CN113951133A - 一种萝卜种质的创制方法 - Google Patents

一种萝卜种质的创制方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113951133A
CN113951133A CN202111421003.9A CN202111421003A CN113951133A CN 113951133 A CN113951133 A CN 113951133A CN 202111421003 A CN202111421003 A CN 202111421003A CN 113951133 A CN113951133 A CN 113951133A
Authority
CN
China
Prior art keywords
radish
line
germplasm
donor
steps
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202111421003.9A
Other languages
English (en)
Inventor
徐立功
韩太利
孙继峰
杨晓东
孙莎莎
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Weifang Academy Of Agricultural Sciences Weifang Branch Of Shandong Academy Of Agricultural Sciences
Original Assignee
Weifang Academy Of Agricultural Sciences Weifang Branch Of Shandong Academy Of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Weifang Academy Of Agricultural Sciences Weifang Branch Of Shandong Academy Of Agricultural Sciences filed Critical Weifang Academy Of Agricultural Sciences Weifang Branch Of Shandong Academy Of Agricultural Sciences
Priority to CN202111421003.9A priority Critical patent/CN113951133A/zh
Publication of CN113951133A publication Critical patent/CN113951133A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/02—Methods or apparatus for hybridisation; Artificial pollination ; Fertility
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/04—Processes of selection involving genotypic or phenotypic markers; Methods of using phenotypic markers for selection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/12—Processes for modifying agronomic input traits, e.g. crop yield
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/12—Processes for modifying agronomic input traits, e.g. crop yield
    • A01H1/122—Processes for modifying agronomic input traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • A01H1/1245—Processes for modifying agronomic input traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, e.g. pathogen, pest or disease resistance

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Storage Of Fruits Or Vegetables (AREA)

Abstract

本发明公开了一种萝卜种质的创制方法，该方法包括如下步骤：1）二环系双亲本材料的创制：将变异潍农潍县萝卜与高密堤东萝卜杂交得到二环系父本WD‑1，将天津卫青萝卜与变异潍农潍县三号大青萝卜杂交得到二环系母本TD‑1；2）DH系供体杂交后代代植株的创制：将二环系父本与二环系母本TD‑1进行杂交和自交后挑选出供体植株并标号为WT1‑4‑27、WT1‑4‑30，将其作为游离小孢子培养的供体植株；3）优异DH系的创制：4）二倍体的根肿病抗性检验：5）DH系加倍：6）四倍体亲本加工适应性：7)适宜加工的抗根肿病萝卜种质的创制；本发明的种质具有皮色深绿、抗病性好、甜度高且产量高，生长周期短。

Description

一种萝卜种质的创制方法
技术领域
本发明涉及一种农产品种质的创制，具体的说，涉及一种萝卜种质的创制方法，属于农作物种植领域。
背景技术
萝卜是十字花科萝卜属中能形成肥大肉质根的二年生草本植物，染色体数2n=2x=18。萝卜的肉质根发达，主要由次生木质部构成，是主要的食用器官。
萝卜种质产品器官的商品品质、感官品质和生化品质性状，商品品质性状包括肉质根外观、根毛及其根毛疤痕大小、糠心程度等，感官品质性状包括肉质根硬度、质地和风味等，生化品质性状涉及与营养有关的Vc含量、粗蛋白含量等和与风味有关的可溶性糖含量、粗纤维素含量、硫代葡萄糖苷含量等。
但是，现在一些萝卜种植户大量滥用农药、施肥等，导致萝卜种子混杂、退化严重，导致萝卜的种植质量严重下降。
为解决上述技术问题，现有技术中出现了一种萝卜选育方法；如专利申请号为：CN201510952604.0，公开了一种有机大青萝卜新品种及其选育方法。本发明提供的有机大青萝卜新品种，母本采用潍县大青皮萝卜，在单株变异的基础上经过五代人工自交产生的稳定自交不亲和系，父本采用高脚青大缨品系与青圆脆杂交后代选育的二环系，经连续6代单株选择与系圃混合选择而育成的自交不亲和系，杂交得到有机大青萝卜新品种。
上述该类现有的萝卜新品种及其选育方法选育出来的大青萝卜新品种其皮色浅，抗病性差，并且生产周期过长，产量低，进而种质性差。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种皮色深绿、抗病性好、甜度高且产量高，生长周期短的优良性状种质。
为了解决上述技术方案，本发明提供如下技术方案：
一种萝卜种质的创制方法，该方法包括如下步骤：1）二环系双亲材料的创制：将变异潍农潍县萝卜与高密堤东萝卜杂交得到二环系父本WD-1，将天津卫青萝卜与变异潍农潍萝卜三号大青萝卜杂交得到二环系母本TD-1；
2）DH系供体杂交后代植株的创制：将二环系父本WD-1与二环系母本TD-1进行杂交和自交后挑选出供体植株并标号为WT1-4-27、WT1-4-30，将其作为游离小孢子培养的供体植株；
3）优异DH系的创制：先将供体植株进行春化保存，再将供体植株定植，使定植的植株待生长出花蕾后培养创制萝卜植株，对创制的萝卜植株进行倍体鉴定；
4）二倍体的根肿病抗性检验：将加倍处理后的再生植株18个二倍体基因型通过自交授粉后获得种子，在萝卜2片真叶（未破肚）时使用菌液用苗期鉴定和苗圃鉴定相结合的方法进行根肿病抗性鉴定；
5）DH系加倍：将优异的康根肿病DH材料经自交授粉、播种、修剪处理、春化处理、定植、授粉，获得四倍体种子；
6）四倍体亲本加工适应性：将4份材料的抗根肿病四倍体材料进行加工适用性检验；
7）适宜加工的抗根肿病萝卜种质的创制。
以下是本发明对上述技术方案的进一步优化：
步骤2）中二环系父本WD-1与二环系母本TD-1进行杂交，对后代自交得到杂交后代，对杂交后代自交3代后筛出供体植株并标号为WT1-4-27、WT1-4-30。
进一步优化：步骤3）中优异DH系的创制按如下步骤进行：
a、供体材料的保存：将供体植株以吸水纸全包裹后，放入塑料袋中，保存在0-1℃的冷库中进行40天春化处理；
b、供体材料定植：春化结束后将供体植株定植于温度在10-20℃的温室内，待第一朵花开花后，保持温度在10-15℃。
进一步优化：步骤3）中优异DH系的创制步骤还包括：
c、萝卜DH系的创制：待定植的植株生长出第一朵花后，去掉主枝花蕾，使一级侧枝抽枝开花，待一级侧枝有4-6朵花时，采摘顶部花蕾，选取长2-3mm花蕾，摘除剩余花蕾，使二级分枝抽枝开花；
d、将选取的萝卜花蕾在温度为4-6℃的冰箱中预处理24h，用75%的酒精消毒30-40s，再用0.1%的升汞消毒9-10min，无菌水冲洗5-6min，冲洗3次，处理后的花蕾放入无菌研钵中，加入B5洗涤培养基，收集滤液并离心，离心后加入0.1%平阳霉素并进行暗培养，得到以WT1-4-27为供体获得32个再生植株，以WT1-4-30为供体获得25个再生植株，共计57个；
e、对再生植株进行倍性鉴定，鉴定后对单倍体、双倍体进行组培扩繁至10株/基因型，单倍体3周生根后进行加倍处理，剪去1cm根尖，留2cm的根，放入0.2%的秋水仙素中处理8小时。
进一步优化：步骤4）中菌液制备步骤如下：
S1、将感根肿病白菜根，利用搅拌器将其搅碎，得到混合物；
S2、将混合物依次用2层和4层纱布进行过滤，得到滤液；
S3、将滤液在4000r/min条件下离心10-15min，弃上清液，收集沉淀；
S4、用蒸馏水将沉淀进行悬浮，步骤S2和S3重复3次，得到根肿病菌沉淀物；
S5、将根肿病菌沉淀物用蒸馏水稀释，使其孢子浓度均为1×107个·L-1，将菌液置于容器内，加葡萄糖至糖浓度为1%，覆盖保鲜膜，32℃以上天气时，在阳光下暴晒2小时后使用，以提升孢子活性。
进一步优化：步骤4）中，接种时，用小刀在萝卜苗（未破肚）根部1cm处，沿60°方向切下，向每个穴孔中浇入5ml孢子液，在萝卜基质内1cm粗时调查发病情况，通过苗期鉴定获得抗根肿病材料15份，选取性状优良萝卜4份。
进一步优化：步骤5）的具体操作步骤为：将4份优异的康根肿病DH材料自交授粉后，获得DH系种子，将DH系种子播种至培养基质中，在两叶一心时，从基质中取出，清洗2min后剪去1cm主根根尖，留2cm的根，放入0.4%的秋水仙素中处理6-10h，重新栽入培养基质中，在六叶一心时，对加倍成功的萝卜放入冷库进行春化处理40天，定植于拱棚，待开花后授粉，获得四倍体种子。
进一步优化：步骤6）中将抗根肿病四倍体材料进行加工适用性检验时，首先将收获萝卜去掉萝卜缨并清洗干净，去掉少许萝卜头，将余下20cm萝卜纵切成8段厚1cm的长条，再将其横切成2段，取皮备用，采用超声波进行消毒，得到预处理好的萝卜皮，而后进行腌制。
进一步优化：腌制步骤包括：1）、将预处理好的萝卜皮放入容器中，倒入体积比为1:10的山西老陈醋与食用醋酸，醋面没过萝卜，按1：1000质量，加入体积为1:1的短乳杆菌与维斯氏菌，在4±0.2℃浸泡72h后按重量为100:1.5萝卜皮与食盐的比例，先在容器中放入少许盐，然后按照一层萝卜一层盐，腌制容器至4/5处时，将30%的盐量作面盐撒于顶层，用重于萝卜1.5倍的重物施压于顶层，以加速萝卜渗透脱水，在温度为4±0.2℃时腌制2.5天，脱水约占萝卜总重18%时及时翻缸弃液；
2）、将腌渍后萝卜与食盐按重量100:1.5比例备料，按上述相同工艺完成腌渍并施以重压，在温度为4±0.2℃时腌渍5.5天，脱水占萝卜总重18%时完成腌制，将腌制后的萝卜捞出清洗脱盐、晾干后用超声波消毒备用；
3）、将萝卜与1%葡萄水、米曲霉、酵母菌、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌等混合菌种人工接种在30±0.2℃中发酵5.5天，发酵完成后检测口感、韧性、污染程度等，从中选出口感酸、脆、酱香浓郁、污染查的材料做亲本。
进一步优化：步骤7）为，将来源于DH系的四倍体材料为母本TD-1与DH系材料为父本WD-1进行杂交，获得三倍体种质，进行根肿抗病性和加工适应性检验，确定种质性质优良。
本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：
1、本发明提供的萝卜种质创制方法，其所种植的萝卜皮色深绿、肉色淡绿，肉质细嫩且味道甘甜，在生长过程中对病毒和细菌具有抵抗能力，由于抗病性好，因此萝卜的产量大量增加，适宜高产栽培。
2、采用本发明萝卜种质的创制方法，促进了萝卜产业的快速发展，为农业和经济做出了重要贡献。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明，应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：一种萝卜种质的创制方法，具体包括如下步骤：
二环系双亲材料的创制：利用市场所售的变异潍农潍县萝卜与市场所售的高密堤东萝卜进行杂交，杂交后对后代挑选出皮色深绿、肉色绿、抗病性好的二环系父本WD-1。
利用市场所售的天津卫青萝卜与市场所售的变异潍农潍萝卜三号大青萝卜进行杂交，杂交后对后代挑选出甜度高、产量高和抗病性好的二环系母本TD-1。
DH系供体杂交后代植株的创制：将上述父本WD-1与母本TD-1进行杂交，对后代自交，自交后得到杂交后代，对杂交后代筛选品质较好的种质连续自交3代，挑选出皮色深绿且肉色绿，抗病性好，甜度高且顺直的WT1-4-27、WT1-4-30作为游离小孢子培养的供体植株。
优异DH系的创制：先将供体植株进行春化保存，再将供体植株定植，使定植的植株待生长出花蕾后培养创制萝卜植株，对创制的萝卜植株进行倍体鉴定。
DH系的创制按如下步骤进行：a、供体材料的保存：在11月底，将上述的供体植株WT1-4-27、WT1-4-30挑选出质量好的后，将萝卜上的叶子去掉，用吸水纸包裹萝卜，放入塑料袋中保湿，将放入塑料袋中的萝卜放入0±0.2℃的冷库中储存，在冷库中进行40天的春化处理。
b、供体材料定植：在冷库中春化40天后，在1月中旬定植到10℃的温室内，第一朵花开花后，保持温室温度为10±0.2℃有利于提高游离小孢子胚胎发生的频率。
c、萝卜DH系的创制：萝卜抽薹后将主薹摘掉，待定植的植株生长出第一朵花后，去掉主枝花蕾，留6个一级侧枝，促进一级侧枝抽枝开花，待一级侧枝有4朵花时，采摘顶部花蕾，选取长2mm花蕾，摘除剩余花蕾，每一级侧枝留2个二级侧枝，促进二级分枝抽枝开花。
d、将选取的花蕾在保湿的条件下于4±0.2℃的冰箱内预处理24h，将预处理好的花蕾用75%的酒精消毒30s，用0.1%的升汞消毒9min，随后用无菌水冲洗5min，冲洗3次，然后将花蕾放入无菌研体中，加入少量B5洗涤培养基，用研棒轻轻挤压，使小孢子从花药中游离到溶液中，用孔径为45µm的尼龙筛网过滤并收集滤液，100g离心3min，离心3次，第三次离心后用NLN-13培养基将小孢子密度调至 1×105个·mL-1，，所用培养基中加入0.1%的平阳霉素，用以提升种质的多样性水平，在每个体积为60mm的无菌玻璃培养皿中分装2ml的悬浮液，并加入1%的活性炭100μL，用市场所售的Parafilm 封口膜进行封口，分装后先在温度为32.5±0.2℃的条件下暗培养48h，后将其放于25±0.2℃的温度下继续暗培养。通过培养后，以WT1-4-27为供体获得32个再生植株，以WT1-4-30为供体获得25个再生植株，共计57个。
e、利用流式细胞仪对再生植株进行倍性鉴定结果，以WT1-4-27为供体获得32个再生植株中26个为单倍体，2个为多倍体，4个为二倍体，以WT1-4-30为供体获得25个再生植株中20个为单倍体，1个为非整倍体，4个二倍体，共计46个单倍体，3个非整倍体，8个二倍体。
对上述单倍体、双倍体进行组倍扩繁，扩繁至每个基因型30株植株，单倍体在生根培养基中3周左右生根后进行加倍处理，从培养基中取出后，剪去1cm根尖部分，留2cm的根，放入0.2%的秋水仙素中处理8小时。
二倍体的根肿病抗性检验：
46个单倍体株系，经处理获得10个二倍体基因型，总计18个二倍体进行，通过自交授粉后获得种子，在秋季采用苗期鉴定的方法进行根肿病抗性鉴定。
苗期鉴定：根据萝卜根部肿瘤大小和肿瘤多少来判定抗病程度，采用50空穴盘进行萝卜育苗，萝卜在2片真叶时接菌，接种前准备菌液：
S1、将感根肿病白菜根根，利用搅拌器将其搅碎，得到混合物；
S2、将混合物依次使用2层和4层纱布进行过滤，得到滤液；
S3、将滤液在4000r/min条件下离心10min，弃上清液，收集沉淀；
S4、用蒸馏水将沉淀进行悬浮，其中S2和S3重复3次，得到根肿病菌的沉淀；
S5、将获得的根肿病菌沉淀物用蒸馏水稀释，使其孢子浓度均为1×107个·L-1，将菌液置于容器内，加葡萄糖至糖浓度为1%，覆盖保鲜膜，32℃以上天气时，11:00-13:00在阳光下暴晒2小时后使用，以提升孢子活性。
接种时，用锋利小刀在萝卜苗基质内1cm处，沿60°方向切下，向每个穴孔中浇入5ml孢子液，将穴盘置于育苗床上，田间正常管理，在萝卜1cm粗时调查发病情况。
通过苗期鉴定获得抗根肿病材料15份，结合田间表现，选取皮色深绿、肉色翠绿、根型顺直、重量在1.5±0.2KG重的萝卜4份。
DH系加倍：
将4份优异的抗根肿病DH萝卜进行自交授粉，获得DH系种子，将每个萝卜取100个种子播种于萝卜育苗专用培养基质中，在两叶一心时，将其从基质中取出，用清水冲洗2min后，洗净根部后剪去1cm根尖部分，留有2cm的根，将其放入0.4%的秋水仙素中暗处理6小时，处理完成后用清水冲洗10s，重新栽入萝卜苗专用培养基质中，在六叶一心时，对成功加倍的萝卜放置于冷库中进行春化处理40天，春化完成后将其定植于拱棚，开花后进行授粉，获得四倍体种子，其中4个基因型获得不同数目的四倍体。
四倍体亲本加工适应性：
将4份材料的抗根肿病四倍体材料进行加工适用性检验，具体包括如下步骤：
S1、将抗根肿病四倍体材料进行加工适用性检验，将收获萝卜后去掉萝卜缨后清洗干净，将萝卜切去头部少许，切出的截面直径为4cm，将余下20cm萝卜纵切成8段厚1cm的长条，再将其横切成2段，取皮备用，采用超声波进行消毒；
S2、将萝卜皮放入玻璃容器中摆放整齐，倒入按体积比为1:10的山西老陈醋与食用醋酸，醋面没过萝卜，使抗坏血酸酶失活，保持维生素活性，同时能够使萝卜更脆，按照质量比为1：1000加入体积比为1:1的短乳杆菌与维斯氏菌，在4±0.2℃浸泡72h后根据萝卜皮与食盐100:1的比例，先在容器中放入少许盐，然后按照一层萝卜一层盐，尽量增大萝卜与食盐的接触面积，腌制容器至4/5处时，将30%的盐量作面盐撒于顶层，用重于萝卜1倍的重物施压于顶层，以加速萝卜渗透脱水，在温度为4±0.2℃时腌制2天，脱水约占萝卜总重15%时及时翻缸弃液；
S3、将腌渍后萝卜与食盐按重量100:1比例备料，按上述相同工艺完成腌渍并施以重压，在温度为4±0.2℃时腌渍5天，脱水占萝卜总重15%时完成腌制，将腌制后的萝卜捞出清洗后用超声波消毒备用；
S4、将萝卜与1%葡萄水、米曲霉、酵母菌、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌等混合菌种人工接种在30±0.2℃中发酵5天，发酵完成后检测口感，从中选出口感酸、脆的材料做亲本。
适宜加工的抗根肿病萝卜种质的创制：
以该四倍体材料为母本TD-1，与DH系为父本WD-1进行杂交，获得三倍体种质，进行根肿病抗性和加工适应性检验，确定获得的种质性状优良。
实施例2：一种萝卜种质的创制方法，具体包括如下步骤：
二环系双亲材料的创制：利用市场所售的变异潍农潍县萝卜与市场所售的高密堤东萝卜进行杂交，杂交后对后代挑选出皮色深绿、肉色绿、抗病性好的二环系父本WD-1。
利用市场所售的天津卫青萝卜与市场所售的变异潍农潍萝卜三号大青萝卜进行杂交，杂交后对后代挑选出甜度高、产量高和抗病性好的二环系母本TD-1。
DH系供体杂交后代植株的创制：将上述父本WD-1与母本TD-1进行杂交，对后代自交，自交后得到杂交后代，对杂交后代筛选品质较好的种质连续自交3代，挑选出皮色深绿且肉色绿，抗病性好，甜度高且顺直的WT1-4-27、WT1-4-30作为游离小孢子培养的供体植株。
优异DH系的创制，该DH系的创制步骤包括：a、供体材料的保存：在11月底，将上述的供体植株WT1-4-27、WT1-4-30挑选出质量好的后，将萝卜上的叶子去掉，用吸水纸包裹萝卜，放入塑料袋中保湿，将放入塑料袋中的萝卜放入0.5±0.1℃的冷库中储存，在冷库中进行40天的春化处理。
b、供体材料定植：在冷库中春化40天后，在1月中旬定植到15±0.2℃的温室内，第一朵花开花后，保持温室温度为10±0.2℃，开花期在15±0.2℃有利于提高游离小孢子胚胎发生的频率。
c、萝卜DH系的创制：萝卜抽薹后将主薹摘掉，待定植的植株生长出第一朵花后，去掉主枝花蕾，留6个一级侧枝，促进一级侧枝抽枝开花，待一级侧枝有5朵花时，采摘顶部花蕾，选取长2.5mm花蕾，摘除剩余花蕾，每一级侧枝留2个二级侧枝，促进二级分枝抽枝开花。
d、将选取的花蕾在保湿的条件下于4±0.2℃的冰箱内预处理24h，将预处理好的花蕾用75%的酒精消毒35s，用0.1%的升汞消毒9.5min，随后用无菌水冲洗5.5min，冲洗3次，然后将花蕾放入无菌研体中，加入少量B5洗涤培养基，用研棒轻轻挤压，使小孢子从花药中游离到溶液中，用孔径为45µm的尼龙筛网过滤并收集滤液，100g离心3.5min，离心3次，第三次离心后用NLN-13培养基将小孢子密度调至 1×105个·mL-1，，所用培养基中加入0.1%的平阳霉素，用以提升种质的多样性水平，在每个体积为60mm的无菌玻璃培养皿中分装2ml的悬浮液，并加入1%的活性炭100μL，用市场所售的Parafilm 封口膜进行封口，分装后先在温度为33±0.2℃的条件下暗培养48h，后将其放于25.5±0.2℃的温度下继续暗培养。通过培养后，以WT1-4-27为供体获得32个再生植株，以WT1-4-30为供体获得25个再生植株，共计57个。
e、利用流式细胞仪对再生植株进行倍性鉴定结果，以WT1-4-27为供体获得32个再生植株中26个为单倍体，2个为多倍体，4个为二倍体，以WT1-4-30为供体获得25个再生植株中20个为单倍体，1个为非整倍体，4个二倍体，共计46个单倍体，3个非整倍体，8个二倍体。
对上述单倍体、双倍体进行组倍扩繁，扩繁至每个基因型30株植株，单倍体在生根培养基中3周左右生根后进行加倍处理，从培养基中取出后，剪去1cm
根尖部分，留2cm的根，放入0.2%的秋水仙素中处理8小时。
二倍体的根肿病抗性检验：
46个单倍体株系，经处理获得10个二倍体基因型，总计18个二倍体基因型，通过自交授粉后获得种子，在秋季采用苗期鉴定的方法进行根肿病抗性鉴定。
苗期鉴定：根据萝卜根部肿瘤大小和肿瘤多少来判定抗病程度，采用50空穴盘进行萝卜育苗，萝卜在2片真叶时接菌，接种前准备菌液：
S1、将感根肿病白菜根根，利用搅拌器将其搅碎，得到混合物；
S2、将混合物依次使用2层和4层纱布进行过滤，得到滤液；
S3、将滤液在4000r/min条件下离心13min，弃上清液，收集沉淀；
S4、用蒸馏水将沉淀进行悬浮，其中S2和S3重复3次，得到根肿病菌的沉淀；
S5、将获得的根肿病菌沉淀物用蒸馏水稀释，使其孢子浓度均为1×107个·L-1，将菌液置于容器内，加葡萄糖至糖浓度为1%，覆盖保鲜膜，32℃以上天气时，11:00-13:00在阳光下暴晒2小时后用，以提升孢子活性。
接种时，用锋利小刀在萝卜苗根部1cm处，沿60°方向切下，向每个穴孔中浇入5ml孢子液，将穴盘置于育苗床上，田间正常管理，在萝卜1cm粗时调查发病情况。
通过苗期鉴定获得抗根肿病材料15份，结合田间表现，选取皮色深绿、肉色翠绿、根型顺直、重量在1.8±0.2KG重的萝卜4份。
DH系加倍：
将4份优异的抗根肿病DH萝卜进行自交授粉，获得DH系种子，将每个萝卜取100个种子播种于萝卜育苗专用培养基质中，在两叶一心时，将其从基质中取出，用清水冲洗2min，洗净根部后剪去1cm根尖部分，留有2cm的根，将其放入0.4%的秋水仙素中处理8小时，处理完成后用清水冲洗10s，重新栽入萝卜苗专用培养基质中，在六叶一心时，对成功加倍的萝卜放置于冷库中进行春化处理40天，春化完成后将其定植于拱棚，开花后进行授粉，获得4倍体种子，其中4个基因型获得不同数目的四倍体。
四倍体亲本加工适应性：
将4份材料的抗根肿病四倍体材料进行加工适用性检验，具体包括如下步骤：
S1、将抗根肿病四倍体材料进行加工适用性检验，将收获萝卜后去掉萝卜缨后清洗干净，将萝卜切去头部少许，切出的截面直径为4cm，将余下20cm萝卜纵切成8段厚1cm的长条，再将其横切成2段，取皮备用，采用超声波进行消毒；
S2、将萝卜皮放入玻璃容器中摆放整齐，倒入按体积比为1:10的山西老陈醋与食用醋酸，醋面没过萝卜，使抗坏血酸酶失活，保持维生素活性，同时能够使萝卜更脆，按照质量比为1：1000加入体积比为1:1的短乳杆菌与维斯氏菌，在4±0.2℃浸泡72h后根据萝卜皮与食盐100:1的比例，先在容器中放入少许盐，然后按照一层萝卜一层盐，尽量增大萝卜与食盐的接触面积，腌制容器至4/5处时，将30%的盐量作面盐撒于顶层，用重于萝卜1倍的重物施压于顶层，以加速萝卜渗透脱水，在温度为4±0.2℃时腌制2天，脱水约占萝卜总重15%时及时翻缸弃液；
S3、将腌渍后萝卜与食盐按重量100:1比例备料，按上述相同工艺完成腌渍并施以重压，在温度为4±0.2℃时腌渍5天，脱水占萝卜总重15%时完成腌制，将腌制后的萝卜捞出清洗后用超声波消毒备用；
S4、将萝卜与1%葡萄水、米曲霉、酵母菌、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌等混合菌种人工接种在30±0.2℃中发酵5天，发酵完成后检测口感，从中选出口感酸、脆的材料做亲本。
适宜加工的抗根肿病萝卜种质的创制：
以该四倍体材料为母本TD-1，与DH系为父本WD-1进行杂交，获得三倍体种质，进行根肿病抗性和加工适应性检验，确定获得的种质性状优良。
实施例3：一种萝卜种质的创制方法，具体包括如下步骤：
二环系双亲材料的创制：利用市场所售的变异潍农潍县萝卜与市场所售的高密堤东萝卜进行杂交，杂交后对后代挑选出皮色深绿、肉色绿、抗病性好的二环系父本WD-1。
利用市场所售的天津卫青萝卜与市场所售的变异潍农潍萝卜三号大青萝卜进行杂交，杂交后对后代挑选出甜度高、产量高和抗病性好的二环系母本TD-1。
DH系供体杂交后代植株的创制：将上述父本WD-1与母本TD-1进行杂交，对后代自交，自交后得到杂交后代，对杂交后代筛选品质较好的种质连续自交3代，挑选出皮色深绿且肉色绿，抗病性好，甜度高且顺直的WT1-4-27、WT1-4-30作为游离小孢子培养的供体植株。
优异DH系的创制，该DH系的创制步骤包括：a、供体材料的保存：在11月底，将上述的供体植株WT1-4-27、WT1-4-30挑选出质量好的后，将萝卜上的叶子去掉，用吸水纸包裹萝卜，放入塑料袋中保湿，将放入塑料袋中的萝卜放入1±0.2℃的冷库中储存，在冷库中进行40天的春化处理。
b、供体材料定植：在冷库中春化40天后，在1月中旬定植到20±0.2℃的温室内，第一朵花开花后，保持温室温度为10±0.2℃有利于提高游离小孢子胚胎发生的频率。
c、萝卜DH系的创制：萝卜抽薹后将主薹摘掉，待定植的植株生长出第一朵花后，去掉主枝花蕾，留6个一级侧枝，促进一级侧枝抽枝开花，待一级侧枝有6朵花时，采摘顶部花蕾，选取长3mm花蕾，摘除剩余花蕾，每一级侧枝留2个二级侧枝，促进二级分枝抽枝开花。
d、将选取的花蕾在保湿的条件下于6±0.2℃的冰箱内预处理24h，将预处理好的花蕾用75%的酒精消毒40s，用0.1%的升汞消毒10min，随后用无菌水冲洗6min，冲洗3次，然后将花蕾放入无菌研体中，加入少量B5洗涤培养基，用研棒轻轻挤压，使小孢子从花药中游离到溶液中，用孔径为45µm的尼龙筛网过滤并收集滤液，100g离心4min，离心3次，第三次离心后用NLN-13培养基将小孢子密度调至 1×105个·mL-1，，所用培养基中加入0.1%的平阳霉素，用以提升种质的多样性水平，在每个体积为60mm的无菌玻璃培养皿中分装2ml的悬浮液，并加入1%的活性炭100μL，用市场所售的Parafilm 封口膜进行封口，分装后先在温度为33.5±0.2℃的条件下暗培养48h，后将其放于26±0.2℃的温度下继续暗培养。通过培养后，以WT1-4-27为供体获得32个再生植株，以WT1-4-30为供体获得25个再生植株，共计57个。
e、利用流式细胞仪对再生植株进行倍性鉴定结果，以WT1-4-27为供体获得32个再生植株中26个为单倍体，2个为多倍体，4个为二倍体，以WT1-4-30为供体获得25个再生植株中20个为单倍体，1个为非整倍体，4个二倍体，共计46个单倍体，3个非整倍体，8个二倍体。
对上述单倍体、双倍体进行组倍扩繁，扩繁至每个基因型30株植株，单倍体在生根培养基中3周左右生根后进行加倍处理，从培养基中取出后，剪去1cm根尖部分，留2cm的根，放入0.2%的秋水仙素中处理8小时。
不同时间、部位对出胚量的影响：
Figure 986015DEST_PATH_IMAGE001
由上表可见，在去除主薹后，一级侧枝有5朵花左右、二级侧枝5朵花左右时，进行游离小孢子培养的效果最好。
二倍体的根肿病抗性检验：
46个单倍体株系，经处理获得10个二倍体基因型，总计18个二倍体基因型，通过自交授粉后获得种子，在秋季采用苗期鉴定的方法进行根肿病抗性鉴定。
苗期鉴定：根据萝卜根部肿瘤大小和肿瘤多少来判定抗病程度，采用50空穴盘进行萝卜育苗，萝卜在2片真叶时接菌，接种前准备菌液：
S1、将感根肿病白菜根根，利用搅拌器将其搅碎，得到混合物；
S2、将混合物依次使用2层和4层纱布进行过滤，得到滤液；
S3、将滤液在4000r/min条件下离心15min，弃上清液，收集沉淀；
S4、用蒸馏水将沉淀进行悬浮，其中S2和S3重复3次，得到根肿病菌的沉淀；
S5、将获得的根肿病菌沉淀物用蒸馏水稀释，使其孢子浓度均为1×107个·L-1，将菌液置于容器内，加葡萄糖至糖浓度为1%，覆盖保鲜膜，32℃以上天气时，11:00-13:00在阳光下暴晒2小时后使用，以提升孢子活性。
接种时，用锋利小刀在萝卜苗基质内1cm处，沿60°方向切下，向每个穴孔中浇入5ml孢子液，将穴盘置于育苗床上，田间正常管理，在萝卜1cm粗时调查发病情况。
通过苗期鉴定获得抗根肿病材料15份，结合田间表现，选取皮色深绿、肉色翠绿、根型顺直、重量在2.0±0.2KG重的萝卜4份。
DH系加倍：
将4份优异的抗根肿病DH萝卜进行自交授粉，获得DH系种子，将每个萝卜取100个种子播种于萝卜育苗专用培养基质中，在两叶一心时，将其从基质中取出，用清水冲洗2min，洗净根部后剪去1cm根尖部分，留有2cm的根，将其放入0.4%的秋水仙素中处理10小时，处理完成后用清水冲洗10s，重新栽入萝卜苗专用培养基质中，在六叶一心时，对成功加倍的萝卜放置于冷库中进行春化处理40天，春化完成后将其定植于拱棚，开花后进行授粉，获得4倍体种子，其中4个基因型获得不同数目的四倍体。
四倍体亲本加工适应性：
将4份材料的抗根肿病四倍体材料进行加工适用性检验，具体包括如下步骤：
S1、将抗根肿病四倍体材料进行加工适用性检验，将收获萝卜后去掉萝卜缨后清洗干净，将萝卜切去头部少许，切出的截面直径为4cm，将余下20cm萝卜纵切成8段厚1cm的长条，再将其横切成2段，取皮备用，采用超声波进行消毒；
S2、将萝卜皮放入玻璃容器中摆放整齐，倒入按体积比为1:10的山西老陈醋与食用醋酸，醋面没过萝卜，使抗坏血酸酶失活，保持维生素活性，同时能够使萝卜更脆，按照质量比为1：1000加入体积比为1:1的短乳杆菌与维斯氏菌，在4±0.2℃浸泡72h后根据萝卜皮与食盐100:1的比例，先在容器中放入少许盐，然后按照一层萝卜一层盐，尽量增大萝卜与食盐的接触面积，腌制容器至4/5处时，将30%的盐量作面盐撒于顶层，用重于萝卜1倍的重物施压于顶层，以加速萝卜渗透脱水，在温度为4±0.2℃时腌制2天，脱水约占萝卜总重15%时及时翻缸弃液；
S3、将腌渍后萝卜与食盐按重量100:1比例备料，按上述相同工艺完成腌渍并施以重压，在温度为4±0.2℃时腌渍5天，脱水占萝卜总重15%时完成腌制，将腌制后的萝卜捞出清洗后用超声波消毒备用；
S4、将萝卜与1%葡萄水、米曲霉、酵母菌、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌等混合菌种人工接种在30±0.2℃中发酵5天，发酵完成后检测口感，从中选出口感酸、脆的材料做亲本。
适宜加工的抗根肿病萝卜种质的创制：
以该四倍体材料为母本TD-1，与DH系为父本WD-1进行杂交，获得三倍体种质，进行根肿病抗性和加工适应性检验，确定获得的种质性状优良。
本发明实施例提供的萝卜种质创制方法具有皮色深绿、抗病性好、甜度高的优良性状种质。
2018-2019年在山东省潍坊市寒亭区固堤街道张院试验场进行品种种质比较试验，以潍坊著名品种市场所售的潍县萝卜为对比实施例，随机排列，三组平行试验，于2018年8月份进行播种，其管理过程与其他萝卜相同，种质检测结果如下表所示：
表1 潍县萝卜种质与本发明种质比较试验产量结果
Figure 870794DEST_PATH_IMAGE002
由表1可知，本发明中萝卜的种质与潍县萝卜种质相对比，本发明中萝卜种质的萝卜比普通萝卜的生长周期短5-9天，产量比普通萝卜相比增长21-33%，本发明所提供的萝卜种质较普通萝卜的种质具有产量高、周期短的优点。
表2 潍县萝卜种质与本发明种质抗病性比较检测结果
Figure 934565DEST_PATH_IMAGE003
由表2可知。本发明中的萝卜种质与潍县萝卜种质相比较，本发明中的种质抗病虫和抗病毒性要优于普通萝卜的种质，在病症和病级明显优于潍县萝卜种质，因此该发明中的种质具有抗病毒和抗病虫的特性。
随机选取本发明中种质的萝卜与潍县萝卜10根，对比其颜色、口感即外观，其检测结果如下表所示：
表3 感官检测
Figure 664624DEST_PATH_IMAGE004
根据表3可知，本发明中所创制的萝卜种质比现有技术中潍县萝卜的种质所种植的萝卜在颜色、口感和外观方面都较优异。
对于本领域的普通技术人员而言，根据本发明的教导，在不脱离本发明的原理与精神的情况下，对实施方式所进行的改变、修改、替换和变型仍落入本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种萝卜种质的创制方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：1）二环系双亲材料的创制：将变异潍农潍县萝卜与高密堤东萝卜杂交得到二环系父本WD-1，将天津卫青萝卜与变异潍农潍萝卜三号大青萝卜杂交得到二环系母本TD-1；
2）DH系供体杂交后代植株的创制：将二环系父本WD-1与二环系母本TD-1进行杂交和自交后挑选出供体植株并标号为WT1-4-27、WT1-4-30，将其作为游离小孢子培养的供体植株；
3）优异DH系的创制：先将供体植株进行春化保存，再将供体植株定植，使定植的植株待生长出花蕾后培养创制萝卜植株，对创制的萝卜植株进行倍体鉴定；
4）二倍体的根肿病抗性检验：将加倍处理后的再生植株18个二倍体基因型通过自交授粉后获得种子，在萝卜2片真叶时使用菌液用苗期鉴定和苗圃鉴定相结合的方法进行根肿病抗性鉴定；
5）DH系加倍：将优异的康根肿病DH材料经自交授粉、播种、修剪处理、春化处理、定植、授粉，获得四倍体种子；
6）四倍体亲本加工适应性：将4份材料的抗根肿病四倍体材料进行加工适用性检验；
7)适宜加工的抗根肿病萝卜种质的创制。
2.根据权利要求1所述的一种萝卜种质的创制方法，其特征在于：步骤2）中二环系父本WD-1与二环系母本TD-1进行杂交，对后代自交得到杂交后代，对杂交后代自交3.代后筛出供体植株并标号为WT1-4-27、WT1-4-30。
3.根据权利要求2所述的一种萝卜种质的创制方法，其特征在于：步骤3）中优异DH系的创制按如下步骤进行：
a、供体材料的保存：将供体植株以吸水纸全包裹后，放入塑料袋中，保存在0-1℃的冷库中进行40天春化处理；
b、供体材料定植：春化结束后将供体植株定植于温度在10-20℃的温室内，待第一朵花开花后，保持温度在10-15℃。
4.根据权利要求3所述的一种萝卜种质的创制方法，其特征在于：步骤3）中优异DH系的创制步骤还包括：
c、萝卜DH系的创制：待定植的植株生长出第一朵花后，去掉主枝花蕾，使一级侧枝抽枝开花，待1级侧枝有4-6朵花时，采摘顶部花蕾，选取长2-3mm花蕾，摘除剩余花蕾，使二级分枝抽枝开花；
d、将选取的萝卜花蕾在温度为4-6℃的冰箱中预处理24h，用75%的酒精消毒30-40s，再用0.1%的升汞消毒9-10min，无菌水冲洗5-6min，冲洗3次，处理后的花蕾放入无菌研钵中，加入B5洗涤培养基，收集滤液并离心，离心后加入0.1%平阳霉素并进行暗培养，得到以WT1-4-27为供体获得32个再生植株，以WT1-4-30为供体获得25个再生植株，共计57个；
e、对再生植株进行倍性鉴定，鉴定后对单倍体、双倍体进行组培扩繁至10株/基因型，单倍体3周生根后进行加倍处理，剪去1cm根尖，留2cm的根，放入0.2%的秋水仙素中处理8小时。
5.根据权利要求4所述的一种萝卜种质的创制方法，其特征在于：步骤4）中菌液制备步骤如下：
S1、将感根肿病白菜根，利用搅拌器将其搅碎，得到混合物；
S2、将混合物依次用2层和4层纱布进行过滤，得到滤液；
S3、将滤液在4000r/min条件下离心10-15min，弃上清液，收集沉淀；
S4、用蒸馏水将沉淀进行悬浮，步骤S2和S3重复3次，得到根肿病菌沉淀物；
S5、将根肿病菌沉淀物用蒸馏水稀释，使其孢子浓度均为1×107个·L-1，将菌液置于容器内，加葡萄糖至糖浓度为1%，覆盖保鲜膜，32℃以上天气时，在阳光下暴晒2小时后使用，以提升孢子活性。
6.根据权利要求5所述的一种萝卜种质的创制方法，其特征在于：步骤4）中，接种时，用小刀在萝卜苗根部1cm处，沿60°方向切下，向每个穴孔中浇入5ml孢子液，在萝卜基质内1cm粗时调查发病情况，通过苗期鉴定获得抗根肿病材料15份，选取性状优良萝卜4份。
7.根据权利要求6所述的一种萝卜种质的创制方法，其特征在于：步骤5）的具体操作步骤为：将4份优异的康根肿病DH材料自交授粉后，获得DH系种子，将DH系种子播种至培养基质中，在两叶一心时，从基质中取出，清洗2min后剪去1cm主根根尖，留2cm的根，放入0.4%的秋水仙素中处理6-10h，重新栽入培养基质中，在六叶一心时，对加倍成功的萝卜放入冷库进行春化处理40天，定植于拱棚，待开花后授粉，获得四倍体种子。
8.根据权利要求7所述的一种萝卜种质的创制方法，其特征在于：步骤6）中将抗根肿病四倍体材料进行加工适用性检验时，首先将收获萝卜去掉萝卜缨并清洗干净，去掉少许萝卜头，将余下20cm萝卜纵切成8段厚1cm的长条，再将其横切成2段，取皮备用，采用超声波进行消毒，得到预处理好的萝卜皮，而后进行腌制。
9.根据权利要求8所述的一种萝卜种质的创制方法，其特征在于：腌制步骤包括：1）、将预处理好的萝卜皮放入容器中，倒入体积比为1:10的山西老陈醋与食用醋酸，醋面没过萝卜，按1：1000质量，加入体积为1:1的短乳杆菌与维斯氏菌，在4±0.2℃浸泡72h后按重量为100:1.5萝卜皮与食盐的比例，先在容器中放入少许盐，然后按照一层萝卜一层盐，腌制容器至4/5处时，将30%的盐量作面盐撒于顶层，用重于萝卜1.5倍的重物施压于顶层，以加速萝卜渗透脱水，在温度为4±0.2℃时腌制2.5天，脱水约占萝卜总重18%时及时翻缸弃液；
2）、将腌渍后萝卜与食盐按重量100:1.5比例备料，按上述相同工艺完成腌渍并施以重压，在温度为4±0.2℃时腌渍5.5天，脱水占萝卜总重18%时完成腌制，将腌制后的萝卜捞出清洗脱盐、晾干后用超声波消毒备用；
3）、将萝卜与1%葡萄水、米曲霉、酵母菌、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌等混合菌种人工接种在30±0.2℃中发酵5.5天，发酵完成后检测口感、韧性、污染程度等，从中选出口感酸、脆、酱香浓郁、污染查的材料做亲本。
10.根据权利要求9所述的一种萝卜种质的创制方法，其特征在于：步骤7）为，将来源于DH系的四倍体材料为母本TD-1与DH系材料为父本WD-1进行杂交，获得三倍体种质，进行根肿抗病性和加工适应性检验，确定种质性质优良。
CN202111421003.9A 2021-11-26 2021-11-26 一种萝卜种质的创制方法 Pending CN113951133A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111421003.9A CN113951133A (zh) 2021-11-26 2021-11-26 一种萝卜种质的创制方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111421003.9A CN113951133A (zh) 2021-11-26 2021-11-26 一种萝卜种质的创制方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113951133A true CN113951133A (zh) 2022-01-21

Family

ID=79472224

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111421003.9A Pending CN113951133A (zh) 2021-11-26 2021-11-26 一种萝卜种质的创制方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113951133A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116391613A (zh) * 2023-03-27 2023-07-07 南充市农业科学院 一种创制萝卜彩叶新种质的方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116391613A (zh) * 2023-03-27 2023-07-07 南充市农业科学院 一种创制萝卜彩叶新种质的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kailis et al. Producing table olives
Fabbri et al. Olive propagation manual
Bounous et al. Chestnut: botany, horticulture, and utilization
Inden et al. Japanese bunching onion (Allium fistulosum L.)
Barghchi et al. Pistachio (Pistacia vera L.)
Rajan Propagation of horticultural crops
CN104938286B (zh) 一种梨杂交播种育苗方法
CN106688376A (zh) 一种牛油果种苗的培养方法
Parks et al. Propagation and production of Gac (Momordica cochinchinensis Spreng.), a greenhouse case study
CN110637723A (zh) 百香果叶片植株再生快繁技术
Debnath Influence of propagation method a nd indole-3-butyric acid on growth and development of in vitro-and ex vitro-derived lingonberry plants
Mickelbart Sapodilla: A potential crop for subtropical climates
CN113951133A (zh) 一种萝卜种质的创制方法
Pope Papaya culture in Hawaii
Rana et al. Effect of Seed pre-treatment on seed germination and seedling growth of papaya
Gajc-Wolska et al. The Influence of Grafting and Biostimulators on the Yield and Fruit Quality of Greenhouse Tomato CV.(Mill.) Grown in the Field
Yadav et al. Chestnut production and its prospects in Nepal
CN103392592A (zh) 一种四倍体松花菜的培育方法
Desai et al. Papaya
CN106106192A (zh) 一种嘉宝果组织培养体系的建立方法
CN105918109A (zh) 一种紫色快菜选育方法
CN106106121B (zh) 一种叶产虾青素番茄品种的培育方法
Hiwale The pomegranate
KR20210050893A (ko) 백합 조직 배양 방법
CN112544366B (zh) 一种百香果种苗的培育方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20220121

RJ01 Rejection of invention patent application after publication