Ala Ala Val Ala Lys Ala Leu Thr Leu Gly Leu Ile Arg Leu

565 570

<210> 48

<211> 546

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 48

aaggatctgc gatcgctccg gtgcccgtca gtgggcagag cgcacatcgc ccacagtccc 60

cgagaagttg gggggagggg tcggcaattg aacgggtgcc tagagaaggt ggcgcggggt 120

aaactgggaa agtgatgtcg tgtactggct ccgccttttt cccgagggtg ggggagaacc 180

gtatataagt gcagtagtcg ccgtgaacgt tctttttcgc aacgggtttg ccgccagaac 240

acagctgaag cttcgagggg ctcgcatctc tccttcacgc gcccgccgcc ctacctgagg 300

ccgccatcca cgccggttga gtcgcgttct gccgcctccc gcctgtggtg cctcctgaac 360

tgcgtccgcc gtctaggtaa gtttaaagct caggtcgaga ccgggccttt gtccggcgct 420

cccttggagc ctacctagac tcagccggct ctccacgctt tgcctgaccc tgcttgctca 480

actctacgtc tttgtttcgt tttctgttct gcgccgttac agatccaagc tgtgaccggc 540

gcctac 546

<210> 49

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 49

gcaacaaact tctcactact caaacaagca ggtgacgtgg aggagaatcc cgggcct 57

<210> 50

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 50

gagggcagag gaagtctgct aacatgcggt gacgtcgagg agaatcctgg ccca 54

<210> 51

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 51

taacaccgtg cgtgttgact attttacctc tggcggtgat aatggttgca 50

<210> 52

<211> 237

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 52

Met Ser Thr Lys Lys Lys Pro Leu Thr Gln Glu Gln Leu Glu Asp Ala

1 5 10 15

Arg Arg Leu Lys Ala Ile Tyr Glu Lys Lys Lys Asn Glu Leu Gly Leu

20 25 30

Ser Gln Glu Ser Val Ala Asp Lys Met Gly Met Gly Gln Ser Gly Val

35 40 45

Gly Ala Leu Phe Asn Gly Ile Asn Ala Leu Asn Ala Tyr Asn Ala Ala

50 55 60

Leu Leu Ala Lys Ile Leu Lys Val Ser Val Glu Glu Phe Ser Pro Ser

65 70 75 80

Ile Ala Arg Glu Ile Tyr Glu Met Tyr Glu Ala Val Ser Met Gln Pro

85 90 95

Ser Leu Arg Ser Glu Tyr Glu Tyr Pro Val Phe Ser His Val Gln Ala

100 105 110

Gly Met Phe Ser Pro Glu Leu Arg Thr Phe Thr Lys Gly Asp Ala Glu

115 120 125

Arg Trp Val Ser Thr Thr Lys Lys Ala Ser Asp Ser Ala Phe Trp Leu

130 135 140

Glu Val Glu Gly Asn Ser Met Thr Ala Pro Thr Gly Ser Lys Pro Ser

145 150 155 160

Phe Pro Asp Gly Met Leu Ile Leu Val Asp Pro Glu Gln Ala Val Glu

165 170 175

Pro Gly Asp Phe Cys Ile Ala Arg Leu Gly Gly Asp Glu Phe Thr Phe

180 185 190

Lys Lys Leu Ile Arg Asp Ser Gly Gln Val Phe Leu Gln Pro Leu Asn

195 200 205

Pro Gln Tyr Pro Met Ile Pro Cys Asn Glu Ser Cys Ser Val Val Gly

210 215 220

Lys Val Ile Ala Ser Gln Trp Pro Glu Glu Thr Phe Gly

225 230 235

<210> 53

<211> 56

<212> DNA

<213> 荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）

<400> 53

gattcgttac caattgacat gatacgaaac gtaccgtatc gttaaggtta ctagag 56

<210> 54

<211> 155

<212> DNA

<213> 恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）

<400> 54

ggggcctcgc ttgggttatt gctggtgccc ggccgggcgc aatattcatg ttgatgattt 60

attatatatc gagtggtgta tttatcaata ttgtttgctc cgttatcgtt attaacaagt 120

catcaataaa gccatcacga gtaccataga ggatc 155

<210> 55

<211> 269

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 55

cctgttgtgc ttgttcttgc cgaccctcgg atagacgacg gatggggtgg tcaatgtatt 60

gatgccgtcc atatcatgaa tcaaaacaat ccatttgatc aatatcaagc tcactcttaa 120

gcttcactca tccgctgcat ggccccacca gaaagggctg gcgcggcaag ccggcggcgc 180

actcgcactg gatgcgccgc tgttgagcct ggccatgaca acgcgccgat agcggccaca 240

ccccgccagg cagggtagga gacaaggag 269

<210> 56

<211> 665

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 56

tttcaaaaat tcttactttt tttttggatg gacgcaaaga agtttaataa tcatattaca 60

tggcattacc accatataca tatccatata catatccata tctaatctta cttatatgtt 120

gtggaaatgt aaagagcccc attatcttag cctaaaaaaa ccttctcttt ggaactttca 180

gtaatacgct taactgctca ttgctatatt gaagtacgga ttagaagccg ccgagcgggt 240

gacagccctc cgaaggaaga ctctcctccg tgcgtcctcg tcttcaccgg tcgcgttcct 300

gaaacgcaga tgtgcctcgc gccgcactgc tccgaacaat aaagattcta caatactagc 360

ttttatggtt atgaagagga aaaattggca gtaacctggc cccacaaacc ttcaaatgaa 420

cgaatcaaat taacaaccat aggatgataa tgcgattagt tttttagcct tatttctggg 480

gtaattaatc agcgaagcga tgatttttga tctattaaca gatatataaa tgcaaaaact 540

gatgatacga aacgtaccgt atcgttaagg tgatgatacg aaacgtaccg tatcgttaag 600

gtaataaaag tatcaacaaa aaattgttaa tatacctcta tactttaacg tcaaggagaa 660

aaaac 665

<210> 57

<211> 317

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 57

acttttcata ctcccgccat tcagagaaga aaccaattgt ccatattgca tcagacattg 60

ccgtcactgc gtcttttact ggctcttctc gctaaccaaa ccggtaaccc cgcttattaa 120

aagcattctg taacaaagcg ggaccaaagc catgacaaaa acgcgtaaca aaagtgtcta 180

taatcacggc agaaaagtcc acattgatta tttgcacggc gtcacacttt gctatgccat 240

agcattttta tccataagat tagcggatcc tacctgacgc tttttatcgc aactctctac 300

tgtttctcca tacccgt 317

<210> 58

<211> 292

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 58

Met Ala Glu Ala Gln Asn Asp Pro Leu Leu Pro Gly Tyr Ser Phe Asn

1 5 10 15

Ala His Leu Val Ala Gly Leu Thr Pro Ile Glu Ala Asn Gly Tyr Leu

20 25 30

Asp Phe Phe Ile Asp Arg Pro Leu Gly Met Lys Gly Tyr Ile Leu Asn

35 40 45

Leu Thr Ile Arg Gly Gln Gly Val Val Lys Asn Gln Gly Arg Glu Phe

50 55 60

Val Cys Arg Pro Gly Asp Ile Leu Leu Phe Pro Pro Gly Glu Ile His

65 70 75 80

His Tyr Gly Arg His Pro Glu Ala Arg Glu Trp Tyr His Gln Trp Val

85 90 95

Tyr Phe Arg Pro Arg Ala Tyr Trp His Glu Trp Leu Asn Trp Pro Ser

100 105 110

Ile Phe Ala Asn Thr Gly Phe Phe Arg Pro Asp Glu Ala His Gln Pro

115 120 125

His Phe Ser Asp Leu Phe Gly Gln Ile Ile Asn Ala Gly Gln Gly Glu

130 135 140

Gly Arg Tyr Ser Glu Leu Leu Ala Ile Asn Leu Leu Glu Gln Leu Leu

145 150 155 160

Leu Arg Arg Met Glu Ala Ile Asn Glu Ser Leu His Pro Pro Met Asp

165 170 175

Asn Arg Val Arg Glu Ala Cys Gln Tyr Ile Ser Asp His Leu Ala Asp

180 185 190

Ser Asn Phe Asp Ile Ala Ser Val Ala Gln His Val Cys Leu Ser Pro

195 200 205

Ser Arg Leu Ser His Leu Phe Arg Gln Gln Leu Gly Ile Ser Val Leu

210 215 220

Ser Trp Arg Glu Asp Gln Arg Ile Ser Gln Ala Lys Leu Leu Leu Ser

225 230 235 240

Thr Thr Arg Met Pro Ile Ala Thr Val Gly Arg Asn Val Gly Phe Asp

245 250 255

Asp Gln Leu Tyr Phe Ser Arg Val Phe Lys Lys Cys Thr Gly Ala Ser

260 265 270

Pro Ser Glu Phe Arg Ala Gly Cys Glu Glu Lys Val Asn Asp Val Ala

275 280 285

Val Lys Leu Ser

290

Claims

信号分子选自于2,4-二乙酰基间苯三酚(DAPG)、对香豆酰基-高丝氨酸内酯(pC)、异戊酰基-高丝氨酸内酯(IV)、水杨酸盐(Sal)、次甲霉素呋喃(MMF)以及柚皮素(NG)中的一种或多种；

所述信号发送元件为信号分子生物合成基因表达盒；

其中，所述MMF生物合成基因为MmfL、MmfH以及MmfP的编码序列；所述与MMF相互作用的别构转录因子为MmfR；所述MmfR的操纵序列为SEQ ID NO：38；

2.一种多细胞基因线路，所述基因线路包含存在于不同细胞的信号发送元件和信号接收元件，从而借助信号分子将各细胞偶联；

其中，所述信号分子选自于2,4-二乙酰基间苯三酚(DAPG)、对香豆酰基-高丝氨酸内酯(pC)、异戊酰基-高丝氨酸内酯(IV)、水杨酸盐(Sal)、次甲霉素呋喃(MMF)以及柚皮素(NG)中的一种或多种；

所述信号发送元件为信号分子生物合成基因表达盒；

3.权利要求1所述的细胞间通讯系统在人工构建多细胞信号网络、多细胞基因线路和/或多细胞组织中的用途。