CN113912730A - 缓释的抗FcRn抗体或抗原结合片段及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了缓释的抗FcRn抗体或抗原结合片段及其应用，包含重链可变区和重链恒定区。所述重链可变区为骆驼科动物重链抗体的VHH或者由骆驼科动物重链抗体的VHH组成的多肽，所述VHH包括CDRs 1、2和3，其中，所述VHH CDR1区、VHH CDR2区和VHH CDR3区，分别包含与SEQ ID NO：1、2和3所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：4、5和6所示的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列；所述重链恒定区具有与SEQ ID NO：9所述的氨基酸序列至少80%同一性的氨基酸序列。通过在FcRn抗体缀合HSA抗体序列，延长原抗体半衰期，减少给予药物的次数。

Description

缓释的抗FcRn抗体或抗原结合片段及其应用
技术领域
本发明涉及生物药物领域。具体而言，本发明涉及一种新型的经人工设计的半衰期延长的抗体，特别是缓释的抗FcRn抗体或抗原结合片段。本发明还涉及这些结合FcRn的抗体的治疗和诊断用途，特别是在治疗、预防和/或诊断FcRn相关疾病，例如自身免疫相关疾病中的用途。
背景技术
对于部分抗体代谢速度快的问题，过去已经开发了几种方法来延长抗体片段的半衰期，制备缓释药物。这些方法包括使用特定的缓释制剂降低片段对血清蛋白酶的敏感性，或通过减少细胞内内体隔室中受体结合亲和力的氨基酸取代，降低抗体片段的内在清除率，从而导致配体-分选过程中的再循环增加，延长细胞外基质的半衰期。
此外，治疗性蛋白质与具有固有长血清半衰期的第二分子的缀合，也是一种常见的缓释药物制备方法。如通过聚乙二醇（PEG）的化学附着来增加蛋白质的流体动力学尺寸（聚乙二醇可以在人类中产生终末半衰期长达14天的药物），或者由氨基酸Pro、Ala和/或Scr组成构象紊乱的多肽序列，或者将治疗性蛋白质与具有长血清半衰期的天然蛋白质融合而产生新的蛋白质（包括67kDa的血清白蛋白（SA）），或者是抗体的 Fc部分，在天然二聚体形式中额外增加60-70kDa的序列。这产生了在人体中具有数天的终末半衰期的药物，如与Fc区融合的TNF受体（p75）半衰期为4天。有研究者已经通过使用抗SA抗体延长了短期药物的半衰期。
针对短半衰期的FcRn抗体，有报道指出，通过阻断FcRn的结合，可以选择性的清除血清中的IgG抗体，但对IgM、IgA和白蛋白没有影响。另外，FcRn阻断对IgG的清除作用是暂时且可恢复的，单次给予药物后，可以减少患者体内45%-85%的IgG，且在停药后59-57天左右可以恢复。但传统FcRn抗体或Fc片段在体内代谢时间快，作用时间短，需要频繁的重复给予药物，不良反应增加。所以如何增加药物半衰期，从而延长作用时间，减少给予药物次数，是我们需要解决的一个问题。
发明内容
本发明旨在解决现有技术中，部分抗体药物代谢速度快的问题，具体来说，解决FcRn抗体或Fc片段半衰期短的技术问题。为此，本发明的一个目的在于制备缓释的抗FcRn抗体或抗原结合片段。
需要说明的是，本发明是基于发明人的下列工作而完成的：
FcRn是一种位于细胞膜表面的IgG抗体受体，其蛋白结构和MHC-I分子类似，主要在内皮细胞中表达（在其它组织或细胞中也能检测到），其结构包含由α链和β2微球蛋白组成的异二聚体。FcRn可以和IgG的Fc部分结合，阻止IgG分子被溶酶体裂解，可以起到增长IgG体内半衰期的作用，参与到IgG的体内转运、维持和分布代谢过程中，所述重链可变区为骆驼科动物重链抗体的VHH或者由骆驼科动物重链抗体的VHH组成的多肽。发明人将半衰期延长的重链可变区序列，和能与FcRn位点特异结合的重链恒定区序列相连接，使原FcRn抗体在保持与FcRn特异性结合的同时，半衰期显著延长，从而药物作用时间延长，提高药物的作用效果。
发明人将半衰期延长的缓释抗体和原FcRn抗体同时向小鼠注射，以PBS为对照，比较抗体在体内的代谢时间，发明人发现，本发明实施例的抗体具有更长的半衰期。再将半衰期延长的缓释抗体和FcRn抗体，同时向已经注射PD标志物的小鼠注射，以PBS为对照，比较不同抗体对小鼠体内PD标志物代谢的影响，发明人惊奇的发现，本发明实施例的抗体可以更长时间的作用于PD标志物。将FcRn抗体VHH和HSA抗体恒定区缀合后，所得的缓释抗体分子药效时间延长，在受试者体内的作用时间增加，从而减少给予药物次数，降低药物的毒副反应。
因而，根据本发明实施例的一个方面，提供了一种缓释的抗FcRn抗体或抗原结合片段。根据本发明的实施例，抗体VHH包括CDRs 1、2和3，其中，所述VHH CDR1区包含与所选VHH CDR1氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列，VHH CDR2区包含与所选VHH CDR2氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列，并且VHH CDR3区包含与所选VHH CDR3氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列；其中，所述抗体VHH CDRs 1、2和3氨基酸序列为SEQ ID NO：1、2和3所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO：4、5和6所示的氨基酸序列；抗体重链恒定区具有与SEQ ID NO：9所述的氨基酸序列至少80%同一性的氨基酸序列。
根据本发明实施例的缓释的抗FcRn抗体或抗原结合片段，将具有延长半衰期的重链可变区序列和能与FcRn位点特异结合的重链恒定区相连接，使该抗体的半衰期相比单独的FcRn位点特异结合的重链恒定区显著延长，在一些实施例中，半衰期延长达8倍左右。
另外，根据本发明上述实施例的抗体或抗原结合片段，还可以具有如下附加的技术特征：
根据本发明的实施例，所述抗体或抗原结合片段重链可变区包括与SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列至少80%同一性的氨基酸序列。所述至少80%同一性为至少82%、优选至少85%、更优选至少90%、进一步优选至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或甚至99%同一性等大于等于80%的任何百分比的同一性。进一步说明的是，该抗体或抗原结合片段重链可变区的序列可以是在SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的基础上进行一个或多个核苷酸的插入、删除、突变或修饰等得到的。
根据本发明的实施例，所述抗体或抗原结合片段特异性结合人血清白蛋白，且特异结合人FcRn。本发明实施例的抗体含有人血清白蛋白和FcRn两种特异性抗原结合位点，是一种双特异性抗体，既可以与FcRn特异性结合，作用于免疫细胞，又可以与HSA结合，延长体内的作用时间。
根据本发明的实施例，所述抗体或抗原结合片段是人源化的抗体或其抗原结合片段。人源化抗体主要指鼠源单克隆抗体以基因克隆及DNA重组技术改造，经改造后与人的靶点结合，重新表达的抗体，其大部分氨基酸序列为人源序列取代，基本保留亲本鼠单克隆抗体的亲和力和特异性，又降低了其异源性，有利应用于人体，例如，本发明实施例的抗体或抗原结合片段经人源化后，可以与人的FcRn和HAS特异性结合。
根据本发明的实施例，所述抗体或抗原结合片段的半衰期为75-85小时，具体地，可以为78、79、80、81小时等。由此，重链恒定区和具有HSA特异亲和性的本发明实施例的重链可变区的序列相连，重链可变区的序列能显著延缓抗体的代谢时间，延长抗体的半衰期。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种核酸。根据本发明的实施例，所述核酸编码前项所述的FcRn抗体或抗原结合片段。由此，由该核酸编码的多肽可以与FcRn特异性结合，并且体内代谢时间显著增加。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种载体。根据本发明的实施例，所述载体可以运载前述核酸。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种细胞。根据本发明的实施例，所述细胞包含有前述载体。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种制备FcRn抗体或抗原结合片段的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：（1）在适合表达重组外源蛋白的条件下培养前项所述的细胞；（2）从细胞培养物中分离纯化具有白蛋白结合功能的分子。本发明采用体外细胞培养后分离纯化目的蛋白的方法，得到特异性结合FcRn，并且体内代谢时间增加的抗体。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种组合物。根据本发明的实施例，所述组合物包括：前项所述的FcRn抗体或抗原结合片段，或前项所述的核酸；以及药学上可接受的辅料。由此，该组合物为可以与FcRn特异性结合，并且半衰期长，药效佳。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种抗体-药物缀合物。根据本发明的实施例，所述抗体-药物缀合物，包括与治疗剂共价结合的前项所述的抗体或其抗原结合片段。
根据本发明的另一方面，本发明提供了前述组合物和前述的抗体-药物缀合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗自身免疫性疾病。根据本发明的实施例，所述自身免疫性疾病选自但不限于重症肌无力、寻常性天疱疮、天疱疮、免疫性血小板减少症、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、新生儿溶血或自身免疫性溶血性贫血。
根据本发明上述实施例的，发明人发现了两种HSA抗体序列，该序列可以与HSA特异性结合，产生相应药效。并且，发明人创造性的将HSA抗体序列分别和FcRn抗体相缀合，二者可以紧密的结合成结构稳定的化合物。HSA和hFcRn在抗体代谢中均起到了延缓抗体体内清除的作用，二者缀合构建的缓释抗体分子，可更加显著的增加药物在受试者体内的作用时间，从而产生更为持续的药效。自身免疫疾病的发病原因之一，即是因为体液免疫的紊乱导致自身免疫抗体的增多，由于FcRn可以增长IgG半衰期的机制同时适用于自身免疫抗体，因此通过延长FcRn抗体的药效时间，也可以加快自体免疫抗体在体内的清除，从而促进自身免疫疾病治疗的研究。由此，本发明实施例的抗体可以与HSA和hFcRn双特异性结合，代谢速率慢，半衰期长，能加快自体免疫抗体在体内的清除，对自身免疫性疾病的治疗效果显著提高。
为更好理解本发明，首先定义一些术语。其他定义则贯穿具体实施方式部
分而列出。
除非另外指出，无论在本文中用于指代重链抗体或指代常规 4-链抗体，术
语“免疫球蛋白序列”均用作通用术语，包括全尺寸抗体，其单独的链，以及其所有部分、结构域或片段（分别包括但不限于抗原结合结构域或片段，如VHH结构域或VH/VL 结构域）。此外，如在本文中所使用的术语“序列”（例如在“免疫球蛋白序列”、“抗体序列”、“可变结构域序列”、“VHH序列”或“蛋白质序列”的术语中）通常应被理解为包括相关氨基酸序列以及编码其的核酸或核苷酸序列二者，除非上下文需要更有限制性的解释。
可以使用免疫球蛋白单可变结构域作为用于制备含有可以充当结合单元（即，针对相同靶标的相同或不同表位和/或针对一个或多个不同靶标）的一个或多个另外的免疫球蛋白单可变结构域的多肽的“结合单元”、“结合结构域”或“构建单元”（这些术语可互换使用）。
术语“缀合”、“连接”和“偶联”是指两个或更多个分子的缔合。连接也可以是遗传的（即重组融合）。在具体上下文中，所述术语包括提及连接配体（例如抗体部分）与效应分子。所述连接这种连接可以使用多种本领域公认的技术来实现，例如可通过化学或重组的方式。“化学方式”是指所述抗体部分与效应分子之间的反应，使所述两个分子之间形成共价键以形成一个分子。
术语“载体”和“核酸构建体”是指能够运输与其连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指其中可以连接另外的DNA 区段的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA 区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们被导入的宿主细胞中自主复制（例如，具有细菌复制起点和游离型哺乳动物载体的细菌载体）。其他载体（例如非附加型哺乳动物载体）可以在导入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，并由此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们有效连接的基因的表达。这种载体在本文中被称为“重组表达载体”（或简称为“表达载体”）。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体通常以质粒的形式存在。然而，也包括其他形式的表达载体，如病毒载体（例如，复制缺陷型逆转录病毒，腺病毒和腺伴随病毒），其起到等同的功能。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领
域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并
不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的
部件。在附图中：
图1显示了根据本发明一个实施例的H4-3-Ef、m19-Ef与Ef在HSA/hFcRn 转基因小鼠体内代谢结果示意图；
图2显示了根据本发明一个实施例的在HSA/hFcRn转基因小鼠体内给予H4-3-Ef和m19-Ef，以及多次给予PD标志物的实验给药方案示意图；
图3显示了根据本发明一个实施例的在多次给予PD标志物的HSA/hFcRn转基因小鼠体内，给予H4-3-Ef和m19-Ef后，PD标志物代谢结果示意图；
图4显示了根据本发明一个实施例的H4-3-Ef与m19-Ef在多次给予PD标志物的HSA/hFcRn转基因小鼠体内代谢结果示意图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件（例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社）或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Sigma公司。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、 “示例”、“具体示例”或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
实施例1：纳米抗体构建
利用抗原免疫骆驼，分离外周血单核细胞（PBMC）并提取总RNA进行反转录，以反转录产物为模板扩增纳米抗体重链可变区 (variable domain of the heavy-chain ofheavy chain antibody, VHH) 并连入噬菌体展示载体，电转入大肠杆菌TG1感受态细胞，构建骆驼免疫库。
具体地，骆驼免疫两周一次，共4次。每次注射0.8 mg HSA胞外区重组蛋白（购于华兰生物工程股份有限公司，产品批号：201405030），佐以弗氏完全/不完全佐剂（Sigma，F5881, F5506），采取皮下多点注射的方式。每次免疫后2周采集1 mL血分离血清，用免疫原作为测定抗原，通过ELISA法分别测定血清中全抗体（IgG）和重链抗体（heavy chainantibody，HcAb）的滴度。当血清滴度达到建库要求后，采集100 mL骆驼外周血并用分离试剂盒（天津灏洋，Cat: TBD2011CM）分离PBMC，提取PBMC的总RNA反转获得cDNA，作为后续扩增VHH片段的模板。在此模板基础上，通过分子克隆方法构建了一个1.8×108骆驼抗人HSAVHH抗体免疫库，用于特异性抗人HSA纳米抗体的筛选。
随后通过固相筛选的方法对所构建的骆驼免疫库进行筛选，获得特异性噬菌体展示纳米抗体，并对其进行CDR移植等人源化处理，得到HSA纳米抗体HzH4-3（序列如SEQ IDNO：7所示）、Hz2MG6m19序列如SEQ ID NO：8所示）。
实施例2： FcRn缓释抗体的构建
本实施例中，将实施例1得到的HSA纳米抗体HzH4-3、Hz2MG6m19序列，C端连接FcRn抗体Efgartigimod（简称Ef，序列如SEQ ID NO：9所示），构建H4-3-Ef和m19-Ef真核表达载体，然后转染真核细胞进行表达和纯化，获得针对hFcRn缓释抗体H4-3-Ef和m19-Ef。
实施例3：ELISA方法检测H4-3-Ef、m19-Ef在HSA/FcRn 双转人源化小鼠体内的代谢
采用hFcRn雌性6周龄转基因小鼠进行实验，分3组进行实验，每组4只，前两组静脉注射H4-3-Ef和m19-Ef，均为300 μg/只。随后于2h、4h、8h、24h、48h、79h、120h、151h 和192h断尾采血。另外一组注射Ef，为300 μg/只，随后于0.5h、1h、3h、4 h、5h、6h、8h、24h、30h、48h、79h和96h断尾采血，收集血清并于-20℃保存。
采血全部完成后，对收集的血清进行ELISA检测，步骤如下：
1)包被anti-Fc Ab（Sigma，I2136）于96孔酶联板点样，0.5μg/mL，100μL/孔，4℃过夜；
2)PBS洗板3次后，加入0.5%酪蛋白-PBS，37℃封闭60min，PBST洗板3次；
3)加入稀释后的待检测血清样本，37℃孵育60min，PBST洗板4次；
4)加入1:5000稀释的HRP-羊抗人IgG（Cat:109-035-098，Jackson ImmunoResearch），37℃孵育40min，PBST洗板4次；
5)加入TMB底物（Cat：LK-TMB-S-002，北京利科生物技术有限公司）显色，37℃孵育10min后，加入2M HCl终止反应；
6)以630nm为参比波长，读取并记录波长450nm下孔板的吸光度A450nm-630nm。
表1 抗FcRn抗体小鼠体内代谢检测结果
Figure 575405DEST_PATH_IMAGE001
以Ef标准抗体的浓度为Y轴，时间为X轴，绘制时间-抗体浓度曲线图，进行线性拟合，实验结果图如图1，表1所示。H4-3-Ef和m19-Ef在hFcRn转基因小鼠体内表现出比Ef更加长的药物代谢时间。给予FcRn抗体后，Ef呈现出更快的代谢趋势，在8 h内血药浓度下降至100μg/ml以下，而H4-3-Ef和m19-Ef血药浓度大于300μg/ml，直至96 h后，Ef几乎代谢完毕，而H4- 3-Ef和m19-Ef的代谢趋势相近，血药浓度依然保持在100μg/ml以上。由此，实验结果表明，在一次给予药物的情况下，本发明实施例的抗体的代谢速率低，能在体内较长时间维持较高的血药浓度。
实施例4：ELISA方法检测H4-3-Ef和m19-Ef在HSA/FcRn 双转人源化小鼠体内对PD标志物的代谢影响
采用HSA/hFcRn转基因雌性6周龄小鼠进行实验，分4组进行实验，每组4只，在第0和96h给予S1RBD 抗体PD标志物（REGN10987，重链序列如SEQ ID NO：10所示，轻链序列如SEQ ID NO：11所示），其中，0h给予100μg/只，96h给予50μg/只，然后在给予PD标志物48h后给予Ef、H4-3-Ef和m19-Ef，均为2mg/只，以PBS作为对照，实验设计见图2，具体分组信息如下表2：
表2. H4-3-Ef对重复给予PD标志物代谢影响的分组信息
Figure 289283DEST_PATH_IMAGE003
在给予PD标志物后分别于8h、24h、48h、56h、72h、96h、104h、120h、144h、152h、168h和192h收集血清，-20℃保存待用。
采血全部完成后，对收集的血清进行ELISA检测，步骤如下：
1)包被S1RBD-his（序列号：QHD43416.1，319-533 aa）于96孔酶联板，0.5μg/mL，100μL/孔，4℃过夜；
2)PBS洗板3次后，加入0.5%酪蛋白-PBS，37℃封闭60min，PBST洗板3次；
3)加入稀释后的待检测血清样本，37℃孵育60min，PBST洗板4次；
4)加入1:5000稀释的HRP-羊抗人IgG （Cat:109-035-098，Jackson ImmunoResearch），37℃孵育40min，PBST洗板4次；
5)加入TMB底物（Cat：LK-TMB-S-002，北京利科生物技术有限公司）显色，37℃孵育10min后，加入2M HCl终止反应；
6)以630nm为参比波长，读取并记录波长450nm下孔板的吸光度A450nm-630nm。
以标准抗体的浓度为Y轴，时间为X轴，绘制抗体浓度标准曲线图，进行线性拟合，计算采集血清中PD标志物药物浓度，实验结果见图3。
结果显示，首次给予FcRn抗体后，PD标志物在Ef的作用下，呈现出更快的代谢趋势，但是在第二次给予PD标志物后，此时Ef组的PD标志物的代谢趋势与PBS组相近，而H4-3-Ef与m19-Ef组的PD标志物代谢趋势明相对更快，提示在二次给予PD标志物的情况下，H4-3-Ef与m19-Ef降低PD标志物的作用更为持久。
血清中抗体的ELISA检测实验步骤如下：
1)包被anti-Fc antibody（Sigma，I2136-1ML）于96孔酶联板，0.5μg/mL，100μL/孔，4℃过夜；
2)PBS洗板3次后，加入0.5%酪蛋白-PBS，37℃封闭60min，PBST洗板3次；
3)加入稀释后的待检测血清样本，37℃孵育60min，PBST洗板4次；
4)加入1:5000稀释的HRP-羊抗人IgG （Cat:109-035-098，Jackson ImmunoResearch），37℃孵育40min，PBST洗板4次；
5)加入TMB底物（Cat：LK-TMB-S-002，北京利科生物技术有限公司）显色，37℃孵育10min后，加入2M HCl终止反应；以630nm为参比波长，读取并记录波长450nm下孔板的吸光度A450nm-630nm。
之后以标准抗体的浓度为Y轴，时间为X轴，绘制抗体浓度标准曲线图，进行线性拟合，计算出小鼠体内Ef和H4-3-Ef血药浓度。可以发现（图4），Ef在96h内已几乎代谢完毕，而H4-3-Ef与m19-Ef仍然维持了较高的血药浓度，与PD标志物的代谢趋势相吻合。提示在一次给予抗体的情况下，H4-3-Ef与m19-Ef起到了更为持久的降低PD标志物的作用。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、 “示例”、“具体示例”或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 北京科诺信诚科技有限公司
<120> 缓释的抗FcRn抗体或抗原结合片段及其应用
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> H4-3z-VHH-CDR1(Artificial Sequence)
<400> 1
Pro Asn Cys Val Ala
1 5
<210> 2
<211> 20
<212> PRT
<213> H4-3z-VHH-CDR2(Artificial Sequence)
<400> 2
Ala Ile Tyr Thr Ser Ser Gly Leu Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp
1 5 10 15
Thr Val Lys Gly
20
<210> 3
<211> 17
<212> PRT
<213> H4-3z-VHH-CDR3(Artificial Sequence)
<400> 3
Asp Trp Lys Tyr Asp Ser Thr Arg Cys Gly Leu Glu Val Glu Tyr Asp
1 5 10 15
Ser
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> m19-VHH-CDR1(Artificial Sequence)
<400> 4
Thr Ala Tyr Ile Ala
1 5
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> m19-VHH-CDR2(Artificial Sequence)
<400> 5
Gly Ile Tyr Thr Val Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Thr Asp Thr Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 6
<211> 16
<212> PRT
<213> m19-VHH-CDR3(Artificial Sequence)
<400> 6
Gly Arg Thr Asp Thr Ala Ala Leu Arg Asp Pro Glu Ser Phe Gly Tyr
1 5 10 15
<210> 7
<211> 129
<212> PRT
<213> H4-3z-VHH(Artificial Sequence)
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Ser Tyr Arg Pro Asn
20 25 30
Cys Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Ala Ile Tyr Thr Ser Ser Gly Leu Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala
50 55 60
Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
65 70 75 80
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Trp Lys Tyr Asp Ser Thr Arg Cys Gly Leu
100 105 110
Glu Val Glu Tyr Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 8
<211> 125
<212> PRT
<213> m19-VHH(Artificial Sequence)
<400> 8
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Tyr Pro Thr Ala
20 25 30
Tyr Ile Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Gly Ile Tyr Thr Val Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Thr Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Arg Thr Asp Thr Ala Ala Leu Arg Asp Pro Glu Ser Phe
100 105 110
Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 9
<211> 227
<212> PRT
<213> Ef(Artificial Sequence)
<400> 9
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr
20 25 30
Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu Lys Phe His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 10
<211> 450
<212> PRT
<213> PDMarker-H(Artificial Sequence)
<400> 10
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Gly Ser Asp Tyr Gly Asp Tyr Leu Leu Val Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 11
<211> 218
<212> PRT
<213> PDMarker-L(Artificial Sequence)
<400> 11
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Leu Thr Ser Ile
85 90 95
Ser Thr Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
100 105 110
Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215

Claims (13)

1.一种缓释的抗FcRn抗体或抗原结合片段，其特征在于，包含：
重链可变区：所述重链可变区为骆驼科动物重链抗体的VHH或者由骆驼科动物重链抗体的VHH组成的多肽，所述VHH包括CDRs 1、2和3，其中，所述VHH CDR1区包含与所选VHHCDR1氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列，VHH CDR2区包含与所选VHH CDR2氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列，并且VHH CDR3区包含与所选VHH CDR3氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列；其中，所述所选VHH CDRs 1、2和3氨基酸序列为SEQID NO：1、2和3所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO：4、5和6所示的氨基酸序列；
重链恒定区：所述重链恒定区具有与SEQ ID NO：9所述的氨基酸序列至少80%同一性的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区包括与SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列至少80%同一性的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段特异性结合人血清白蛋白，且特异结合人FcRn。
4.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段是人源化的抗体或其抗原结合片段。
5.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段的半衰期为75-85小时。
6.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码权利要求1-5任一项所述的FcRn抗体或抗原结合片段。
7.一种载体，其特征在于，所述载体包括权利要求6所述的核酸。
8.一种细胞，其特征在于，所述细胞包括权利要求7所述的载体。
9.一种制备FcRn抗体或抗原结合片段的方法，其特征在于，包括：
（1）在适合表达重组外源蛋白的条件下培养权利要求8所述的细胞，
（2）从细胞培养物中分离纯化具有白蛋白结合功能的分子。
10.一种组合物，其特征在于，包括：
权利要求1-5任一项所述的FcRn抗体或抗原结合片段或权利要求6所述的核酸；以及
药学上可接受的辅料。
11.一种抗体-药物缀合物，其特征在于，包括与治疗剂共价结合的权利要求1至5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
12.权利要求10所述的组合物或权利要求11所述的抗体-药物缀合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗自身免疫性疾病。
13.根据权利要求12所述的用途，其特征在于，所述自身免疫性疾病选自重症肌无力、寻常性天疱疮、天疱疮、免疫性血小板减少症、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、新生儿溶血或自身免疫性溶血性贫血。
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