CN113957058A - 一株甘蓝夜蛾核型多角体病毒毒株、杀虫剂及生产方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于农业害虫的生物防治技术领域，涉及鳞翅目害虫的防治，特别是指一株甘蓝夜蛾核型多角体病毒、杀虫剂及生产方法和应用。该毒株为甘蓝夜蛾核型多角体病毒中国河南株，为从前未分离和鉴定过的昆虫致病性病毒毒株，2021年9月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V202152。本发明提供的MbMNPV‑CHN1病毒相较于一般的杆状病毒具有较为广泛的杀虫谱，而且与以往的甘蓝夜蛾核型多角体病毒毒株相比，对甘蓝夜蛾、黏虫、甜菜夜蛾、银纹夜蛾、棉铃虫、草地贪夜蛾、烟青虫等多种鳞翅目害虫具有更高的毒力，具有很好的开发应用前景。

Description

一株甘蓝夜蛾核型多角体病毒毒株、杀虫剂及生产方法和 应用

技术领域

本发明属于农业害虫的生物防治技术领域，涉及鳞翅目害虫的防治，特别是指一株甘蓝夜蛾核型多角体病毒毒株、杀虫剂及生产方法和应用。

背景技术

杆状病毒属于杆状病毒科，因其病毒粒子呈杆状而得名，是一类寄生于节肢动物的专一性病原微生物，其宿主昆虫集中于鳞翅目、膜翅目和双翅目。作为农林害虫防治的杀虫剂，杆状病毒正成为国内外生物农药研究开发十分活跃的领域之一。中国已发现近200株昆虫杆状病毒，有20多种杆状病毒被研制成杀虫剂并先后进入大田应用实验和生产示范，其中有11种被注册为商业杀虫剂。

因具有对宿主昆虫的高度致病性、对非靶标生物安全、能够在环境中长期存活，对人、畜及其他脊椎动物无害，不污染环境，同时具有防效时间长，使用方便等优点，杆状病毒作为杀虫剂高度契合绿色农业对农药的要求，因而成为国家绿色农业中重点发展的产品之一。不过，杆状病毒是宿主专一性病原微生物，自然界中绝大多数杆状病毒仅对宿主昆虫有较强感染力，而对非宿主昆虫无感染活性或者感染活性极弱，这导致了杆状病毒杀虫剂杀虫范围过于狭窄，限制了杆状病毒杀虫剂的应用规模。据统计，近年来世界范围内微生物杀虫剂仅占杀虫剂销售量的1-2%，其中杆状病毒杀虫剂在微生物杀虫剂中仅占12%；中国每年生产病毒杀虫剂约1600吨，仅占杀虫剂生产总量的0.2%。因此，病毒杀虫剂仍有很大的发展空间。

甘蓝夜蛾核型多角体病毒是甘蓝夜蛾的主要病原微生物，该病毒1960年首次在日本发现。一种杆状病毒往往会有多个不同的毒株或分离株，而同种病毒不同毒株间的宿主范围和毒力有较大差异，有针对性的分离和筛选出高毒广谱性毒株，才能生产出优良的病毒杀虫剂产品。因此，本发明分离出的对多种非原宿主昆虫具有高毒力的甘蓝夜蛾核型多角体病毒毒株对于高效昆虫杆状病毒杀虫剂的开发以及害虫的无公害防治具有重要意义。

发明内容

本发明提出了一株甘蓝夜蛾核型多角体病毒毒株、杀虫剂及生产方法和应用，该毒株相较于现有的甘蓝夜蛾核型多角体病毒毒株，对多种鳞翅目害虫具有更高的毒力；同时，本发明提出一种甘蓝夜蛾核型多角体病毒新毒株的制备方法，在满足杀虫活性的同时，具有更高的病毒产量。

本发明的技术方案是这样实现的：

一株甘蓝夜蛾核型多角体病毒毒株（Mamestra brassicae multiplenucleopolyhedrovirus），命名为：甘蓝夜蛾核型多角体病毒CHN1（MbMNPV-CHN1），保藏编号为：CCTCC No:V202152，保藏时间：2021年9月28日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号。

上述的甘蓝夜蛾核型多角体病毒毒株为广谱杆状病毒。

一种大规模生产上述的甘蓝夜蛾核型多角体病毒的方法，步骤为：

以浓度为1×10⁷ OBs/mL的甘蓝夜蛾核型多角体病毒侵染黏虫幼虫，待黏虫死亡后收集虫尸，用蒸馏水稀释，涡旋振荡器充分混匀，经纯化后，收集甘蓝夜蛾核型多角体病毒毒株。

所述黏虫幼虫为3-5龄初幼虫。

所述黏虫幼虫为5龄初幼虫，其单头病毒产量为1.2344×10¹⁰ OBs。

含有上述的甘蓝夜蛾核型多角体病毒的杀虫剂。

上述的杀虫剂在防治甘蓝夜蛾、黏虫、甜菜夜蛾和/或银纹夜蛾中的应用。

所述杀虫剂中甘蓝夜蛾核型多角体病毒的使用浓度为1×10⁴ ~5×10⁷ OBs/mL；在防治3龄甘蓝夜蛾、黏虫、甜菜夜蛾和/或银纹夜蛾时，达到90%及以上死亡率的使用浓度为7.5×10⁶ ~1.5×10⁷ OBs/mL。

上述的杀虫剂在防治棉铃虫、草地贪夜蛾和/或烟青虫中的应用。

所述杀虫剂中甘蓝夜蛾核型多角体病毒的使用浓度为1×10⁵~5×10⁸ OBs/mL；在防治3龄棉铃虫、草地贪夜蛾和/或烟青虫时，达到90%及以上死亡率的使用浓度为（2~3.5）×10⁸ OBs/mL。

本发明具有以下有益效果：

1. 本发明的MbMNPV-CHN1病毒毒株（甘蓝夜蛾核型多角体病毒毒株）分离于河南省新乡市玉米田的黏虫虫尸，具有杀虫谱广、毒力高等优点，对甘蓝夜蛾、黏虫、甜菜夜蛾、银纹夜蛾、棉铃虫、草地贪夜蛾、烟青虫等多种鳞翅目害虫幼虫具良好的杀虫活性。

2. 本发明提供的MbMNPV-CHN1毒株在满足广谱性的同时，对非原寄主具有更高的毒力；以黏虫作为上述MbMNPV-CHN1毒株大量增殖的优选替代宿主的方法，甘蓝夜蛾作为MbMNPV-CHN1毒株的原宿主，人工饲养过程中容易出现滞育现象，不适用于杆状病毒的大规模生产。该毒株首次分离于黏虫虫尸，长期与黏虫协同进化，对黏虫具有良好的适应性，加之黏虫人工饲养技术成熟，可满足杆状病毒的大规模生产。

3. 本发明以黏虫作为替代寄主，在保持毒力稳定的同时，具有更高的病毒产量，为鳞翅目害虫的病毒杀虫剂的研发提供了优良的生产株。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的甘蓝夜蛾核型多角体病毒新毒株MbMNPV-CHN1的形态图，其中A为病毒外观扫描电镜图，B为病毒超薄切片透射电镜图。

图2为本发明的甘蓝夜蛾核型多角体病毒MbMNPV-CHN1的38个核心基因联合系统发育树。

图3为本发明的甘蓝夜蛾核型多角体病毒MbMNPV-CHN1在黏虫不同龄期幼虫中的单头产量图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：病毒的鉴定

1. 病毒的分离与纯化

在下列实施例中，MbMNPV-CHN1毒株分离自河南省新乡市田间患病黏虫虫尸。收集虫尸，加入无菌水研磨，接着用三层纱布过滤。对滤液进行差速离心（低速200×g离心5min，取上清；高速2000×g离心35 min，取沉淀，反复3次），直至获得较纯净的多角体，4℃保存。

2. 病毒的增殖

对分离的病毒进行计数。采用饲料混药法，将人工饲料切成2 mm³的方块，放入24孔养虫板中，然后将10 μL病毒以1×10⁷ OBs/mL的浓度滴加到饲料上，放入3龄黏虫幼虫。每孔1快饲料，1头幼虫，每头置于25±1℃、相对湿度70%±5、光周期14 L:10 D的恒温培养箱内培养，每天观察，含毒饲料被取食干净后加入新鲜无毒饲料，待幼虫出现感染症状后，收集虫尸，并置于4℃保存。

取病死黏虫虫尸，加入无菌水研磨，接着用三层纱布过滤。对滤液进行反复差速离心，直至获得较纯净的多角体，4℃保存。

3. 扫描电镜观察

将纯化后的病毒多角体用2.5%戊二醛固定4 h，用蒸馏水漂洗3次，重悬后将多角体滴在锡箔纸上，室温自然风干，喷金涂覆后用扫描电子显微镜（S-3400N, Hitachi）进行观察并拍照。

CHN1毒株多角体呈不规则、近球形多面体结构，多角体平均大小为2.12±0.57 μm（图1A）。

4. 透射电镜观察

将纯化后的病毒多角体用2.5%戊二醛固定4 h，再用0.1mol/L的PBS漂洗，然后将多角体嵌入树脂中，切片，并进行染色，用透射电子显微镜（Tecnai G2 20 TWIN, FEI）在200 kV的加速电压下观察并拍照。

透射电镜下可观察到病毒粒子在多角体内紧密封闭包埋，随机分布，包埋类型为多粒包埋型。病毒束为长杆状，每束大多含有2-6个病毒粒子，单个病毒粒子长直径为270.75±20.92 nm，短直径为31.25±3.47 nm（图1B）。

5. 基因组提取及测序

取浓度为1×10⁹ OBs/mL的病毒悬液200 μL，加入100 μL的3×DAS裂解液（0.1mol/L Na₂CO₃，0.5 mol/L NaCl，0.01 mol/L EDTA，pH=10.9），37℃水浴30 min。然后加入200 μL的Tris-HCl缓冲液（pH=7.4），10000×g离心8 min。取上清加入蛋白酶K（终浓度100μg/mL）和五分之一体积的10% SDS，置于65℃水浴1 h，期间不定时摇晃2-3次。后加入等体积的Tris饱和酚混匀，10000×g离心5 min，取上清加入等体积的酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）抽提2次，10000×g离心5 min，取上清加入十分之一体积的3 M NaAc和2倍体积的冰的无水乙醇，置于-20℃冰箱2 h沉淀DNA，然后10000×g离心2 min得到DNA沉淀，用75%的乙醇洗涤1-2次后加入无菌水溶解。用得到的病毒DNA测序。

6. 基因组序列分析

CHN1毒株基因组序列全长153882 bp，高于MbMNPV-K1株（152710 bp），低于MbMNPV-CHb1株（154451 bp）；GC含量为40.08%，高于K1株（39.99%）和CHb1株（40.07%）；共有163个开放阅读框（ORF），多于K1株（159个）和CHb1株（162个）。ORF区全长140802 bp，占基因组全长的91.50%。利用MEGA7对杆状病毒的38个核心基因进行多基因联合系统发育分析（图2），发现该病毒株属于杆状病毒科、α杆状病毒属、第二组，是一株新的甘蓝夜蛾核型多角体病毒毒株。

通过Alignment比对分析发现，该毒株基因组与MbMNPVK1株（NC_023681）、CHb1株（JX138237）、CTa株（KJ871680）相似度分别为95.62%、94.76%、96.63%；与蓓带夜蛾核型多角体病毒B型（Mamestra configurata nucleopolyhedrovirusB，McNPV-B，AY126275）相似度为92.14%；与棉铃虫多粒包埋型核型多角体病毒（Helicoverpa armigera multiplenucleopolyhedrovirus，HaMNPV，EU730893）相似度为96.23%；与黏虫核型多角体病毒AH1株（Leucania sepaata nucleopolyhedrovirus AH1，LsNPV AH1，AY394490）相似度为49.91%。

CHN1毒株虽然分离自病死黏虫，但考虑到其与LsNPV基因组相似度较低，亲缘关系较远，与MbMNPV亲缘关系较近，因此将该毒株命名为甘蓝夜蛾核型多角体病毒MbMNPV-CHN1（Mamestra brassicae multiple nucleopolyhedrovirusCHN1），并于2021年9月28日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V202152。

本发明的另一个方面涉及CHN1毒株的一个特异基因ORF140，其核苷酸序列及氨基酸序列见序列表SEQ ID No.1。通过在NCBI数据库中比对后发现，该基因与其他甘蓝夜蛾核型多角体病毒及黏虫核型多角体病毒无同源性较高的序列，而仅与棉铃虫多粒包埋型核型多角体病毒HaMNPV的gp139（ACH88661.1）较为相似，但相似度也仅为69.57%。

实施例2：CHN1毒株对黏虫毒力测定

挑选3龄初期的黏虫幼虫，采用液滴法进行毒力测定，病毒终浓度分别为3×10⁶、1×10⁶、3×10⁵、1×10⁵、3×10⁴和1×10⁴ OBs/mL，对照组（CK）以蒸馏水替代病毒，每个处理重复3次，每个重复30头幼虫。置于27±1℃，相对湿度70%±5、光周期14 L:10 D的恒温培养箱内饲养，逐日检查并记录各处理死亡虫数。用SPSS 23.0对病毒浓度-幼虫死亡率数据进行probit分析，计算回归方程及LC₅₀。

实施例3：CHN1毒株对甜菜夜蛾毒力测定

挑选3龄初期的甜菜夜蛾幼虫进行毒力测定，药剂配制和具体试验方案与实施例3相同。

实施例4：CHN1毒株对银纹夜蛾毒力测定

挑选3龄初期的银纹夜蛾幼虫进行毒力测定，病毒终浓度分别为1×10⁷、3×10⁶、1×10⁶、3×10⁵、1×10⁵、和3×10⁴ OBs/mL，具体试验方案与实施例3相同。

实施例5：CHN1毒株对棉铃虫毒力测定

挑选3龄初期的棉铃虫幼虫进行毒力测定，病毒终浓度分别为1×10⁸、3×10⁷、1×10⁷、3×10⁶、1×10⁶、和3×10⁵ OBs/mL，具体试验方案与实施例3相同。

实施例6：CHN1毒株对草地贪夜蛾毒力测定

挑选3龄初期的草地贪夜蛾幼虫进行毒力测定，药剂配制和具体试验方案与实施例6相同。

实施例7：CHN1毒株对烟青虫毒力测定

挑选3龄初期的烟青虫进行毒力测定，药剂配制和具体试验方案与实施例6相同。

实施例8：CHN1毒株对甘蓝夜蛾毒力测定

挑选3龄初期的甘蓝夜蛾进行毒力测定，药剂配制和具体试验方案与实施例5相同。

表1 MbMNPV-CHN1毒株对夜蛾科部分害虫的毒力

CHN1毒株对部分鳞翅目夜蛾科幼虫的防治效果见表1，该毒株对甘蓝夜蛾、黏虫、甜菜夜蛾、银纹夜蛾均具有很高的毒力，LC₅₀分别为1.66×10⁵、1.49×10⁵、1.02×10⁵、1.50×10⁵ OBs/mL，当使用浓度（1.5~2.5）×10⁴ OBs/mL时，四种害虫死亡率可达30%，当使用浓度为7.5×10⁶ ~1.5×10⁷ OBs/mL时，死亡率可达90%；对棉铃虫、草地贪夜蛾、烟青虫也具有较高毒力，LC₅₀分别为3.40×10⁶、4.70×10⁶、2.71×10⁶ OBs/mL，当使用浓度为（4.5~7.5）×10⁵ OBs/mL时，三种害虫死亡率可达30%，当使用浓度为（2~3.5）×10⁸ OBs/mL时，死亡率可达90%，具有很好的应用潜力。

实施效果例1

CHN1与CHb1毒株对黏虫防治效果对比：

参照实施例3所述方法，配制终浓度为1×10⁷ OBs/mL的CHN1与CHb1病毒悬液，对照组（CK）以蒸馏水替代病毒。采用液滴法感染3龄初期的黏虫幼虫，每个处理重复3次，每个重复50头幼虫。置于27±1℃，相对湿度70%±5、光周期14 L:10 D的恒温培养箱内饲养，逐日检查并记录各处理死亡虫数，并计算校正死亡率，计算公式如下：

实施效果例2

CHN1与CHb1毒株对棉铃虫防治效果对比：

实验选取3龄初期棉铃虫幼虫，具体试验方案参照实施效果例1。

实施效果例3

CHN1与CHb1毒株对草地贪夜蛾防治效果对比：

实验选取3龄初期草地贪夜蛾幼虫，具体试验方案参照实施效果例1。

实施效果例4

CHN1与CHb1毒株对烟青虫防治效果对比：

实验选取3龄初期烟青虫幼虫，具体试验方案参照实施效果例1。

表2 CHN1与CHb1毒株毒力对比

由表2可以看出，CHN1对黏虫、草地贪夜蛾的防治效果均优于CHb1，其中CHN1对黏虫的5 d校正死亡率为7.33%，是CHb1的10.94倍，10 d校正死亡率为81.87%，是CHb1的2.98倍；对草地贪夜蛾的5 d校正死亡率为29.31%，是CHb1的13.79倍，10 d校正死亡率为75.22%，是CHb1的3.15倍。二者对棉铃虫、烟青虫的防治效果相近，但CHN1毒株稍优于CHb1。相比CHb1毒株，CHN1除了对原宿主甘蓝夜蛾拥有良好的防效外，对非原宿主具有更好的杀虫效果，具有良好的应用与开发潜能。

应用例

CHN1毒株在不同龄期黏虫体内单虫病毒产量：

用浓度为1×10⁷ OBs/mL的CHN1毒株分别侵染3、4、5龄初期的黏虫幼虫，待试虫死亡后收集单头虫尸，用蒸馏水定容至1mL，涡旋振荡器充分混匀，用血球计数板进行计数。

CHN1毒株在不同龄期黏虫幼虫中单虫病毒产量见图3。结果表明，以黏虫5龄幼虫作为替代寄主可获得更高的产量，单头产量可达1.2344×10¹⁰ OBs，是黏虫三龄幼虫的19.44倍，四龄幼虫的1.98倍，可满足该毒株的规模化生产要求。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110> 河南农业大学

<120> 一株甘蓝夜蛾核型多角体病毒、杀虫剂及生产方法和应用

<141> 2021-11-01

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 156

<212> DNA

<213> ORF140(Mamestra brassicae multiple nucleopolyhedrovirus)

<400> 1

atgtttttcg aaagcaaaga ttgtatgaaa ggtggcaaca acacgataac cttatgtgat 60

aactttatct tttttaaaac cgacaaacaa cttgcatcat cttttatcaa agttggattt 120

ggcgaaacat gttttttcaa agcaaagatc gattag 156

Claims (10)

1.一株甘蓝夜蛾核型多角体病毒毒株，命名为：甘蓝夜蛾核型多角体病毒CHN1MbMNPV-CHN1，保藏编号为：CCTCC No:V202152，保藏时间：2021年9月28日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号。

2.权利要求1所述的甘蓝夜蛾核型多角体病毒毒株为广谱杆状病毒。

3.一种大规模生产权利要求1所述的甘蓝夜蛾核型多角体病毒毒株的方法，其特征在于，步骤为：以浓度为1×10⁷ OBs/mL的甘蓝夜蛾核型多角体病毒侵染黏虫幼虫，待黏虫死亡后收集虫尸，用蒸馏水稀释，涡旋振荡器充分混匀，经纯化后，收集甘蓝夜蛾核型多角体病毒毒株。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述黏虫幼虫为3-5龄初幼虫。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述黏虫幼虫为5龄初幼虫，其单头病毒产量为1.2344×10¹⁰ OBs。

6.含有权利要求1所述的甘蓝夜蛾核型多角体病毒的杀虫剂。

7.权利要求6所述的杀虫剂在防治甘蓝夜蛾、黏虫、甜菜夜蛾和/或银纹夜蛾中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述杀虫剂中甘蓝夜蛾核型多角体病毒的使用浓度为1×10⁴ ~5×10⁷ OBs/mL。

9.权利要求6所述的杀虫剂在防治棉铃虫、草地贪夜蛾和/或烟青虫中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述杀虫剂中甘蓝夜蛾核型多角体病毒的使用浓度为1×10⁵~5×10⁸ OBs/mL。

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