CN113939308A

CN113939308A - 用于治疗移植物抗宿主病的β-内酰胺酶组合物

Info

Publication number: CN113939308A
Application number: CN202080038667.4A
Authority: CN
Inventors: M·卡拉科; S·康奈利; M·R·M·范登布林克; J·佩莱德; M·B·达席尔瓦
Original assignee: Memorial Sloan Kettering Cancer Center; Synthetic Biologics Inc
Current assignee: Memorial Sloan Kettering Cancer Center; Theriva Biologics Inc
Priority date: 2019-05-06
Filing date: 2020-05-05
Publication date: 2022-01-14
Also published as: WO2020227262A1; CA3136833A1; US20220218800A1; EP3965804A4; AU2020270439A1; KR20220006072A; EP3965804A1; JP2022532162A

Abstract

本发明部分涉及用于使用β‑内酰胺酶剂降低同种异体‑HCT接受者中与IVβ‑内酰胺抗生素使用相关的并发症如aGVHD和VRE定殖和/或VRE血流感染的发生率和/或严重性的方法和组合物。

Description

用于治疗移植物抗宿主病的β-内酰胺酶组合物

技术领域

本发明部分涉及用于降低移植物抗宿主病(GVHD)的发生率和/或严重性的方法和组合物。特别地，本发明部分提供使用一种或多种β-内酰胺酶剂降低GVHD的发生率和/或严重性的方法和组合物。

政府权益

本发明是在政府支持下根据美国国立卫生研究院授予的CA008748进行。政府拥有本发明的某些权利。

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年5月6日提交的美国临时申请号62/843,849的权益，所述申请的全部内容特此以引用的方式整体并入。

以电子方式提交的文本文件的描述

随此以电子方式提交的文本文件的内容以引用的方式整体并入本文：序列表的计算机可读格式拷贝(文件名称：SYN-043PC_ST25.t xt；创建日期：2020年5月4日；文件大小：12,140字节)。

背景技术

同种异体造血干细胞移植(同种异体-HCT)可以是用于白血病和淋巴瘤的治愈性治疗，并且每年用于治疗18,000名患者。然而，移植物抗宿主病(GVHD)是影响20％-50％的同种异体-HCT接受者的主要并发症。约一半的GVHD病例对类固醇有反应。类固醇难治性GVHD，并且特别是胃肠(GI)GVHD是严重的问题，并且占移植后死亡率的约20％。事实上，对小鼠的研究进一步证明，用抗生素治疗患有GVHD的小鼠导致结肠的保护性粘液衬层的丧失和肠道屏障功能的损害。

特别地，在同种异体-HCT患者中观察到肠道微生物群的严重生态失调，这可能是由于发热(尤其是发热性嗜中性粒细胞减少症)的经验性治疗经常需要使用广谱抗生素所致。因此，认为肠道微生物群实际上可调节同种异体-HCT后感染和GVHD的风险。

目前，旨在减轻GI GVHD并发症的有效治疗很少。因此，需要预防或改善GVHD的新策略。

发明内容

本发明尤其提供用于降低与向同种异体-HCT接受者施用静脉内(IV)β-内酰胺抗生素相关的并发症如急性GVHD(aGVHD)和/或万古霉素耐药性肠球菌(VRE)定殖和/或感染的发生率和/或严重性的方法和组合物。在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者施用本文所述的β-内酰胺酶剂来降低与向同种异体-HCT接受者施用静脉内(IV)β-内酰胺抗生素相关的并发症的发生率和/或严重性的方法。在另一个方面，本发明考虑通过向有需要的受试者施用本文所述的β-内酰胺酶剂来降低aGVHD的发生率和/或严重性的方法。在另一方面，本发明考虑通过向有需要的受试者施用本文所述的β-内酰胺酶剂来预防VRE定殖和/或VRE血流感染的方法。在各种实施方案中，所述受试者正被或已被施用IVβ-内酰胺抗生素。

在一些实施方案中，降低与同种异体-HCT相关的并发症(如aGVHD和/或VRE定殖和/或VRE血流感染)的发生率和/或严重性包括预防微生物组的变化。例如，本发明的方法可预防和/或减弱由于微生物多样性的丧失和任何给定细菌菌株的过度生长所致的微生物组单支配(monodomination)。

在各种实施方案中，有发展aGVHD风险的受试者是移植接受者。在另外实施方案中，所述受试者是同种异体-HCT的接受者。在一些实施方案中，所述受试者是骨髓细胞、外周血细胞和脐带细胞中的一者或多者的接受者。

在一些实施方案中，本发明的组合物在移植之前施用。在一些实施方案中，本发明的组合物在移植之后施用。

在各种实施方案中，本文所述的制剂和方法仅在胃肠(GI)道中起作用并因此提供特异性递送，同时避免或减少对β-内酰胺酶剂的全身暴露并使它们的潜在全身效应最小化。在各种实施方案中，所述β-内酰胺酶剂被释放到肠道的一个或多个区域中。在一个实施方案中，所述β-内酰胺酶剂被释放到小肠中。在另一个实施方案中，所述β-内酰胺酶剂被释放到大肠中。

在各种实施方案中，所述微生物组保护剂(例如，β-内酰胺酶剂)可与另外的治疗剂或预防剂(包括但不限于免疫抑制剂(例如，环孢菌素、他克莫司、甲氨蝶呤)、抗体和其他预防aGVHD的免疫调节剂组合施用于受试者。

附图说明

图1示出，哌拉西林的量(μg/g粪便)在接受皮下施用500mg/kg哌拉西林/他唑巴坦每天两次持续两天+通过口服管饲每天两次P3A的液体制剂(例如，磷酸盐缓冲盐水溶液中的β-内酰胺酶)持续两天的小鼠中减少。条形图最左边的条形对应于来自对照小鼠群组的数据；条形图的中间条形对应于来自接受哌拉西林/他唑巴坦但未接受P3A(例如，磷酸盐缓冲盐水溶液中的β-内酰胺酶)的第一小鼠群组的数据；并且条形图最右边的条形对应于来自接受哌拉西林/他唑巴坦和P3A(例如，磷酸盐缓冲盐水溶液中的β-内酰胺酶)两者的第二小鼠群组的数据。

图2示出，小鼠粪便中厚壁菌门的丰度通过单独哌拉西林/他唑巴坦降低，并且当哌拉西林/他唑巴坦与P3A一起施用时，厚壁菌门的丰度倍数得到恢复和保护。条形图最左边的条形对应于来自对照小鼠群组的数据，其中未施用哌拉西林/他唑巴坦或β-内酰胺酶；左边第二个条形对应于来自仅接受P3A的小鼠群组的数据；右边第二个条形对应于来自接受哌拉西林/他唑巴坦但未接受P3A的液体制剂(例如，磷酸盐缓冲盐水溶液中的β-内酰胺酶)的第一小鼠群组的数据；并且条形图最右边的条形对应于来自接受哌拉西林/他唑巴坦和P3A(例如，磷酸盐缓冲盐水溶液中的β-内酰胺酶)两者的第二小鼠群组的数据。

图3示出小鼠粪便中存在的总细菌拷贝数通过哌拉西林/他唑巴坦降低，并且当哌拉西林/他唑巴坦与P3A一起施用时，这种降低减少。条形图最左边的条形对应于来自对照小鼠群组的数据，其中未施用哌拉西林/他唑巴坦或β-内酰胺酶；左边第二个条形对应于来自仅接受P3A的小鼠群组的数据；右边第二个条形对应于来自接受哌拉西林/他唑巴坦但未接受P3A的液体制剂(例如，磷酸盐缓冲盐水溶液中的β-内酰胺酶)的第一小鼠群组的数据；并且条形图最右边的条形对应于来自接受哌拉西林/他唑巴坦和P3A(例如，磷酸盐缓冲盐水溶液中的β-内酰胺酶)两者的第二小鼠群组的数据。

图4示出以骨髓移植(BMT)后30天为终点的存活研究的结果。数据表明，在降低死亡率方面，P3A施用减轻了与骨髓移植相关的抗生素加剧的GVHD。BM是指仅接受骨髓细胞的群组。BM+T是指接受骨髓细胞和脾T淋巴细胞的群组。

图5描绘16S测序分析的结果，其中与来自单独施用哌拉西林/他唑巴坦的小鼠的粪便样品相比，来自施用哌拉西林/他唑巴坦(Zosyn)和SYN-004(P3A)两者的小鼠的粪便样品显示降低的肠球菌属单优势度(monodominance)。盐水组显示最大的条形为梭菌属；Zosyn组显示最大的条形为肠球菌属；并且Zosyn+SYN-004组显示最大的条形为梭菌属。

图6描绘16S测序分析的结果，其中与来自单独施用ZO的小鼠的粪便样品相比，来自施用哌拉西林/他唑巴坦(Zosyn；缩写为ZO)和SYN-004(P3A；缩写为Blact)两者的小鼠的粪便样品显示降低的肠球菌属单优势度。空条形表示特定样品没有扩增。在BM(骨髓)组中：盐水群组显示最大条形为梭菌属；ZO群组显示最大条形为肠球菌属；并且ZO+Blac群组显示最大的条形为左起前两个条形中肠球菌属和左起接下来两个条形中梭菌属。在BM(骨髓)+T细胞组中：盐水群组显示最大条形为梭菌属；ZO群组显示最大条形为肠球菌属；ZO+Blact群组显示最大条形为梭菌属。

图7示出，与单独亚胺培南+西司他丁存在下相比，在亚胺培南+西司他丁以及10mg/kg和50mg/kg剂量的P2A存在下厚壁菌门的丰度倍数得到恢复和保护。

图8描绘16S测序分析的结果，其中与来自仅施用亚胺培南+西司他丁小鼠的粪便样品相比，来自施用亚胺培南+西司他丁和SYN-006(P2A；以10mg/kg和50mg/kg剂量)两者的小鼠粪便样品显示肠球菌属单优势度降低。在亚胺培南组中，抗生素前(“abx前”)群组显示最大条形为乳杆菌属，并且抗生素后(“abx后”)群组显示最大条形为肠球菌属。在亚胺培南+P2A(1mg)组中，抗生素前(“abx前”)群组显示最大条形为梭菌属和乳杆菌属，并且抗生素后(“abx后”)群组显示最大条形为肠球菌属。在亚胺培南+P2A(10mg)组中，抗生素前(“abx前”)群组显示最大条形为乳杆菌属，并且抗生素后(“abx后”)群组显示最大条形为梭菌属。在亚胺培南+P2A(50mg)组中，抗生素前(“abx前”)群组显示最大条形为乳杆菌属，并且抗生素后(“abx后”)群组显示最大条形为乳杆菌属和梭菌属。

图9示出当用单独亚胺培南+西司他丁或与1mg/kg、10mg/kg和50mg/kg剂量的P2A组合治疗时，小鼠粪便中屎肠球菌的相对丰度。

图10示出当施用P2A时以骨髓移植后40天为终点的存活研究的结果。“BM”是指仅接受骨髓细胞的群组。“BM+T”是指接受骨髓细胞和脾T淋巴细胞的群组。

具体实施方式

本发明部分涉及用于降低与向同种异体造血干细胞移植(同种异体-HCT)施用IVβ-内酰胺抗生素相关的各种并发症(包括但不限于，急性移植物抗宿主病(aGVHD)和万古霉素耐药性肠球菌(VRE)定殖和/或VRE血流感染)的发生率和/或严重性的组合物和方法。在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者施用本文所述的β-内酰胺酶剂来降低与向同种异体-HCT接受者施用IVβ-内酰胺抗生素相关的并发症的发生率和/或严重性的方法。在各种实施方案中，所述受试者正被或已被施用IVβ-内酰胺抗生素。

在另一个方面，本发明考虑通过向有需要的受试者施用本文所述的β-内酰胺酶剂来降低aGVHD的发生率和/或严重性的方法。在另一方面，本发明考虑通过向有需要的受试者施用本文所述的β-内酰胺酶剂来预防VRE定殖和/或VRE血流感染和/或降低VRE定殖和/或VRE血流感染的发生率的方法。在各种实施方案中，β-内酰胺酶剂被释放到肠道的一个或多个区域中，在所述一个或多个区域中它维持和/或调节细菌负荷并预防细菌菌株的损失，从而保持微生物组多样性并预防微生物组单支配。

β-内酰胺酶剂

在一些方面，本发明涉及一种或多种β-内酰胺酶，例如用于降低与向同种异体-HCT接受者施用IVβ-内酰胺抗生素相关的并发症(包括但不限于aGVHD和VRE定殖和/或VRE血流感染)的发生率和/或严重性的用途。

如本文所用，β-内酰胺酶是指水解β-内酰胺的酶。β-内酰胺环的酰胺键的水解使抗微生物剂无生物活性。如本文所用，A类β-内酰胺酶(Ambler分类)是指丝氨酸β-内酰胺酶，其中β-内酰胺的水解由活性位点中的丝氨酸介导，通常在α螺旋2的氨基酸位置70处。A类β-内酰胺酶包括但不限于Len-1、SHV-1、TEM-1、PSE-3/PSE-3、ROB-1、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)(如5/B 1型、569/H 1型和569/H 3型)、炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthrasis)属、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)如PenP、韦氏芽孢杆菌(Bacillusweihenstephanensis)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、PC1、Sme-1、NmcA、IMI-、PER-、VEB-、GES-、KPC-、CME-和CTX-M型β-内酰胺酶。

在各个方面，本发明中使用的β-内酰胺酶具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列(即，“SYN-004”或“利巴沙酶(ribaxamase)”或“P3A”，如WO 2011/148041中所述，其全部内容特此以引用的方式并入)。可对此序列进行突变，以生成可由本发明的方法使用的β-内酰胺酶衍生物。

SEQ ID NO:1

TEMKDDFAKLEEQFDAKLGIFALDTGTNRTVAYRPDERFAFASTIKALTVGVLLQQKSIEDLNQRITYTRDDLVNYNPITEKHVDTGMTLKELADASLRYSDNAAQNLILKQIGGPESLKKELRKIGDEVTNPERFEPELNEVNPGETQDTSTARALVTSLRAFALEDKLPSEKRELLIDWMKRNTTGDALIRAGVPDGWEVADKTGAASYGTRNDIAIIWPPKGDPVVLAVLSSRDKKDAKYDNKLIAEATKVVMKALNMNGK.

在一些实施方案中，所述β-内酰胺酶包含与SEQ ID NO:1具有至少约60％(例如，约60％、或约61％、或约62％、或约63％、或约64％、或约65％、或约66％、或约67％、或约68％、或约69％、或约70％、或约71％、或约72％、或约73％、或约74％、或约75％、或约76％、或约77％、或约78％、或约79％、或约80％、或约81％、或约82％、或约83％、或约84％、或约85％、或约86％、或约87％、或约88％、或约89％、或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％)序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，SEQ ID NO:1可在序列的第一个残基之前具有Met和/或Thr。在各种实施方案中，Met可被裂解。如本文所述，可对在第一个残基之前包含Met和/或Thr的序列进行突变，以生成β-内酰胺酶衍生物。在一些实施方案中，前导Thr可相对于另一前导氨基酸(例如，Lys)引起酶的稳定性增加。例如，这样的残基可赋予对氨基肽酶增加的抗性。

本文还提供了SYN-004的核苷酸序列为SEQ ID NO:2：

SEQ ID NO:2

atgactgagatgaaagatgattttgcgaagctggaagaacagtttgacgcaaaattgggcattttcgcgttggacacgggtacgaatcgtacggttgcctaccgtccggacgagcgcttcgccttcgcgagcacgatcaaagccctgaccgtcggcgtgctgctccagcaaaagagcatcgaggacctgaaccagcgcattacctacacccgtgatgatctggtgaactataatccgatcaccgagaaacacgttgataccggtatgaccctgaaagaactggcagatgcaagcctgcgctacagcgataacgcggctcagaatctgattctgaagcaaatcggtggtccggagagcttgaagaaagaactgcgtaaaatcggcgatgaagtcactaatccggagcgttttgagccggagctgaacgaagtgaatccgggtgaaacgcaagacacgagcaccgcgcgtgcgcttgtcacctccctgcgcgctttcgcactggaagataagctgccgtcggagaaacgcgagctgctgatcgactggatgaagcgcaatacgaccggcgacgcgctgattcgtgcgggcgttccggacggttgggaagtggctgacaagaccggtgcggcgagctacggcacccgtaacgatatcgcgatcatttggccacctaaaggtgacccggtcgtgctggccgtactgagcagccgtgacaagaaagacgcaaagtatgataacaagctgattgcagaggcgaccaaagttgttatgaaggcactgaacatgaatggtaag

在一些实施方案中，本发明的多核苷酸可与SEQ ID NO:2具有至少约60％(例如，约60％、或约61％、或约62％、或约63％、或约64％、或约65％、或约66％、或约67％、或约68％、或约69％、或约70％、或约71％、或约72％、或约73％、或约74％、或约75％、或约76％、或约77％、或约78％、或约79％、或约80％、或约81％、或约82％、或约83％、或约84％、或约85％、或约86％、或约87％、或约88％、或约89％、或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％)序列同一性。

在一些实施方案中，β-内酰胺酶(例如，SYN-004)具有显著头孢曲松水解活性。在一些实施方案中，与天然存在的β-内酰胺酶P1A相比，β-内酰胺酶(例如SYN-004)显著更有效地水解头孢曲松。

在说明性实施方案中，所述β-内酰胺酶包含与SEQ ID NO:1具有至少60％序列同一性的氨基酸序列以及Ambler分类的以下各项：在位置232处除丙氨酸(A)以外的疏水性残基；在位置237处除丙氨酸(A)以外的亲水性残基；在位置238处除丙氨酸(A)以外的疏水性残基；在位置240处除丝氨酸(S)以外的亲水性残基；以及在位置276处除天冬氨酸(D)以外的亲水性残基。在一些实施方案中，在位置232处除丙氨酸(A)以外的疏水性残基是甘氨酸(G)。在一些实施方案中，在位置237处除丙氨酸(A)以外的亲水性残基是丝氨酸(S)。在一些实施方案中，在位置238处除丙氨酸(A)以外的疏水性残基是甘氨酸(G)。在一些实施方案中，在位置240处除丝氨酸(S)以外的亲水性残基是天冬氨酸(D)。在一些实施方案中，在位置276处除天冬氨酸(D)以外是天冬酰胺(N)。在一些实施方案中，所述β-内酰胺酶包含A232G、A237S、A238G、S240D和D276N中的一者或多者。在一些实施方案中，所述β-内酰胺酶包含A232G、A237S、A238G、S240D和D276N中的所有，其序列是SEQ ID NO:3，即P4A。在一些实施方案中，所述β-内酰胺酶和/或药物组合物包含与SEQ ID NO:3具有至少90％、或95％、或97％、或99％、或100％序列同一性的氨基酸序列。

SEQ ID NO:3

EMKDDFAKLEEQFDAKLGIFALDTGTNRTVAYRPDERFAFASTIKALTVGVLLQQKSIEDLNQRITTRDDLVNYNPITEKHVDTGMTLKELADASLRYSDNAAQNLILKQIGGPESLKKELRKIGDEVTNPERFEPELNEVNPGETQDTSTARALVTSLRAFALEDKLPSEKRELLIDWMKRNTTGDALIRAGVPDGWEVGDKTGSGDYGTRNDIAIIWPPKGDPVVLAVLSSRDKKDAKYDNKLIAEATKVVMKALNMNGK

在一些实施方案中，本发明的β-内酰胺酶多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少约60％(例如，约60％、或约61％、或约62％、或约63％、或约64％、或约65％、或约66％、或约67％、或约68％、或约69％、或约70％、或约71％、或约72％、或约73％、或约74％、或约75％、或约76％、或约77％、或约78％、或约79％、或约80％、或约81％、或约82％、或约83％、或约84％、或约85％、或约86％、或约87％、或约88％、或约89％、或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％)序列同一性的氨基酸序列。

SEQ ID NO:4源自SEQ ID NO:3，并且还包含QASKT氨基酸的信号和添加(编码区加下划线)：

MIQKRKRTVSFRLVLMCTLLFVSLPITKTSAQASKTEMKDDFAKLEEQFDAKLGIFALDTGTNRTVAY RPDERFAFASTIKALTVGVLLQQKSIEDLNQRITYTRDDLVNYNPITEKHVDTGMTLKELADASLRYSDNAAQNLI LKQIGGPESLKKELRKIGDEVTNPERFEPELNEVNPGETQDTSTARALVTSLRAFALEDKLPSEKRELLIDWMKRN TTGDALIRAGVPDGWEVGDKTGSGDYGTRNDIAIIWPPKGDPVVLAVL SSRDKKDAKYDNKLIAEATKVVMKALNMNGK

在一些实施方案中，本发明的β-内酰胺酶多肽包含与SEQ ID NO:4具有至少约60％(例如，约60％、或约61％、或约62％、或约63％、或约64％、或约65％、或约66％、或约67％、或约68％、或约69％、或约70％、或约71％、或约72％、或约73％、或约74％、或约75％、或约76％、或约77％、或约78％、或约79％、或约80％、或约81％、或约82％、或约83％、或约84％、或约85％、或约86％、或约87％、或约88％、或约89％、或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％)序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述β-内酰胺酶和/或药物组合物包含与SEQ ID NO:4具有至少90％、或95％、或97％、或99％、或100％序列同一性的氨基酸序列。

本发明的说明性多核苷酸是SEQ ID NO:5，其为A232G、A237S、A238G、S240D和D276N突变体、Hind III位点(AAGCTT以粗体显示)以及附加的K和T氨基酸的全核苷酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:5的加下划线部分被省略。前导序列和附加的核苷酸(HindIII位点以及K和T氨基酸—用于添加氨基酸序列QASKT)加下划线。

在一些实施方案中，本发明的多核苷酸与SEQ ID NO:5(有或没有加下划线部分)具有至少约60％(例如，约60％、或约61％、或约62％、或约63％、或约64％、或约65％、或约66％、或约67％、或约68％、或约69％、或约70％、或约71％、或约72％、或约73％、或约74％、或约75％、或约76％、或约77％、或约78％、或约79％、或约80％、或约81％、或约82％、或约83％、或约84％、或约85％、或约86％、或约87％、或约88％、或约89％、或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％)序列同一性。

在各个方面中，所述β-内酰胺酶多肽具有SEQ ID NO:6(即，P2A)的序列或者由SEQID NO:6的一个或多个突变衍生：

ETGTISISQLNKNVWVHTELGYFNGEAVPSNGLVLNTSKGLVLVDSSWDNKLTKELIEMVEKKFQKRVTDVIITHAHADRIGGITALKERGIKAHSTALTAELAKNSGYEEPLGDLQTITSLKFGNTKVETFYPGKGHTEDNIVVWLPQYQILAGGCLVKSAEAKDLGNVADAYVNEWSTSIENVLKRYGNINSVVPGHGEVGDKGLLLHTLDLLK.

在一些实施方案中，本发明的β-内酰胺酶多肽包含与SEQ ID NO:6具有至少约60％(例如，约60％、或约61％、或约62％、或约63％、或约64％、或约65％、或约66％、或约67％、或约68％、或约69％、或约70％、或约71％、或约72％、或约73％、或约74％、或约75％、或约76％、或约77％、或约78％、或约79％、或约80％、或约81％、或约82％、或约83％、或约84％、或约85％、或约86％、或约87％、或约88％、或约89％、或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％)序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述β-内酰胺酶和/或药物组合物包含与SEQ ID NO:6具有至少90％、或95％、或97％、或99％、或100％序列同一性的氨基酸序列。

β-内酰胺酶(包括P1A(即SEQ ID NO:1，除了位置276是D而不是N)、P2A、P3A/SYN-004和P4A及其衍生物)的附加序列例如在WO 2011/148041和PCT/US2015/026457中进行描述，所述专利的全部内容特此以引用的方式并入。

此外，所述β-内酰胺酶多肽可包含来自SEQ ID NO:1的第一个残基的附加上游残基(参见例如，JBC 258(18):11211,1983，所述文献的内容特此以引用的方式并入-包括penP和penP1的大外型和小外型型式)。此外，所述β-内酰胺酶多肽还可包含来自SEQ IDNO:1的最后残基的附加下游残基。

在一些实施方案中，所述β-内酰胺酶包含相对于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的一个或多个(例如，约1、或约2、或约3、或约4、或约5、或约6、或约7、或约8、或约9、或约10个)突变。在一些实施方案中，所述β-内酰胺酶包含SYN-004的变体，例如与SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％同一性的序列。在各种实施方案中，SEQ ID NO:1的一个或多个氨基酸被天然存在的氨基酸取代，如亲水性氨基酸(例如，极性且带正电荷的亲水性氨基酸，如精氨酸(R)或赖氨酸(K)；极性且带中性电荷的亲水性氨基酸，如天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、脯氨酸(P)和半胱氨酸(C)；极性且带负电荷的亲水性氨基酸，如天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)；或芳香族、极性且带正电荷的亲水性氨基酸，如组氨酸(H))；或疏水性氨基酸(例如，疏水性脂肪族氨基酸，如甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)或缬氨酸(V)；疏水性芳香族氨基酸，如苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)或酪氨酸(Y)；或非经典氨基酸(例如，硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸、N-甲酰甲硫氨酸β-丙氨酸、GABA和δ-氨基乙酰丙酸、4-氨基苯甲酸(PABA)、常见氨基酸的D-异构体、2,4-二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、γ-Abu、ε-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、半胱氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟代-氨基酸、设计者氨基酸如β甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸以及一般的氨基酸类似物)。在一些实施方案中，SEQ ID NO:1可在序列的第一个残基之前具有Met和/或Thr。这些残基可如以上类似地突变。

说明性突变体包括：

在所有这些突变体中，残基的编号对应于SEQ ID NO:1。这些残基编号可转换为Ambler编号(Ambler等人,1991,“A standard numbering scheme for the Class Aβ-lactamases,”Biochem.J.276:269-272，其内容特此以引用的方式并入)，通过使用任何常规生物信息学方法，例如通过使用BLAST(基本局部比对搜索工具)或FASTA(FAST-AII)。

在各种实施方案中，本发明中使用的β-内酰胺酶在细菌细胞如大肠杆菌细胞中产生(参见例如PCT/US15/47187，其全部内容特此以引用的方式并入)。

在各种实施方案中，本发明的β-内酰胺酶水解β-内酰胺。β-内酰胺环的酰胺键的水解使抗微生物剂无生物活性。β-内酰胺抗生素的实例对于本领域的技术人员将是显而易见的。静脉内β-内酰胺抗生素的说明性实例包括但不限于青霉素类(哌拉西林/他唑巴坦)、头孢菌素类(头孢吡肟)和/或碳青霉烯类(美罗培南；亚胺培南/西司他丁)。

治疗方法

在一些方面，本发明提供了用于降低与向同种异体-HCT接受者施用IVβ-内酰胺抗生素相关的并发症的发生率和/或严重性的组合物和方法，所述并发症包括但不限于aGVHD和/或VRE定殖和/或VRE血流感染和/或一种或多种多重耐药性病原体的定殖、定殖的扩增或单支配。

在一些实施方案中，单支配包括受试者的微生物组内约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％或约35％的微生物群是单一生物体。

在特定实施方案中，本发明提供用于预防VRE定殖和/或VRE血流感染的组合物和方法。在一些实施方案中，本发明的方法预防与VRE定殖和/或VRE血流感染相关的肠道生态失调。

在一些方面，提供了一种预防移植接受者中的VRE定殖和/或VRE血流感染的方法，所述方法包括施用本发明的β-内酰胺酶剂。

在一些方面，提供了一种预防移植接受者中一种或多种多重耐药性生物体的定殖和/或血流感染的方法，所述方法包括施用本发明的β-内酰胺酶剂。在一些实施方案中，本发明的方法预防与一种或多种多重耐药性生物体的定殖和/或血流感染相关的肠道生态失调。

例如，在各种实施方案中，本发明的方法可用于治疗或预防由以下病原体中的一者或多者引起的感染：嗜水气单胞菌；芽孢杆菌属，例如蜡样芽孢杆菌；双歧杆菌属；博德特氏菌属；疏螺旋体属；布鲁氏菌属；伯克霍尔德氏菌；艰难梭菌；弯曲杆菌属，例如，胎儿弯曲杆菌和空肠弯曲杆菌；衣原体属；嗜衣原体；梭菌属，例如肉毒梭菌、艰难梭菌(先前为艰难梭菌)和产气荚膜梭菌；棒状杆菌属；柯克斯氏体属；埃立克体属；肠杆菌科，例如碳青霉烯耐药性肠杆菌科(CRE)和超广谱产β-内酰胺酶肠杆菌科(ESBL-E)、氟喹诺酮耐药性肠杆菌科；肠球菌属，例如万古霉素耐药性肠球菌属某种、超广谱β-内酰胺耐药性肠球菌(ESBL)和万古霉素耐药性肠球菌(VRE)；埃希氏菌属，例如肠集聚性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠毒素性大肠杆菌(如但不限于LT和/或ST)、大肠杆菌0157:1-17和多重耐药性细菌大肠杆菌；弗朗西斯氏菌属；嗜血杆菌属；螺杆菌属，例如幽门螺杆菌；克雷伯氏菌属，例如肺炎克雷伯氏菌和多重耐药性细菌克雷伯氏菌；军团杆菌属；钩端螺旋体属；李斯特氏菌属，例如单核细胞增多性李斯特氏菌；摩根氏菌属；分枝杆菌属；支原体；奈瑟氏菌属；东方体属；类志贺邻单胞菌；抗生素耐药性变形菌门；变形杆菌属；假单胞菌属；立克次氏体属；沙门氏菌属，例如副伤寒沙门氏菌、沙门氏菌属某种和伤寒沙门氏菌；志贺氏菌属，例如志贺氏菌属某种；葡萄球菌属例如，金黄色葡萄球菌和葡萄球菌属某种；链球菌属；密螺旋体属；弧菌属，例如霍乱弧菌、副溶血弧菌、弧菌属某种和创伤弧菌；以及耶尔森氏菌属，例如小肠结肠炎耶尔森氏菌。

在各种实施方案中，本发明的方法可用于治疗或预防抗生素耐药性细菌的感染，所述抗生素耐药性细菌例如抗生素耐药性变形菌门、VRE、碳青霉烯耐药性肠杆菌科(CRE)、氟喹诺酮耐药性肠杆菌科和超广谱产β-内酰胺酶肠杆菌科(ESBL-E)。

在特定实施方案中，本发明提供用于降低aGVHD的发生率和/或严重性的组合物和方法。在各种实施方案中，有发展aGVHD风险的受试者是移植接受者。在另外实施方案中，所述受试者是同种异体-HCT的接受者。在一些实施方案中，所述受试者是骨髓细胞、外周血细胞和脐带细胞中的一者或多者的接受者。在各种实施方案中，有发展aGVHD风险的受试者正在或已被施用IVβ-内酰胺抗生素。

在一些实施方案中，本发明的方法预防与aGVHD相关的肠道生态失调。在各种实施方案中，本发明的方法预防与aGVHD相关的肠道微生物群多样性的丧失。例如，本发明的方法考虑施用用于调节和/或降低与aGVHD相关的任何给定细菌菌株(例如肠球菌属)的单支配的组合物。本发明的另外实施方案提供用于预防已经历移植的受试者中微生物组多样性减少的组合物和方法。

在一些方面，提供了一种降低移植接受者中aGVHD的发生率和/或严重性的方法，所述方法包括施用本发明的β-内酰胺酶剂。例如，降低aGVHD的严重性可包括将接受β-内酰胺酶的患者的aGVHD等级降低至低于IV的等级，所述IV被归类为最严重形式的aGVHD；或者将aGVHD降低一个或多个等级(例如，III级至II级)。

在实施方案中，本发明的方法涉及降低移植接受者中aGVHD的发生率和/或严重性。在实施方案中，移植接受者是癌症患者，例如已接受或正在接受放射疗法或化学疗法并随后接受同种异体-HCT的患者。在实施方案中，移植接受者患有血液或骨髓癌症。在实施方案中，移植接受者是造血干细胞移植的接受者。在某些实施方案中，癌症选自白血病、淋巴瘤、骨髓瘤和骨髓增生异常。在某些实施方案中，癌症选自骨肉瘤、尤文氏肿瘤、脊索瘤和软骨肉瘤。

aGVHD是从供体移植至接受者的细胞或组织的退化，其是由于接受者的免疫系统识别所述细胞或组织为外来所致。因此，由于I类MHC存在于身体的更多细胞上，因此最合乎需要的是从具有最高匹配的I类MHC特征、然后是最高匹配的II类MHC特征的人移植细胞和组织。因此，在大多数移植接受者中，aGVHD是由于免疫系统对错配的II类MHC分子和其他多态性蛋白质(次要组织相容性抗原)的激活。

用于治疗血液和骨髓癌症的一种选择是例如通过放射疗法或化学疗法杀死现有的血液和骨髓细胞，并从健康供体移植类似的细胞，称为同种异体造血干细胞移植(同种异体-HCT)。

在实施方案中，本发明的方法涉及急性和慢性形式的GVHD。经典急性或暴发形式的疾病(aGVHD)通常在移植后的前100天内观察到，并且由于相关的发病率和死亡率它对移植物的有效性是重大挑战。慢性形式的移植物抗宿主病(cGVHD)通常发生在100天之后。中度至重度cGVHD病例的出现对长期存活产生不利影响。骨髓移植后，移植物中存在的T细胞(无论是作为污染物还是有意引入宿主中)在将宿主组织感知为抗原性外来物后攻击移植接受者的组织。T细胞产生过量的细胞因子，包括TNFα和干扰素-γ(IFNγ)。cGVHD中的组织损伤主要是由于纤维化。广泛范围的宿主抗原可引发移植物抗宿主病，其中包括人白细胞抗原(HLA)。然而，即使当HLA相同的兄弟姐妹是供体时也可能发生GVHD。aGVHD的特征在于对肝脏、皮肤和粘膜以及胃肠道的选择性损伤。aGVHD中的组织损伤主要是由于细胞凋亡。aGVHD严重性基于病变/皮疹(皮肤)的范围和类型、腹泻量(胃肠)和血清胆红素水平(肝脏)按I(轻度)至IV(非常严重)的等级分级。cGVHD的特征在于比aGVHD更广泛的组织分布。皮肤和肺连同胃肠道、肝脏、眼睛、肌肉骨骼系统和造血系统一起被认为是cGVHD中的主要靶器官。在同种异体HCT的前2周内可能发生超急性和快速致命形式的aGVHD，通常是由于HLA错配或GVHD预防不足。与cGVHD相关的风险因素在针对先前aGVHD调整后通常不会改变，从而表明cGVHD不仅仅是先前aGVHD的演变。

在实施方案中，本发明的方法涉及降低aGVHD的发生率和/或严重性。在实施方案中，本发明的方法预期将β-内酰胺酶施用于用IVβ-内酰胺抗生素治疗并且具有一种或多种aGVHD风险因素(如HLA“错配”或不相关供体、年龄较大的患者、女性供体至男性接受者、预处理方案(conditioning regimen)的强度或预处理方案期间的全身照射以及供体淋巴细胞输注)的患者。在实施方案中，本发明的方法降低aGVHD症状(如皮疹、胃肠道病症和肝脏症状)的发生率和/或严重性。

在实施方案中，本发明的方法涉及如比林汉姆标准中的一个或多个所定义的GVHD：1)施用具有存活和功能性免疫细胞的免疫活性移植物；2)接受者是免疫组织不相容的；和3)接受者免疫功能低下并且因此不能破坏或灭活移植的细胞。

制剂/改良释放特征

在各种实施方案中，本发明采用包含至少一种β-内酰胺酶的改良释放制剂，其中所述制剂将大量的β-内酰胺酶释放到胃肠道的一个或多个区域中。在一些实施方案中，β-内酰胺酶是SYN-004(又名P3A)，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，或其变体(例如，如上所述)。在一些实施方案中，β-内酰胺酶是SYN-006(又名P2A)或其变体。例如，制剂可在胃之后释放至少约60％的β-内酰胺酶(例如SYN-004或SYN-006)并进入胃肠道的一个或多个区域。

在各种实施方案中，本发明的改良释放制剂被设计为立即释放(例如，在摄入时)。在各种实施方案中，改良释放制剂可具有持续释放特征，即活性成分在身体(例如，胃肠道)中在延长的时间段内缓慢释放。在各种实施方案中，改良释放制剂可具有延迟释放特征，即在摄入时不立即释放活性成分；而是，推迟活性成分的释放，直到组合物在胃肠道中下部；例如，用于在小肠(例如，十二指肠、空肠、回肠中的一者或多者)或大肠(例如，盲肠、结肠的升部、横部、降部或乙状结肠部分以及直肠中的一者或多者)中释放。例如，组合物可被肠溶包衣以延迟活性成分的释放，直到它到达小肠或大肠。在一些实施方案中，粪便中不存在大量本发明制剂的活性成分。

在各种实施方案中，本发明的改良释放制剂在胃之后释放至少60％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)至肠的一个或多个区域中。例如，改良释放制剂在肠中释放至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)。

在各种实施方案中，本发明的改良释放制剂在小肠中释放至少60％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)。例如，改良释放制剂在小肠中释放至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)。

在一个实施方案中，本发明的改良释放制剂在十二指肠中释放至少60％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)。例如，改良释放制剂在十二指肠中释放至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)。

在一个实施方案中，本发明的改良释放制剂在空肠中释放至少60％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)。例如，改良释放制剂在空肠中释放至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)。

在一个实施方案中，本发明的改良释放制剂在回肠和/或回盲部(ileocecaljunction)中释放至少60％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)。例如，改良释放制剂在回肠和/或回盲部中释放至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)。

在各种实施方案中，本发明的改良释放制剂在大肠中释放至少60％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)。例如，改良释放制剂在大肠中释放至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)。

在一个实施方案中，本发明的改良释放制剂在盲肠中释放至少60％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)。例如，改良释放制剂在盲肠中释放至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)。

在一个实施方案中，本发明的改良释放制剂在升结肠中释放至少60％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)。例如，改良释放制剂在升结肠中释放至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)。

在一个实施方案中，本发明的改良释放制剂在横结肠中释放至少60％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)。例如，改良释放制剂在横结肠中释放至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)。

在一个实施方案中，本发明的改良释放制剂在降结肠中释放至少60％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)。例如，改良释放制剂在降结肠中释放至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)。

在一个实施方案中，本发明的改良释放制剂在乙状结肠中释放至少60％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)。例如，改良释放制剂在乙状结肠中释放至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)。

在各种实施方案中，改良释放制剂在胃中基本上不释放β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)。

在某些实施方案中，改良释放制剂在特定pH下释放β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)。例如，在一些实施方案中，改良释放制剂在酸性环境中基本上稳定并且在接近中性至碱性环境中基本上不稳定(例如，快速溶解或物理不稳定)。在一些实施方案中，稳定性指示基本上不释放，而不稳定性指示基本上释放。例如，在一些实施方案中，改良释放制剂在约7.0或更低、或约6.5或更低、或约6.0或更低、或约5.5或更低、或约5.0或更低、或约4.5或更低、或约4.0或更低、或约3.5或更低、或约3.0或更低、或约2.5或更低、或约2.0或更低、或约1.5或更低、或约1.0或更低的pH下基本上稳定。在一些实施方案中，本发明的制剂在较低pH区域中是稳定的，并且因此基本上不会在例如胃中释放。在一些实施方案中，改良释放制剂在约1至约4或更低的pH下基本上稳定，并且在更大的pH值下基本上不稳定。在这些实施方案中，改良释放制剂基本上不在胃中释放。在这些实施方案中，改良释放制剂基本上在小肠(例如，十二指肠、空肠和回肠中的一者或多者)和/或大肠(例如，盲肠、升结肠、横结肠、降结肠和乙状结肠中的一者或多者)中释放。在一些实施方案中，改良释放制剂在约4至约5或更低的pH下基本上稳定，并且因此在更大的pH值下基本上不稳定，且因此基本上不在胃和/或小肠(例如，十二指肠、空肠和回肠中的一者或多者)中释放。在这些实施方案中，改良释放制剂基本上在大肠(例如，盲肠、升结肠、横结肠、降结肠和乙状结肠中的一者或多者)中释放。在各种实施方案中，本文所述的pH值可如本领域中已知的那样调节以说明受试者的状态，例如，是处于禁食状态还是餐后状态。

在一些实施方案中，改良释放制剂在胃液中基本上稳定并且在肠液中基本上不稳定，并且因此基本上在小肠(例如，十二指肠、空肠和回肠中的一者或多者)和/或大肠(例如，盲肠、升结肠、横结肠、降结肠和乙状结肠中的一者或多者)中释放。

在一些实施方案中，改良释放制剂在胃液中稳定或在酸性环境中稳定。这些改良释放制剂在约15、或约30、或约45、或约60或约90分钟内在pH为约4至约5或更低的胃液、或pH为约4至约5或更低的模拟胃液中释放约30重量％或更少的β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)和/或所述改良释放制剂中的另外治疗剂。本发明的改良释放制剂可在约15、或约30、或约45、或约60或约90分钟内在pH为4-5或更低的胃液、或pH为4-5或更低的模拟胃液中释放约0重量％至约30重量％、约0重量％至约25重量％、约0重量％至约20重量％、约0重量％至约15重量％、约0重量％至约10重量％、约5重量％至约30重量％、约5重量％至约25重量％、约5重量％至约20重量％、约5重量％至约15重量％、约5重量％至约10重量％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)和/或所述改良释放制剂中的另外治疗剂。本发明的改良释放制剂可在约15、或约30、或约45、或约60或约90分钟内在pH为5或更低的胃液、或pH为5或更低的模拟胃液中释放约1重量％、约2重量％、约3重量％、约4重量％、约5重量％、约6重量％、约7重量％、约8重量％、约9重量％或约10重量％的总β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)和/或所述改良释放制剂中的另外治疗剂。

在一些实施方案中，改良释放制剂在肠液中不稳定。这些改良释放制剂在约15、或约30、或约45、或约60或约90分钟内在肠液或模拟肠液中释放约70重量％或更多的β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)和/或所述改良释放制剂中的另外治疗剂。在一些实施方案中，改良释放制剂在接近中性至碱性的环境中不稳定。这些改良释放制剂在约15、或约30、或约45、或约60或约90分钟内在pH为约4-5或更高的肠液、或pH为约4-5或更高的模拟肠液中释放约70重量％或更多的β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)和/或所述改良释放制剂中的另外治疗剂。在接近中性或碱性环境中不稳定的改良释放制剂可在约5分钟至约90分钟、或约10分钟至约90分钟、或约15分钟至约90分钟、或约20分钟至约90分钟、或约25分钟至约90分钟、或约30分钟至约90分钟、或约5分钟至约60分钟、或约10分钟至约60分钟、或约15分钟至约60分钟、或约20分钟至约60分钟、或约25分钟至约90分钟或约30分钟至约60分钟内在pH大于约5的流体(例如，pH为约5至约14、约6至约14、约7至约14、约8至约14、约9至约14、约10至约14、或约11至约14的流体)中释放70重量％或更多的β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)和/或所述改良释放制剂中的另外治疗剂。

模拟胃液和模拟肠液的实例包括但不限于2005药典23NF/28USP中在第2858页Test Solutions中公开的那些和/或本领域技术人员已知的其他模拟胃液和模拟肠液，例如，在没有酶的情况下制备的模拟胃液和/或肠液。

在一个实施方案中，改良释放制剂可在胃液中保持基本上完整，或者可基本上不溶。改良释放制剂可包含一种或多种pH依赖性的延迟释放包衣。pH依赖性的延迟释放包衣在酸性环境(约5或更低的pH)中将是基本上稳定的，并且在接近中性至碱性环境(pH大于约5)中基本上不稳定。例如，延迟释放包衣可在接近中性至碱性环境中基本上崩解或溶解，如在小肠(例如，十二指肠、空肠和回肠中的一者或多者)和/或大肠(例如，盲肠、升结肠、横结肠、降结肠和乙状结肠中的一者或多者)中发现的。

可替代地，改良释放制剂的稳定性可以是酶依赖性的。在此类实施方案中，改良释放制剂可包含一种或多种酶依赖性的延迟释放包衣。酶依赖性的延迟释放包衣在不含特定酶的流体中将是基本上稳定的，并且在含有酶的流体中基本上不稳定。延迟释放包衣将在含有适当酶的流体中基本上崩解或溶解。可例如通过使用仅在暴露于肠中的酶如半乳甘露聚糖时释放活性成分的材料来实现酶依赖性控制。此外，在肠道菌群中存在微生物酶的情况下，改良释放制剂的稳定性可取决于酶的稳定性。

在各种实施方案中，包含β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006或其变体)的改良释放制剂在食糜中基本上稳定。例如，在一些实施方案中，在施用后约10、或9、或8、或7、或6、或5、或4、或3、或2、或1小时内β-内酰胺酶活性的损失小于约50％或约40％、或约30％、或约20％、或约10％。

在一些实施方案中，提供双脉冲制剂。在各种实施方案中，本发明提供在沿着肠的不同位置、在不同时间和/或在不同pH下释放多个剂量的β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)的改良释放制剂。在一个说明性实施方案中，改良释放制剂包含第一剂量的β-内酰胺酶和第二剂量的β-内酰胺酶，其中所述第一剂量和所述第二剂量在沿着肠的不同位置、在不同时间和/或在不同pH下释放。例如，第一剂量在十二指肠释放，并且第二剂量在回肠释放。在另一个实例中，第一剂量在空肠释放，并且第二剂量在回肠释放。在其他实施方案中，第一剂量在沿着小肠的位置(例如，十二指肠)释放，而第二剂量沿着大肠(例如，升结肠)释放。在各种实施方案中，改良释放制剂可在沿着肠的不同位置、在不同时间和/或在不同pH下释放至少一个剂量、至少两个剂量、至少三个剂量、至少四个剂量、至少五个剂量、至少六个剂量、至少七个剂量或至少八个剂量的β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)。此外，本文的双脉冲描述适用于释放β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)和另外治疗剂的改良释放制剂。

在各种实施方案中，本发明使用β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)的改良释放制剂，所述改良释放制剂还可包含药学上可接受的载体或赋形剂。本领域技术人员将认识到，所述制剂可呈适合于所需用途和施用途径的任何合适的形式。

在一些实施方案中，包含β-内酰胺酶(和/或另外的治疗剂)的改良释放制剂的施用是口服、静脉内和胃肠外中的任一种。在一些实施方案中，包含β-内酰胺酶(和/或另外的剂)的改良释放制剂的施用不是静脉内的，以便例如防止对全身施用的抗生素的干扰。在其他实施方案中，施用途径包括例如：口服、皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、舌下、鼻内、脑内、阴道内、透皮、直肠、通过吸入或局部，特别是施用至耳、鼻、眼或皮肤。

可口服施用包含如本文所述的β-内酰胺酶(和/或另外的治疗剂)的任何改良释放制剂。此类本发明制剂也可通过任何其它方便的途径施用，例如通过静脉内输注或弹丸式注射，通过经由上皮或粘膜皮肤衬层(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，并且可与另外的治疗剂一起施用。施用可以是全身性的或局部的。在一些实施方案中，施用不在感染部位，以避免例如抗生素在感染部位水解。各种递送系统是已知的，例如，包封在脂质体、微粒、微胶囊、胶囊等中，并且可用于施用。在具体实施方案中，向需要治疗的区域局部施用可为希望的。

用于口服使用的合适剂型包括例如固体剂型，如片剂、可分散粉末、颗粒剂和胶囊。在一个实施方案中，改良释放制剂呈胶囊形式。在另一个实施方案中，改良释放制剂呈片剂形式。在又一个实施方案中，改良释放制剂呈软凝胶胶囊的形式。在另一实施方案中，改良释放制剂呈明胶或羟丙基甲基纤维素(HPMC)胶囊的形式。

在一些剂型中，将本文所述的剂与至少一种惰性、药学上可接受的赋形剂或载体，诸如柠檬酸钠、磷酸二钙等，和/或a)填充剂或增量剂，诸如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、硅酸、微晶纤维素和面包师专用糖等；b)粘合剂，例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、阿拉伯胶、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、羟丙基纤维素(HPC)和羟甲基纤维素等；c)湿润剂，诸如甘油等；d)崩解剂，诸如琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐、碳酸钠、交联聚合物，诸如交聚维酮(交联聚乙烯吡咯烷酮)、交联羧甲基纤维素钠(交联的羧甲基纤维素钠)、羟基乙酸淀粉钠等；e)溶液阻溶剂(solution retarding agent)，诸如，石蜡等；f)吸收促进剂，诸如，季铵化合物等；g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯等；h)吸附剂，诸如，高岭土和膨润土粘土等；以及i)润滑剂，诸如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠、山嵛酸甘油酯(glyceryl behenate)等以及此类赋形剂的混合物混合。本领域技术人员将认识到，特定的赋形剂在口服剂型中可具有两种或更多种功能。在口服剂型例如胶囊或片剂的情况下，剂型还可包含缓冲剂。

改良释放制剂可另外包含表面活性剂。适合用于本发明的表面活性剂包括但不限于任何药学上可接受的无毒表面活性剂。适用于本发明组合物的表面活性剂种类包括但不限于聚乙氧基化脂肪酸、PEG-脂肪酸二酯、PEG-脂肪酸单酯和二酯混合物、聚乙二醇甘油脂肪酸酯、醇-油酯交换产物、聚甘油脂肪酸、丙二醇脂肪酸酯、丙二醇酯-甘油酯的混合物、甘油单酯和甘油二酯、甾醇和甾醇衍生物、聚乙二醇脱水山梨糖醇脂肪酸酯、聚乙二醇烷基醚、糖酯、聚乙二醇烷基酚、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物、脱水山梨糖醇脂肪酸酯、低级醇脂肪酸酯、离子表面活性剂以及它们的混合物。在一些实施方案中，本发明的组合物可包含一种或多种表面活性剂，包括但不限于月桂基硫酸钠、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80和柠檬酸三乙酯。

改良释放制剂还可包含药学上可接受的增塑剂以获得所需的机械性质，如柔性和硬度。此类增塑剂包括但不限于三乙酸甘油酯、柠檬酸酯、柠檬酸三乙酯、邻苯二甲酸酯、癸二酸二丁酯、鲸蜡醇、聚乙二醇、聚山梨醇酯或其他增塑剂。

改良释放制剂还可包含一种或多种施加溶剂。可用于施加例如延迟释放包衣组合物的更常见溶剂中的一些包括异丙醇、丙酮、二氯甲烷等。

改良释放制剂还可包含一种或多种碱性材料。适合用于本发明组合物的碱性材料包括但不限于酸诸如磷酸、碳酸、柠檬酸的钠盐、钾盐、钙盐、镁盐和铝盐以及其他铝/镁化合物。此外，碱性材料可选自抗酸剂材料，诸如氢氧化铝、氢氧化钙、氢氧化镁和氧化镁。

固体口服剂型可通过例如将本发明的剂与一种或多种合适的赋形剂制粒(例如湿法或干法制粒)来制备。或者，可使用常规方法例如流化床或锅包衣将本发明的剂层积到惰性核(例如，那普瑞尔(nonpareil)/糖球，如蔗糖球或二氧化硅球)上，或使用本领域中已知的方法挤出和滚圆成含活性化合物的小丸。在实施方案中，将β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)喷涂到蔗糖球上。然后可使用常规方法将此类小丸掺入片剂或胶囊中。

除活性剂之外，悬浮液还可含有助悬剂，例如像乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂、黄蓍胶等，以及它们的混合物。

除惰性稀释剂外，口服组合物还可包含佐剂，如甜味剂、调味剂和芳香剂。

适于肠胃外施用(例如，静脉内、肌内、腹膜内、皮下和关节内注射和输注)的剂型包括例如溶液、悬浮液、分散液、乳液等。它们也可以无菌固体组合物(例如，冻干组合物)的形式制造，可将其在即将使用时溶解或悬浮在无菌注射介质中。它们可含有例如本领域已知的助悬剂或分散剂。

包含β-内酰胺酶(和/或另外治疗剂)的制剂可方便地以单位剂量的形式提供并且可通过制药领域所熟知的任何方法进行制备。此类方法一般包括将治疗剂结合于由一种或多种附加成份所构成的载体中的步骤。通常，通过将治疗剂与液体载体(例如，磷酸盐缓冲盐水)、细分的固体载体或两者均匀且紧密地结合在一起，然后如果需要，将产品成型为所需制剂的剂型(例如，湿法或干法制粒、粉末共混物等，然后使用本领域已知的常规方法压片)来制备制剂。

在各种实施方案中，本发明的改良释放制剂可利用一种或多种改良释放包衣诸如延迟释放包衣来提供β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)与任选的其他另外治疗剂的有效、延迟但基本递送至胃肠道。

在一个实施方案中，延迟释放包衣包括在酸性环境中基本上稳定且在接近中性至碱性环境中基本上不稳定的肠溶剂。在一个实施方案中，延迟释放包衣含有在胃液中基本上稳定的肠溶剂。肠溶剂可选自例如甲基丙烯酸共聚物、邻苯二甲酸醋酸纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、聚乙酸乙烯邻苯二甲酸酯、羧甲基乙基纤维素和

型聚合物(聚(甲基丙烯酸，甲基丙烯酸甲酯)、乙酸琥珀酸羟丙基甲基纤维素)、乙酸偏苯三酸纤维素、虫胶或其他合适的肠溶包衣聚合物的溶液或分散液。

型聚合物包括例如

FS 30D、L 30 D-55、L 100-55、L 100、L 12,5、L 12,5 P、R L 30D、RL PO、RL 100、RL 12,5、RS 30 D、RS PO、RS 100、RS 12,5、NE 30 D、NE 40 D、NM 30 D、S100、S 12,5和S 12,5P。类似聚合物包括

MAE 30 DP和

MAE100 P。在一些实施方案中，使用

FS 30D、L 30 D-55、L 100-55、L 100、L 12,5、L12,5P RL 30D、RL PO、RL 100、RL 12,5、RS 30D、RS PO、RS 100、RS 12,5、NE 30D、NE 40D、NM 30D、S 100、S 12,5S 12,5P、

MAE 30DP和

MAE 100P中的一者或多者。以下文献以引用的方式整体并入：(1)Thakral等人,“

A technologyevalu ation”Expert Opinion on Drug Delivery第10卷(2013)第131-149页；(2)Niranjan Patra等人,“Pharmaceutical significance of Eudragit:A review,”FutureJournal of Pharmaceutical Sciences第3卷(10.1016/j.fjps.2017.02.001)；(3)Sonje,Abhijit和Chandra,Amrish,“Compre hensive review on eudragit polymers,”International Research Journ al of Pharmacy第4卷(10.7897/2230-8407.04515)。在各种实施方案中，肠溶剂可以是前述溶液或分散液的组合。在一个实施方案中，延迟释放包衣包括肠溶剂

L 30 D-55。

在某些实施方案中，一种或多种包衣系统添加剂与肠溶剂一起使用。例如，一种或多种PlasACRYL^TM添加剂可用作防粘剂包衣添加剂。示例性PlasACRYL^TM添加剂包括但不限于PlasACRYL^TM HTP20和PlasACRYL^TM T20。在一个实施方案中，PlasACRYL^TMHTP20与

L 30 D-55包衣一起配制。在另一个实施方案中，PlasACRYL^TMT20与

FS 30 D包衣一起配制。

在另一个实施方案中，延迟释放包衣在水溶液中时可随时间变化而降解，而不考虑溶液中的pH和/或酶的存在。这种包衣可包含水不溶性聚合物。因此，它在水溶液中的溶解度与pH无关。如本文所用的术语“非pH依赖性”是指聚合物的水渗透性及其释放药物成分的能力不随pH变化和/或仅非常轻微地依赖于pH。此类包衣可用于制备例如持续释放制剂。合适的水不溶性聚合物包括药学上可接受的无毒聚合物，所述聚合物基本上不溶于水性介质(例如水)，与溶液的pH无关。合适的聚合物包括但不限于纤维素醚、纤维素酯或纤维素醚-酯，即其中纤维素骨架上的一些羟基被烷基取代并且一些羟基被烷酰基改性的纤维素衍生物。实例包括乙基纤维素、乙酰基纤维素、硝基纤维素等。不溶性聚合物的其他实例包括但不限于漆、和丙烯酸和/或甲基丙烯酸酯聚合物、具有低季铵含量的丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯的聚合物或共聚物、或其混合物等。不溶性聚合物的其他实例包括EUDRAGIT

EUDRAGIT

和EUDRAGIT

可用于本发明的不溶性聚合物包括聚乙烯酯、聚乙烯醇缩醛、聚丙烯酸酯、丁二烯苯乙烯共聚物等。在一个实施方案中，通过使用缓慢侵蚀的蜡塞(例如，各种PEGS，包括例如PEG6000)来实现结肠递送。

在另一实施方案中，延迟释放包衣可由肠道菌群中存在的微生物酶降解。在一个实施方案中，延迟释放包衣可由小肠中存在的细菌降解。在另一个实施方案中，延迟释放包衣可由大肠中存在的细菌降解。

在各种实施方案中，本发明提供了一种制剂，所述制剂包含：具有包含一种或多种β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)的底包衣(base coat)的核心颗粒，以及设置在所述包衣的核心颗粒上的延迟释放包衣。延迟释放包衣可在酸性环境和/或胃液中基本上稳定，和/或在接近中性至碱性环境或肠液中基本上不稳定，从而使包衣的核心颗粒暴露于肠液。包含一种或多种β-内酰胺酶的底包衣还可包含一种或多种另外的治疗剂。任选地，可将多个底包衣施加至核心上，每个底包衣可含有β-内酰胺酶和/或另外的治疗剂。在一个实施方案中，核心颗粒包含蔗糖。所述制剂可通过本领域已知的方法来制备。例如，可将β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)喷涂到惰性核心(例如，蔗糖核心或蔗糖球)上并用肠溶层(例如，EUDRAGIT L30 D-55)喷雾干燥以形成含β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)的小丸。

任选地，核心颗粒可包含一种或多种β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)和/或一种或多种另外的治疗剂。在一个实施方案中，一个或多个剂量的β-内酰胺酶可被包封在核心颗粒中，例如，呈微球的形式。例如，β-内酰胺酶可与聚合物(例如胶乳)结合，然后形成微粒、微囊化酶制剂，而不使用蔗糖核心。由此形成的微球体可任选地被延迟释放包衣包覆。

用于产生微粒(如微球、聚集体、其它)的多种方法是已知的，所述方法适合于酶的包含。它们通常涉及至少两种相，一种相含有酶，并且一种相含有形成微粒骨架的聚合物。最常见的是凝聚，其中通过添加第三种组分使聚合物与其溶剂相分离；或多相乳液，如水包油包水(w/o/w)乳液，其中内部水相含有蛋白质，中间有机相含有聚合物，以及支持w/o/w双重乳液直到可除去溶剂以形成微球的外部水相稳定剂。可替代地，将β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)和稳定赋形剂(例如，海藻糖、甘露醇、吐温80、聚乙烯醇)合并并且从水溶液喷洒并收集。然后将颗粒悬浮在干燥的、水不混溶的含有机溶剂的聚合物和释放调节(release modifying)化合物中，并对悬浮液进行超声处理以分散颗粒。另一种方法使用水相但不使用有机溶剂。具体地，将酶、缓冲组分、聚合物胶乳以及稳定和释放调节赋形剂溶解/分散于水中。将水性分散体喷雾干燥，从而导致胶乳聚结，并将蛋白质和赋形剂掺入聚结的胶乳颗粒中。当释放调节剂在酸性条件下不溶但在较高pH(如羧酸)下可溶时，则从基质中释放在胃环境中受到抑制。

在一些实施方案中，在将延迟释放包衣施加至包衣的核心颗粒之前，所述颗粒可任选地被一个或多个分离层包覆，所述一个或多个分离层包含药物赋形剂，包括碱性化合物例如pH缓冲化合物。分离层基本上使包衣的核心颗粒与延迟释放包衣分离。

分离层可通过通常与包衣设备如包衣锅、包衣制粒机一起使用或在使用水和/或有机溶剂进行包衣过程的流化床装置中使用的包衣或分层程序施加至包衣的核心颗粒上。作为替代方案，可通过使用粉末包衣技术将分离层施加至核心材料上。用于分离层的材料是药学上可接受的化合物，例如糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、羟丙基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠等，单独或混合使用。添加剂诸如增塑剂、着色剂、色素、填充剂、防粘剂和抗静电剂例如硬脂酸镁、二氧化钛、滑石和其他添加剂也可包含于分离层中。

在一些实施方案中，具有延迟释放包衣的包衣颗粒可进一步被外包衣层(overcoat layer)包覆。外包衣层可如针对其他包衣组合物所述的那样施加。外包衣材料是药学上可接受的化合物，诸如糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、羟丙基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠等，单独或混合使用。外包衣材料可防止被延迟释放包衣包覆的颗粒的潜在团聚，保护延迟释放包衣在压实过程中不开裂或增强压片过程。

在各种实施方案中，制剂可包含多个改良释放颗粒或小丸或微球。在一个实施方案中，制剂呈包含多个小丸的胶囊形式。在一个实施方案中，制剂呈包含多个微球的胶囊形式。

在一些实施方案中，改良释放制剂是填充有多个含β-内酰胺酶的小丸(例如，含SYN-004或SYN-006，(或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)的小丸)的胶囊，从所述胶囊释放β-内酰胺酶。在一个实施方案中，胶囊是明胶胶囊，如硬明胶胶囊。在另一个实施方案中，胶囊是羟丙基甲基纤维素(HPMC)胶囊。例如，制剂可呈包含多个小丸的胶囊形式。例如，制剂可呈胶囊的形式，例如包含多个含β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)的肠溶包衣小丸的明胶或羟丙基甲基纤维素(HPMC)胶囊。在此类实施方案中，可使用小丸的组合，其中每个小丸被设计成在特定时间点或位置释放。在各种实施方案中，小丸(例如肠溶包衣小丸)被设计成无改变地通过胃，然后释放β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)至肠的一个或多个区域中。在一些实施方案中，含β-内酰胺酶的小丸可进行肠溶包衣以在不同的肠道pH值下释放β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)。

在各种实施方案中，本发明的制剂呈胶囊(例如，硬明胶或HPMC胶囊)形式，所述胶囊包含多个肠溶包衣的含β-内酰胺酶的小丸。在此类实施方案中，小丸(或每个单独的小丸)包含β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)、β-内酰胺酶例如SYN-004或SYN-006或变体喷洒到其上的蔗糖球、粘合剂赋形剂(例如羟丙基纤维素(HPC))、肠溶聚合物(例如，EUDRAGIT L 30D-55)、增塑剂(例如，柠檬酸三乙酯)、助流剂(例如，单硬脂酸甘油酯)、乳化剂和缓冲盐。

在各种实施方案中，本发明的制剂呈胶囊(例如，硬明胶或HPMC胶囊)形式，所述胶囊包含多个肠溶包衣的含β-内酰胺酶的小丸。在此类实施方案中，小丸(或每个单独的小丸)包含约10重量％-20重量％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)。例如，β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)可以约10重量％、约11重量％、约12重量％、约13重量％、约14重量％、约15重量％、约16重量％、约17重量％、约18重量％、约19重量％或约20重量％存在。在一些实施方案中，小丸(或每个单独的小丸)包含约20重量％-30重量％的蔗糖球，β-内酰胺酶例如SYN-004或SYN-006或变体喷洒到所述蔗糖球上。例如，蔗糖球可以约20重量％、约21重量％、约22重量％、约23重量％、约24重量％、约25重量％、约26重量％、约27重量％、约28重量％、约29重量％或约30重量％存在。在各种实施方案中，小丸(或每个单独的小丸)包含约30重量％-40重量％的粘合剂赋形剂(例如，羟丙基纤维素(HPC))。例如，粘合剂赋形剂可以约30重量％、约31重量％、约32重量％、约33重量％、约34重量％、约35重量％、约36重量％、约37重量％、约38重量％、约39重量％或约40重量％存在。在一些实施方案中，小丸(或每个单独的小丸)包含约15重量％-25重量％的肠溶聚合物(例如，EUDRAGITL 30D-55)。例如，肠溶聚合物可以约15重量％、约16重量％、约17重量％、约18重量％、约19重量％、约20重量％、约21重量％、约22重量％、约23重量％、约24重量％或约25重量％存在。在一些实施方案中，小丸(或每个单独的小丸)包含约1.5重量％-2.5重量％的增塑剂(例如，柠檬酸三乙酯)。例如，增塑剂可以约1.5重量％、约1.6重量％、约1.7重量％、约1.8重量％、约1.9重量％、约2重量％、约2.1重量％、约2.2重量％、约2.3重量％、约2.4重量％、约2.5重量％存在。在一些实施方案中，小丸(或每个单独的小丸)包含约0.5重量％-1.5重量％的助流剂(例如，单硬脂酸甘油酯)。例如，助流剂可以约0.5重量％、约0.6重量％、约0.7重量％、约0.8重量％、约0.9重量％、约1重量％、约1.1重量％、约1.2重量％、约1.3重量％、约1.4重量％或约1.5重量％存在。在一些实施方案中，小丸(或每个单独的小丸)包含约0.1重量％-1.0重量％的乳化剂(例如，聚山梨醇酯-80)。例如，乳化剂可以约0.1重量％、约0.2重量％、约0.3重量％、约0.4重量％、约0.5重量％、约0.6重量％、约0.7重量％、约0.8重量％、约0.9重量％或约1重量％存在。在一些实施方案中，小丸(或每个单独的小丸)还包含约1重量％-2重量％的缓冲盐。例如，缓冲盐可以约1.1重量％、约1.2重量％、约1.3重量％、约1.4重量％、约1.5重量％、约1.6重量％、约1.7重量％、约1.8重量％、约1.9重量％或约2重量％存在。如本文所述的重量是指除胶囊本身的重量之外的所有组分的总重量。

在一些实施方案中，小丸(或每个单独的小丸)包含约16重量％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)；约23重量％的蔗糖球；约35重量％的粘合剂赋形剂(例如，羟丙基纤维素(HPC))；约21重量％的肠溶聚合物(例如，EUDRAGIT L 30D-55)；约2重量％的增塑剂(例如，柠檬酸三乙酯)；约1重量％的助流剂(例如，单硬脂酸甘油酯)；约0.5重量％的乳化剂(例如，聚山梨醇酯-80)；和约2重量％的缓冲盐。如本文所述的重量是指除胶囊本身的重量之外的所有组分的总重量。

例如，小丸(或每个单独的小丸)包含约15.8重量％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)；约23.3重量％的蔗糖球；约35重量％的粘合剂赋形剂(例如，羟丙基纤维素(HPC))；约20.8重量％的肠溶聚合物(例如，EUDRAGIT L 30D-55)；约2.1重量％的增塑剂(例如，柠檬酸三乙酯)；约1.0重量％的助流剂(例如，单硬脂酸甘油酯)；约0.4重量％的乳化剂(例如，聚山梨醇酯-80)；和约1.6重量％的缓冲盐。如本文所述的重量是指除胶囊本身的重量之外的所有组分的总重量。

在各种实施方案中，本发明的制剂呈胶囊(例如，硬明胶或HPMC胶囊)形式，所述胶囊包含约75mg的β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)。胶囊包含多个肠溶包衣的含β-内酰胺酶的小丸。在此类实施方案中，制剂包含约10重量％-20重量％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)。例如，β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)可以约10重量％、约11重量％、约12重量％、约13重量％、约14重量％、约15重量％、约16重量％、约17重量％、约18重量％、约19重量％或约20重量％存在。在一些实施方案中，制剂包含约15重量％-25重量％的蔗糖球。例如，蔗糖球可以约15重量％、约16重量％、约17重量％、约18重量％、约19重量％、约20重量％、约21重量％、约22重量％、约23重量％、约24重量％或约25重量％存在。在各种实施方案中，制剂包含约25重量％-35重量％的粘合剂赋形剂(例如，羟丙基纤维素(HPC))。例如，粘合剂赋形剂可以约25重量％、约26重量％、约27重量％、约28重量％、约29重量％、约30重量％、约31重量％、约32重量％、约33重量％、约34重量％或约35重量％存在。在一些实施方案中，制剂包含约10重量％-25重量％的肠溶聚合物(例如，EUDRAGIT L 30D-55)。例如，肠溶聚合物可以约10重量％、约11重量％、约12重量％、约13重量％、约14重量％、约15重量％、约16重量％、约17重量％、约18重量％、约19重量％、约20重量％、约21重量％、约22重量％、约23重量％、约24重量％或约25重量％存在。在一些实施方案中，制剂包含约1.5重量％-2.5重量％的增塑剂(例如，柠檬酸三乙酯)。例如，增塑剂可以约1.5重量％、约1.6重量％、约1.7重量％、约1.8重量％、约1.9重量％、约2重量％、约2.1重量％、约2.2重量％、约2.3重量％、约2.4重量％、约2.5重量％存在。在一些实施方案中，制剂包含约0.5重量-1.5重量％的助流剂(例如，单硬脂酸甘油酯)。例如，助流剂可以约0.5重量％、约0.6重量％、约0.7重量％、约0.8重量％、约0.9重量％、约1重量％、约1.1重量％、约1.2重量％、约1.3重量％、约1.4重量％或约1.5重量％存在。在一些实施方案中，制剂包含约0.1重量％-1.0重量％的乳化剂(例如，聚山梨醇酯-80)。例如，乳化剂可以约0.1重量％、约0.2重量％、约0.3重量％、约0.4重量％、约0.5重量％、约0.6重量％、约0.7重量％、约0.8重量％、约0.9重量％或约1重量％存在。在一些实施方案中，制剂包含约1重量％-2重量％的缓冲盐。例如，缓冲盐可以约1重量％、约1.1重量％、约1.2重量％、约1.3重量％、约1.4重量％、约1.5重量％、约1.6重量％、约1.7重量％、约1.8重量％、约1.9重量％或约2重量％存在。在一些实施方案中，制剂包含约10重量％-20重量％的明胶或HPMC胶囊。例如，明胶或HPMC胶囊可以是约10重量％、约11重量％、约12重量％、约13重量％、约14重量％、约15重量％、约16重量％、约17重量％、约18重量％、约19重量％或约20重量％。

在一些实施方案中，本发明的制剂包含约75mg的β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)。在此类实施方案中，制剂包含约13重量％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)；约19重量％的蔗糖球；约29重量％的粘合剂赋形剂(例如，羟丙基纤维素(HPC))；约17重量％的肠溶聚合物(例如，EUDRAGIT L 30D-55)；约2重量％的增塑剂(例如，柠檬酸三乙酯)；约1重量％的助流剂(例如，单硬脂酸甘油酯)；约0.5重量％的乳化剂(例如，聚山梨醇酯-80)；约1重量％的缓冲盐；和约17重量％的明胶或HPMC胶囊。

例如，制剂包含约13.1重量％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)；约19.4重量％的蔗糖球；约29.1重量％的粘合剂赋形剂(例如，羟丙基纤维素(HPC))；约17.3重量％的肠溶聚合物(例如，EUDRAGIT L30D-55)；约1.7重量％的增塑剂(例如，柠檬酸三乙酯)；约0.9重量％的助流剂(例如，单硬脂酸甘油酯)；约0.4重量％的乳化剂(例如，聚山梨醇酯-80)；约1.3重量％的缓冲盐；和约16.8重量％的明胶或HPMC胶囊。

在各种实施方案中，本发明的制剂呈胶囊(例如，硬明胶或HPMC胶囊)形式，所述胶囊包含约25mg的β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)。胶囊包含多个肠溶包衣的含β-内酰胺酶的小丸。在此类实施方案中，制剂包含约5重量％-15重量％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)。例如，β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)可以约5重量％、约6重量％、约7重量％、约8重量％、约9重量％、约10重量％、约11重量％、约12重量％、约13重量％、约14重量％或约15重量％存在。在一些实施方案中，制剂包含约10重量％-20重量％的蔗糖球。例如，蔗糖球可以约10重量％、约11重量％、约12重量％、约13重量％、约14重量％、约15重量％、约16重量％、约17重量％、约18重量％、约19重量％或约20重量％存在。在各种实施方案中，制剂包含约15重量％-25重量％的粘合剂赋形剂(例如，羟丙基纤维素(HPC))。例如，粘合剂赋形剂可以约15重量％、约16重量％、约17重量％、约18重量％、约19重量％、约20重量％、约21重量％、约22重量％、约23重量％、约24重量％或约25重量％存在。在一些实施方案中，制剂包含约10重量％-20重量％的肠溶聚合物(例如，EUDRAGIT L 30D-55)。例如，肠溶聚合物可以约10重量％、约11重量％、约12重量％、约13重量％、约14重量％、约15重量％、约16重量％、约17重量％、约18重量％、约19重量％或约20重量％存在。在一些实施方案中，制剂包含约1.0重量％-2.0重量％的增塑剂(例如，柠檬酸三乙酯)。例如，增塑剂可以约1.0重量％、约1.1重量％、约1.2重量％、约1.3重量％、约1.4重量％、约1.5重量％、约1.6重量％、约1.7重量％、约1.8重量％、约1.9重量％或约2.0重量％存在。在一些实施方案中，制剂包含约0.1重量-1.0重量％的助流剂(例如，单硬脂酸甘油酯)。例如，助流剂可以约0.1重量％、约0.2重量％、约0.3重量％、约0.4重量％、约0.5重量％、约0.6重量％、约0.7重量％、约0.8重量％、约0.9重量％或约1重量％存在。在一些实施方案中，制剂包含约0.1重量％-1.0重量％的乳化剂(例如，聚山梨醇酯-80)。例如，乳化剂可以约0.1重量％、约0.2重量％、约0.3重量％、约0.4重量％、约0.5重量％、约0.6重量％、约0.7重量％、约0.8重量％、约0.9重量％或约1重量％存在。在一些实施方案中，制剂包含约0.5重量％-1.5重量％的缓冲盐。例如，缓冲盐可以约0.5重量％、约0.6重量％、约0.7重量％、约0.8重量％、约0.9重量％、约1.0重量％、约1.1重量％、约1.2重量％、约1.3重量％、约1.4重量％或约1.5重量％存在。在一些实施方案中，制剂包含约30重量％-40重量％的明胶或HPMC胶囊。例如，明胶或HPMC胶囊可以是约30重量％、约31重量％、约32重量％、约33重量％、约34重量％、约35重量％、约36重量％、约37重量％、约38重量％、约39重量％或约40重量％。

在一些实施方案中，本发明的制剂包含约25mg的β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)。在此类实施方案中，制剂包含约10重量％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)；约15重量％的蔗糖球；约22重量％的粘合剂赋形剂(例如，羟丙基纤维素(HPC))；约13重量％的肠溶聚合物(例如，EUDRAGIT L 30D-55)；约1重量％的增塑剂(例如，柠檬酸三乙酯)；约0.5重量％的助流剂(例如，单硬脂酸甘油酯)；约0.3重量％的乳化剂(例如，聚山梨醇酯-80)；约1重量％的缓冲盐；和约38重量％的明胶或HPMC胶囊。

例如，制剂包含约9.8重量％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)；约14.5重量％的蔗糖球；约21.8重量％的粘合剂赋形剂(例如，羟丙基纤维素(HPC))；约13重量％的肠溶聚合物(例如，EUDRAGIT L 30D-55)；约1.3重量％的增塑剂(例如，柠檬酸三乙酯)；约0.6重量％的助流剂(例如，单硬脂酸甘油酯)；约0.3重量％的乳化剂(例如，聚山梨醇酯-80)；约1.0重量％的缓冲盐；和约37.7重量％的明胶或HPMC胶囊。

本发明还提供了沿着胃肠道释放多个剂量的β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)和/或另外的治疗剂的改良释放制剂。在此类实施方案中，这种制剂的总体释放特征可通过利用例如多种颗粒类型或多个层来调整。在一个实施方案中，β-内酰胺酶的第一剂量可被配制用于在例如小肠(例如，十二指肠、空肠、回肠中的一者或多者)或大肠(例如，盲肠、结肠的升部、横部、降部或乙状结肠部分以及直肠中的一者或多者)中释放，而第二剂量被配制用于在例如小肠(例如，十二指肠、空肠、回肠中的一者或多者)或大肠(例如，盲肠、结肠的升部、横部、降部或乙状结肠部分以及直肠中的一者或多者)的不同区域中延迟释放。可替代地，在沿着肠的不同位置释放多个剂量。例如，在一个实施方案中，β-内酰胺酶的第一剂量可被配制用于在例如小肠(例如，十二指肠、空肠、回肠中的一者或多者)中释放，而第二剂量被配制用于例如在小肠的另一部分(例如，十二指肠、空肠、回肠中的一者或多者)中延迟释放。在另一个实施方案中，β-内酰胺酶的第一剂量可被配制用于在例如大肠(例如，盲肠、结肠的升部、横部、降部或乙状结肠部分以及直肠中的一者或多者)中释放，而第二剂量被配制用于在例如大肠的另一部分(例如，盲肠、结肠的升部、横部、降部或乙状结肠部分以及直肠中的一者或多者)中延迟释放。

在各种实施方案中，本文所述的剂呈药学上可接受的盐的形式，即适合用于与人和其它动物的组织接触而无过度毒性、刺激、过敏反应等，并且与合理的益处/风险比相称的那些盐。药学上可接受的盐是本领域公知的。盐可在治疗剂的最终分离和纯化过程中原位制备，或者通过使游离碱官能团与合适的酸或者游离酸官能团与合适的碱部分反应来单独制备。合适的酸加成盐的实例包括乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐等。代表性碱金属或碱土金属盐包括钠盐、锂盐、钾盐、钙盐、镁盐等，以及无毒的铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。

在各种实施方案中，本发明的制剂提供许多优点。例如，发明人已经成功地配制了蛋白质(即β-内酰胺酶)，其本身具有挑战性。在各种实施方案中，本发明的制剂在其中释放药物的胃肠道环境进一步加剧了这一点。此外，在各种实施方案中，本发明的制剂提供足够缓慢的胃肠道释放以允许在胃肠道中的良好保护性包覆而免受例如在小肠中的各种抗生素的不利影响(这是通过与较慢释放相称的β-内酰胺酶半衰期的增加来突出的一种益处)。此外，例如，与EUDRAGIT不同，通过用HPC包衣本发明小丸的药物物质层，本发明制剂使制剂中EUGRAGIT的量最小化，并且因此减轻可能的剂量限制性毒性和制造并发症。

施用和剂量

应理解，根据本发明施用的β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)的实际剂量将根据例如特定剂型和施用方式而变化。本领域技术人员可考虑许多可改变β-内酰胺酶作用的因素(例如，体重、性别、饮食、施用时间、施用途径、排泄速率、受试者的疾患、药物组合、遗传倾向和反应敏感性)。施用可在最大耐受剂量范围内连续进行或者以一个或多个离散剂量进行。本领域技术人员可使用常规剂量施用测试来确定一组给定条件下的最佳施用速率。

β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)的个体剂量可以单位剂型(例如，片剂或胶囊剂)施用，所述单位剂型含有例如每单位剂型约0.01mg至约1,000mg、约0.01mg至约950mg、约0.01mg至约900mg、约0.01mg至约850mg、约0.01mg至约800mg、约0.01mg至约750mg、约0.01mg至约700mg、约0.01mg至约650mg、约0.01mg至约600mg、约0.01mg至约550mg、约0.01mg至约500mg、约0.01mg至约450mg、约0.01mg至约400mg、约0.01mg至约350mg、约0.01mg至约300mg、约0.01mg至约250mg、约0.01mg至约200mg、约0.01mg至约150mg、约0.01mg至约100mg、约0.1mg至约90mg、约0.1mg至约80mg、约0.1mg至约70mg、约0.1mg至约60mg、约0.1mg至约50mg、约0.1mg至约40mg活性成分、约0.1mg至约30mg、约0.1mg至约20mg、约0.1mg至约10mg、约0.1mg至约5mg、约0.1mg至约3mg、约0.1mg至约1mg，或每单位剂型约5mg至约80mg。例如，单位剂型可以是约0.01mg、约0.02mg、约0.03mg、约0.04mg、约0.05mg、约0.06mg、约0.07mg、约0.08mg、约0.09mg、约0.1mg、约0.2mg、约0.3mg、约0.4mg、约0.5mg、约0.6mg、约0.7mg、约0.8mg、约0.9mg、约1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg、约8mg、约9mg、约10mg、约15mg、约20mg、约25mg、约30mg、约35mg、约40mg、约45mg、约50mg、约55mg、约60mg、约65mg、约70mg、约75mg、约80mg、约85mg、约90mg、约95mg、约100mg、约150mg、约200mg、约250mg、约300mg、约350mg、约400mg、约450mg、约500mg、约550mg、约600mg、约650mg、约700mg、约750mg、约800mg、约850mg、约900mg、约950mg或约1,000mg，包括其间的所有值和范围。在一个实施方案中，β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)的个体剂量以含有25mgβ-内酰胺酶的单位剂型施用。在另一个实施方案中，β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)的个体剂量以含有50mgβ-内酰胺酶的单位剂型施用。在另一实施方案中，β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)的个体剂量以含有75mgβ-内酰胺酶的单位剂型施用。

在一个实施方案中，以每天约0.01mg至100mg的量、每天约0.01mg至约1,000mg、每天约0.01mg至约950mg、每天约0.01mg至约900mg、每天约0.01mg至约850mg、每天约0.01mg至约800mg、每天约0.01mg至约750mg、每天约0.01mg至约700mg、每天约0.01mg至约650mg、每天约0.01mg至约600mg、每天约0.01mg至约550mg、每天约0.01mg至约500mg、每天约0.01mg至约450mg、每天约0.01mg至约400mg、每天约0.01mg至约350mg、每天约0.01mg至约300mg、每天约0.01mg至约250mg、每天约0.01mg至约200mg、每天约0.01mg至约150mg、每天约0.1mg至约100mg、每天约0.1mg至约95mg、每天约0.1mg至约90mg、每天约0.1mg至约85mg、每天约0.1mg至约80mg、每天约0.1mg至约75mg、每天约0.1mg至约70mg、每天约0.1mg至约65mg、每天约0.1mg至约60mg、每天约0.1mg至约55mg、每天约0.1mg至约50mg、每天约0.1mg至约45mg、每天约0.1mg至约40mg、每天约0.1mg至约35mg、每天约0.1mg至约30mg、每天约0.1mg至约25mg、每天约0.1mg至约20mg、每天约0.1mg至约15mg、每天约0.1mg至约10mg、每天约0.1mg至约5mg、每天约0.1mg至约3mg、每天约0.1mg至约1mg或每天约5mg至约80mg的量施用β-内酰胺酶。

在各种实施方案中，以约0.01mg、约0.02mg、约0.03mg、约0.04mg、约0.05mg、约0.06mg、约0.07mg、约0.08mg、约0.09mg、约0.1mg、约0.2mg、约0.3mg、约0.4mg、约0.5mg、约0.6mg、约0.7mg、约0.8mg、约0.9mg、约1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg、约8mg、约9mg、约10mg、约15mg、约20mg、约25mg、约30mg、约35mg、约40mg、约45mg、约50mg、约55mg、约60mg、约65mg、约70mg、约75mg、约80mg、约85mg、约90mg、约95mg、约100mg、约150mg、约200mg、约250mg、约300mg、约350mg、约400mg、约450mg、约500mg、约550mg、约600mg、约650mg、约700mg、约750mg、约800mg、约850mg、约900mg、约950mg或约1,000mg(包括其间的所有值和范围)的每日剂量β-内酰胺酶。

在一些实施方案中，β-内酰胺酶(例如，SYN-004或SYN-006，或本文所述的其他β-内酰胺酶剂，以及它们的变体)的合适剂量在约0.01mg/kg至约100mg/kg受试者体重的范围内，例如约0.01mg/kg、约0.02mg/kg、约0.03mg/kg、约0.04mg/kg、约0.05mg/kg、约0.06mg/kg、约0.07mg/kg、约0.08mg/kg、约0.09mg/kg、约0.1mg/kg、约0.2mg/kg、约0.3mg/kg、约0.4mg/kg、约0.5mg/kg、约0.6mg/kg、约0.7mg/kg、约0.8mg/kg、约0.9mg/kg、约1mg/kg、约1.1mg/kg、约1.2mg/kg、约1.3mg/kg、约1.4mg/kg、约1.5mg/kg、约1.6mg/kg、约1.7mg/kg、约1.8mg/kg,1.9mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约55mg/kg、约60mg/kg、约65mg/kg、约70mg/kg、约75mg/kg、约80mg/kg、约85mg/kg、约90mg/kg、约95mg/kg或约100mg/kg体重，包括其间的所有值和范围。在其它实施方案中，β-内酰胺酶的合适剂量在约0.01mg/kg体重至约10mg/kg体重的范围内、在约0.01mg/kg体重至约9mg/kg体重的范围内、在约0.01mg/kg体重至约8mg/kg体重的范围内、在约0.01mg/kg体重至约7mg/kg体重的范围内、在0.01mg/kg体重至约6mg/kg体重的范围内、在约0.05mg/kg体重至约5mg/kg体重的范围内、在约0.05mg/kg体重至约4mg/kg体重的范围内、在约0.05mg/kg体重至约3mg/kg体重的范围内、在约0.05mg/kg体重至约2mg/kg体重的范围内、在约0.05mg/kg体重至约1.5mg/kg体重的范围内或在约0.05mg/kg体重至约1mg/kg体重的范围内。

在各种实施方案中，SYN-004或SYN-006的剂量介于约75mg至约300mg之间，例如约75mg、或约100mg、或约125mg、或约150mg、或约175mg、或约200mg、或约225mg、或约250mg、或约275mg或约300mg。

根据本发明的某些实施方案，β-内酰胺酶可例如约每日一次、约每隔一日一次、约每三日一次、约每周一次、约每两周一次、约每月一次、约每两个月一次、约每三个月一次、约每六个月一次或约每年一次。在某些实施方案中，β-内酰胺酶可每日多于一次施用，例如，每日约两次、约三次、约四次、约五次、约六次、约七次、约八次、约九次或者约十次。

另外的治疗剂和组合疗法

本发明的微生物组保护剂的施用可与另外的治疗剂组合。另外的治疗剂和本发明制剂的共同施用可以是同时的或依次的。此外，本发明的制剂可包含另外的治疗剂(例如通过共配制)。

在一些实施方案中，本发明的改良释放制剂与另外的治疗剂组合施用。在一个实施方案中，将另外的治疗剂和微生物组保护剂组合成单一的改良释放制剂。在一些实施方案中，治疗和/或预防的方法包括将本发明的改良释放制剂施用于正在进行用另外的治疗剂治疗的受试者。

在一个实施方案中，同时向受试者施用另外的剂和微生物组保护剂。如本文所用的术语“同时”是指另外的剂和微生物组保护剂以不超过约60分钟，诸如不超过约30分钟、不超过约20分钟、不超过约10分钟、不超过约5分钟或不超过约1分钟的时间间隔施用。另外的剂和微生物组保护剂的施用可通过同时施用单一制剂(例如，包含另外的剂和微生物组保护剂)或单独的制剂(例如，包含另外的剂的第一制剂和包含微生物组保护剂的第二制剂)来进行。

如果另外的治疗剂和微生物组保护剂的施用的时间安排使得所述另外的剂和微生物组保护剂的药理学活性在时间上重叠，从而发挥组合治疗效果，则共施用不需要同时施用另外的治疗剂。例如，可依次施用另外的剂和微生物组保护剂。如本文中所用的术语“依次地”意指另外的剂和微生物组保护剂以超过约60分钟的时间间隔施用。例如，另外的剂与微生物组保护剂的依次施用之间的时间间隔可超过约60分钟、超过约2小时、超过约5小时、超过约10小时、超过约1天、超过约2天、超过于约3天或超过约1周。最佳施用时间将取决于正在施用的另外的剂和微生物组保护剂的代谢速率、排泄速率和/或药效活性。可首先施用另外的剂或微生物组保护剂。

在另一实施方案中，将另外的治疗剂和微生物组保护剂同时施用于受试者，但另外的治疗剂和微生物组保护剂从它们各自的剂型(或如果共配制则为单一单位剂型)释放在胃肠道中依次发生。

共施用也不需要通过相同的施用途径向受试者施用另外的治疗剂。相反，每种治疗剂可通过任何适当的途径(例如，肠胃外或非肠胃外)施用。

在一些实施方案中，一种或多种微生物组保护剂用于降低与向同种异体-HCT接受者施用IVβ-内酰胺抗生素相关的并发症(如aGVHD和VRE定殖和/或VRE血流感染)的发生率和/或严重性的方法中。

在一些实施方案中，一种或多种微生物组保护剂与一种或多种治疗剂组合使用，所述一种或多种治疗剂预防或治疗与同种异体-HCT相关的病症(如aGVHD和VRE定殖和/或VRE血流感染)的一种或多种症状或副作用。此类剂包括但不限于免疫抑制剂，如皮质类固醇(如甲泼尼龙或泼尼松)和其他免疫抑制药物。在一些实施方案中，说明性aGVHD治疗是泼尼松。其他说明性aGVHD预防和治疗包括依鲁替尼(例如IMBRUVICA)、吗替麦考酚酯、mTOR抑制剂如西罗莫司(雷帕霉素)、依维莫司、钙调磷酸酶抑制剂如他克莫司或环孢菌素、环孢素、单克隆抗体，如英夫利昔单抗(例如REMICADE)、托珠单抗(例如ACTEMRA)、阿仑单抗(例如CAMPATH)、巴利昔单抗(例如SIMULECT)、达利珠单抗(例如ZINBRYTA)和地尼白介素-毒素连接物(例如ONTAK)、抗胸腺细胞球蛋白(ATG)、抗淋巴细胞球蛋白(ALG)、喷司他丁(例如NIPENT)、鲁索替尼(例如JAKAFI)和光分离置换法。

在一些实施方案中，通过施用β-内酰胺酶降低aGVHD的发生率和/或严重性能够降低用于预防或治疗aGVHD的另外疗法的剂量、给药时间长度或给药频率，所述另外疗法包括甲泼尼龙或泼尼松和其他免疫抑制药物，包括依鲁替尼(例如IMBRUVICA)、吗替麦考酚酯、mTOR抑制剂如西罗莫司(雷帕霉素)、依维莫司、钙调磷酸酶抑制剂如他克莫司或环孢菌素、环孢素、单克隆抗体，如英夫利昔单抗(例如REMICADE)、托珠单抗(例如ACTEMRA)、阿仑单抗(例如CAMPATH)、巴利昔单抗(例如SIMULECT)、达利珠单抗(例如ZINBRYTA)和地尼白介素-毒素连接物(例如ONTAK)、抗胸腺细胞球蛋白(ATG)、抗淋巴细胞球蛋白(ALG)、喷司他丁(例如NIPENT)、鲁索替尼(例如JAKAFI)和光分离置换法。例如，这可免除以较高剂量或频率使用一种或多种类固醇的患者治疗。

药盒

本发明提供了可简化本文所述的改良释放制剂的施用的药盒。所述药盒是材料或组分的集合，包括至少一种本文所述的改良释放制剂。药盒中配置的组分的确切性质取决于其预期目的。在一个实施方案中，药盒被配置成用于治疗人受试者。

使用说明书可包括在药盒中。使用说明书通常包括描述在使用药盒的组分来实现所需的结果(如治疗本文所述相关的病症)中待采用的技术的切实表述。任选地，药盒也含有其它有用组分，如稀释剂、缓冲剂、药学上可接受的载体、注射器、导管、施用器、移液或测量工具、绷带材料或如将易于由本领域技术人员认识到的其它有用随身用品。

装配在药盒中的材料或组分可以维持其可操作性和实用性的任何方便且合适的方式提供给从业者商店。例如，所述组分可在室温、冷藏或冷冻温度下提供。所述组分通常包含在合适的包装材料中。在各种实施方案中，所述包装材料通过熟知的方法构建，优选地以提供无菌的、无污染的环境。所述包装材料可具有外标签，所述外标签指示药盒和/或其组分的内容物和/或目的。

定义

如本文所用，“一个/种(a/an)”或“所述(the)”可意指一个或多于一个/种。

另外，当与参考数字指示结合使用时，术语“约”意指参考数字指示加上或减去该参考数字指示的多至10％。例如，语言“约50”覆盖45％至55％的范围。

当与医疗用途结合使用时，“有效量”是有效于提供目标病症的可测量治疗、预防或其发病率的降低的量。

如本文所用，如果相对于不存在这种调节，在存在剂或刺激的情况下活性和/或效果的读数降低显著量，如降低至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或更多直至并包括至少约100％，则某物“减少”。如本领域普通技术人员将理解的，在一些实施方案中，活性降低并且一些下游读数将减少但其他可增加。

相反，如果相对于不存在剂或刺激物，在这种剂或刺激物存在下，活性和/或效果的读数增加显著量，例如增加至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或更多、直至并包括至少约100％或更多、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约50倍、至少约100倍，则活性“增加”。

如本文所提及的，除非另外指定，否则所有组成百分比均按总组合物的重量计。如本文所用的，单词“包括”及其变型意图为非限制性的，以使得列表中的项目的详述不排除也可适用于此技术的组合物和方法的其他类似项目。类似地，术语“可以”和“可”以及其变型意图为非限制性的，以使得实施方案可以或可包括某些元素或特性的详述不排除不包含哪些元素或特性的本技术的其它实施方案。

尽管作为诸如包括、含有或具有等术语的同义词的开放式术语“包括”在本文中用于描述并要求保护本发明，可选地可以使用诸如“由……组成”或“基本上由……组成”等替代性术语来描述本发明或其实施方案。

如本文所用的，单词“优选的”和“优选地”是指本技术在某些情况下提供某些益处的实施方案。然而，在相同或其他情况下，其他实施方案也可以是优选的。此外，一个或多个优选实施方案的详述并不意味着其他实施方案不适用的，并且并不意图从本技术的范围内排除其他实施方案。

本文描述的实现治疗效果所需要的组合物的量可出于特定目的根据常规程序凭经验确定。通常，为了治疗目的而施用治疗剂(例如本文所述的β-内酰胺酶和/或另外的治疗剂)，以药理学有效剂量给予所述治疗剂。“药理学有效量”、“药理学有效剂量”、“治疗有效量”或“有效量”是指足以产生所需生理效果的量或能够实现所需结果，尤其是治疗病症或疾病的量。如本文所用的有效量包括足以例如延迟病症或疾病的症状的发展、改变病症或疾病的症状的进程(例如，减缓疾病症状的进展)、减少或消除病症或疾病的一个或多个症状或表现并且逆转病症或疾病的症状的量。治疗益处还包括停止或减缓潜在疾病或病症的进展，不论是否实现改善。

可通过标准药物程序在细胞培养物、组织样品、组织匀浆或实验动物中测定有效量、毒性和治疗功效，所述标准药物程序例如用于测定LD50(对约50％群体致死的剂量)和ED50(在约50％群体中治疗有效的剂量)。剂量可根据所采用的剂型和使用的施用途径而改变。毒性作用与治疗作用之间的剂量比是治疗指数，并且它可被表示为比率LD50/ED50。在一些实施方案中，表现出大治疗指数的组合物和方法为优选的。可以初始由体外测定，包括例如细胞培养物测定评估治疗有效剂量。另外，可在动物模型中配制剂量，以实现循环血浆浓度范围，所述循环血浆浓度范围包括如在细胞培养物中或在适当的动物模型中测定的IC50。可例如通过高效液相色谱测量血浆中所述组合物的水平。可通过合适的生物测定来监测任何特定剂量的效果。可由医师确定剂量，并且必要时进行调整以适合所观察到的治疗作用。

在某些实施方案中，所述效果将引起至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约50％、至少约70％或至少约90％的可量化变化。在一些实施方案中，所述效果将引起约10％、约20％、约30％、约50％、约70％或甚至约90％或更大的可量化变化。治疗益处还包括停止或减缓潜在疾病或病症的进展，不论是否实现改善。

如本文所用，“治疗方法”同样适用于治疗本文所述的疾病或病症的组合物的用途和/或用于治疗本文所述的疾病或病症的组合物和/或在制造用于治疗本文所述的疾病或病症的药物中的用途。

实施例

实施例1：SYN-004(P3A)降解和/或降低小鼠粪便中的哌拉西林水平

此实验的目的是确定SYN-004的液体制剂(例如，磷酸盐缓冲盐水溶液中的β-内酰胺酶)是否能够通过口服管饲递送至小鼠的小肠和大肠。

小鼠接受每天两次皮下施用500mg/kg哌拉西林/他唑巴坦持续两天。小鼠同时分为两个组：(1)接受每天两次皮下施用500mg/kg哌拉西林/他唑巴坦持续两天、但未通过口服管饲接受P3A的液体制剂(例如，盐水溶液中的β-内酰胺酶)的第一群组；和(2)接受每天两次皮下施用500mg/kg哌拉西林/他唑巴坦持续两天和通过口服管饲以10mg/kg每天两次施用P3A持续两天的第二群组。对照小鼠群组既不接受哌拉西林/他唑巴坦，也不接受通过口服管饲的P3A。

2天后，评估小鼠粪便中哌拉西林的存在。图1示出，哌拉西林的量(μg/g粪便)在接受皮下施用500mg/kg哌拉西林/他唑巴坦每天两次持续两天+通过口服管饲每天两次P3A的液体制剂(例如，磷酸盐缓冲盐水溶液中的β-内酰胺酶)持续两天的小鼠中减少。条形图最左边的条形对应于来自对照小鼠群组的数据；条形图的中间条形对应于来自接受哌拉西林/他唑巴坦但未接受P3A的第一小鼠群组的数据；并且条形图最右边的条形对应于来自接受哌拉西林/他唑巴坦和P3A两者的第二小鼠群组的数据。

实施例2：SYN-004(P3A)保护厚壁菌门细菌门免受哌拉西林/他唑巴坦的影响

小鼠接受每天两次皮下施用125mg/kg哌拉西林/他唑巴坦持续两天。小鼠同时分为两个组：(1)接受每天两次皮下施用125mg/kg哌拉西林/他唑巴坦持续两天、但未通过口服管饲接受P3A的液体制剂(例如，磷酸盐缓冲盐水溶液中的β-内酰胺酶)的第一群组；和(2)接受每天两次皮下施用125mg/kg哌拉西林/他唑巴坦持续两天和通过口服管饲以10mg/kg每天两次施用P3A持续两天的第二群组。对照小鼠群组既不接受哌拉西林/他唑巴坦，也不接受通过口服管饲的P3A。另一对照小鼠群组仅接受P3A。

两天后，对小鼠粪便进行16S测序分析，以评估小鼠粪便中厚壁菌门细菌门属(例如G+厌氧菌，包括产生短链脂肪酸的乳杆菌属和梭菌属)的水平。图2示出，小鼠粪便中厚壁菌门的丰度通过单独哌拉西林/他唑巴坦降低，并且厚壁菌门的丰度倍数在P3A存在下得到恢复和保护。条形图最左边的条形对应于来自对照小鼠群组的数据，其中未施用药物或β-内酰胺酶；左边第二个条形对应于来自仅接受P3A的小鼠群组的数据；右边第二个条形对应于来自接受哌拉西林/他唑巴坦但未接受P3A的液体制剂(例如，磷酸盐缓冲盐水溶液中的β-内酰胺酶)的第一小鼠群组的数据；并且条形图最右边的条形对应于来自接受哌拉西林/他唑巴坦和P3A两者的第二小鼠群组的数据。

还进行了16S测序分析以评估每克小鼠粪便中存在的总细菌拷贝数。图3示出小鼠粪便中存在的总细菌拷贝数通过哌拉西林/他唑巴坦降低，并且当哌拉西林/他唑巴坦与P3A一起施用时，这种降低减少。条形图最左边的条形对应于来自对照小鼠群组的数据，其中未施用药物或β-内酰胺酶；左边第二个条形对应于来自仅接受P3A的小鼠群组的数据；右边第二个条形对应于来自接受哌拉西林/他唑巴坦但未接受P3A的液体制剂(例如，磷酸盐缓冲盐水溶液中的β-内酰胺酶)的第一小鼠群组的数据；并且条形图最右边的条形对应于来自接受哌拉西林/他唑巴坦和P3A两者的第二小鼠群组的数据。

实施例3：SYN-004(P3A)减轻了模型生物体中抗生素加剧的GVHD

进行此实验以评估SYN-004施用对保护和/或降低与骨髓移植相关的GVHD严重性的影响。

对129S1小鼠进行致死照射，然后移植5M的骨髓细胞(B6供体骨髓)和来自C57BL/6小鼠的确定剂量的2M的脾T淋巴细胞。这两只小鼠共有MHC型H2^b，并且因此代表临床相关的MHC匹配的移植模型。

将小鼠分成四个群组：(1)仅接受5M的B6供体骨髓细胞的群组；(2)接受5M的B6供体骨髓细胞+2M的T细胞+从骨髓移植后第10天开始每周三次皮下施用100mg/kg哌拉西林/他唑巴坦+从骨髓移植后第10天开始经由口服管饲以20mg/kg每周三次并与哌拉西林/他唑巴坦施用同时的P3A液体制剂(例如，磷酸盐缓冲盐水溶液中的β-内酰胺酶)的群组；(3)接受B6供体骨髓细胞+T细胞的群组；(4)接受5M的B6供体骨髓细胞+2M的T细胞+从骨髓移植后第10天开始每周三次皮下施用100mg/kg哌拉西林/他唑巴坦的群组。

图4示出以骨髓移植后30天为终点的存活研究的结果。数据表明，在降低死亡率方面，P3A施用减轻了与骨髓移植相关的抗生素加剧的GVHD。

实施例4：SYN-004 (P3A)预防模型生物体中肠道微生物群多样性的丧失和肠道生态失调

进行此实验以评估SYN-004施用对调节和/或降低肠球菌属单支配的影响。所述实验还旨在评估SYN-004施用是否能够预防经历了骨髓移植的致死照射小鼠中微生物组多样性的降低。

对129S1小鼠进行致死照射，然后移植5M的骨髓细胞(B6供体骨髓)和来自C57BL/6小鼠的确定剂量的2M的脾T淋巴细胞。将小鼠分成三组：(1)接受施用盐水的群组；(2)接受施用哌拉西林/他唑巴坦的群组；(3)接受施用哌拉西林/他唑巴坦(Zosyn，缩写为ZO)和SYN-004(P3A；缩写为Blact)的群组。

在移植后第21天收集粪便样品并进行16S测序分析。图5和图6描绘16S测序分析的结果，其中与来自仅施用了哌拉西林/他唑巴坦的小鼠的粪便样品相比，来自施用了哌拉西林/他唑巴坦和SYN-004两者的小鼠的粪便样品显示降低的肠球菌属单优势度。关于图6，空条形表示特定样品没有扩增。

实施例5：SYN-006(P2A)保护模型生物体的肠道微生物组免受β-内酰胺抗生素的影响

进行了实验以确定SYN-006的液体制剂(例如，磷酸盐缓冲盐水溶液中的β-内酰胺酶)是否能够通过口服管饲递送至小鼠的小肠和大肠。

小鼠接受皮下施用100mg/kg亚胺培南+西司他丁持续两天，在第三天收集粪便样品。小鼠同时分成四个群组：(1)接受皮下施用100mg/kg亚胺培南+西司他丁持续两天、但未通过口服管饲接受P2A的液体制剂(例如，盐水溶液中的β-内酰胺酶)的第一群组；(2)接受皮下施用100mg/kg亚胺培南+西司他丁持续两天和经由口管饲以1mg/kg每天两次施用P2A持续两天的第二群组；(3)接受皮下施用100mg/kg亚胺培南+西司他丁持续两天和经由口服管饲以10mg/kg每天两次施用P2A持续两天的第三群组；和(4)接受皮下施用100mg/kg亚胺培南+西司他丁持续两天和经由口服管饲以50mg/kg每天两次施用P2A持续两天的第四群组。

在第3天，收集小鼠粪便。对小鼠粪便进行16S测序分析，以评估小鼠粪便中厚壁菌门细菌门属(例如G+厌氧菌，包括产生短链脂肪酸的乳杆菌属和梭菌属)的水平。图7示出，与单独亚胺培南+西司他丁存在下相比，在亚胺培南+西司他丁以及10mg/kg和50mg/kg剂量的P2A存在下厚壁菌门的丰度倍数得到恢复和保护。条形图最左边的条形对应于来自仅接受亚胺培南+西司他丁的小鼠群组的数据；左边第二个条形对应于来自接受亚胺培南+西司他丁和1mg/kg的P2A的第二小鼠群组的数据；左边第三个条形对应于来自接受亚胺培南+西司他丁和10mg/kg的P2A的第三小鼠群组的数据；并且条形图最右边的条形对应于来自接受亚胺培南+西司他丁和50mg/kg的P2A的第四小鼠群组的数据。

接下来，进行实验以评估SYN-006(P2A)施用对调节和/或降低肠球菌属单支配并且特别是对亚胺培南治疗的小鼠中屎肠球菌的过度生长的影响。

小鼠接受皮下施用100mg/kg亚胺培南+西司他丁持续两天，在第三天收集粪便样品。小鼠同时分成四个群组：(1)接受皮下施用100mg/kg亚胺培南+西司他丁持续两天、但未通过口服管饲接受P2A的液体制剂(例如，盐水溶液中的β-内酰胺酶)的第一群组；(2)接受皮下施用100mg/kg亚胺培南+西司他丁持续两天和经由口管饲以1mg/kg每天两次施用P2A持续两天的第二群组；(3)接受皮下施用100mg/kg亚胺培南+西司他丁持续两天和经由口服管饲以10mg/kg每天两次施用P2A持续两天的第三群组；和(4)接受皮下施用100mg/kg亚胺培南+西司他丁持续两天和经由口服管饲以50mg/kg每天两次施用P2A持续两天的第四群组。在第3天收集粪便样品并进行16S测序分析。图8描绘16S测序分析的结果，其中与来自仅施用了亚胺培南+西司他丁小鼠的粪便样品相比，来自施用了亚胺培南+西司他丁和SYN-006(以10mg/kg和50mg/kg剂量)两者的小鼠粪便样品显示肠球菌属单优势度降低。图9示出当用单独亚胺培南+西司他丁或与1mg/kg、10mg/kg和50mg/kg剂量的P2A组合治疗时，小鼠粪便中屎肠球菌的相对丰度。结果表明，SYN-006(P2A)预防亚胺培南治疗的小鼠中屎肠球菌的过度生长。在每个直方图中，左边的簇代表治疗前的值，并且右边的簇代表治疗后的值。

实施例6：SYN-006(P2A)减轻了模型生物体中抗生素加剧的GVHD

进行此实验以评估SYN-006(P2A)施用对保护和/或降低与骨髓移植相关的GVHD严重性的影响。

对129S1小鼠进行致死照射，然后移植5M的骨髓细胞(B6供体骨髓)和来自2MC57BL/6小鼠的确定剂量的脾T淋巴细胞。这两只小鼠共有MHC型H2^b，并且因此代表临床相关的MHC匹配的移植模型。

将小鼠分成三个群组：(1)仅接受5M的B6供体骨髓细胞和2M的T细胞的群组；(2)接受5M的B6供体骨髓细胞和2M的T细胞+骨髓移植后第10-25天每周3次皮下施用100mg/kg亚胺培南+西司他丁的群组；(3)接受5M的B6供体骨髓细胞和2M的T细胞+骨髓移植后第10-25天每周三次次皮下施用100mg/kg亚胺培南+西司他丁+骨髓移植后第10-25天每周三次经由口服管饲以50mg/kg施用P2A的液体制剂(例如，磷酸盐缓冲盐水溶液中的β-内酰胺酶)的群组。

图10示出以骨髓移植后40天为终点的存活研究的结果。数据表明，在降低死亡率方面，P2A施用减轻了与骨髓移植相关的抗生素加剧的GVHD(p＝0.0096，曼特尔-考克斯检验)。

等效方案

尽管已经结合其具体的实施方案描述本发明，但应理解，本发明能够有进一步的修改，并且本申请旨在涵盖本发明的任何变型、用途或变更，所述变型、用途或变更大体上符合本发明的原理，且包括在本发明所属领域内的已知或常规实践范围内的并可以适用于上文阐述的和所附权利要求范围内的基本特征的与本公开的此类偏离。

本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验来确定本文明确描述的特定实施方案的许多等效方案。所述等效方案意图涵盖于所附权利要求书的范围内。

以引用的方式并入

本文引用的所有专利和出版物以引用的方式整体并入本文。

本文所论述的出版物仅仅出于其在本申请的提交日期之前公开而提供。本文中的任何内容均不应解释为承认本发明无权凭借在先发明而早于此类出版物。

如本文所用的，所有标题仅用于组织，并不意图以任何方式限制本公开。任何单个章节的内容可以同样适用于所有章节。

序列表

<110> 合成生物制品有限公司(Synthetic Biologics, Inc.)

纪念斯隆凯特琳癌症中心(Memorial Sloan Kettering Cancer Center)

<120> 用于治疗移植物抗宿主病的β-内酰胺酶组合物

<130> SYN-043PC/112492-5043

<150> US 62/843,849

<151> 2019-05-06

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 264

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成聚合物.

<400> 1

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<220>

<223> 合成聚合物.

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<211> 900

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<400> 5

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<210> 6

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195 200 205

Leu His Thr Leu Asp Leu Leu Lys

210 215

Claims

1.一种降低有需要的受试者的移植物抗宿主病(GVHD)的发生率和/或严重性的方法，所述方法包括施用有效量的β-内酰胺酶剂。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述β-内酰胺酶剂具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6具有至少95％同一性的氨基酸序列。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述β-内酰胺酶剂具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6的氨基酸序列。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述受试者是移植接受者。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述受试者是同种异体造血干细胞移植的接受者。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述受试者是骨髓细胞、外周血细胞或脐带细胞的接受者。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述受试者正被或已被施用IVβ-内酰胺抗生素。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述β-内酰胺抗生素选自青霉素类(例如哌拉西林/他唑巴坦)、头孢菌素类(例如头孢吡肟)和/或碳青霉烯类(例如美罗培南；亚胺培南/西司他丁)。

9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述GVHD是急性的。

10.如权利要求4-9中任一项所述的方法，其中所述β-内酰胺酶在所述移植之前施用。

11.如权利要求4-10中任一项所述的方法，其中所述β-内酰胺酶在所述移植之后施用。

12.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者中的肠道生态失调得到减轻或消除。

13.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者的肠道微生物组内的新定殖得到预防。

14.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者的所述肠道微生物组内定殖的扩增得到预防。

15.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述肠道微生物组的单支配得到预防。

16.如权利要求13-15中任一项所述的方法，其中所述微生物组定殖、定殖的扩增或单支配包含一种或多种多重耐药性生物体。

17.如权利要求16所述的方法，其中所述一种或多种多重耐药性生物体选自嗜水气单胞菌；芽孢杆菌属，例如蜡样芽孢杆菌；双歧杆菌属；博德特氏菌属；疏螺旋体属；布鲁氏菌属；伯克霍尔德氏菌；艰难梭菌；弯曲杆菌属，例如，胎儿弯曲杆菌和空肠弯曲杆菌；衣原体属；嗜衣原体；梭菌属，例如肉毒梭菌、艰难梭菌(先前为艰难梭菌)和产气荚膜梭菌；棒状杆菌属；柯克斯氏体属；埃立克体属；肠杆菌科，例如碳青霉烯耐药性肠杆菌科(CRE)和超广谱产β-内酰胺酶肠杆菌科(ESBL-E)、氟喹诺酮耐药性肠杆菌科；肠球菌属，例如万古霉素耐药性肠球菌属某种、超广谱β-内酰胺耐药性肠球菌(ESBL)和万古霉素耐药性肠球菌(VRE)；埃希氏菌属，例如肠集聚性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠毒素性大肠杆菌(如但不限于LT和/或ST)、大肠杆菌0157:1-17和多重耐药性细菌大肠杆菌；弗朗西斯氏菌属；嗜血杆菌属；螺杆菌属，例如幽门螺杆菌；克雷伯氏菌属，例如肺炎克雷伯氏菌和多重耐药性细菌克雷伯氏菌；军团杆菌属；钩端螺旋体属；李斯特氏菌属，例如单核细胞增多性李斯特氏菌；摩根氏菌属；分枝杆菌属；支原体；奈瑟氏菌属；东方体属；类志贺邻单胞菌；抗生素耐药性变形菌门；变形杆菌属；假单胞菌属；立克次氏体属；沙门氏菌属，例如副伤寒沙门氏菌、沙门氏菌属某种和伤寒沙门氏菌；志贺氏菌属，例如志贺氏菌属某种；葡萄球菌属例如，金黄色葡萄球菌和葡萄球菌属某种；链球菌属；密螺旋体属；弧菌属，例如霍乱弧菌、副溶血弧菌、弧菌属某种和创伤弧菌；以及耶尔森氏菌属，例如小肠结肠炎耶尔森氏菌。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述微生物组定殖、定殖的扩增或单支配包含肠球菌物种的过度生长。

19.如权利要求18所述的方法，其中所述微生物组定殖、定殖的扩增或单支配包含万古霉素耐药性肠球菌(VRE)。

20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中用于治疗GVHD的治疗剂的给药剂量或时间长度或给药频率得到降低。

21.如权利要求20所述的方法，其中用于治疗GVHD的所述治疗剂是类固醇。

22.如权利要求21所述的方法，其中用于治疗GVHD的所述治疗剂是甲泼尼龙或泼尼松。

23.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述β-内酰胺酶剂在小肠中释放。

24.如权利要求22所述的方法，其中所述β-内酰胺酶剂在十二指肠、空肠、回肠和/或回盲部中的一者或多者处释放。

25.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述β-内酰胺酶剂在大肠中释放。

26.如权利要求24所述的方法，其中所述β-内酰胺酶剂在盲肠、结肠的升部、横部、降部或乙状结肠部分以及直肠中的一者或多者处释放。

27.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述β-内酰胺酶剂与在胃液中基本上稳定的改良释放包衣一起配制。

28.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述β-内酰胺酶剂与具有pH依赖性溶解性的改良释放包衣一起配制。

29.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述β-内酰胺酶剂与具有时间依赖性侵蚀特征的改良释放包衣一起配制。

30.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述β-内酰胺酶剂与由存在于肠道菌群中的微生物酶降解的改良释放包衣一起配制。

31.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述β-内酰胺酶剂被配制为胶囊或片剂。

32.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述β-内酰胺酶剂被配制用于口服施用。

33.一种预防作为移植接受者的受试者中一种或多种多重耐药性病原体的定殖、定殖的扩增或单支配和/或感染或降低其发生率的方法，所述方法包括施用有效量的β-内酰胺酶剂。

34.如权利要求33所述的方法，其中所述β-内酰胺酶剂具有与SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:6具有至少95％同一性的氨基酸序列。

35.如权利要求33所述的方法，其中所述β-内酰胺酶剂具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6的氨基酸序列。

36.如权利要求33所述的方法，其中所述受试者已经经历了长期住院治疗并且/或者具有增加的由于所述定殖和/或感染而死亡的风险。

37.如权利要求33所述的方法，其中所述受试者是同种异体造血干细胞移植的接受者。

38.如权利要求33-37中任一项所述的方法，其中所述受试者是骨髓细胞、外周血细胞或脐带细胞的接受者。

39.如权利要求33-38中任一项所述的方法，其中所述受试者正被或已被施用IVβ-内酰胺抗生素。

40.如权利要求39所述的方法，其中所述β-内酰胺抗生素选自青霉素类(哌拉西林/他唑巴坦)、头孢菌素类(头孢吡肟)、亚胺培南/西司他丁和美罗培南。

41.如权利要求33-40中任一项所述的方法，其中所述β-内酰胺酶在所述移植之前施用。

42.如权利要求36-41中任一项所述的方法，其中所述β-内酰胺酶在所述移植之后施用。

43.如权利要求33-42中任一项所述的方法，其中所述受试者中的肠道生态失调得到减轻或消除。

44.如权利要求33-43中任一项所述的方法，其中所述受试者的肠道微生物组内的新定殖得到预防。

45.如权利要求33-44中任一项所述的方法，其中所述受试者的所述肠道微生物组内定殖的扩增得到预防。

46.如权利要求33-45中任一项所述的方法，其中所述肠道微生物组的单支配得到预防。

47.如权利要求33-46中任一项所述的方法，其中所述微生物组定殖、定殖的扩增或单支配包含一种或多种多重耐药性生物体。

48.如权利要求47所述的方法，其中所述一种或多种多重耐药性生物体选自嗜水气单胞菌；芽孢杆菌属，例如蜡样芽孢杆菌；双歧杆菌属；博德特氏菌属；疏螺旋体属；布鲁氏菌属；伯克霍尔德氏菌；艰难梭菌；弯曲杆菌属，例如，胎儿弯曲杆菌和空肠弯曲杆菌；衣原体属；嗜衣原体；梭菌属，例如肉毒梭菌、艰难梭菌(先前为艰难梭菌)和产气荚膜梭菌；棒状杆菌属；柯克斯氏体属；埃立克体属；肠杆菌科，例如碳青霉烯耐药性肠杆菌科(CRE)和超广谱产β-内酰胺酶肠杆菌科(ESBL-E)、氟喹诺酮耐药性肠杆菌科；肠球菌属，例如万古霉素耐药性肠球菌属某种、超广谱β-内酰胺耐药性肠球菌(ESBL)和万古霉素耐药性肠球菌(VRE)；埃希氏菌属，例如肠集聚性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠毒素性大肠杆菌(如但不限于LT和/或ST)、大肠杆菌0157:1-17和多重耐药性细菌大肠杆菌；弗朗西斯氏菌属；嗜血杆菌属；螺杆菌属，例如幽门螺杆菌；克雷伯氏菌属，例如肺炎克雷伯氏菌和多重耐药性细菌克雷伯氏菌；军团杆菌属；钩端螺旋体属；李斯特氏菌属，例如单核细胞增多性李斯特氏菌；摩根氏菌属；分枝杆菌属；支原体；奈瑟氏菌属；东方体属；类志贺邻单胞菌；抗生素耐药性变形菌门；变形杆菌属；假单胞菌属；立克次氏体属；沙门氏菌属，例如副伤寒沙门氏菌、沙门氏菌属某种和伤寒沙门氏菌；志贺氏菌属，例如志贺氏菌属某种；葡萄球菌属例如，金黄色葡萄球菌和葡萄球菌属某种；链球菌属；密螺旋体属；弧菌属，例如霍乱弧菌、副溶血弧菌、弧菌属某种和创伤弧菌；以及耶尔森氏菌属，例如小肠结肠炎耶尔森氏菌。

49.如权利要求33-48中任一项所述的方法，其中VRE的肠道定殖得到减少。

50.如权利要求33-49中任一项所述的方法，其中由VRE引起的血流感染得到减轻。

51.如权利要求33-50中任一项所述的方法，其中用于治疗VRE定殖和/或感染的治疗剂的给药剂量或时间长度或给药频率得到降低。

52.如权利要求33-48中任一项所述的方法，其中碳青霉烯耐药性肠杆菌科菌(CRE)的肠道定殖得到减少。

53.如权利要求33-49中任一项所述的方法，其中由CRE引起的血流感染得到减轻。

54.如权利要求52-53中任一项所述的方法，其中用于治疗CRE定殖和/或感染的治疗剂的给药剂量或时间长度或给药频率得到降低。

55.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述β-内酰胺酶剂在小肠中释放。

56.如权利要求55所述的方法，其中所述β-内酰胺酶剂在十二指肠、空肠、回肠和/或回盲部中的一者或多者处释放。

57.如权利要求33-54中任一项所述的方法，其中所述β-内酰胺酶剂在大肠中释放。

58.如权利要求57所述的方法，其中所述β-内酰胺酶剂在盲肠、结肠的升部、横部、降部或乙状结肠部分以及直肠中的一者或多者处释放。

59.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述β-内酰胺酶剂与在胃液中基本上稳定的改良释放包衣一起配制。

60.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述β-内酰胺酶剂与具有pH依赖性溶解性的改良释放包衣一起配制。

61.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述β-内酰胺酶剂与具有时间依赖性侵蚀特征的改良释放包衣一起配制。

62.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述β-内酰胺酶剂与由存在于肠道菌群中的微生物酶降解的改良释放包衣一起配制。

63.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述β-内酰胺酶剂被配制为胶囊或片剂。

64.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述β-内酰胺酶剂被配制用于口服施用。