CN113924487A

CN113924487A - 色谱方法、在色谱方法中测定至少一种化合物的浓度的方法、获得吸附等温线的方法、获得至少一种固定相的方法和评估预定的吸附等温线的准确度的方法

Info

Publication number: CN113924487A
Application number: CN202080038271.XA
Authority: CN
Inventors: 多米尼克·斯坦; 简·施韦伦巴赫
Original assignee: Sartorius Stedim Biotech GmbH
Current assignee: Sartorius Stedim Biotech GmbH
Priority date: 2019-05-24
Filing date: 2020-05-08
Publication date: 2022-01-11
Also published as: US20220229029A1; EP3977115A1; WO2020239393A1

Abstract

本发明涉及色谱方法、在色谱方法中测定至少一种化合物的浓度的方法、获得吸附等温线的方法、获得至少一种固定相的方法和评估预定的吸附等温线的准确度的方法。

Description

色谱方法、在色谱方法中测定至少一种化合物的浓度的方法、获得吸附等温线的方法、获得至少一种固定相的方法和评估预定的吸附等温线的准确度的方法

色谱操作期间涉及的质量传递机理和动力学现象的分析和建模是关于放大目的、质量源于设计方式以及过程集成和优化的重要工具(Schwellenbach,Jan；Zobel,Steffen；Taft,Florian；Villain,Louis；Strube,Jochen(2016):Purification of MonoclonalAntibodies Using a Fiber Based Cation-Exchange Stationary Phase:ParameterDetermination and Modeling.In Bioengineering(Basel,Switzerland)3(4).DOI:10.3390/bioengineering3040024)。已经提出了许多数学模型来描述在色谱操作期间获得的浓度分布，其特征在于在相关质量传输现象的描述中不同的复杂性水平。

可以通过吸附等温线来描述在色谱方法中化合物向固定相和从固定相的吸附和解吸之间的平衡。吸附等温线是使通过固定相对化合物的结合容量q与流动相中至少一种化合物的浓度相关的方程式，即具有形式q＝f(c)的方程式。因此，吸附等温线可以通过实验获得不同浓度的q值，随后例如使用一元回归来确定，以便将预定函数与实验确定的q值拟合。

然而，除了化合物在流动相中的浓度c之外，结合容量可能受到其它参数的影响，例如流动相的组成和色谱温度(即包括化合物以及固定相和流动相的色谱系统的温度)。因此，基于一元回归，即基于其中仅改变浓度c同时保持其它相关参数恒定的数据的吸附等温线，当其它相关参数改变时，可能无法描述吸附/解吸平衡。

作为该问题的解决方案，已经提出通过一元或多元回归来确定多个吸附等温线q＝f(c)，使得其它相关参数在等温线之间变化，但是对于每个等温线，不被等温线本身考虑的参数保持恒定，随后线性内插多个吸附等温线。因此，可以获得这样的吸附等温线，该吸附等温线不仅考虑了浓度c的变化，而且原则上当其它参数变化时，例如流动相的组成和色谱温度变化时，该吸附等温线也可以是有效的。

然而，在上述常规方法中，获得可靠的吸附等温线需要许多实验。此外，即使基于多个数据点获得吸附等温线，用于从数据获得吸附等温线的常规方法也可能产生缺陷结果。具体地，除浓度c之外的影响结合容量的参数可能具有非线性效应，使得线性内插可能产生不准确的结果。

鉴于上述情况，本发明所解决的技术问题是提供一种获得吸附等温线的方法，该吸附等温线应该得到准确可靠的结果，其中由固定相对化合物的结合容量不仅受流动相中化合物浓度的影响；提供一种利用在上述方法中获得的吸附等温线来评估预定的吸附等温线的准确度的方法；提供一种在采用所获得的吸附等温线的色谱方法中测定化合物浓度的方法；基于获得吸附等温线的方法获得固定相的方法；以及采用确定浓度的方法或获得固定相的方法的色谱方法。

上述技术问题的解决方案通过提供权利要求所限定的主题来实现。

在第一方面，本发明涉及获得至少一种化合物的吸附等温线的方法，其包括以下步骤：(ia)选择至少一种化合物；(ib)选择固定相；(ic)选择流动相；(id)选择至少一种化合物、固定相和流动相的温度；其中选自表征流动相的组成和温度的参数的至少一个参数是变化的；(ii)获得包括至少一个变化的参数和至少一种化合物在流动相中的浓度的多个参数值集；(iii)对于在步骤(ii)中获得的多个参数值集中的每一个，通过固定相获得至少一种化合物的多个结合容量值；以及(iv)通过多元数据分析基于在步骤(iii)中获得的多个结合容量值获得吸附等温线。

由于在本发明的方法中通过多元数据分析(例如多元回归)获得吸附等温线，因此可以获得这样的吸附等温线，其产生准确和可靠的结果，其中由固定相对至少一种化合物的结合容量不仅受流动相中化合物浓度的影响，而且还受选自表征流动相的组成和温度的参数的至少一个参数的影响。即，本发明的方法不仅给出使固定相对化合物的结合容量q与至少一种化合物在流动相中的浓度相关的吸附等温线，即具有形式q＝f(c)的方程式，而且给出更具体的吸附等温线，其中结合容量q进一步与至少一个其它参数p_j相关，即，q＝f(c,p_j)。所述至少一个参数选自表征流动相的组成和温度的参数。

根据本发明的优选实施方案，多元数据分析包括非线性多元回归。特别优选地，多元数据分析是非线性多元回归。因此，即使至少一个变化的参数对结合容量具有非线性影响，也可以通过本发明的方法获得准确的吸附等温线。

步骤(ia)中选择的至少一种化合物不受特别限制。例如，它可以选自小分子(Mn≤8000g/mol，基于聚苯乙烯标准通过GPC测定)、药物、蛋白质、核苷酸、核苷、生物细胞、病毒、病毒样颗粒、抗体-药物缀合物、电荷变化抗体、抗体片段、聚氨基酸和多肽。优选地，至少一种化合物包含或为蛋白质和/或药物。

步骤(ia)中选择的至少一种化合物的数量没有特别限制。优选地，所述至少一种化合物的数量为2或更多。当数量为至少2时，可以获得两种或更多种不同化合物的各自的吸附等温线，这使得可以确定特定的固定相是否适于将两种或更多种化合物彼此分离。作为化合物数量的优选上限，可以涉及的数量为20、优选10。

根据本发明，步骤(ib)没有特别限制。原则上，可以使用适于色谱法的任何固定相。合适的固定相是例如多孔和无孔球形颗粒、多孔和无孔非球形颗粒，例如二氧化硅颗粒、色谱树脂、色谱膜、色谱整体料、膜吸附剂、织造物、非织造物和混合基质。根据本发明，在步骤(ib)中优选地选择具有与离子交换色谱膜、疏水相互作用膜和/或亲和膜相同的相互作用形式的离子交换色谱膜、疏水相互作用膜、亲和膜或整体料。

根据本发明，可以在步骤(ic)中选择可以用于色谱方法的任何流动相。流动相优选为液体。此外，流动相可以包括或为有机溶剂或有机溶剂的混合物。除了一种或多种有机溶剂之外，流动相可以包括水。优选地，流动相是水性介质。流动相的组成可以变化。例如，当流动相包括一种或多种有机溶剂时，一种或多种有机溶剂的浓度可以改变。此外，当流动相是水性介质时，流动相的pH和/或盐浓度可以变化。

根据本发明，流动相的pH原则上可以取任何值。优选地，pH值为0至14，更优选2至12，特别优选3至11，甚至更优选4至10，最优选5至9。当然，pH也可以保持恒定。

根据本发明，只要不超过盐在流动相中的溶解度，流动相的盐浓度原则上可以取任何值。优选地，盐浓度的值为0至10mol/L，更优选0至5mol/L，特别优选0至3mol/L，最优选0至1mol/L。当然，盐浓度也可以在色谱方法期间保持恒定。

根据本发明，一种或多种盐可以溶解在流动相中。一种或多种盐没有特别限制。优选地，所述一种或多种盐选自氯化钠、氯化钾、硫酸钠、碳酸钠、硫酸钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸铵、脲盐酸盐、胍盐酸盐、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、甘氨酸、柠檬酸三钠及其组合。替代地或另外地，流动相可以含有相应的酸，例如盐酸、硫酸、柠檬酸等。

在本发明方法的步骤(id)中，选择至少一种化合物、固定相和流动相的温度。该温度可以称为“色谱温度”。该温度没有特别限制。优选地，色谱温度大于0℃，更优选至少1℃，特别优选至少5℃，甚至更优选至少15℃。上述温度的上限优选小于100℃，优选80℃或更低，更优选70℃或更低，特别优选60℃或更低，甚至更优选50℃或更低。上述温度可以变化，优选在上述范围内变化。优选地，上述温度是恒定的。

根据本发明，选自表征流动相的组成和温度的参数的至少一个参数p_j是变化的。根据本发明的优选实施方案，表征流动相的组成的参数选自包括在流动相中的溶剂的浓度、pH、盐浓度、盐离子/缓冲液组分、溶解剂、洗脱剂、置换组分、有机分子、至少一种化合物的浓度。

根据本发明的方法，可以考虑对结合容量有影响的几个变化参数p_j(j是一或更大的整数)。因此，可以获得精确地考虑各种变化参数的影响的整体吸附等温线q＝f(c,p_j)。根据本发明的优选实施方案，所述至少一个变化参数的数量是两个或更多个。尽管对于变化参数的数量没有上限，但是根据本发明，考虑到当变化参数的数量高时步骤(iv)中的多元数据分析(例如，多变量回归)的高复杂性，优选该值为至多10，更优选为至多5，甚至更优选为至多3。

优选变化的参数包括流动相的pH和盐浓度。根据本发明的特别优选的实施方案，变化参数的数量是二并且两个变化参数p₁和p₂分别是流动相的pH和盐浓度。当固定相是离子交换膜、疏水相互作用膜、混合模式膜或亲和膜时，获得准确地考虑pH和盐浓度的影响的吸附等温线是特别有用的。

在步骤(ii)中获得多个参数值集。根据本发明，对于获得参数值集的方式没有具体限制，只要参数值集包括至少一个变化参数的值和至少一种化合物在流动相中的浓度的值。优选地，所述参数值集由所述至少一个变化的参数的值和至少一种化合物在流动相中的浓度的值组成。

根据本发明的优选实施方案，在步骤(ii)中通过实验设计获得多个参数值集。在根据本发明的方法中使用实验设计使得可以以满足某些所需标准的方式进行步骤(ii)和步骤(iii)。当在本发明方法中涉及实验设计时，可以定义某些期望的特性，例如关于在步骤(iv)中获得的吸附等温线的准确度，并且确定在步骤(ii)中获得实现期望特性所必需的参数值集的最佳和/或最小数量。例如，实验设计可以是根据本发明的D-、A-、E-或G-最优设计。此外，实验设计可以是Plackett-Burmann设计或确定性筛查设计(DSD)，即基于3ⁿ析因设计的饱和分数的Rechtschaffner设计(根据Rechtschaffner；Technometrics 1967，第9卷，第4期，第569至575页)，其支持所有一阶交互和二次项，由完全析因设计或部分析因设计和星点组成的中心复合正交(CCO)设计，或由完全析因设计或部分析因设计和置于侧面的面上的星点组成的中心复合面(CCF)设计。

此外，实验设计可以是Box Behnken或三级RSM设计。在此，除了中心点之外的所有设计点都位于超立方体的边缘的中心，并且也位于球体的表面上。可以估计全二次模型。

Rechtschaffner、Box Behnken、CCO或CCF实验设计对于确定非线性交互是有益的，并且对于对等温线的行为进行建模是特别有利的。

优选地，使用的设计能够考虑线性、交互和二次项。

实验设计可以是完全析因设计或部分析因设计。当实验设计是完全析因设计时，可以获得步骤(iv)中的吸附等温线的非常高的准确度。当实验设计是部分因子设计时，在步骤(ii)中获得的多个参数值集的数量可以被显著减少，从而在步骤(iii)中需要获得较低数量的结合容量值。这可以大大减少获得结合容量值的(实验)工作，使得可以在步骤(iii)中不需要确定过量的结合容量值就可以获得高度准确的整体等温线。

在本发明方法的步骤(iii)中，获得多个结合容量值。在本文中，结合容量q被理解为至少一种化合物吸附在固定相上而不是位于流动相中的比例，并且以mol/L(或g/L)表示。根据本发明，结合容量值可以取自现有的或预定的结合容量值和/或通过步骤(iii)中的实验室实验测定。

根据本发明的优选实施方案，步骤(iii)包括一个或多个实验室实验。具体地，可以使用间歇实验，因为它们对目标分子提供低需求并且可以是自动化的。在动态条件下基于通过固定相形成的填充色谱床内的吸收的其它实验也可以使用，因为所得平衡数据是相同的，但需要较高量的目标分子。优选在步骤(iii)中通过实验获得所有结合容量值。

根据本发明的优选实施方案，通过高通量筛查(HTS)进行一个或多个实验室实验。特别优选地，在步骤(iii)中获得的所有结合容量值通过HTS通过实验获得。

在本发明方法的步骤(iv)中，基于在步骤(iii)中获得的多个结合容量值，通过多元数据分析获得吸附等温线。通过多元数据分析，其优选地是多元回归，可以获得具有形式q＝f(c,p_j)并表达结合容量q对流动相中至少一种化合物的浓度c和至少一个参数p_j的相关性的方程式。在至少一个参数的数量是两个或更多的情况下，该方程式可以是形式q＝f(c,p₁,p₂,…)，如上文所示。

在多元回归中，第一步骤(iv-1)可以是选择至少一个参数方程式。接下来的步骤(iv-2)可以获得用于所述至少一个参数方程式的参数，以便尽可能接近地将所述至少一个参数方程式中的每一个与在步骤(iii)中获得的所述多个结合容量值拟合。步骤(iv-2)之后可以是确定多于一个拟合参数方程式中的每一个的拟合质量的步骤(iv-3)，以及选择具有最佳拟合质量的拟合参数方程式作为吸附等温线的步骤(iv-4)，这对于在步骤(iv-1)中已经选择了多于一个参数方程式的情况是特别优选的。即，步骤(iv)优选包括以下步骤：(iv-1)选择至少一个参数方程式；(iv-2)将至少一个参数方程式中的每一个与在步骤(iii)中获得的多个结合容量值拟合。可选地，如果在步骤(iv-1)中选择了多于一个的参数方程式，则该方法可以进一步包括以下步骤：(iv-3)确定多于一个的拟合参数方程中的每一个的拟合质量；以及(iv-4)选择拟合质量最好的拟合参数方程作为吸附等温线。在省略步骤(iv-3)和步骤(iv-4)的情况下，在步骤(iv-2)中获得的拟合参数方程式对应于在步骤(iv)中获得的吸附等温线。

在步骤(iv)中获得的吸附等温线没有特别限制。吸附等温线可以是常规的吸附等温线，例如空间质量作用(SMA)吸附等温线、Langmuir吸附等温线或Freundlich吸附等温线。以类似的方式，优选在步骤(iv-1)中选择的参数方程式没有特别限制，并且可以是基于常规吸附等温线的参数方程式，所述常规吸附等温线例如空间质量作用(SMA)吸附等温线、Langmuir吸附等温线或Freundlich吸附等温线。优选地，在步骤(iv-1)中优选地选择的参数方程式对应于在步骤(iv)中以参数形式获得的吸附等温线。

吸附等温线的参数形式是吸附等温线的一般形式，其中吸附等温线的某些常数值由参数方程式中的可变参数表示。参数的具体数值可以在优选的拟合步骤(iv-2)中获得。

根据本发明的优选实施方案，获得SMA等温线作为步骤(iv)的吸附等温线。根据影响因素如盐浓度和/或pH，可以使用SMA等温线以便描述至少一种化合物的吸附。SMA等温线可以如在Brooks,Clayton A.；Cramer,Steven M.(1992):Steric mass-action ionexchange.Displacement profiles and induced salt gradients中。在AIChE J.38(12),pp.1969–1978.DOI:10.1002/aic.690381212中；以及在Journal of Chromatography A,1233(2012)54-65“Determination of parameters for the steric mass action model-A comparison between two approaches”中详细描述所测定。当固定相是离子交换固定相，例如离子交换树脂或离子交换色谱膜时，优选SMA等温线。

在以下方程式中，显示了与至少一种化合物的空间因子σ_i、至少一种化合物的特征电荷v_i和抗衡离子q₁的结合容量(q₁是盐的结合容量)以及至少一种化合物的结合容量q_i相关的电中性。在式中，n是至少一种化合物的数量，并且Λ是色谱介质(固定相)的离子容量。

色谱介质的离子容量Λ限定色谱主链上配体的数量。离子容量(或色谱介质的容量)Λ可以通过主链上的配体与结合至每个配体的特征组分的化学反应来测定或通过滴定来测定。对于离子交换色谱(IEX)，通过用相应的酸或碱滴定带电配体来测定离子容量Λ。

对于快速平衡或处于平衡状态，SMA等温线可以写成如下方程式。

在上述方程式中，c_i是至少一种化合物的浓度，并且c₁是结合位点处的盐浓度。

特征电荷v_i和平衡常数k可以通过用以下方程式对容量因子logk′进行曲线评估来确定

在方程式中

使用对数容量因子对对数盐浓度的线性回归，通过斜率和截距得到电荷v_i和平衡常数K_i。可以通过实验结果的误差最小化来拟合空间因子σ_i或用以下方程式对于c_i→∞；q₁→0进行计算：

根据本发明的另一个优选实施方案，可以在步骤(iv)中获得Langmuir等温线。

Langmuir等温线可以对于多种组分(即，在至少一种化合物的数量为2或更大的情况下)进行书写

其中q_i表示化合物i的结合容量，K_i是平衡吸附常数，q_max，i是色谱介质的最大结合容量，c_i是流动相中化合物i的浓度。此外，总和

包括存在于流动相中的能够吸附至固定相的所有组分，包括化合物i。

按照由Yamamot等人(Biotechnology and Bioengineering，Vol XXV，Pp.1465-1583(1983))和Forrer(Nicola Forrer，“Antibody purification with ion-exchangechromatography”，dissertation，ETH Zurich 2008)公开的著作，Langmuir参数，即最大结合容量q_max，i和平衡结合常数K_i，可以与流体相中的盐浓度或pH相关，以描述盐/pH依赖性结合行为。在以下方程式中，盐浓度或pH由c_mod表示。

q_max，i＝a₁·c_mod+a₂

K_i＝b₁·exp(-b₂·c_mod)

参数a₁、a₂、b₁和b₂是用于描述等温线参数q_max，i和K_i的盐或pH依赖性的系数。如果对于不同的盐浓度已经获得等温线参数，则可以通过上述示出的函数与盐依赖性等温线参数数据集的最小二乘拟合来确定系数。

在既要考虑盐浓度又要考虑pH的情况下，可以扩展上述方程式(q_max，i＝a₁·c_mod，盐+a₂+a₃c_mod，pH+a₄)。

在Biotechnology and Bioengineering，Vol XXV，Pp.1465-1583(1983)和“Antibody purification with ion-exchange chromatography”，dissertation，ETHZurich 2008中呈现的以上修改的Langmuir等温线在此被称为Yamamoto-Langmuir等温线。

根据本发明，拟合步骤(iv-2)没有特别限制。该拟合可以通过最小二乘拟合、多元回归，例如多重线性或非线性回归来实现，其中多重非线性回归是优选的。合适的拟合方法是本领域技术人员已知的。这种拟合通常通过利用拟合算法来执行，该算法被重复地执行多次迭代。

在拟合步骤(iv-2)中，在步骤(iii)中获得的每个结合容量值可以用于一步拟合以获得吸附等温线(或至少一个拟合的参数方程式)。通过相应地进行，可以在单个拟合步骤中获得吸附等温线。

根据本发明的优选实施方案，拟合步骤(iv-2)包括多个初步拟合步骤(iv-2a)，随后是主拟合步骤(iv-2b)。

在步骤(iv-2a)中，获得多个初步吸附等温线，其中对于每个初步吸附等温线，至少一个变化的参数中的一个或多个保持恒定。在步骤(iv-2a)中，通过将参数方程式与参数值集的一部分拟合来获得初步吸附等温线中的每一个，其中参数值集的一部分中的每一个的特征在于至少一个变化的参数中的一个或多个保持恒定。相同的参数方程式用于步骤(iv-2a)中的每个初步拟合。

参数方程式没有特别限制，例如可以是常规的等温线，例如Langmuir等温线、SMA等温线或Yamamoto-Langmuir等温线。此外，参数方程式可以通过实验设计来确定，其中物理-化学相互作用通过所观察到的参数之间的实验发现的相关性来描述。根据本发明，参数方程式优选地选自Langmuir等温线、SMA等温线、Yamamoto-Langmuir等温线，或通过实验设计确定的参数方程式，更优选地选自Langmuir等温线、SMA等温线、或通过实验设计确定的参数方程式，最优选地选自通过实验设计确定的参数方程式。

将步骤(iv-2a)中获得的初步吸附等温线的各个参数作为主拟合步骤(iv-2b)中的基础。即，在主拟合步骤(iv-2b)中，通过将一个参数方程式与在步骤(iv-2a)中获得的拟合参数方程式的每个参数的相应数值拟合来获得(整体)吸附等温线。在主拟合步骤中使用的各个参数方程式没有特别限制。原则上，可以将任何参数方程式用于该任务，只要可以获得令人满意的拟合即可。例如，参数方程式可以考虑线性项、二次项、三次项、交互项等。在实施例10中给出了这种参数方程式的实例。

在步骤(iv-2a)中至少一个变化参数中的多于一个参数保持恒定的情况下，需要几个初步拟合步骤，其中第一初步拟合步骤是对步骤(iii)中获得的多个结合容量值的拟合，并且第二拟合步骤和随后的初步拟合步骤是对前一初步拟合步骤中获得的拟合的初步参数方程式的参数的数值的拟合。然而，为了将获得吸附等温线的工作保持在合理的限度内，应将至少一个变化参数中的至多三个、优选至多两个、最优选至多一个保持恒定。即，随后的初步拟合步骤的数量优选地为至多3、更优选地为至多2、甚至更优选地为至多1。

尽管原因是未知的，但是已经发现通过进行一个或多个初步拟合步骤(iv-2a)，随后进行主拟合步骤(iv-2b)，可以获得具有优异准确度的吸附等温线。

本发明的方法还可以包括确定吸附等温线的拟合质量的步骤。在步骤(iv)之后确定拟合质量可以以与上述步骤(iv-3)类似的方式进行。对于质量控制的两个步骤，可以使用相同的方法。例如，拟合质量可以通过诸如拟合优度、方差分析(ANOVA)的方法和/或通过使用相关矩阵来确定。通过控制吸附等温线的质量的步骤，可以确保满足一定的精度要求。

根据本发明，在质量不令人满意的情况下，可以通过返回到步骤(ii)来进行根据本发明的方法。即，在所确定的质量不令人满意的情况下，可以将另外的参数值集添加到多个参数值集中，以便获得更多的信息。然后，基于补充的多个参数值集，可以获得附加的结合容量值。在获得关于一个或多个参数值集和相应的结合容量值的附加信息之后，可以在步骤(iv)中获得更精确的等温线。

在另一方面，本发明涉及获得至少一种固定相的方法，其包括以下步骤：(I)执行根据本发明的获得吸附等温线的方法m次，其中m是2或更大的整数，并且m个执行关于步骤(ib)彼此不同；以及(II)基于步骤(I)的结果选择至少一个固定相。

可以由操作人员进行步骤(II)。或者，步骤(II)可以是自动的，例如通过使用计算机。

通过机械模型对色谱过程的完整描述(例如分离问题)对于参数优化和放大是非常有益的。可以预测的过程窗口直接与测定的参数空间相关。在不需要在中试规模上耗费时间和材料的实验工作的情况下，可以直接预测关于生产规模的优化的固定相。通过使用包括最佳的固定相的优化的工艺参数集，可以提高总的工艺效率。对于本文公开的方式，在实验室规模上获得吸附等温线的实验工作也可以显著降低。基于使用的固定相的表征，可以确认和执行所公开的方式的有效性。

根据本发明的优选实施方案，进行步骤(I)，使得在m次执行的每一次中，在步骤(ia)中选择至少两种不同的化合物，并且在m次执行的每一次中，所述至少两种不同的化合物是相同的。通过该优选实施方案，可以找到用于将几种化合物彼此分离的最佳固定相。

在另一个方面，本发明涉及色谱方法，所述色谱方法包括获得根据本发明的至少一种固定相的方法，以及使用在步骤(II)中选择的至少一种固定相进行色谱法的步骤(III)。

根据本发明，可以确定多个不同固定相的各个吸附等温线。基于所获得的结果，可以选择具有与所需吸附等温线最接近的吸附等温线的固定相。还可以选择彼此可以相同或不同的几个固定相，例如，在色谱方法包括几个阶段的情况下，每个阶段都涉及固定相的使用。

根据本发明的获得至少一种固定相的方法在色谱过程的开发中特别有用。通常，工业色谱方法包括几个色谱阶段，每个色谱阶段使用具有固定相的不同色谱柱，其可以相同或不同。为了最佳的性能，需要仔细选择固定相。一旦开发了这种多级色谱过程，改变仔细选择的固定相中的一个可能损害整个过程。然而，在色谱过程开发的相当晚的阶段，不能再使用一种或多种固定相，使得一种或多种固定相与另一种固定相的这种交换变得不可避免。在这种情况下，可以找到通过根据本发明以最小的工作获得至少一种固定相的方法来交换的固定相的适当替代物。

在另一方面，本发明涉及评估预定的吸附等温线的准确度的方法，包括获得根据本发明的吸附等温线的方法和将预定的吸附等温线与在步骤(iv)中获得的吸附等温线进行比较的步骤。

如上所述，根据本发明的获得吸附等温线的方法使得可以获得非常准确的吸附等温线，即其密切反映了固定相的物理/实验行为。因此，一旦获得这种高度准确的吸附等温线，就可以通过比较来容易地评价预定吸附等温线的准确度。预定的吸附等温线没有特别限制。例如，它可以从文献中取得或者可以通过获得吸附等温线的一般方法重新确定。

在另一方面，本发明涉及在色谱方法中测定至少一种化合物的浓度的方法，所述方法包括获得根据本发明的吸附等温线的方法，并且还包括以下步骤：(v)选择具有色谱床的色谱装置，所述色谱床包括固定相和流动相；以及(vi)基于在步骤(iv)中获得的吸附等温线，计算在色谱装置的预定位置z处和在预定时间t时的流动相中的至少一种化合物的浓度c(z,t)。

基于通过根据本发明的方法获得的吸附等温线，可以准确地计算浓度c(z,t)。

色谱法是分离的物理方法，其中待分离的组分分布在两个相之间，其中一个相是固定的(固定相)，而另一个相(流动相)在预定方向上移动。

本发明的方法不限于特定类型的色谱法。例如，本发明的方法可以用于吸附色谱法、亲和色谱法、柱色谱法、置换色谱法、洗脱色谱法、排阻色谱法、迎头色谱法、气相色谱法、离子交换色谱法、等温色谱法、凝胶渗透色谱法、液相色谱法、正相色谱法、分配色谱法、平面色谱法、程序化流动色谱法、疏水作用色谱法、混合模式色谱法、程序化压力色谱法、程序化温度色谱法、热解-气相色谱、反应色谱法、反相色谱法、超临界流体色谱法、二维色谱法等。根据本发明的方法特别适用于离子交换色谱法、疏水作用色谱法、亲和色谱法和混合模式色谱法。

在根据本发明的在色谱方法中确定至少一种化合物的浓度的方法中，可以测定一种或多种化合物取决于过程期间的时间t和色谱装置/色谱床的位置z的浓度。在本文中，色谱装置的位置z沿着其中流动相在色谱法期间移动的上述预定方向。在本发明的上下文中，可以假定至少一种化合物的浓度在垂直于方向z的两个其它方向x和y上不变化。

本发明的方法能够计算色谱过程中至少一种化合物的浓度。原则上可以测定在色谱装置的任何预定位置z处和在色谱期间的任何时间t时存在于流动相中的任何化合物的浓度。优选地，计算在色谱装置的出口处在多个时间点的至少一种化合物的浓度。

可以计算仅一种化合物的浓度。然而，优选计算两种或更多种化合物的浓度。特别优选计算至少两种不同化合物的各自浓度，其中至少一种化合物是目标化合物，并且一种或多种其它化合物是杂质化合物。因此，例如可以通过本发明的方法确定在步骤(ib)至步骤(id)和步骤(v)中选择的色谱参数是否能够令人满意地将一种或多种目标化合物与一种或多种杂质化合物分离。

根据本发明，目标化合物与杂质化合物之间的令人满意的分离意指在色谱期间的所有时间t时，在色谱装置的出口处，目标化合物和杂质化合物中的仅一种在流动相中具有显著浓度。即，目标化合物和杂质化合物基本上在不同的时间t时离开色谱装置。显著浓度为至少0.01μmol/L、优选至少0.001μmol/L、特别优选至少0.0001μmol/L的浓度。

在步骤(v)中选择的色谱装置没有特别限制。色谱装置可以具有从实验室规模(其中色谱床的体积V_b为至多500mL，优选至多100mL，特别优选至多20mL，甚至更优选至多5mL)至工业规模的任何尺寸(其中色谱床的体积V_b为大于500mL，优选至少1L，特别优选至少5L,甚至更优选至少10L)。优选地，体积V_b为至少0.01mL，更优选至少0.1mL，特别优选至少0.5mL。进一步优选的是，体积V_b为至多1000L，更优选为至多500L。优选地，色谱装置的色谱床的体积V_b大于500mL。

根据本发明的方法的步骤(v)不限于选择单个色谱装置。在步骤(v)中可以选择一个色谱装置或多个色谱装置。在选择几个色谱装置的情况下，色谱方法可以被称为多级色谱方法，其中几个色谱装置串联放置。此外，几个色谱装置也可以并联放置。几个色谱设备中的每一个可以具有相同或不同的固定相。优选地，在步骤(v)中选择串联放置的几个色谱装置，每个色谱装置具有不同的固定相。几个色谱装置的数量没有特别限制。优选地，该数值为至多5，更优选为至多4，最优选为至多3。

优选地，步骤(v)不仅包括色谱装置的选择，而且包括至少一个罐、液体泵、检测器、多个阀和过程控制软件(色谱设备的选择)的选择，但不限于此。色谱设备在其机械和系统上可能因加工复杂性而变化。例如，当色谱法是连续色谱方法时，可以省略罐。在图18显示的示例性色谱设备中，往复泵P1将进料溶液从进料罐B1提供至色谱装置，在此是膜吸附剂MA1。优选在色谱装置MA1的下游检测相应的检测器信号。此后，优选将流动相收集在罐B2中或进一步纯化。优选将杂质导向废物收集器(图18未显示)。

根据本发明，流动相的组成可以在色谱方法(梯度色谱法)期间变化。例如，当流动相包括一种或多种有机溶剂时，一种或多种有机溶剂的浓度可以在色谱法期间改变。此外，当流动相是水性介质时，流动相的pH和/或盐浓度可以在色谱方法期间变化。

关于在步骤(v)中选择的色谱装置的固定相，当就由多孔颗粒材料构成的固定相而言时，色谱床的总孔隙率ε_T可以分成两个术语：

·内部孔隙率/空隙率ε_p：该项描述了相对于色谱床的总体积，多孔颗粒的内部空隙率。

·体相孔隙率/空隙率ε_b：该项描述了相对于色谱床的总体积，色谱床(流动通道)中的颗粒之间的空隙率。

两个孔隙率值ε_p和ε_b可以相加，以得到色谱床的总孔隙率ε_T：

ε_T＝ε_p+ε_b

色谱床的特征还可以在于

·固定相孔隙率ε_sp：该项描述了相对于固定相的总体积，多孔颗粒的内部空隙率。

由颗粒材料构成的固定相不仅可以通过上述参数ε_T、ε_p、ε_b和ε_sp来描述，还可以通常通过固定相来描述，所述固定相例如膜、整料、非织造物、织造物和其它非特定介质。根据固定相(基质)的结构，内部孔隙率ε_p可以等于零，这导致由于缺少基质内结构扩散而可以简化质量传输现象。

内部孔隙率ε_p、固定相孔隙率ε_sp、体相孔隙率ε_b和总孔隙率ε_T的值可以如下所解释的确定。

逆体积尺寸排阻色谱法(iSEC)是广泛使用的相对于分子尺寸测定色谱介质的空隙率和孔隙率的方法。必须选择用于逆体积尺寸排阻色谱法的参考分子(示踪物分子)。参考分子的尺寸应与至少一种化合物(例如目标分子)的尺寸相匹配。优选参考分子不与固定相相互作用。具有窄且限定的尺寸分布的参考分子的优选分子种类特别地但不限于多糖、聚丙烯酸酯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、胶乳珠。(逆体积尺寸排阻色谱法可以另外用于使用各种模型计算孔径分布。)

统计矩的常规方法表示了主要的分析方式。该方法适用于由示踪物的窄矩形脉冲注入系统导致的色谱峰，该方法是计算色谱床实际体积、空隙率(孔隙率)和分散系数D_ax的有效方式。

按照矩分析技术，可以使用以下方式计算取决于缓冲条件和分子尺寸的空隙率值：

其中ε表示示踪物分子(参考分子)可达到的体积分数，V表示色谱床体积，F表示体积流速并且μ_p表示示踪物峰的第一矩。

对于所有信号，第一矩(μ_p)和第二矩

可以如由H.W.Haynes(A Model for theApplication of Gas Chromatography to measurements of Diffusion in BidisperseStructured Catalysts，AIChE J.19(1973)1043-1046.doi：10.1002/aic.690190526)提出的进行测量和计算，并且如果需要，通过减去色谱装置(例如HPLC系统)的柱外体积引起的矩来校正。

该校正程序可以通过测定在没有色谱介质的情况下测量的示踪物信号的第一矩(μ_HPLC)和第二矩

来进行。然后从在色谱介质存在下测定的第一矩(μ_p，obs)和第二矩

减去相应值以消除色谱系统的影响(参见以下式(4)和式(5))。

μ_p＝μ_p，obs-μ_HPLC (4)

其中μ_p和

是示踪物峰的第一矩和第二矩。μ_p，obs和

归因于整个系统，而μ_HPLC和

仅对应于柱外体积。C_d，i(t)表示示踪物i在检测器处在时间t时的浓度。即，通过检测器检测浓度C_d，i(t)。

如果色谱床没有内部孔隙率，则可以通过应用式(1)、式(2)和式(4)直接获得相对于所用分子尺寸的体相孔隙率ε_b。在这种情况下，ε_b＝ε＝ε_T，ε_p＝0并且ε_sp＝0。

如果色谱床具有内部孔隙率ε_p和固定相孔隙率ε_sp，则可以使用以下方式测定ε_p和ε_sp的值：

小示踪物分子可以完全达到反映停滞相的内部空隙率ε_p，以及由流动相所占据的较大传输通道中的体积ε_b。因此，所获得的可达到的体积分数的边界值反映了色谱床的总空隙率ε_T。即，在使用小分子(例如丙酮)作为示踪物i的情况下，在式(1)中，ε＝ε_T。

大的示踪物分子i被完全排除在内部空隙率ε_p之外。所获得的可达到的体积分数的边界值反映了流动相所占据的外部空隙率(体相孔隙率)ε_b。即，在使用通过尺寸排阻色谱法测定的重均分子量M_w为2000000g/mol的大分子(例如右旋糖酐)作为示踪物i的情况下，在式(1)中，ε＝ε_b。两个边界值都是描述色谱床的固定相孔隙率ε_sp所必需的：

相同的方式可以用于内部孔隙率ε_p。外部孔隙率和总孔隙率的两个值都是其计算(ε_p＝ε_T-ε_b)所必需的。

因此，确定ε_p和ε_sp需要不可达到内部孔隙的一种示踪物分子(例如右旋糖酐)，以及完全可达到内部孔隙的另一种示踪物分子(例如丙酮)。式(1)、式(2)和式(4)的组合使得可以计算ε_p或ε_sp的值，如在J.Schwellenbach，S.Zobel，F.Taft，L.Villain，J.Strube，Purification Of monoclonal antibodies using a fiber based cation-exchangestationary phase：parameter determination and modeling，Bioengineering 3(2016)24/1-24/20.doi：10.3390/bioengineering3040024中详细描述。

在未知色谱床的内部孔隙率ε_p是否为零的情况下，根据上述方法处理固定相来确定内部孔隙率ε_p。如果ε_p是零，则使用小示踪物分子和大示踪物分子的实验对于式(1)中的ε将产生相同的结果，即，ε_b＝ε_T，并且根据式“ε_p＝ε_T-ε_b”，ε_p的所得值将是0。

在固定相由颗粒材料(例如二氧化硅颗粒)构成的情况下，色谱床的内部孔隙率ε_p反映了颗粒内的孔隙率。与此相反，体相孔隙率ε_b由颗粒之间的空间构成，而不考虑内部孔隙率ε_p。流动相可达到的总体积(总孔隙率ε_T)是体相孔隙率和内部孔隙率之和(ε_T＝ε_p+ε_b)。

这些空隙率值ε_p、ε_sp、ε_b和ε_T的测定可以针对不同的流动相的组成并且在不同的温度下进行。例如，可以使用关于盐浓度、pH和温度的不同条件来确定函数关系，如在本发明方法的优选步骤(v′)的上下文中详细描述的。

根据优选的实施方案，在根据本发明的在色谱方法中测定至少一种化合物的浓度的方法还包括以下步骤：(v′)至少测定流动相在色谱床中的流速v和色谱床的体相孔隙率ε_b；其中在步骤(vi)中，浓度c(z，t)的计算进一步基于流速v和体相孔隙率ε_b。

根据在根据本发明的在色谱方法中测定至少一种化合物的浓度的方法的优选实施方案，在上述步骤(v′)中，进一步测定至少一种化合物在色谱床中的轴向分散系数D_ax，并且在步骤(vi)中，浓度c(z，t)的计算进一步基于轴向分散系数D_ax。因此，根据本发明，特别优选的是浓度c(z，t)的计算进一步基于流速v、体相孔隙率ε_b和轴向分散系数D_ax。

根据本发明的优选实施方案，固定相是可逆膨胀的。如果与固定相接触的流动相的组成的变化导致固定相的体积的变化，则固定相被认为是“可溶胀的”。当固定相的体积改变时，孔隙率也改变。因此，根据本发明，如果与固定相接触的流动相的组成的变化导致内部孔隙率ε_p、固定相孔隙率ε_sp和整体孔隙度ε_b的变化，则固定相被认为是“可溶胀的”。

例如，内部孔隙率ε_p、固定相孔隙率ε_sp、体相孔隙率ε_b的变化可以是至少5％，优选至少10％，特别优选至少15％。基于较大孔隙率与较小孔隙率的比率来计算相应孔隙率的变化。如果孔隙率的变化是可逆的，即如果在与固定相接触的流动相的组成变化之前的原始孔隙率可以通过恢复流动相的原始组成来恢复，则固定相被认为是“可逆膨胀的”。

常规模型假设固定相的空间结构在色谱过程中保持恒定。然而，在某些条件下，例如流动相的不同组成或不同色谱温度，固定相的体积可能显著变化，导致波动的孔隙率。因此，通过考虑这些波动可以获得改善的准确度。

具体地，许多色谱介质根据周围条件显示出可逆的溶胀。主要的实例是带有接枝的带电水凝胶层的离子交换膜吸附剂或多孔树脂(

EMD)。取决于盐浓度，由于在低盐浓度下的排斥性链间和链内相互作用，水凝胶层可以完全膨胀，或者由于屏蔽作用，水凝胶层在高盐浓度下塌陷(参见图1)。通过在对色谱方法建模时考虑这种行为，可以提高准确度。

鉴于以上所述，在根据本发明的在色谱方法中确定至少一种化合物的浓度的方法中，优选的是，在步骤(v′)中，对于至少一个变化参数的不同值，例如对于流动相的不同盐浓度和/或不同pH值，确定流速v、体相孔隙率ε_b和任选地轴向分散系数D_ax；并且在步骤(vi)中，在考虑步骤(v′)的结果的同时，浓度c(z，t)的计算还基于流速v、体相孔隙率ε_b和任选的轴向分散系数D_ax。因此，在步骤(vi)中，可以考虑固定相的空间结构的变化及其对v、ε_b和任选的D_ax的值的影响，从而可以提高方法的准确度。

根据本发明的优选实施方案，当流动相与固定相接触时，在固定相的至少一部分表面上形成凝胶，优选水凝胶。在此，“凝胶”被认为是非流体网络，其通过流动相在其整个体积中膨胀。优选地，凝胶形成在固定相的整个表面上。“水凝胶”是通过作为水性介质的流动相膨胀的凝胶。

根据本发明的优选实施方案，固定相表面的至少一部分由结合到固定相支撑结构表面的聚合物构成。固定相支撑结构没有特别限制，并且可以具有颗粒、珠或多孔膜的形式。优选地，固定相的整个表面由聚合物构成。根据本发明的特别优选的实施方案，如上所述，当聚合物与流动相接触时，由聚合物形成凝胶。甚至更优选该凝胶是水凝胶。

根据本发明，优选色谱床具有至多0.90、优选至多0.50、特别优选至多0.20、甚至更优选至多0.05、最优选0.01、例如0.00的内部孔隙率ε_p。此外，优选固定相具有10至99、优选30至90、甚至更优选45至80的体相孔隙率ε_b。总孔隙率ε_T优选为10至99，更优选30至90，特别优选45至80。

体相孔隙率ε_b可以如上述测定。可以基于以下方程式来计算流速v的值

其中F是流动相的体积流速(预定的)，并且A是在步骤(id)中选择的色谱装置的横截面积。可以通过直接的几何计算来确定A的值。

根据本发明的优选实施方案，在步骤(v′)中，对于流动相的变化的组成和/或对于变化的色谱温度，进一步测定至少一种化合物在色谱床中的轴向分散系数D_ax，并且在步骤(vi)中，浓度c(z，t)的计算进一步基于轴向分散系数D_ax。基于吸附等温线以及参数v、ε_b和D_ax，可以基于以下描述的平衡分散模型进行步骤(vi)。

至少一种化合物在色谱床中的轴向分散系数D_ax可以基于以下方程式计算

D_ax＝α·v

其中α是分散性因子。如实施例5中所示，可以通过测量在不同的线流速下的轴向分散系数经由线性回归来测定该因子。以类似的方式，如下所述的至少一种化合物在假设的DPF(分布式活塞流管)中的轴向分散系数D_ax，DPF可以使用方程式D_ax，DPF＝α_DPF·v计算。

或者，轴向分散系数D_ax可以由以下的方程式计算。

在上述方程式中，Bo是博登斯坦数，v是线速度，并且L是特征长度。博登斯坦数是通过脉冲示踪实验确定的，在脉冲示踪实验中，轴向分散系数或者以误差最小化与实验数据拟合，或者使用矩分析。特征长度是色谱床高度(参见Octave Levenspiel；TraxerTechnology Modeling ofthe Flow of Fluids ISBN：978-1-4419-8073-1)。

作为替代方案，可以由以下方程式计算轴向分散系数D_ax。

在上述方程式中，HETP是等于一个理论板的高度，并且v如上所定义。HETP可以通过示踪实验测定，其中使用在给定线速度v和特征长度L(色谱床高度)下的相应峰的方差

此外，进一步优选的是，在步骤(v′)中，除了v、ε_b和D_ax之外，针对变化的流动相的组成和/或变化的色谱温度，还测定色谱床的内部孔隙率ε_p和/或固定相孔隙率ε_sp，并且在步骤(vi)中，基于v、ε_b、D_ax以及ε_p和/或ε_sp计算浓度c(z，t)。基于吸附等温线以及参数v、ε_b、D_ax以及ε_p/ε_sp，可以基于以下描述的集中的孔模型或一般速率模型进行步骤(vi)。

在步骤(v′)中，可以针对流动相的若干组成(例如针对若干pH值和/或针对若干盐浓度)和/或针对若干温度测定上述参数。优选地，色谱温度保持恒定，使得仅流动相的组成可以是变化的，例如盐浓度和/或pH。针对每种变化的参数(例如温度、pH、盐浓度)，测定v、ε_b和任选地D_ax、ε_sp和ε_p的至少两个值、优选至少三个值、更优选至少四个值。该数量越多，本发明方法的准确度越高。然而，为了效率，该数量应至多为10、优选至多为7、特别优选至多为6。

根据优选的实施方案，对于v、ε_b和任选的D_ax、ε_sp和ε_p的任选待确定的值通过实验设计获得。在这一点上，与前述关于步骤(ii)的相应优选实施方案所概述的基本上相同。

根据本发明，在步骤(v′)中获得的v、ε_b和任选地D_ax、ε_sp和ε_p的值可以在步骤(vi)中直接取用。在这种情况下，可以限定其中在步骤(v′)中获得的相应值适用的变化的流动相的组成和/或变化的色谱温度的范围。例如，在针对2mM和4mM的NaCl浓度测定v，即v(2mM)和v(4mM)的情况下，可以取v(2mM)作为多至3.0mM的NaCl浓度的线速度，并且可以取v(4mM)作为大于3.0mM的NaCl浓度的线速度。

根据本发明的优选实施方案，对在步骤(v′)中测定的v、ε_b和任选地D_ax、ε_sp和ε_p的值进行内插，并且基于内插在步骤(vi)中取用v、ε_b和任选地D_ax、ε_sp和ε_p的值。根据本发明，可以通过对v、ε_b和任选地D_ax、ε_sp和ε_p的每两个相邻值限定线性函数来进行内插，即，以绘图的方式，通过在v、ε_b和任选地D_ax、ε_sp和ε_p的每两个相邻值之间绘制一条线来进行内插。

优选地，通过对数学函数进行拟合(例如最小二乘拟合)来进行内插。进一步优选地，拟合具有至少0.90、特别优选至少0.95的准确度R²。合适的拟合函数可以选自线性函数、多项式函数、诸如log或ln的对数函数、指数函数、玻尔兹曼函数等。

在本发明方法的步骤(vi)中，基于吸附等温线，计算在色谱装置的预定位置z处和预定时间t时至少一种化合物在流动相中的浓度c(z，t)。如上所述，步骤(vi)中的计算还可以基于流速v、体相孔隙率ε_b和轴向分散系数D_ax。此外，可以考虑内部孔隙率ε_p和/或固定相孔隙率ε_sp。

根据本发明的优选实施方案，在步骤(vi)中，基于以下方程式计算c(z，t)

其中Z是包括以下项的和

以及

其中

q(z，t)表示固定相结合至少一种化合物的结合容量。

在本文中，已经提及v、ε_b、D_ax等的值可以根据色谱温度和流动相的组成(盐浓度、pH)而变化。因此，由于色谱温度和流动相的组成可以根据在固定相中的位置z和时间t而变化，因此v、ε_b、D_ax等的值也可以根据在固定相中的位置z和时间t而变化，即v＝v(z，t)，ε_b＝ε_b(z，t)，D_ax＝D_ax(z，t)等。

根据本发明的优选实施方案，

即，基于平衡模型计算浓度c(z，t)。

本领域技术人员能够通过依靠其背景知识，基于方程式

计算c(z，t)。优选地，通过使用计算机进行，特别优选地通过基于计算机的数值方法进行基于方程式

计算c(z，t)。

优选地，和Z还包括项

根据本发明的优选实施方案，

即基于平衡分散模型计算浓度c(z，t)。

根据本发明的另一个优选实施方案，基于集中的孔模型计算浓度c(z，t)，根据：

条件是

其中k_eff是整体质量传递系数，c_f是固定相中溶质浓度的体积平均值，q_f是结合在固定相上的溶质浓度的体积平均值，并且A是固定相的比交换面积。

交换表面积A和有效膜扩散系数k_eff可以组合成单速率系数k_eff，A：

k_eff，A＝A·k_eff

整体质量传递系数k_eff满足以下方程式

其中k_ext是外部质量传递系数，并且k_int是内部质量传递系数。

根据一般速率模型和集中的孔模型，假定固定相的表面覆盖有构成流动相的组合物的停滞层/相。进一步假定流动相在停滞相附近形成层流层。从流动相到固定相的质量传输通过层流层并通过停滞层进行。

外部质量传递系数k_ext表征了从流动相到固定相周围的停滞相的质量传输，并且可以通过Sherwood数Sh的评估来确定：

其中d_P表示流动相的流的特征直径，例如膜的孔径。它可以使用扫描电子显微镜或液-液位移孔隙率测定法测定。参数D_体相表示至少一种化合物的分子扩散系数。

根据本发明，可以使用爱因斯坦-斯托克斯(Einstein-Stokes)方程式基于分子半径r、溶剂的动态粘度η、温度T和玻耳兹曼(Boltzmann)常数k_B来估计体相扩散系数D_体相：

在限定的条件下，可以使用动态光散射测定分子半径r。该方法依赖于由溶液中的分子运动引起的散射光的强度波动。该方法也允许直接获取扩散系数。

可以使用落球粘度计测定溶液粘度η。斯托克斯定律是落球粘度计的基础，其中流体在垂直玻璃管中是静止的。允许已知尺寸和密度的球体下降通过液体。如果正确选择，则其达到最终速度，所述最终速度可以通过其经过管上的两个标记所花费的时间来测量。电子感测可以用于不透明流体。已知最终速度、球体的尺寸和密度以及液体的密度，斯托克斯定律可以用于计算流体的粘度。

根据本发明，可以基于施密特(Sc)数和雷诺(Re)数(E.J.Wilson，C.J.Geankoplis，Liquid mass transfer at very low Reynolds numbers in packedbeds，Ind.Eng.Chem.Fundam.5(1966)9-14.doi：10.1021/i160017a002)来计算Sh：

针对0.0015＜Re＜55

雷诺数Re是流体内惯性力与粘滞力的无量纲比率，该流体由于不同的流速而受到相对内部运动，在边界表面例如管道内部的情况下，该流体被称为边界层。

·ρ是流动相的密度(SI单位：kg/m³)

·v是流动相的线速度(m/s)

·L是色谱床的高度(m)

·μ是流动相的动态粘度(Pa·s或N·s/m²或kg/m·s)

·v是流动相的运动粘度(m²/s)。

施密特数(Sc)是定义为动量扩散率(运动粘度)和质量扩散率的比率的无量纲数，并且用于表征其中同时存在动量和质量扩散对流过程的流体流动。

其中：

·v是流动相的运动粘度(m²/s)。

·D是质量扩散率(m²/s)。

·μ是流动相的动态粘度(Pa·s或N·s/m²或kg/m·s)

·ρ是流动相的密度(SI单位：kg/m³)

根据本发明，表征固定相周围的停滞相内的“集中的”质量传输的内部质量传递系数k_int可以如下计算(E.Glueckauf，Theory of chromatography.VII.The general theoryOf two solutes following non-linear isotherms，Discuss.Faraday Soc.7(1949)12.doi：10.1039/df9490700012)：

其中D_eff表示停滞相内的有效分子扩散系数，其可以如K.Kaczmarski，D.Antos，H.Sajonz，P.Sajonz，G.Guiochon，Comparative modeling of breakthrough curves ofbovine serum albumin in anion-exchange chromatography，J.Chromatogr.A.925(2001)1-17.doi：10.1016/S0021-9673(01)01035-4中所述进行计算，并且R_p表示颗粒半径，其可以使用扫描电子显微镜或液-液位移孔隙率测定法测定。

由于在狭缩的孔系统中的运动，有效扩散系数D_eff在多孔系统如色谱树脂或膜吸附剂的水凝胶层中通常低一个数量级。这可以概括为曲折因子τ。

因此，基于体相扩散系数D_体相和曲折因子τ，可以计算有效扩散常数D_eff。

按照由Mackie和Meares(J.S.Mackie，P.Meares，The Diffusion ofElectrolytesin a Cation-Exchange Resin Membrane.I.Theoretical，Proc.R.Soc.London.Ser.A.Math.Phys.Sci.232(1955)498_509.http：//rspa.royalsocietypublishing.org/content/ 232/1191/498.abstract.)公开的相关性，可以使用固定相孔隙率ε_sp计算曲折因子：

可以如上所述测定固定相孔隙率ε_sp。

参数k_int可以解释为由厚度为R_p/5的平坦扩散层引起的质量传递阻力。

用于计算由球形多孔颗粒构成的固定相的k_int的上述方法可以被转移到不由球形多孔颗粒构成的固定相。假定固定相在其表面上具有均匀分布的吸附位点，并且假设至少一种化合物的溶质分子在达到吸附位点之前必须在停滞相内行进，则扩散路径可以表示为d_H/2(J.Schwellenbach，S.Zobel，F.Taft，L.Villain，J.Strube，Purification ofmonoclonal antibodies using a fiber based cation-exchange stationary phase：parameter determination and modeling，Bioengineering 3(2016)24/1-24/20.doi：10.3390/bioengineering3040024)，还可以基于以下方程式计算k_int：

其中d_h表示停滞相的厚度。在膜吸附剂的情况下，停滞相可以解释为水凝胶层厚度。它可以如下计算：

其中d_h是水凝胶层厚度，V_b是柱体积，A_spec是比表面积，m是固定相质量，并且ε_in和ε_ex是小示踪物分子(例如丙酮)所观察到的可完全达到水凝胶层的孔隙率值，以及流体动力学半径r_H＞15nm的大示踪物分子(例如具有2.000.000g/mol的分子量Mn的右旋糖酐)所观察到的完全排除在水凝胶层之外的孔隙率值。膜吸附剂的比表面积A_spec可以经由BET测量来确定。

根据本发明的另一个优选实施方案，基于一般速率模型计算浓度c(z，t)，根据：

其中k_ext是至少一种化合物关于膜传递的动力学系数，c_f是至少一种化合物在固定相的孔或吸附层中的浓度，并且r是固定相颗粒的半径，其可以通过扫描电子显微镜测定。

如果固定相孔隙率ε_sp为非零值，则在一般速率模型中需要考虑以下方程式。

其中D_eff是有效扩散系数。

除了上述用于测定质量传递参数(例如k_eff、D_eff等)的方法，还可以使用其它方法进行直接或间接评估。这包括但不限于对由不同色谱实验产生的信号的评估(如在E.C.Ladd，T.Hahn，J.Seiler，S.A.Oelmeier，I.Asen，C.Silberer，L.Villain，J.Hubbuch，Modeling and simulation of anion-exchange membrane chromatography forpurification of Sf9 insect cell-derived virus-like particles，J.Chromatogr.A.1429(2016)142-154中描述的)、示踪物信号评估或间歇提取实验的评估。

在许多情况下，色谱装置不仅包含固定相/色谱床。可以存在辅助元件，如阀、管、流量分配器等。这些辅助元件，即流动相流经并且与色谱床不同的色谱装置的部分，被称为“外部系统”。这些辅助元件对色谱装置的流体动力学性质的影响可以考虑如下所述。

根据本发明的优选实施方案，在步骤(vi)中，色谱装置可以视为假设的搅拌罐(ST)、假设的分布式活塞流管(DPF或PFP)和色谱床的组合，其中DPF布置在ST的下游，并且色谱床布置在DPF的下游，如图17所示。(或者，色谱装置可以视为假设的搅拌罐(ST)和假设的分布式活塞流管(DPF或PFP)中的仅一种与色谱床的组合。)因此，优选将外部系统视为一系列ST和DPF(外部系统“ST+DPF”)。即，根据本发明的优选实施方案，基于以下方程式计算c(z，t)：

其中

V_SYS＝V_ST+V_DPF

c(t＝0，z)＝0

在上述方程式中，z^DPF是(假设的)DPF中的位置，

是z^DPF可以取的最大值(DPF的出口)，z是色谱床中的位置，

是(假设的)ST入口处的至少一种化合物的浓度，

是ST出口处的至少一种化合物的浓度，V_ST是ST的体积，F是通过ST的流动相的体积流速，C^DPF是DPF中的至少一种化合物的浓度，

是DPF入口处的至少一种化合物的浓度，

是DPF出口处的至少一种化合物的浓度，c(z＝0，t)是色谱床入口处的至少一种化合物的浓度，

是DPF的轴向分散系数，其可以以与色谱床的分散系数D_ax类似的方式测定，V_SYS是除色谱床的体积V_b之外的流动相可达到的色谱装置的总体积，V_ST是搅拌罐的体积，并且V_DPF是DPF的体积。其它表达式如上所定义。

根据该优选实施方案，外部系统的贡献集中在柱的前面，这意味着假设的搅拌罐的出口等于假设的DPF/PFP的入口，并且DPF/PFP的出口等于色谱床的入口(参见图1)。

V_SYS可以基于色谱设备的几何形状来测定。具体地，V_SYS可以在没有色谱介质的情况下通过应用示踪物信号的第一矩的分析来测定。

V_SYS＝Fμ_p

其中如上所述，F表示体积流速并且μ_p表示示踪物峰的第一矩。在脉冲注入之后离开系统的示踪物物质的全部浓度分布的回归得到描述外部系统的流体动态行为所必需的全部参数集。如果ST和DPF的组合被用于描述该行为，则误差最小化拟合程序得到

V_ST和V_DPF。

如上所述，步骤(vi)中的c(z，t)的计算可以基于偏微分方程式(PDE，取决于时间和空间)。为了求解这些方程式，可以将PDE变换成常微分方程式(ODE)。这通常通过用数值方法描述空间相关性来完成。然后，将一个PDE转换为k个ODE，其中k是离散化的程度。使用的数值方法可以是(但不限于)有限差分方法、正交配置或对有限元的正交配置。

在大多数情况下，所得到的k个ODE的系统不能分析地求解。现有技术的方式是在离散时间步骤的数值积分。存在各种不同的积分方法，并且可以根据需要来使用。这些方法为(但不限于)隐式Euler方法、显式Euler方法、变步长隐式Euler方法和Runge-Kutta方法。

各种商业软件捆绑提供了解析上述PDE系统的可能性，在步骤(vi)中的c(z，t)的计算可以基于所述PDE系统。这些包括Aspen Custom

在另一方面，本发明涉及色谱方法，其包括上述在色谱方法中测定至少一种化合物的浓度的方法，以及(iv)进行色谱法的步骤。

根据本发明的优选实施方案，步骤(vi)包括计算在若干时间点t时在色谱装置的出口处的化合物在流动相中的浓度c_out(t)，并且步骤(vii)包括在其中c_out(t)＞0.0mmol/L、优选地其中c_out(t)＞0.00mmol/L的时间t时收集流动相。根据本发明，可以在步骤(vi)中计算至少一种化合物的穿透曲线，并且可以根据所计算的穿透曲线来收集流动相。特别优选在其中c_out(t)为显著浓度(即至少0.01μmol/L、优选至少0.001μmol/L、特别优选至少0.0001μmol/L的浓度)的时间t时收集流动相。

通过使用上述方法，可以可靠地预测浓度c(z，t)，从而可以根据在步骤(vi)中获得的c(z，t)的结果来控制或调整色谱方法。这在工业色谱方法中可以是特别相关的。在许多情况下，工业色谱方法采用串联放置的多个色谱装置。(根据关于本发明方法的步骤(v)的上述优选实施方案，在这种工业方法中在步骤(v)中选择几个色谱装置。)通常，用于这种工业方法的工艺参数(包括各种固定相、流动相的组成等)是很平衡的。在不满足预定的工艺条件的情况下，整个多阶段工艺可以被折衷，可能导致通过色谱工艺纯化的化合物的损失。然而，在其中多个色谱装置串联放置的这种良好平衡的工业方法中，可能发生例如由于临时系统故障和/或人为错误而不满足预定的工艺条件。例如，盐浓度、pH、温度或其它相关参数可以超出所需的限制。通常，考虑到多级色谱过程的通常精细的平衡，如果不是不可能补偿的话，这种故障可能是困难的。

然而，本发明的色谱方法利用吸附等温线，其中考虑了固定相的组成和/或温度对固定相的结合容量的影响。因此，在临时系统故障和/或人为错误的情况下，可以例如通过改变流动相的组成和/或色谱温度来迅速确定用于补偿错误的适当机构。通过使用可公开获得的软件(例如来自Sartorius AG的

)，可以将相应的控制或反馈回路集成到色谱方法中。

根据本发明的优选实施方案，步骤(vii)包括在色谱方法中监测至少一个变化参数的值。至少一个变化参数可以以本领域技术人员已知的任何方式监测，例如通过使用一个或多个传感器的测量。根据本发明，可以仅监视至少一个变化参数中的一些或全部。

优选地，步骤(vii)还包括确定一个或多个监测值是否满足相应的预定标准，并且在不满足相应的预定标准的情况下，基于在步骤(iv)中获得的吸附等温线在色谱方法中调整至少一个变化参数中的一个或多个。基于吸附等温线所提供的信息，可以确定所述至少一个变化参数中的一个或多个的适当调整(变化)，以便对不满足预定标准进行补偿。例如，预定标准可以是流动相中的盐浓度，并且调整的参数可以是流动相的pH，反之亦然。

本发明提供了快速获得准确可靠的整体吸附等温线的方法。所获得的吸附等温线可以用于在色谱方法中确定至少一种化合物的浓度，用于获得色谱方法的至少一个固定相，用于评估预定的吸附等温线和在色谱方法中的准确度。

图1示意性地示出了带电水凝胶层取决于流动相的盐浓度的可逆溶胀行为。

图2示出了根据盐浓度c_S，在

Q Nano模块上测定的右旋糖酐2000kDa分子的孔隙率值ε(c_S)。

图3示出了可达到的体积分数取决于示踪物分子大小的依赖性，在此，示踪物分子为在pH 7、10mM NaCl的10mM KPi缓冲液中的支链烷烃(参见实施例2)，其中各化合物的流体动力学半径r_H如S.Viel,D.Capitani,L.Mannina,A.Segre,Diffusion-ordered NMRspectroscopy:A versatile tool for the molecular weight determination ofuncharged polysaccharides,Biomacromolecules.4(2003)1843-1847.doi:10.1021/bm0342638中所述进行测定。

图4示出了Fractogel EMD SO₃ ^-(M)取决于盐浓度的固定相孔隙率值ε_sp并且相应拟合成玻尔兹曼函数(参见实施例2)。

图5示出了Fractogel EMD SO₃ ^-(M)取决于盐浓度的体相孔隙率值ε_b并且相应拟合成玻尔兹曼函数(参见实施例2)。

图6示出了实施例3的等温线测定工作流程。

图7示出了实施例3的牛血清白蛋白在

Q上的平衡吸附数据。

图8示出了在实施例3a的8小时平衡后从

S洗脱的细胞培养物上清液积分的尺寸排阻色谱图。

图9示出了实施例3a的水凝胶接枝的色谱介质(水凝胶接枝的膜吸附剂

S)在20mM的盐浓度下多种组分的平衡吸附数据。该图表示Langmuir等温线拟合。

图10示出了实施例3b的单克隆抗体的单体取决于电导率和pH的平衡吸附数据图。

图11示出了实施例3b的单克隆抗体的二聚体取决于电导率和pH的平衡吸附数据图。

图12示出了实施例5的色谱介质取决于线流速的轴向分散系数。

图13示出了实施例5的外部系统“ST+DPF”(参见图17)的DPF取决于线流速的轴向分散系数

图14示出了实施例7的在低盐浓度下的模拟结果。

图15示出了实施例7的在高盐浓度下的模拟结果。

图16(a)示出了实施例8的包括Langmuir等温线拟合的平衡吸附数据。

图16(b)示出了实施例8的平衡结合常数对盐浓度的依赖性。

图16(c)示出了实施例8的最大吸附容量对盐浓度的依赖性。

图17示出了根据本发明的优选实施方案的色谱装置的示意图。

图18示出了示例性色谱设备。

图19示意性地示出了本发明的优选实施方案。

图20示出了实施例10的结果。

本发明还通过以下非限制性实施例进行例示。

实施例

实施例1：根据工艺条件确定孔隙率数据(步骤(v'))

可逆溶胀行为的测定可以使用逆体积尺寸排阻色谱法(iSEC)容易地进行，同时改变所需的过程条件。在此，给出了具体实例。

固定相是

S膜吸附剂。作为膜吸附剂，

S不具有内部孔隙率(ε_b＝ε_T)。它示出了源自其带电水凝胶表面改性的显著的可逆溶胀行为。色谱装置是3mL(V_b＝3mL)具有8mm床高度的

Nano。

色谱设备的死体积V_Dead通过使用5μL注射液0.25g/L右旋糖酐(Mw＝2000kDa，通过尺寸排阻色谱法测定)测定，通过RI检测器测定在无色谱装置的情况下为0.319±0.03mL。峰最大值和第一动量分析分别用于测定死体积。色谱装置的死体积为1mL。

对于iSEC实验，使用的缓冲液是10mM磷酸钾缓冲液(KPi)，缓冲液为pH 7。盐浓度(NaCl)为0.01至0.8M。膜吸附剂(MA)在加载50μL注射液0.5g/L右旋糖酐2000kDa之前用所需的盐浓度平衡15个膜体积。使用IR检测器记录所得的峰响应。

基于以下方程式确定孔隙率ε。

所获得的孔隙率值取决于所使用的盐浓度，如图2所示。

将数据集使用玻尔兹曼函数拟合，如下所示。

拟合参数测定如下：

实施例2：根据过程条件确定孔隙率数据(步骤(v'))

在色谱介质具有外部孔隙率和内部孔隙率的情况下，可以使用如上所述的逆体积尺寸排阻色谱来测定两个值。根据示踪物分子大小，具有内部孔隙率的色谱介质显示出不同的色谱床的可达到的体积分数。Fractogel EMD SO₃ ^-(M)的实例示于图3中。

固定相孔隙率ε_sp可以使用总孔隙率ε_T和外部孔隙率ε_b(空隙率)来计算。

总孔隙率ε_T是由具有内部孔隙率完全可通达性的示踪物分子可通达的。在该实施例中，使用丙酮。完全排除的示踪物分子可以确定体相孔隙率ε_b。在该实施例中，使用分子量Mw为2000kDa的右旋糖酐。使用上述方程式，可以使用所获得的ε_R和ε_b的值来计算取决于盐浓度的固定相孔隙率ε_sp。包括玻尔兹曼拟合的所获得的ε_sp(固定相孔隙率)和ε_b(外部孔隙率)的值和相应的参数示于图4和图5中。

固定相孔隙率ε_sp：

参数	值
		A<sub>1</sub>	0.365
A<sub>2</sub>	0.674
		x<sub>0</sub>	0.122
dx	0.140

体相孔隙率ε_b：

当使用玻尔兹曼函数时，孔隙率值ε_b和ε_sp均获得了优异的拟合。

实施例3：获得平衡吸附数据(步骤(iii))

在实施例3中，获得牛血清白蛋白(BSA)在

Q上的平衡吸附数据。

对于

Q(平均孔径为3μm且配体密度为2-5

)，用0.1至5g/L牛血清白蛋白(BSA)进行的基于如Antibodies 2018,7(1),13；https://doi.org/10.3390/antib7010013,“Evaluation of Continuous Membrane Chromatography Concepts withan Enhanced Process Simulation Approach”,Zobel,Stein,Strube中所示的间歇实验的平衡吸附数据的测定。使用的缓冲液是20mM TRIS HCl缓冲液，pH＝7，NaCl浓度为0至0.3MNaCl。使用HCl或NaOH调节pH值。将直径为20cm且高度为0.024-0.028cm的圆形

Q膜吸附剂(MA)样品在具有各自的pH和盐浓度的20mM TRIS HCl缓冲液中平衡30分钟。缓冲液的体积是MA体积的200倍。在30分钟的平衡时间之后，将MA用纸擦拭并转移到12孔板腔中。将BSA溶解在对应于实验pH和盐浓度的TRIS HCl缓冲液中。通过UV/Vis光谱在280nm测量BSA进料溶液的浓度，并将4mL添加至12孔板中的MA中。在至少8小时的停留时间之后，测量上清液浓度，再次将MA用纸擦拭并转移到新的孔板中。随后，用4mL 20mM TRIS HCl和1MNaCl洗脱MA至少4小时。在4小时洗脱时间之后测量上清液浓度。在图6中示意性地描绘了上述过程。

将获得的三种不同的盐浓度的数据集示于图7中。

实施例3a：获得几种化合物的平衡吸附数据

实施例3的方法对于多组分分析也是可行的。突出的实例是同时测定单克隆抗体(mAb)以及它们的聚集体和污染物的平衡吸附数据。间歇实验可以以相同的方式进行，但必须以允许区分所有组分(mAb单体、聚集体和其它污染物)的方式分析上清液和洗脱液。例如，这可以通过尺寸排阻色谱法实现。

所获得的尺寸排阻色谱图的所得峰(参见本实施例的图8)可以使用适当的校准来评估，以测定在图6中所示的间歇实验期间目标组分的浓度。这得到平衡吸附数据。对于给定的盐浓度，在图9中示出了实例。

实施例3b：获得变化的盐浓度和变化的pH的平衡吸附数据

在上述实施例3中，仅改变盐浓度。按照相同的方法，也可以改变其它的影响因素如pH，从而得到多维吸附数据图。图10和图11示出了单克隆抗体IgG及其二聚体取决于pH和盐浓度在

Q上的平衡吸附数据。

实施例4：将数据集拟合成SMA等温线(步骤(iv))

将实施例3中获得的数据集用于计算蛋白质特征电荷ν_i和平衡常数K_i，此外，在三种不同盐浓度(c_S＝0.05、0.15、0.25M)下使用计算机辅助最小二乘回归将空间因子σ_i对SMA吸附等温线进行拟合，以在所研究的盐浓度区域中获得必要的吸附模型参数。离子容量Λ为0.97mol/L(

Q)。

吸附常数：K_i＝7.55

空间因子：σ_i＝46.04

特征电荷：v_i＝2.72

盐浓度：c₁＝0.05M

实施例5：测定流体动力学行为和轴向分散系数

选择来自GE Healthcare的

Explorer作为色谱装置(步骤(v))。

如下测定参数V_SYS、V_ST、V_DPF和

在不存在色谱介质的情况下，进行丙酮(在反渗透水中的2体积％)或mAb(在磷酸钾(KPi)缓冲液中的4mg/mL，10mM、20mM NaCl，pH＝6)的脉冲进样。使用不同的体积流速和缓冲液条件进行实验。按照矩的方法评估所得的峰信号，并使用最小二乘拟合程序回归以获得所需值。该程序的结果在图12和图13中给出。

实施例6:动力学和扩散系数的测定

根据集中的孔模型，使用水凝胶改性的膜吸附剂

S的数学相关性确定有效膜扩散系数D_eff：

使用爱因斯坦-斯托克斯方程式计算体相扩散系数。特别地，将静脉内免疫球蛋白(IVIG，humanγ-Globulin,SeraCare；r＝5.2nm)溶解在在298K的温度下粘度η为1.05mPa·s的磷酸钠缓冲液(20mM，pH＝7)中。

使用逆体积尺寸排阻色谱法(iSEC)测定孔隙率值。简而言之，用50柱体积(CV)的所需缓冲液(磷酸钠缓冲液(20mM，pH＝7))对色谱床进行平衡，然后进样含有具有窄分子量分布的支链淀粉分子(2mg/mL)的溶液(100μL)。平均分子量，与所应用的支链淀粉样品的平均流体动力学半径直接相关，对于每次进样是变化的，覆盖宽的范围(Mn＝320-740,000g/moL)。记录洗脱曲线并通过RI检测器分析。

使用以下相关性计算有效扩散系数。

通过如上所述的iSEC测定内部孔隙率ε_p的值。

对于膜吸附剂，根据相应的目标化合物NaCl、丙酮和单克隆抗体IgG计算以下值：

实施例7：蛋白质纯化过程的预测(步骤(vi))

在实施例1和实施例5中获得的模型参数集用于预测丙酮示踪物脉冲信号的流体动力学行为。发现丙酮在使用的膜吸附剂上的吸附等温线为0(丙酮不与固定相结合)。通过平衡分散模型(EDM)模拟了液相色谱(LC)系统和膜吸附剂(MA)。此外，色谱设备被认为是ST、DPF和色谱柱的组合，如上文所述和如以下方程式(参见图17)所示。

其中

V_SYS＝V_ST+V_DPF

c(t＝0,z)＝0

总体LC系统具有2943mm的管长，1.3mL的体积和1的孔隙率。整个MA装置由5.73mm色谱床高度、3.5mL色谱床体积和76-71％(0.76-0.71)的孔隙率表示。使用的MA是在pH7的10mM KPi缓冲液中的

S。用2mL注射体积的含有5％丙酮和0或0.8M额外氯化钠的KPi缓冲液以4mL/min进行示踪实验。在图14中，比较低盐浓度模拟结果和实验数据。在低盐浓度下，常规和改善的模型方法得到了类似的结果。在高盐浓度下，考虑固定相的可逆溶胀产生比没有考虑固定相的可逆溶胀的方法好得多的结果(参见图15)。图14和图15示出了不同的孔隙率值对流体动态行为的显著影响。

下表示出了常规模拟方法与根据本发明的方法的比较，其对应于半峰宽FWHM(半高全宽)和峰值中心。与常规方法相比，本发明的方法得到了与实验值更小的偏差。

	FWHM	中心
			常规模拟与实验的偏差/％	2.2	10.6
本发明模拟与实验的偏差/％	2.0	2.6

实施例8：将数据集拟合成Langmuir等温线(步骤(iv))

考虑到不同的NaCl浓度，将IVIG在水凝胶接枝的色谱膜上获得的平衡吸附数据的数据集拟合成Langmuir等温线。结果示于图16(a)至图16(c)中。

从图16(a)可以看出，Langmuir拟合以高准确性近似等温线吸附数据。

实施例9：通过实验设计的离子交换色谱(IEX)方法的研究(步骤(ii))

用于单组分离子交换色谱(IEX)步骤的常规间歇等温线测定实验装置可以是：在平衡条件下用6种不同进料浓度c_进料、4种不同盐浓度c_盐和5种pH值测量结合质量。例如，6种不同的进料浓度c_进料可以是在0.5g/L步骤中从0.5至2.5的值，5种pH值可以是在0.5步骤中从5至7的值，并且4种盐浓度c_盐可以选择为0.001M、0.1M、0.2M、0.3M和0.4M。这导致总共120次实验。

与此相反，通过使用实验设计(实验的设计，DoE)，对于完全析因(fullfac)模型将需要总共27次实验，或者对于具有星形距离1的CCF模型将需要总共17次实验。CCF模型结果如下：

因此，上述实施例证明，通过基于实验设计进行步骤(ii)，可以显著减少在步骤(iii)中获得的用于在步骤(iv)中获得吸附等温线的结合容量值的数量。

实施例10：获得用于变化的pH和变化的盐浓度的整体吸附等温线(步骤(iv))

基于在步骤(iii)中获得的吸附数据，可以获得应用设计空间(即，浓度、pH和盐浓度的相应范围)中的整体吸附等温线。这可以通过对潜在统计实验计划的评估来实现。各种商业软件可用于统计计划设计和用于以下评估，例如来自Sartorius AG的

基于在步骤(iii)中获得的实验结合容量值，获得多个初步吸附等温线(iv-2a)，其中对于每个初步吸附等温线，至少一个变化参数之一保持恒定。在此，pH保持恒定，同时通过初步吸附等温线考虑变化的盐浓度。对SMA等温线进行每一个初步拟合。因此，获得了以下SMA等温线参数。

基于在上表中总结的初步拟合中获得的结果，进行主拟合步骤(iv-2b)。即，在主拟合步骤(iv-2b)中，通过将一个参数方程式与在初步拟合步骤中获得的SMA等温线的每个参数的数值拟合来获得整体吸附等温线。结果示于图20中。

考虑线性项、二次项和三次项，得到以下拟合参数方程式。

log(K_i)＝43.90-20.00·pH+3.16·pH²-0.17·pH³

σ_i＝34891-16251.60·pH+2596.88·pH²-136.08·pH³

v_i＝7.57-3.23·pH+0.48·pH²-0.02·pH³

从图20所示的结果可以看出，pH变化对SMA等温线参数K_i(“K”)和σ_i(“空间”)的影响是高度非线性的。常规的线性内插会不考虑这种非线性，从而产生不准确的结果。

Claims

1.获得至少一种化合物的吸附等温线的方法，所述方法包括以下步骤：

(ia)选择所述至少一种化合物；

(ib)选择固定相；

(ic)选择流动相；

(id)选择所述至少一种化合物、所述固定相和所述流动相的温度；

其中选自表征所述流动相的组成和所述温度的参数中的至少一个参数是变化的；

(ii)获得包括所述至少一个变化的参数和所述至少一种化合物在所述流动相中的浓度的多个参数值集；

(iii)对于在步骤(ii)中获得的所述多个参数值集中的每一个，获得所述固定相对所述至少一种化合物的多个结合容量值；以及

(iv)基于在步骤(iii)中获得的所述多个结合容量值通过多元数据分析获得所述吸附等温线。

2.根据权利要求1所述的方法，

其中所述表征所述流动相的组成的参数选自在所述流动相中包含的溶剂的浓度、pH、盐浓度和/或所述至少一种化合物的浓度。

3.根据权利要求1或2所述的方法，

其中所述至少一个变化的参数的数量是两个或更多个。

4.根据权利要求3所述的方法，

其中所述至少两个变化的参数包括所述流动相的pH和盐浓度。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，

其中在步骤(ii)中通过实验设计获得所述多个参数值集。

6.根据权利要求5所述的方法，

其中所述实验设计是完全析因设计或部分析因设计。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，

其中步骤(iii)包括一个或多个实验室实验。

8.在色谱方法中测定至少一种化合物的浓度的方法，所述方法包括根据权利要求1至7中任一项所述的方法，并且还包括以下步骤：

(v)选择具有色谱床的色谱装置，所述色谱床包含所述固定相和所述流动相；以及

(vi)基于在步骤(iv)中获得的所述吸附等温线，计算在所述色谱装置的预定位置z处和在预定时间t时所述至少一种化合物在所述流动相中的浓度c(z,t)。

9.根据权利要求8所述的方法，其中

所述方法还包括以下步骤：

(v')至少确定所述流动相在所述色谱床中的流速v和所述色谱床的体相孔隙率ε_b；

其中在步骤(vi)中，所述浓度c(z,t)的计算进一步基于所述流速v和所述体相孔隙率ε_b。

10.获得至少一种固定相的方法，所述方法包括以下步骤：

(I)执行根据权利要求1至7中任一项所述的方法m次，其中m是2或更大的整数，并且所述m次执行关于步骤(ib)彼此不同；以及

(II)基于步骤(I)的结果选择所述至少一种固定相。

11.评估预定的吸附等温线的准确度的方法，包括根据权利要求1至7中任一项所述的方法以及以下步骤：

将所述预定的吸附等温线与在步骤(iv)中获得的所述吸附等温线进行比较。

12.色谱方法，包括

根据权利要求8或9中任一项所述的在色谱方法中测定至少一种化合物的所述浓度的方法，以及以下步骤：

(vii)进行色谱法。

13.根据权利要求12所述的色谱方法，

其中步骤(vii)包括：

在所述色谱方法中监测所述至少一个变化的参数的值。

14.根据权利要求13所述的色谱方法，

其中步骤(vii)进一步包括

确定一个或多个所述监测值是否满足各自的预定标准，以及

在不满足所述各自的预定标准的情况下，基于在步骤(iv)中获得的所述吸附等温线，在所述色谱方法中调节所述至少一个变化的参数中的一个或多个。

15.色谱方法，包括

根据权利要求10所述的获得至少一种固定相的方法，以及以下步骤：

(III)使用在步骤(II)中选择的所述至少一种固定相进行色谱法。