CN113913289A - 一种气密条件下病原核酸的检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种气密条件下病原核酸的检测试剂盒及检测方法，属于核酸提取技术领域，包括密封盒体、密封盖，密封盒体内从上至下依次设置有由通道连接的第一洗涤剂室、裂解缓冲剂室、第二洗涤剂室、洗脱缓冲剂室、纯化膜室、废液室、反应检测室和在通道上设置的能够开通的密封膜；检测方法包括裂解缓冲剂室、第一洗涤剂室、第二洗涤剂室和洗脱缓冲剂室以密封膜与通道隔离，相应步骤完成以后，激光击穿密封膜，离心驱动相应腔室液体流入通道。本发明通过密封膜隔离预装试剂，完全无接触的激光打孔和离心力驱动，基于流体性质的芯片结构设计，实现检测试剂盒在气密全封闭条件下病原核酸的提取和实时荧光PCR扩增检测。

Description

一种气密条件下病原核酸的检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及核酸提取技术领域，尤其是一种气密条件下病原核酸的检测试剂盒及检测方法。
背景技术
核酸分析技术，作为一种强有力的分子诊断技术，在病原体诊断、传染病预防、疾病监测治疗等方面具有重要的应用。相对于常规的免疫学诊断方法,核酸分析具有高特异性、高灵敏度等突出优势。由于大多数目标基因的浓度低,难以直接分析检测,所以基于核酸扩增原理的PCR、LAMP等核酸分析方法成为了当前核酸分析的主要手段。其完整过程通常包括核酸提取、核酸扩增以及核酸检测三大环节。但传统的核酸分析存在耗时长、成本高、工作量大、设备体积大、需要专门的实验环境和人员等缺点,并且由于核酸扩增的超高灵敏度,在普通实验室开放环境下核酸的扩增过程中,阳性样本的气溶胶交叉污染很容易造成后续样品的核酸检测假阳性。因此对样品在全密闭条件下，进行无交叉污染的自动化核酸扩增分析具有十分重要的应用价值。
目前申请号为202020441774.9的中国实用新型专利公开了一站式全自动封闭式核酸提取与实时荧光PCR测试联合试剂盒。所述联合试剂盒为一体结构，包括加样口A、裂解室(C1)、吸附及洗脱室(C2)、废液室(C3)、洗脱剂室(C4)、荧光PCR室(C5)和切换阀(VT1),连通各个腔室的管道以及控制流体流向的单向阀，维持压力平衡的通气阀,驱动液体流动的活塞(PT)，磁珠。
但是该专利存在以下局限：
1、联合试剂盒的废液室C3的顶端设置有维持腔体内压力平衡的单向通气阀V7，洗脱剂室C4的顶端设置有维持腔体内压力平衡的单向通气阀V8；洗脱剂室C4和荧光PCR室C5之间设置有连通管道，且该连通管道上设置有单向通气阀V5，用于维持荧光PCR室内部压力平衡。由此可见，该专利并没有实现真正的“封闭式”，依然存在产生气溶胶污染，导致生物泄露和样品交叉污染的风险。
2、联合试剂盒标注为注塑成型的一体结构。但VT1切换阀处无法实现密封和一次性注塑工艺成型，因此会存在泄漏风险。
3、联合试剂盒的吸附及洗脱室C2中预存有用于吸附核酸的磁珠。由此可见，吸附核酸的磁珠的生产工艺决定无法实现“无核酸污染”，该种核酸提取纯化方法不适用于高灵敏病毒核酸检测，存在假阳性风险。
4、荧光PCR室C5采用恒温热板PCR反应技术，灵敏度低。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是提供一种气密条件下病原核酸的检测试剂盒及检测方法，实现检测试剂盒在气密全封闭条件下病原核酸的提取。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：
一种气密条件下病原核酸的检测试剂盒，包括设置有样品入口的密封盒体、设置在样品入口处的密封盖，所述密封盒体内从上至下依次设置有由通道连接的填充有第一洗涤剂的第一洗涤剂室、上端与样品入口连接且填充有裂解缓冲剂的裂解缓冲剂室、填充有第二洗涤剂的第二洗涤剂室、填充有洗脱缓冲剂的洗脱缓冲剂室、将样品进行提纯的纯化膜室、储存废液的废液室和填充有扩增混合物的反应检测室；
所述第一洗涤剂室、所述第二洗涤剂室、所述裂解缓冲剂室和所述洗脱缓冲剂室的左侧均设置有与通道连通的出口端，且出口端在使用前进行封闭设置；
所述纯化膜室由通道贯穿，且在纯化膜室的出口端设置纯化膜；
所述废液室的右侧设置有与通道连通的入口端；
所述反应检测室的左端与通道连通。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述密封盒体包括结构层、设置在结构层前侧的第一密封层和设置在结构层后侧的第二密封层；所述结构层从上至下依次设置有由通道孔连接的第一洗涤剂孔、裂解缓冲剂孔、第二洗涤剂孔、洗脱缓冲剂孔、纯化膜孔、废液孔和反应检测孔；在所述裂解缓冲剂孔的上端设置有样品入口孔；所述结构层与第一密封层和第二密封层压合形成密封盒体。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述结构层的材质为透明聚丙烯。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述通道包括设置在第一洗涤剂室出口端的第一阻塞通道、设置在第二洗涤剂室出口端的第二阻塞通道、设置在裂解缓冲剂室出口端的第三阻塞通道、设置在洗脱缓冲剂室出口端的第四阻塞通道、贯穿纯化膜室并连接至反应检测室入口的主通道和设置在废液室入口端的废液通道；所述第一阻塞通道、第二阻塞通道、第三阻塞通道、第四阻塞通道和废液通道均上扬连接至主通道。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述第一阻塞通道、第二阻塞通道、第三阻塞通道和第四阻塞通道均由密封膜封闭。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述密封膜为PET材料黑色膜。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述纯化膜为经过核酸酶处理的硅胶膜。
一种气密条件下病原核酸的检测方法，包括以下步骤：
S1、将待检样品通过样品入口加入密封盒体内，并盖上密封盖进行密封；
S2、将裂解缓冲剂室中的待检样品震动混匀；
S3、将装有待检样品的检测试剂盒与等重量的试剂盒模型或同样装有待检样品的检测试剂盒对称放入转盘上；
S4、先用激光打通第三阻塞通道处的密封膜，转盘旋转，裂解后的待检样品进入所述纯化膜室，产生的废液流入废液室；
S5、再用激光打通第一阻塞通道处的密封膜，转盘旋转，第一洗涤剂流入所述纯化膜室洗涤杂质，产生的废液流入废液室；
S6、再用激光打通第二阻塞通道处的密封膜，转盘旋转，第二洗涤剂流入所述纯化膜室洗涤杂质，产生的废液流入废液室；
S7、转盘旋转，使残留在纯化膜室的废液流入废液室；核酸被吸附在纯化膜上；
S8、最后用激光打通第四阻塞通道处的密封膜，转盘旋转，转盘静止，转盘继续旋转，所述洗脱缓冲剂通过纯化膜室洗脱吸附在纯化膜上的核酸，经主通道进入反应检测室；
S9、在反应检测室内对核酸进行核酸扩增反应；
S10、利用荧光检测系统对反应后的待检样品进行检测。
本发明技术方案的进一步改进在于：S9中所述核酸扩增反应为实时荧光PCR扩增反应，包括若干个升降温循环。
由于采用了上述技术方案，本发明取得的技术进步是：
1、本发明通过设置密封膜隔离预装试剂，完全无接触的激光打孔和离心力驱动，实现检测试剂盒在气密全封闭条件下病原核酸的提取，无二次泄漏风险，保护操作人员的安全。
2、本发明通过三层芯片结构设计，保证检测试剂盒的密封效果。
3、本发明通过设置经过核酸酶处理的纯化膜，实现介质的“无核酸污染”，降低高灵敏检测中常见的假阳性风险。
4、本发明通过采用实时荧光PCR扩增反应，灵敏度在10-200拷贝/毫升，对比于灵敏度在2000-5000拷贝/毫升的恒温扩增检测方法，实时荧光PCR扩增反应具有更高的灵敏度。
附图说明
图1是本发明中检测试剂盒内部结构示意图；
图2是本发明中检测试剂盒整体结构示意图；
图3是本发明中结构层示意图；
图4是本发明中转盘示意图；
其中，1、密封盒体，1-1、结构层，1-1-1、样品入口孔，1-1-2、通道孔，1-1-3、第一洗涤剂孔，1-1-4、裂解缓冲剂孔，1-1-5、第二洗涤剂孔，1-1-6、洗脱缓冲剂孔，1-1-7、纯化膜孔，1-1-8、废液孔，1-1-9、反应检测孔，1-2、第一密封层，1-3第二密封层，2、密封盖，3、第一洗涤剂室，4、裂解缓冲剂室，5、第二洗涤剂室，6、洗脱缓冲剂室，7、纯化膜室，7-1、纯化膜，8、废液室，9、反应检测室，10、通道，10-1、第一阻塞通道，10-2、第二阻塞通道，10-3、第三阻塞通道，10-4、第四阻塞通道，10-5、主通道，10-6、废液通道，11、密封膜。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步详细说明：
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”……等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
此外，术语“第一”、“第二”……仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”……的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“若干个的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
如图1、2所示，一种气密条件下病原核酸的检测试剂盒，包括设有样品入口的密封盒体1、与盒体密封对接形成密封腔的密封盖2、从上至下依次由通道10连接的第一洗涤剂室3、裂解缓冲剂室4、第二洗涤剂室5、洗脱缓冲剂室6、纯化膜室7、废液室8和反应检测室9；
裂解缓冲剂室4填充有裂解缓冲剂，裂解缓冲剂经通道10流入纯化膜室7；裂解缓冲剂室4与样品入口连接；裂解缓冲剂为高盐溶液。
第一洗涤剂室3填充有第一洗涤剂，第一洗涤剂经通道10流入纯化膜室7；第一洗涤剂为900毫摩乙酰葡萄糖异硫氰酸酯(GITC)与10毫摩氨丁三醇在20%乙醇中配置的pH值为7.5的溶液。
第二洗涤剂室5填充有第二洗涤剂，第二洗涤剂经通道10流入纯化膜室7；第二洗涤剂为100毫摩氯化钠与10毫摩氨丁三醇在80%乙醇中配置的pH值为7.5的溶液。
洗脱缓冲剂室6填充有洗脱缓冲剂，洗脱缓冲剂经通道10流入纯化膜室7；洗脱缓冲剂为水，能够将核酸从纯化膜7-1上洗脱下来。
纯化膜室7的出口端由纯化膜7-1密封后，与废液室8和反应检测室9连接；纯化膜7-1为经过核酸酶处理的硅胶膜，在高盐酸条件下可以吸附核酸。
反应检测室9填充有预先冻干的扩增混合物，扩增混合物包含扩增酶、扩增缓冲剂、引物和荧光标记探针。
第一洗涤剂室3、裂解缓冲剂室4、第二洗涤剂室5、洗脱缓冲剂室6出口端由密封膜11封闭，密封膜11为PET材料黑色膜，能够由激光穿透。
如图2、3所示，密封盒体1包括一个结构层1-1、设置在结构层1-1前侧的第一密封层1-2和设置在结构层1-1后侧的第二密封层1-3；结构层1-1从上至下依次设置有由通道孔1-1-2连接的第一洗涤剂孔1-1-3、裂解缓冲剂孔1-1-4、第二洗涤剂孔1-1-5、洗脱缓冲剂孔1-1-6、纯化膜孔1-1-7、废液孔1-1-8和反应检测孔1-1-9；在所述裂解缓冲剂孔1-1-4的上端设置有样品入口孔1-1-1；结构层1-1与第一密封层1-2和第二密封层1-3压合形成内置密封腔的密封盒体1。
通道10包括设置在第一洗涤剂室3出口端的第一阻塞通道10-1、设置在第二洗涤剂室5出口端的第二阻塞通道10-2、设置在裂解缓冲剂室4出口端的第三阻塞通道10-3、设置在洗脱缓冲剂室6出口端的第四阻塞通道10-4和贯穿纯化膜室7并连接至反应检测室9入口的主通道10-5和设置在废液室8入口端的废液通道10-6；第一阻塞通道10-1、第二阻塞通道10-2、第三阻塞通道10-3、第四阻塞通道10-4和废液通道10-6均上扬连接至主通道10-5。
一种气密条件下病原核酸的检测方法，使用气密条件下病原核酸的检测试剂盒，具体包括以下步骤：
S1、将待检样品通过样品入口加入密封盒体1内，并盖上密封盖2进行密封；
S2、将裂解缓冲剂室4中的待检样品震动混匀2分钟；
S3、将装有待检样品的检测试剂盒与等重量的试剂盒模型或同样装有待检样品的检测试剂盒对称放入转盘上；转盘示意图如图4所示；
S4、先用激光打通第三阻塞通道10-3处的密封膜11，转盘以6000rpm转速旋转30秒，裂解后的样品进入纯化膜室7，核酸被纯化膜7-1吸附，产生的废液透过纯化膜7-1流入废液室8；
S5、再用激光打通第一阻塞通道10-1处的密封膜11，转盘以6000rpm转速旋转30秒，第一洗涤剂经主通道10-5流入纯化膜室7，用于洗涤附着在硅胶膜上的杂质，产生的废液透过纯化膜7-1流入废液室8；
S6、再用激光打通第二阻塞通道10-2处的密封膜11，转盘以6000rpm转速旋转30秒，第二洗涤剂经主通道10-5流入纯化膜室7，用于洗涤附着在硅胶膜上的杂质，产生的废液透过纯化膜7-1流入废液室8；
S7、转盘以12000rpm转速旋转5分钟，使残留在纯化膜室7的废液流入废液室8；核酸被吸附在纯化膜7-1上；
S8、最后用激光打通第四阻塞通道10-4处的密封膜11，转盘以300rpm转速旋转30秒，静止反应2分钟，转盘以12000rpm转速旋转1分钟，洗脱缓冲剂经主通道10-5通过纯化膜室7，洗脱吸附在纯化膜7-1上的核酸，经主通道10-5进入反应检测室9；
S9、在反应检测室9内进行实时荧光PCR扩增，具体包括以下步骤：
S9.1、反转录：50℃，20分钟；
S9.2、聚合酶激活：95℃，2分钟；
S9.3、实时荧光PCR循环40次：95℃，10秒；60℃，30秒；
S10、利用荧光检测系统对反应后的待检样品进行检测。
综上所述，本发明能够避免因为检测过程造成检测环境污染，极大程度地降低了因为环境污染和样品间交叉污染造成的检测假阳性结果几率，在保证低或者无假阳性的基础上，进一步提高了检测灵敏度。

Claims (9)

1.一种气密条件下病原核酸的检测试剂盒，包括设置有样品入口的密封盒体（1）、设置在样品入口处的密封盖（2），其特征在于：所述密封盒体（1）内从上至下依次设置有由通道（10）连接的填充有第一洗涤剂的第一洗涤剂室（3）、上端与样品入口连接且填充有裂解缓冲剂的裂解缓冲剂室（4）、填充有第二洗涤剂的第二洗涤剂室（5）、填充有洗脱缓冲剂的洗脱缓冲剂室（6）、将样品进行提纯的纯化膜室（7）、储存废液的废液室（8）和填充有扩增混合物的反应检测室（9）；
所述第一洗涤剂室（3）、所述第二洗涤剂室（5）、所述裂解缓冲剂室（4）和所述洗脱缓冲剂室（6）的左侧均设置有与通道（10）连通的出口端，且出口端在使用前进行封闭设置；
所述纯化膜室（7）由通道（10）贯穿，且在纯化膜室（7）的出口端设置纯化膜（7-1）；
所述废液室（8）的右侧设置有与通道（10）连通的入口端；
所述反应检测室（9）的左端与通道（10）连通。
2.根据权利要求1所述的一种气密条件下病原核酸的检测试剂盒，其特征在于：所述密封盒体（1）包括结构层（1-1）、设置在结构层（1-1）前侧的第一密封层（1-2）和设置在结构层（1-1）后侧的第二密封层（1-3）；所述结构层（1-1）从上至下依次设置有由通道孔（1-1-2）连接的第一洗涤剂孔（1-1-3）、裂解缓冲剂孔（1-1-4）、第二洗涤剂孔（1-1-5）、洗脱缓冲剂孔（1-1-6）、纯化膜孔（1-1-7）、废液孔（1-1-8）和反应检测孔（1-1-9）；在所述裂解缓冲剂孔（1-1-4）的上端设置有样品入口孔（1-1-1）；所述结构层（1-1）与第一密封层（1-2）和第二密封层（1-3）压合形成密封盒体（1）。
3.根据权利要求2所述的一种气密条件下病原核酸的检测试剂盒，其特征在于：所述结构层（1-1）的材质为透明聚丙烯。
4.根据权利要求1所述的一种气密条件下病原核酸的检测试剂盒，其特征在于：所述通道（10）包括设置在第一洗涤剂室（3）出口端的第一阻塞通道（10-1）、设置在第二洗涤剂室（5）出口端的第二阻塞通道（10-2）、设置在裂解缓冲剂室（4）出口端的第三阻塞通道（10-3）、设置在洗脱缓冲剂室（6）出口端的第四阻塞通道（10-4）、贯穿纯化膜室（7）并连接至反应检测室（9）入口的主通道（10-5）和设置在废液室（8）入口端的废液通道（10-6）；所述第一阻塞通道（10-1）、第二阻塞通道（10-2）、第三阻塞通道（10-3）、第四阻塞通道（10-4）和废液通道（10-6）均上扬连接至主通道（10-5）。
5.根据权利要求4所述的一种气密条件下病原核酸的检测试剂盒，其特征在于：所述第一阻塞通道（10-1）、第二阻塞通道（10-2）、第三阻塞通道（10-3）和第四阻塞通道（10-4）均由密封膜（11）封闭。
6.根据权利要求5所述的一种气密条件下病原核酸的检测试剂盒，其特征在于：所述密封膜（11）为PET材料黑色膜。
7.根据权利要求1所述的一种气密条件下病原核酸的检测试剂盒，其特征在于：所述纯化膜（7-1）为经过核酸酶处理的硅胶膜。
8.一种气密条件下病原核酸的检测方法，其特征在于：使用如权利要求1～7任一项所述的气密条件下病原核酸的检测试剂盒，包括以下步骤：
S1、将待检样品通过样品入口加入密封盒体（1）内，并盖上密封盖（2）进行密封；
S2、将裂解缓冲剂室（4）中的待检样品震动混匀；
S3、将装有待检样品的检测试剂盒与等重量的试剂盒模型或同样装有待检样品的检测试剂盒对称放入转盘上；
S4、先用激光打通第三阻塞通道（10-3）处的密封膜（11），转盘旋转，裂解后的待检样品进入所述纯化膜室（7），产生的废液流入废液室（8）；
S5、再用激光打通第一阻塞通道（10-1）处的密封膜（11），转盘旋转，第一洗涤剂流入所述纯化膜室（7）洗涤杂质，产生的废液流入废液室（8）；
S6、再用激光打通第二阻塞通道（10-2）处的密封膜（11），转盘旋转，第二洗涤剂流入所述纯化膜室（7）洗涤杂质，产生的废液流入废液室（8）；
S7、转盘旋转，使残留在纯化膜室（7）的废液流入废液室（8）；核酸被吸附在纯化膜（7-1）上；
S8、最后用激光打通第四阻塞通道（10-4）处的密封膜（11），转盘旋转，转盘静止，转盘继续旋转，所述洗脱缓冲剂通过纯化膜室（7）洗脱吸附在纯化膜（7-1）上的核酸，经主通道（10-5）进入反应检测室（9）；
S9、在反应检测室（9）内对核酸进行核酸扩增反应；
S10、利用荧光检测系统对反应后的待检样品进行检测。
9.根据权利要求8所述的一种气密条件下病原核酸的检测方法，其特征在于：S9中所述核酸扩增反应为实时荧光PCR扩增反应，包括若干个升降温循环。
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