CN113905750A - 用于预防及/或治疗神经退行性疾病、与蛋白质错误折叠关联的疾病及认知能力下降的杜氏藻属藻类制剂 - Google Patents

Abstract

提供神经保护的制剂，具体地，杜氏藻属(Dunaliella)藻类制剂及其在治疗及预防神经退行性疾病、蛋白质错误折叠及认知能力下降的使用。

Description

用于预防及/或治疗神经退行性疾病、与蛋白质错误折叠关联 的疾病及认知能力下降的杜氏藻属藻类制剂

技术领域

本发明涉及神经保护的制剂。更具体地，本发明涉及杜氏藻属(Dunaliella)藻类制剂及其在治疗及预防神经退行性疾病、蛋白质错误折叠及认知能力下降的使用。

背景技术

被认为与目前公开的主题相关且作为背景的参考文献如下所列：

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于此鸣谢上述参考文献不应推论为这些文献与目前公开的主题的可专利性有任何相关。

阿尔茨海默病(AD)是一种进行性的神经退行性疾病，主要表现为脑细胞的损伤和最终破坏，导致记忆丧失和认知及其他大脑功能的改变。阿尔茨海默病主要发生在老年人群中(65岁以上)，它是最常见的痴呆形式，占痴呆病例的60％-80％[1]。

阿尔茨海默病的主要组织学特征是神经性斑块(β-淀粉样蛋白，Aβ)、神经纤维缠结(tau蛋白)、神经血管功能紊乱，还有大脑的新皮质、海马体和其他皮质下区域的神经元和突触的丧失。

淀粉样蛋白级联假说假设，阿尔茨海默病的神经变性是由Aβ斑块在大脑各区域的异常积累引起的。Aβ在大脑中的这种神经质堆积被认为是Aβ产生和清除之间不平衡的结果[2]。此外，少数阿尔茨海默病病例(<1％)，即家族性阿尔茨海默病(早发)，与基因突变有关，而基因突变与Aβ生成增加有关[3]。因此，目前公认大多数阿尔茨海默病病例是散发性(晚发)病例，可能是由于Aβ从大脑中的错误清除所致。

有人提出，视黄醇和β-胡萝卜素有可能抑制淀粉样β的形成[4]。因此，了解类视黄醇调节淀粉样β形成的机制对于开发预防和治疗阿尔茨海默病的潜在疗法具有重要意义。

脑部类胡萝卜素与记忆有关，在先前的一些研究中，记忆是受阿尔茨海默病影响的主要功能[5]。有研究结果表明，从β-胡萝卜素中裂解出来的一些异构体影响认知，因此可能在阿尔茨海默病中发挥作用，而对认知没有影响的其他异构体则干扰或减少前者的有益作用。视黄酸(RA)是β-胡萝卜素的产物，有两种主要异构体：9-顺式视黄酸和全反式视黄酸，它们是视黄酸X受体(RXR)和视黄酸受体(RAR)的配体[6]。虽然RAR(视黄酸受体)被9-顺式视黄酸和全反式视黄酸激活，但RXR(视黄酸X受体)只被9-顺式视黄酸激活[7]。视黄酸X受体是一个配体激活的核受体，它与其他核受体如视黄酸受体形成异质体，并与特定的DNA序列结合以调节基因表达。RXR/RAR异二聚体特别地在阿尔茨海默病易感区表达[8]，诱导大脑脂蛋白E(apoE)和胆固醇转运体(如ATP结合盒式转运体(ABCA1)(人类转运体亚家族ABCA的成员1)，也被称为胆固醇外流调节蛋白(cholesterol efflux regulatoryprotein,CERP)和ATP结合盒式亚家族G成员1(ABCG1))，作为胆固醇传感器，并以apoE依赖的方式减少细胞对淀粉样β的吸收[9]。

因此，目前公认的是，类视黄醇信号通过RAR和RXR的配体激活影响阿尔茨海默病病理的发展[10]。在APP/PS1转基因小鼠中，类视黄醇改善了阿尔茨海默病症状，减少了淀粉样积累和tau的过度磷酸化[11]。

先前的研究表明，用LXR和RXR配体治疗，增加小鼠的全局ABCA1表达，可明显改善淀粉样病理[12]。公开WO 2018/091937[13]也涉及RXR配体前体及其在治疗中枢神经系统疾病、周围神经系统疾病以及记忆和学习障碍中的应用。

此外，有研究表明，RXR激动剂bexarotene通过诱导ABCA1的表达和在阿尔茨海默病小鼠模型中增加小鼠apoE水平来增加淀粉样β的清除。然而，尽管上述bexarotene研究显示了令人振奋的结果，但根据报告，这种药剂对不同的其他AZ动物模型中的斑块负担没有影响[14,15]。此外，进一步表明，bexarotene并没有提供被预期的认知益处[16]。进一步地，bexarotene被证明具有高度的细胞毒性。

此外，Grodstein,F.等人发表的文章[17]涉及一项关于补充β-胡萝卜素和男性认知功能的随机测试，该测试显然没有得出某些结论。因此，β-胡萝卜素在神经保护中的作用以及它在治疗神经退行性疾病中的潜在用途是有争议的。

最后，还描述了盐生杜氏藻(Dunaliella salina)提取物在氯化铝诱发的AZ大鼠模型中的作用[18,19]。作者的结论是，盐生杜氏藻(Dunaliella salina)提取物的生物活性可能受到9-顺式β-胡萝卜素的调节，保护AD大鼠的脑细胞免受氧化压力的影响。这些结论是基于对几个生化参数的检查，例如：钙调蛋白(CaM)水平、对氧酶1(PON1)活性、抗凋亡标志物(Bcl2)、脑源性神经营养因子(BDNF)、DNA加合物的产生以及AD大鼠中淀粉样前体蛋白、β位APP清除酶1(BACE1)和β位APP清除酶2(BACE2)的表达改变。然而，所使用的AD大鼠模型的类型(氯化铝)，以及更重要地，缺乏行为学研究，需要进一步调查。

因此，本领域需要具有最小副作用的有效治疗组成物，对神经退行性过程的行为参数显示出明显的预防和治疗效果，因此，需要对神经退行性和蛋白质错误折叠疾病的治疗和预防应用。

发明内容

通过本公开的第一方面，提供了一种方法，用于预防、治疗、改善、减少或推迟有需要的受试者的一神经退行性疾病、与蛋白质错误折叠关联的一疾病、认知能力下降以及与此关联的任何条件或症状中的至少一者的发作，其特征在于：所述方法包括向所述受试者施用一有效量的至少一杜氏藻属藻类制剂或包含其的任何组成物。

在一些实施例中，根据本公开的所述方法，导致有需要的受试者的与一神经退行性疾病、与蛋白质错误折叠关联的一疾病及认知能力下降中的至少一者关联的至少一症状的改善或减少。

在其他实施例中，根据本公开的所述方法，其中所述症状是短期记忆损伤、长期记忆损伤、受损的认知功能、受损的学习功能、β-淀粉样蛋白沉积、焦虑、抑郁或其任何组合中的至少一者。

在进一步的实施例中，根据本公开的所述方法，导致有需要的受试者的认知功能、短期记忆、长期记忆及β-淀粉样蛋白的获取时间和清除率中的至少一者的改善。

在更进一步的实施例中，根据本公开的所述方法，其中所述神经退行性疾病是阿尔茨海默病、帕金森病、轻度认知障碍(MCI)、伴有轻度认知障碍(MCI)的帕金森病、亨廷顿病、路易体病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、朊病毒病、运动神经元病(MND)、脊髓小脑共济失调(SCA)、脊髓性肌肉萎缩(SMA)、弗里德里希共济失调及任何其他与神经退行性有关的痴呆或共济失调中的至少一者。

在具体的实施例中，根据本公开的所述方法，其中所述神经退行性疾病是阿尔茨海默病。

在其他实施例中，根据本公开的所述方法，是用于预防、治疗、改善、减少或推迟认知能力下降的所述发作。

在特定的实施例中，根据本公开的所述方法，其中所述杜氏藻属藻类是巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)。

在更进一步的具体实施例中，根据本公开的所述方法，其中所述杜氏藻属藻类制剂是口服地施用。

通过本公开的另一方面，提供了至少一种杜氏藻属藻类制剂或包含其的任何组成物的用途，用于预防、治疗、改善、减少或推迟有需要的受试者的一神经退行性疾病、与蛋白质错误折叠关联的一疾病、认知能力下降以及与此关联的任何条件或症状中的至少一者的发作的方法。

在一些实施例中，根据本公开的至少一种杜氏藻属藻类制剂或包含其的任何组成物的用途，所述方法导致有需要的受试者的与一神经退行性疾病、与蛋白质错误折叠关联的一疾病及认知能力下降中的至少一者关联的至少一症状的改善或减少。

在其他实施例中，根据本公开的至少一种杜氏藻属藻类制剂或包含其的任何组成物的用途，所述症状是短期记忆损伤、长期记忆损伤、受损的认知功能、受损的学习功能、β-淀粉样蛋白沉积、焦虑、抑郁或其任何组合中的至少一者。

在进一步的实施例中，根据本公开的至少一种杜氏藻属藻类制剂或包含其的任何组成物的用途，所述方法导致有需要的受试者的认知功能、短期记忆、长期记忆及β-淀粉样蛋白的获取时间和清除率中的至少一者的改善。

在还进一步的实施例中，根据本公开的至少一种杜氏藻属藻类制剂或包含其的任何组成物的用途，所述神经退行性疾病是阿尔茨海默病、帕金森病、轻度认知障碍(MCI)、伴有轻度认知障碍(MCI)的帕金森病、亨廷顿病、路易体病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、朊病毒病、运动神经元病(MND)、脊髓小脑共济失调(SCA)、脊髓性肌肉萎缩(SMA)、弗里德里希共济失调及任何其他与神经退行性有关的痴呆或共济失调中的至少一者轻度认知障碍(MCI)中的至少一种。

在具体的实施例中，根据本公开的至少一种杜氏藻属藻类制剂或包含其的任何组成物的用途，所述神经退行性疾病是阿尔茨海默病。

在其他具体的实施例中，根据本公开的至少一种杜氏藻属藻类制剂或包含其的任何组成物的用途，是用于预防、治疗、改善、减少或推迟认知能力下降的所述发作。

在进一步的具体实施例中，根据本公开的至少一种杜氏藻属藻类制剂或包含其的任何组成物的用途，所述杜氏藻属藻类是巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)。

在其他各种实施例中，根据本公开的至少一种杜氏藻属藻类制剂或包含其的任何组成物的用途，所述杜氏藻属藻类制剂是口服地施用。

在又一些方面，本发明提供了一种方法，用于改善有需要的受试者的短期记忆损伤、长期记忆损伤、受损的认知功能、受损的学习功能、β-淀粉样蛋白沉积中的至少一者。在一些实施例中，本发明的所述方法包括步骤：向所述受试者施用一有效量的至少一杜氏藻属藻类制剂或包含其的任何组成物。

在进一步的实施例中，根据本公开的所述方法，导致有需要的受试者的认知功能、短期记忆、长期记忆及β-淀粉样蛋白的获取时间和清除率中的至少一者的改善。

在其他实施例中，根据本公开的所述方法，是用于预防、治疗、改善、减少或推迟认知能力下降的所述发作。

在特定的实施例中，根据本公开的所述方法，其中所述杜氏藻属藻类是巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)。

在更进一步的具体实施例中，根据本公开的所述方法，其中所述杜氏藻属藻类制剂是口服地施用。

在又一个方面，本公开进一步提供了至少一种杜氏藻属藻类制剂或包含其的任何组成物的用途，用于改善有需要的受试者的短期记忆损伤、长期记忆损伤、受损的认知功能、受损的学习功能、β-淀粉样蛋白沉积中的至少一者的方法。

通过其另一个方面，本公开提供了至少一种杜氏藻属藻类制剂的用法，用于一组成物的制造，所述组成物用于预防、治疗、改善、减少或推迟有需要的受试者的一神经退行性疾病、与蛋白质错误折叠关联的一疾病、认知能力下降以及与此关联的任何条件或症状中的至少一者的发作。

在一些实施例中，根据本公开的所述用法，所述组成物改善或减少有需要的受试者的与一神经退行性疾病、与蛋白质错误折叠关联的一疾病及认知能力下降中的至少一者关联的至少一症状。

在其他实施例中，根据本公开的所述用法，所述症状是短期记忆损伤、长期记忆损伤、受损的认知功能、受损的学习功能、β-淀粉样蛋白沉积、焦虑、抑郁或其任何组合中的至少一者。

在进一步的实施例中，根据本公开的所述用法，所述组成物改善有需要的受试者的认知功能、短期记忆、长期记忆及β-淀粉样蛋白的获取时间和清除率中的至少一者。

在更进一步的实施例中，根据本公开的所述用法，其中所述神经退行性疾病是阿尔茨海默病、帕金森病、轻度认知障碍(Mild Cognitive Impairment，MCI)、伴有轻度认知障碍(MCI)的帕金森病、亨廷顿病、路易体病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(Amyotrophiclateral sclerosis，ALS)、朊病毒病、运动神经元病(Motor neuron disease，MND)、脊髓小脑共济失调(Spinocerebellar ataxia，SCA)、脊髓性肌肉萎缩(Spinal muscular atrophySMA)、弗里德里希共济失调及任何其他与神经退行性有关的痴呆或共济失调中的至少一者轻度认知障碍(MCI)中的至少一种。

在特定的实施例中，根据本公开的所述用法，其中所述神经退行性疾病是阿尔茨海默病。

在其他具体的实施例中，根据本公开的所述用法，是用于预防、治疗、改善、减少或推迟认知能力下降的所述发作。

在进一步的实施例中，根据本公开的所述用法，其中所述杜氏藻属藻类是巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)。

在更进一步的具体实施例中，根据本公开的所述用法，其中所述杜氏藻属藻类制剂是口服地施用。

附图说明

为了更好地理解于此公开的主题，并举例说明如何在实践中进行，现在将参照附图，仅以非限制性例子的方式描述实施例。在附图中：

图1：显示使用本发明的杜氏藻属藻类制剂的治疗在指定时间表对野生型(WT)和Tg2576(Tg)小鼠的体重(公克)的影响的图表。t-测试显示，用本发明的杜氏藻属藻类制剂喂养的WT小鼠(野生型，Duna.Prep.)与用普通饮食喂养的WT小鼠(野生型对照)之间存在显着差异(p<0.05)。数值为平均值±S.E.M.。缩写：Tg为Tg2576；WT为野生型；Duna.Prep.：为本发明的杜氏藻属藻类制剂。

图2A至图2D：显示使用本发明的杜氏藻属藻类制剂的治疗在一开放场地测试中对野生型和Tg2576小鼠的行为参数的影响的条形图。图2A是代表总路径的条形图。双因素方差分析(two way ANOVA)和事后检验显示基因型有显着影响(p<0.05)；图2B是代表细胞使用百分比的条形图；图2C是代表小鼠在竞技场中的运动时间的百分比的条形图；图2D是代表小鼠在竞技场的中心花费的时间的条形图。双因素方差分析显示基因型的显着影响(p<0.05)。数值为平均值±S.E.M.。缩写：Tg为Tg2576；WT为野生型；Duna.Prep.为本发明的杜氏藻属藻类制剂。

图3：显示杜氏藻属藻类制剂的治疗在Y迷宫测试(n＝6-10)中对野生型和Tg2576小鼠的交替的百分比的影响的条形图。数值为平均值±S.E.M.。缩写：Tg为Tg2576；WT为野生型；Duna.Prep.为本发明的杜氏藻属藻类制剂。

图4：显示杜氏藻属藻类制剂的治疗在巴恩斯(Barnes)迷宫测试中对野生型和Tg2576小鼠的空间学习的影响的条形图。黑柱代表最后一次训练测试后24小时(第1天)的参考记忆，以及白柱代表最后一次训练测试后7天(第7天)的长期记忆力。双因素方差分析和事后检验显示，Tg2576Duna.Prep.和Tg2576对照之间在第7天存在显着差异(p<0.05)。数值为平均值±S.E.M.。缩写：Tg为Tg2576；WT为野生型；Duna.Prep.为本发明的杜氏藻属藻类制剂。

图5A至图5C：体外(in vitro)血脑屏障(Blood Brain Barrier,BBB)细胞培养系统的示意图。所述模型由单层内皮细胞组成，形成紧密连接，生长在微孔膜过滤器培养插入物上(管腔侧)，胶质细胞播种在过滤器的腔外侧。来自健康志愿者的低密度脂蛋白(LowDensity Lipoprotein,LDL，100微升,1,600微克/毫升)被加入到管腔侧。细胞培养24小时，然后从管腔侧和腔外侧收集样本并进行分析。

图6A至图6B：图6A表示所述屏障的血液侧的类胡萝卜素，以及图6B表示所述屏障的大脑侧的类胡萝卜素。人类的低密度脂蛋白(LDL)被添加到管腔侧(血液)并培养24小时。

图7A至图7C：显示在指定小鼠组织中的肝脏(图7A)、脂肪(图7B)和大脑(图7C)9-顺式β-胡萝卜素和全反式β-胡萝卜素水平。数值为平均值±S.E.。缩写：9CBC为9-顺式β-胡萝卜素；WT为野生型；βC为β-胡萝卜素。

图8A至图8B：图8A是显示Tg2576对照组小鼠和Tg2576小鼠在杜氏藻属藻类制剂饮食中的不溶性β淀粉样蛋白(Aβ42)水平的条形图。图8B是显示Tg2576对照小鼠和Tg2576小鼠在杜氏藻属藻类制剂饮食中的可溶性β淀粉样蛋白(可溶性Aβ)水平的条形图。缩写：Duna.Prep.为本发明的杜氏藻属藻类制剂；Aβ为淀粉样蛋白。

图9A至图9C：显示野生型和Tg2576小鼠在杜氏藻属藻类制剂饮食或对照饮食中的IL-1a(图9A)、IL-1b(图9B)和TSPO(图9C)的RNA分子计数情况的条形图。数值为平均值±S.E.。缩写：Duna.Prep.为本发明的杜氏藻属藻类制剂。

图10：显示Tg2576小鼠在杜氏藻属藻类制剂饮食或对照饮食下海马体中的TSPO的表达水平的显微照片。T测试显示，以杜氏藻属藻类制剂饮食喂养的Tg2576小鼠与对照组(两组均为n＝5)之间的TSPO蛋白表达水平的统计学差异(p<0.05)。缩写：Duna.Prep.为本发明的杜氏藻属藻类制剂。

图11：显示以杜氏藻属藻类制剂饮食或对照饮食喂养的Tg2576小鼠以及如上述喂养的野生型血浆中的胆固醇(Chol)和甘油三酯(TG)水平的条形图。数值为平均值±S.E.。缩写：Duna.Prep.为本发明的杜氏藻属藻类制剂；Chol为胆固醇；TG为甘油三酯。

图12：显示饮食的9-顺式β-胡萝卜素穿过血脑屏障(BBB)后的拟定效果的示意图。

图13A至图13B：以低脂饲料喂养的5XFAD对照组小鼠(图13A)和以杜氏藻属藻类制剂饮食喂养的5XFAD小鼠(图13B)获得的脑样本的高效液相色谱(HPLC)色谱图。

图14A至图14C：显示5XFAD小鼠或野生型小鼠在杜氏藻属藻类制剂饮食或对照饮食下的肝脏(图14A)、脂肪(图14B)和大脑(图14C)中的9-顺式β-胡萝卜素数量的指定组织的条形图。数值为平均值±S.E.。缩写：Duna.Prep.为本发明的杜氏藻属藻类制剂；9CBC为9-顺式β-胡萝卜素；βC为β-胡萝卜素；WT为野生型；9-顺式为9-顺式β-胡萝卜素。

图15：显示以杜氏藻属藻类制剂饮食或对照饮食喂养的5xFAD小鼠和野生型小鼠的血浆中的胆固醇和甘油三酯水平的条形图。数值为平均值±S.E.。缩写：Duna.Prep.为本发明的杜氏藻属藻类制剂；Chol为胆固醇；TG为甘油三酯。

图16A至图16C：显示杜氏藻属藻类制剂治疗对5XFAD小鼠的短期/长期记忆影响的条形图。图16A显示3小时后新物体识别的条形图，图16B显示24小时后新物体识别的条形图。图16C显示以普通饮食(对照组)喂养的5XFAD小鼠和以杜氏藻属藻类制剂饮食(Duna.Prep.)喂养的5XFAD小鼠的延迟时间的条形图。缩写：Tg为Tg2576；WT为野生型；Duna.Prep.为本发明的杜氏藻属藻类制剂。

图17：显示以杜氏藻属藻类制剂饮食或对照饮食喂养的5xFAD小鼠或野生型小鼠在Y型迷宫测试中的识别记忆的条形图。所述图显示了小鼠的偏好指数，小鼠在新臂上花费的时间与它们在两个臂上花费的时间之间的比率[PI＝(在新臂上花费的时间-在旧臂上花费的时间)/在新+旧臂上花费的时间]。单向方差分析测试显示，5xFAD杜氏藻属藻类制剂(n＝14)和5xFAD对照组(n＝15)之间有显着差异(p<0.05)。数值为平均值±S.E.。缩写：Duna.Prep.为本发明的杜氏藻属藻类制剂。

图18：显示5xFAD小鼠或野生型小鼠在杜氏藻属藻类制剂饮食或对照饮食下的巴恩斯迷宫测试结果的条形图。所述图显示了延迟时间。数值为平均值±S.E.。缩写：Duna.Prep.为本发明的杜氏藻属藻类制剂。

图19A至图19B：显示5xFAD小鼠或野生型小鼠在杜氏藻属藻类制剂饮食或对照饮食中的不溶性(图19A)和可溶性(图19B)淀粉样β的水平的条形图。不溶性(n＝5)Aβ水平(A)没有统计学差异。数值为平均值±S.E.。缩写：Duna.Prep.为本发明的杜氏藻属藻类制剂。

具体实施方式

本发明公开的内容是基于杜氏藻属藻类制剂对神经退行性疾病，如阿尔茨海默病，D)、与蛋白质错误折叠关联的疾病和相关条件的惊人效果。更具体地，作为一个概念的证明，本发明利用各种类似于AD的小鼠模型，证明了杜氏藻属藻类制剂对表明认知功能的生理以及行为参数的影响。

阿尔茨海默病是一种毁灭性的神经退行性疾病，占痴呆病例的60-80％。疾病病理随着时间的推移而恶化，导致记忆丧失和认知功能的改变。

如下所述，发明人研究了杜氏藻属粉末制剂对小鼠模型中类似于AD的神经病理学和认知缺陷的发展的影响。

发明人发现，9-顺式β-胡萝卜素(9βC)和全反式BC穿过血脑屏障(BBB)并在大脑中积累，而且杜氏藻属粉末制剂影响血浆脂质水平。

发明人进一步发现，杜氏藻属粉末制剂改善了受检小鼠模型的长期和短期记忆。此外，杜氏藻属粉末制剂对AD神经病理学有积极影响，并影响涉及炎症的基因和表达。

正如下文所详述，发明人已经证明了杜氏藻属粉末制剂饮食对不同的小鼠模型的影响，这些模型具有不同的突变，导致阿尔茨海默病样症状，即Tg2576和5xFAD。

Tg2576小鼠模型是AD研究中最常用的转基因小鼠模型之一，包含导致Aβ积累和认知障碍的双瑞典式突变。5xFAD小鼠模型包含有APP和PESN基因的5个家族性突变，其特点是快速和积极的Aβ积累和认知损伤。

此外，为了检验杜氏藻属粉末制剂饮食对学习和记忆的影响，我们进行了一系列的认知测试，其中包括通过模型特征来设计的Y-迷宫自发交替、Y-迷宫识别记忆测试、巴恩斯迷宫和新物体识别(NOR)测试。

对Tg2576小鼠和5xFAD小鼠进行了巴恩斯迷宫测试，以评估长期记忆和长期保持。结果表明杜氏藻属粉末制剂明显改善了长期记忆。发明人也证明了长期记忆的改善。

行为学结果显示，在所使用的不同小鼠模型中进行的几乎所有认知测试中，杜氏藻属粉末制剂都明显改善了记忆。

本发明的另一个方面证明了杜氏藻属粉末制剂对小鼠海马体中Aβ沉积的影响。Tg2576和5xFAD小鼠模型的特点是由其突变引起的大量Aβ积累。如本领域所知，阿尔茨海默病的大脑含有可溶性和不可溶性Aβ。虽然最初假设Aβ直到不溶性、纤维状形式的Aβ阶段才具有毒性，但最近的研究表明，可溶性Aβ对记忆有毒性作用，并与痴呆症密切相关，包括损害突触结构和功能以及抑制海马体的LTP。如以下实例所示，对治疗和对照转基因小鼠的海马体进行匀浆，用ELISA法测量其Aβ水平。本文提出的结果意味着，杜氏藻属粉末制剂饮食明显降低了两种模型的可溶性Aβ水平，而不溶性Aβ水平仅在Tg2576小鼠模型中明显降低。此外，杜氏藻属饮食对Tg2576小鼠模型以及5xFAD小鼠模型的基因表达有影响。

更具体地，检验了小鼠模型的海马体中的蛋白质水平表达。重点强调的是小胶质细胞和星形细胞的激活标志物，TSPO和GFAP，以及突触可塑性的突触前蛋白，突触蛋白。如下所示，与未经处理的小鼠相比，在杜氏藻属饮食喂养的Tg2576中，观察到TSPO蛋白水平的明显下降。TSPO是一种高亲和力的胆固醇转运体，主要存在于类固醇合成细胞的线粒体外膜。在正常情况下，TSPO在小胶质细胞中的表达水平较低。然而，在应对神经炎症或损伤时，TSPO的表达被上调，这使它成为一个适当的小胶质细胞激活标志物。

综合来说，如下面的实例以及上文指出的部分所述，用本公开的杜氏藻属制剂喂养的AD模型小鼠经历了各种有益的神经保护作用。举例而言，与用普通饮食喂养的Tg2576小鼠相比，用杜氏藻属制剂喂养的Tg2576小鼠的存活率大幅提高(如表1)。此外，在用杜氏藻属制剂喂养的Tg2576小鼠中观察到了焦虑的减少，这一点通过开放场地行为测试得到了证明(实例2)。在另一项行为测试中，即巴恩斯迷宫测试中，观察到用杜氏藻属制剂喂养的Tg2576小鼠的学习和记忆能力的改善(实例4)。此外，在5xFAD小鼠模型中也证明了杜氏藻属制剂对记忆的有益作用，如实例13所示，其展示了在一个新物体识别测试中获得的结果。

除上述有益影响外，用杜氏藻属藻类制剂喂养的Tg2576小鼠的不溶性β-淀粉样蛋白水平比对照组(用常规饮食喂养，如实例7所示)明显降低。

因此，在第一方面，本发明公开提供了一种预防、治疗、改善、减少或推迟有需要的受试者的一神经退行性疾病、与蛋白质错误折叠关联的一疾病、认知能力下降以及与此关联的任何条件或症状中的至少一者的发作。更具体地，本发明的所述方法可包括以下步骤：向所述受试者施用一有效量的至少一杜氏藻属藻类制剂或包含其的任何组成物。

如本领域所知，本文定义的"杜氏藻属(Dunaliella)"是杜氏藻科(Dunaliellaceae)的一个属。杜氏藻属是一种可运动的、单细胞的、棒状至卵状(9-11微米)的绿藻，常见于海洋水域中。一些杜氏藻属菌株可以积累非常大量的β-胡萝卜素，这是一种维生素A原(视黄醇和其他类视黄醇)和一种健康食品。

β-胡萝卜素属于类胡萝卜素家族，是疏水性化合物，基本上由一个C40碳氢化合物和多达15个双键组成。类胡萝卜素被分为两种类型：仅由碳和氢组成的胡萝卜素，如β-胡萝卜素和番茄红素；以及也包含氧的黄质素，如叶黄素、角黄素和玉米黄素。

本公开内容包括本领域已知的任何杜氏藻属藻类及其任何组合，例如但不限于巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)、盐生杜氏藻(Dunaliella salina)、嗜酸杜氏藻(Dunaliella acidophila)、Dunaliella bioculata、Dunaliella lateralis、Dunaliellamaritima，仅举本领域已知的几个物种。

本文所用的术语"至少一种杜氏藻属藻类制剂"是指至少一种、两种、三种、四种、五种或更多本领域已知的杜氏藻属藻类可用于制备本公开的杜氏藻属藻类制剂，或其任意组合。

如下面的实例所示，发明人已经证明巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)的用途。藻类巴氏杜氏藻是一种耐盐碱的绿藻，也是β胡萝卜素(βc)的天然来源，它可以合成和积累βc，达到其干重的10％。所述藻类在高光照强度和高盐度下形成的βc由大约50％的全反式βc、40％的9-顺式βc和10％的α-胡萝卜素组成。因此，这种藻类是自然界中最知名的9-顺式βC来源。众所周知，合成的9-顺式βC非常昂贵，而且不容易被人类所用，因为在批准为应用于人类之前，应该用纯化的或合成的9-顺式βC进行长期毒性测试。应该注意的是，在本方面有用的杜氏藻属的进一步详细制备在此后有更详细的描述。

因此，在本发明的多个实施例中，杜氏藻属藻类是巴氏杜氏藻(Dunaliellabardawil)。在具体的实施例中，根据本公开的方法包括向受试者施用治疗有效量的巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)制剂或其任何组成物的步骤。

如本领域所知，血脑屏障(BBB)是一个高度选择性的屏障，主要由脑内皮细胞、星形细胞端脚、周细胞、血管周围巨噬细胞和基底膜组成。在限制毒素以及治疗药物的渗透性的最重要的BBB转运体中，有ABC转运体[20]。

ATP结合盒式转运体(ABC转运体)是跨膜蛋白，可转运多种底物，包括脂类、甾醇和药物。这些转运体定位在BBB和脑实质的脑内皮细胞表面。代表所有亚家族的超过20个ABC蛋白与一些人类疾病有关，包括AD和动脉硬化[21]。转运体ABCA1受肝X受体(LXR)和视黄酸X受体(RXR)的转录调节。ABCA1将脂质转运到包括apoE在内的脂蛋白上，apoE是大脑中主要的胆固醇载体，也是晚发性AD的一个既定的遗传风险因素。在一个AD小鼠模型中，ABCA1的缺乏会加剧淀粉样蛋白的生成，而ABCA1的过度表达会减少淀粉样蛋白的负荷，这意味着ABCA1在Aβ代谢中的作用[22]。其他研究证明，在不同的APP转基因小鼠模型中，ABCA1的缺乏会增加淀粉样蛋白的沉积和认知能力的下降，同时伴随着可溶性apoE水平的明显下降[23]。此外，在大脑中过量表达ABCA1的转基因小鼠的淀粉样斑块较少[24]。其他研究显示，脑上皮中ABCB1水平较低的老年人有更多的斑块[25]和更多的血管Aβ[26]。ABC转运体显然在淀粉样β的清除中起着重要作用，因此了解它们的功能和调节因素可能会导致针对AD的新治疗策略的发展。

因此，本文展示的神经保护作用使本公开的杜氏藻属藻类制剂适合于治疗各种神经退行性疾病或疾病。

本文定义的术语"神经退行性疾病(neurodegenerative disease)"是指以中枢神经系统或周围神经系统的结构和功能逐渐退化为特征的一组异质性疾病。

任何已知的神经退行性疾病都包括在本公开的范围内。例如，阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、弗里德里希共济失调症、路易体病、脊髓性肌肉萎缩、运动神经元病、共核蛋白病和tau蛋白病。

在一些实施例中，根据本公开的所述方法可具体适用于神经退行性疾病，如阿尔茨海默病、帕金森病、轻度认知障碍(MCI)、伴有轻度认知障碍的帕金森病、亨廷顿病、路易体病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、朊病毒病、运动神经元病(MND)、脊髓小脑共济失调(SCA)、脊髓性肌肉萎缩(SMA)、弗里德里希共济失调以及其他任何与神经退行性疾病有关的痴呆症或共济失调。

如下所示，发明人已证明(尤其)对阿尔茨海默病的小鼠模型的认知功能有多种有益影响。

因此在一些实施例中，根据本公开的方法特别适用于治疗阿尔茨海默病。

本领域已知的阿尔茨海默病(AD)涉及一种进行性神经退行性疾病，撇除其他的不提，尤其表现在脑细胞的损伤和最终破坏，导致记忆丧失和认知及其他大脑功能的改变。更具体地，阿尔茨海默病，是指一种涉及记忆和其他认知领域恶化的疾病，导致诊断后3至9年内死亡。阿尔茨海默病的主要风险因素是年龄。该病的发病率在65岁以后每5年增加一倍，然而，多达5％的患者是早发的阿尔茨海默病(也被称为年轻发病)，可能在40或50岁时出现。

许多分子病变已经在阿尔茨海默病中被检测到，但从数据中得出的首要主题是，衰老的大脑中错误折叠的蛋白质的积累导致了氧化和炎症损伤，这反过来又导致了能量衰竭和突触功能障碍。

阿尔茨海默病可能主要是一种突触功能障碍。海马体的突触在轻度认知障碍(通常在痴呆之前的有限认知缺陷)患者中开始下降，在这些患者中，剩余的突触轮廓显示出在尺寸上的补偿性增加。在轻度阿尔茨海默病中，突触前囊泡蛋白突触素减少了约25％。随着疾病的发展，突触相对于神经元的损失不成比例，这种损失是与痴呆症的最佳关联。衰老本身会导致突触丧失，这尤其影响到海马体的齿状区。

突触前神经递质的释放和突触后谷氨酸受体离子电流的破坏，部分是由于N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)表面受体的内吞作用和α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸表面受体的内吞作用造成的。后者通过诱导高频刺激序列后电流的持久减少进一步削弱了突触活动。在正常的老化过程中，突触的电位和抑制之间的平衡也会发生类似的变化。神经元内的Aβ可以更早地触发这些突触的缺陷。基底前脑的胆碱能神经元中正常的高水平的神经营养素受体在阿尔茨海默病晚期严重减少。Aβ是一种有力的线粒体毒药，尤其影响突触池。在阿尔茨海默病中，接触Aβ会抑制大脑和分离线粒体中的关键线粒体酶。细胞色素c氧化酶特别地被攻击。因此，电子运输、ATP生产、氧气消耗和线粒体膜电位都会受损。从阿尔茨海默病患者的大脑中分离出来的结构受损的线粒体中积累了Aβ。

没有单一的线性事件链或途径可以启动和驱动阿尔茨海默病。AD是一种渐进性疾病，痴呆症状在若干年内逐渐恶化。在早期阶段，记忆丧失是轻微的，但在AD晚期，个人会失去进行对话和对环境作出反应的能力。患有AD的人在其症状被他人注意到后平均能活8年，但根据年龄和其他健康条件，生存期可能在4到20年之间。

AD最常见的早期症状是难以记住新学的信息，因为AD的变化通常从影响学习的大脑部分开始。随着AD在大脑中的发展，它会导致越来越严重的症状，包括迷失方向、情绪和行为变化；对事件、时间和地点的混淆越来越深；对家人、朋友和专业护理人员的毫无根据的怀疑；更严重的记忆丧失和行为变化；以及说话、吞咽和行走困难。

除了对症治疗以暂时减缓痴呆症状的恶化外，AD目前还没有治愈方法，目前的治疗方法不能阻止AD的发展。

AD的诊断可由熟练的医生进行，包括身体检查和诊断性测试(例如迷你精神状态检查(MMSE))。阿尔茨海默病的早期征兆和症状尤其包括记忆障碍，集中困难，计划或解决问题困难，完成日常工作问题，困惑，语言问题诸如找字问题或说话或写作的词汇量减少，情绪变化诸如抑郁或其他行为和人格变化。

应该理解的是，本发明的杜氏藻属藻类制剂、组成物和方法适用于治疗AD的任何阶段、任何年龄以及与之相关的任何条件和症状。

如上所述，斑块和缠结与AD以及其他与年龄相关的神经退行性过程有关。因此，应该理解的是，本发明进一步包括使用本文公开的联合疗法来治疗其他与年龄有关的疾病。

随着人口老龄化的加剧，认知障碍是一个主要的健康和社会问题。认知能力下降是老龄化中最令人担心的方面之一。就财政、个人和社会负担而言，它也是最昂贵的。这很重要，因为认知能力下降预示着痴呆症、疾病和死亡。

如上所指出，发明人已经显示，用本公开的杜氏藻属藻类制剂喂养的AD模型小鼠经历了学习和记忆能力的改善，记忆能力的改善是与各种神经退行性疾病(例如AD和亨廷顿病)相关的一些症状。

因此，在一些具体的实施例中，根据本公开的所述方法导致与神经退行性疾病、与蛋白质错误折叠相关的疾病和认知能力下降中的至少一种相关的症状得到改善和/或减少。

本文所用的术语"改善(amelioration)"是指减少、缓解、减轻、改善或抒解有需要的受试者的至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％。18％,19％,20％,21％,22％,23％,24％,25％,26％,27％,28％,29％,30％,31％,32％,33％,34％,35％,36％,37％,38％,39％,40％,41％,42％,43％,44％,45％,46％,47％,48％,49％,50％,51％,52％,53％,54％,55％,56％,57％,58％,59％,60％,61％,62％,63％,64％,65％,66％,67％,68％,69％,70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或约100％的与神经退行性疾病、与蛋白质错误折叠相关的疾病和认知能力下降中的至少一种相关的症状。

术语"改善(amelioration)"和"减少(reducing)"在此可互换使用。

在有需要的受试者中的与神经退行性疾病、与蛋白质错误折叠相关的疾病和认知能力下降中的至少一种相关的任何症状(或任何条件或症状)，都包括在本公开内容中。这样的症状(或条件)包括但不限于心理能力的下降(例如短期记忆和长期记忆下降，学习功能受损)，行为和精神问题，缺乏协调，步态不稳，说话改变，震颤，对时间或地点的困惑，下降或不佳的判断力，情绪和性格的改变。

在一些实施例中，根据本公开的所述方法，其中所述症状是短期记忆损伤、长期记忆损伤、受损的认知功能、受损的学习功能、β-淀粉样蛋白沉积、焦虑、抑郁或其任何组合中的至少一者。

在具体的实施例中，这里定义的症状是短期记忆障碍。短期记忆是一个暂时储存和管理进行复杂的认知任务(如学习、推理和理解)所需信息的系统。短期记忆涉及信息处理功能的选择、启动和终止，如编码、存储和检索数据。所谓"短期记忆障碍(short termmemory impairment)"，是指形成新的偶发记忆的能力受损。短期记忆丧失会对一个人的生活质量产生实质性的负面影响。无法形成任何新的事件性记忆使一个人永远生活在"现在(now)"的状态中，新的事件永远不会被编码以便日后回忆。

在其他实施例中，这里定义的症状可能是长期记忆障碍。美国国立卫生研究院(National Institutes of Health,NIH)将"长期记忆丧失(long-term memory loss)"(或"长期记忆障碍(long-term memory impairment)")定义为难以记住过去更长时间发生的事件。长期记忆是在短期记忆或非永久性记忆在海马体中巩固后形成的，海马体是位于内侧颞叶的大脑结构。一旦记忆得到巩固，它们在新皮质中就独立于海马体可用且可以被取回。当病人有长期记忆丧失时，病人表现出存储的记忆的回想问题，而不是创造新的记忆。

在进一步的实施例中，这里定义的症状可以是受损的认知功能。"受损的认知功能(Impaired cognitive function)"是指一个人在记忆、学习新事物、集中注意力或做出影响其日常生活的决定方面有困难。认知障碍的范围从轻微到严重。对于轻度损害，人们可能开始注意到认知功能的变化，但仍然能够进行日常活动。严重程度的损害会导致人们失去理解事物的意义或重要性的能力以及说话或写字的能力，导致无法独立生活。

在更进一步的实施例中，这里定义的症状可以是受损的学习功能。此处定义的术语"受损的学习功能(impaired learning function)"是指学习能力的下降或减少，这影响到语言或非语言信息的获取、组织、保留、理解或使用。学习功能受损的原因是与感知、思考、记忆或学习有关的一个或多个过程出现障碍，还可能涉及组织技能、社会感知、社会交往和观点的把握等方面的困难。

如本文所指出，本发明提供了治疗、抑制和减少，或换句话说，改善受损的认知功能的方法。这里所使用的受损的是指任何减少、损坏、迟缓、降低或减弱的认知参数，例如，学习和记忆功能，至少约为1％、2％、3％。4％,5％,6％,7％,8％,9％,10％,11％,12％,13％,14％,15％,16％,17％,18％,19％,20％,21％,22％,23％,24％,25％,26％,27％,28％,29％,30％,31％,32％,33％,34％,35％,36％,37％,38％,39％,40％,41％,42％,43％,44％,45％,46％,47％,48％,49％,50％,51％,52％,53％,54％,55％,56％,57％,58％,59％,60％,61％,62％,63％,64％,65％,66％,67％,68％,69％,70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％，与健康对象的认知功能相比。

在更进一步的实施例中，本文定义的症状可以是β-淀粉样蛋白沉积。β-淀粉样蛋白是一种蛋白质片段，以粘性、淀粉样斑块的形式沉积在大脑中，在患有AD的个体中以增加的方式沉积。因此，"β-淀粉样蛋白沉积(β-amyloids deposition)"一词是指在大脑中形成β-淀粉样蛋白的聚集物。显着的淀粉样沉积是所有AD患者的一个特性化特征。

如下面的实例所示，杜氏藻属制剂减少了可溶性和不可溶性β-淀粉样蛋白。更具体地，淀粉样蛋白β(Aβ或Abeta)表示36-43个氨基酸的肽，作为阿尔茨海默病患者大脑中发现的淀粉样斑块的主要成分，关键性地涉及了阿尔茨海默病。这些肽来自于淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)，它被β分泌酶和γ分泌酶裂解，产生Aβ。Aβ分子可以聚集形成灵活的可溶性低聚物，可能以几种形式存在。现在认为，某些错误折叠的低聚物(被称为"种子(seed)")可以诱导其他Aβ分子也采取对神经细胞有毒的错误折叠低聚物形式。更具体地，Aβ是一种4kDa的多肽(具有40-和42-氨基酸残基的多肽是主要的种类)，是由被称为淀粉样前体蛋白的前体蛋白经蛋白酶裂解而来。Aβ单体很容易在水介质中聚集，产生各种类型的组合，包括寡聚体、原纤维和淀粉样纤维。AβOs是可溶性的，并可能扩散到整个大脑，而淀粉样蛋白纤维则较大且不溶解，并聚集成淀粉样蛋白斑块，形成AD特有的组织学病变。

不溶性纤维状β淀粉样蛋白病变(被称为神经元斑块)不一定与疾病进展有很好的相关性，这意味着它们不是直接的因果关系。然而，淀粉样蛋白的可溶性形式似乎与疾病的进展有更好的相关性。由此看来，高分子量的低聚物可能会导致突触损失，并最终导致AD中的记忆丧失。

然而，它也存在于许多正常成年人中，并在轻度认知障碍(MCI)个体中观察到。

本发明因此在某些实施例中，提供了治疗、预防、抑制、减少、消除、保护或推迟与年龄相关的轻度认知障碍(MCI)的发作的方法。

本文所用的"与年龄相关的轻度认知障碍(Age-associated mild cognitiveimpairment)"是一种引起认知改变的疾病。主要影响记忆的MCI可被归类为"失忆性MCI(amnestic MCI)"，即受试者在记忆与近期事件、约会、谈话或最近的事件有关的信息时出现障碍。影响记忆以外的思维技能的MCI被称为"非失忆性MCI(nonamnestic MCI)"。可能受非失忆性MCI影响的思维技能包括做出正确决定的能力，判断完成一项复杂任务所需的时间或步骤顺序，或视觉感知。

正常的衰老与许多认知任务中各种记忆能力的下降有关；这种现象被称为与年龄相关的记忆障碍(age-related memory impairment,AMI)、与年龄相关的记忆障碍(age-associated memory impairment,AAMI)或与年龄相关的认知下降(age-associatedcognitive decline,ACD)。在横截面和纵向研究中，对事件或事实的新记忆编码能力和工作记忆都显示出下降。比较衰老对表象记忆、语义记忆、短期记忆和启动的影响的研究发现，表象记忆在正常衰老中尤其受损；一些类型的短期记忆也会受损。这些缺陷可能与刷新最近处理的信息的能力的障碍有关。

正常情况下，一些心理功能的下降与年龄无关，如语言能力、一些数字能力和一般知识，但其他心理能力从中年开始下降，甚至更早。后者包括记忆、执行功能、处理速度和推理的各个方面。因此，应该理解，在一些实施例中，本发明为任何认知能力下降，特别是与年龄有关的认知能力下降提供联合治疗，具体而言，就是50、55、60、65、70、75、80、85、90、95岁及以上的年龄。

在其他实施例中，本文定义的症状或条件是焦虑。术语"焦虑(anxiety)"是指一种不正常的、压倒性的忧虑和恐惧感，通常以身体征兆(如紧张、出汗和脉搏增加)、对威胁的现实和性质的怀疑以及对自己应对威胁的能力的自我怀疑为标志。

在进一步的实施例中，本文定义的症状或条件是抑郁。如本领域所知，术语"抑郁(depression)"是指一种情绪低落和厌恶活动的状态，会影响一个人的思想、行为、倾向、感觉和幸福感。抑郁的情绪是对生活事件-如失去一个所爱的正常临时反应。它也是一些身体疾病的症状，以及一些药物和医学治疗的副作用。抑郁情绪也可能是一些情绪障碍的症状，如严重抑郁症或癔病。

如上所指出，发明人已经显示，用本公开的杜氏藻属藻类制剂喂养的AD模型小鼠，除其他外，还经历了焦虑的减少以及学习和记忆能力的改善。此外，发明人还表明，在用本公开的杜氏藻属藻类制剂喂养的AD模型小鼠中，与对照组(用常规饮食喂养)相比，不溶性β-淀粉样蛋白的水平明显降低。

因此，在一些实施例中，根据本公开的所述方法，导致有需要的受试者的认知功能、短期记忆、长期记忆及β-淀粉样蛋白的获取时间和清除率中的至少一者的改善。

本文所用的术语"改善(improvement)"是指有需要的受试者的认知功能、短期记忆、长期记忆、β-淀粉样蛋白的获取时间和清除率中的至少一者的至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％。33％,34％,35％,36％,37％,38％,39％,40％,41％,42％,43％,44％,45％,46％,47％,48％,49％,50％,51％,52％,53％,54％,55％,56％,57％,58％,59％,60％,61％,62％,63％,64％,65％,66％,67％,68％,69％,70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％的任何恢复、进步或增强，特别是与已检验的任何行为参数相比，特别是在受试者使用本发明的杜氏藻属藻类制剂治疗之前所确定的长期记忆、短期记忆、认知功能、学习功能、焦虑和抑郁。

应该进一步理解的是，在一些实施例中，本发明进一步为不一定患有神经退行性疾病的受试者提供上述认知功能的改善，特别是学习功能、短期和长期记忆，以及焦虑和抑郁的减少，具体而言，本发明为健康受试者提供改善认知功能的方法。

在本公开的进一步特定实施例中，本文所用的术语"改善(improvement)"是指在有需要的受试者中，短期记忆损害、长期记忆损害、受损的认知功能、受损的学习功能、β-淀粉样蛋白沉积中的至少一者的任何恢复、进步或增强。

此处定义的所述方法、杜氏藻属藻类制剂的用途和组成物和用法也可用于预防、减少或治疗认知能力下降。

因此在一些实施例中，根据本公开的所述方法，是用于预防、治疗、改善、减少或推迟认知能力下降的所述发作。

本文所使用的术语"认知衰退(cognitive decline)"是指个人的认知功能受损，以至于如果不进行治疗就不可能实现正常功能。认知能力下降的一些常见迹象是混乱、运动协调性差、短期或长期记忆丧失、身份混乱和判断力下降。

如下所示，发明人已经证明，用本公开的杜氏藻属藻类制剂喂养的Tg2576小鼠的不溶性β-淀粉样蛋白水平比对照组(常规饮食)明显降低。如本领域所知，各种人类退行性疾病，包括阿尔茨海默病、轻链淀粉样病和海绵状脑病，都与被称为"淀粉样纤维(amyloidfibrils)"或"斑块(plaques)"的蛋白质聚集物(它们是错误折叠的蛋白质)在组织中的沉积有关。

因此，在一些实施例中，此处定义的方法、用途和杜氏藻属藻类制剂用于预防、治疗、改善、减少或推迟与蛋白质错误折叠有关的疾病的发生，包括向所述对象施用有效量的至少一种杜氏藻属藻类制剂或包含其的任何组成物。

此处所用的"蛋白质错误折叠和聚集(Protein misfolding and aggregation)"，涉及一种受损的物理过程，通过该过程，蛋白质链以快速和可重复的方式获得其原生三维结构，即通常具有生物功能的构象。蛋白质折叠是一个物理过程，通过这个过程，多肽从随机线圈折叠成其特征和功能的三维结构。当从mRNA的序列翻译成氨基酸的线性链时，每个蛋白质都以未折叠的多肽或随机线圈存在。氨基酸相互作用，产生一个明确的三维结构，即折叠的蛋白质，被称为原生状态。正确的三维结构对功能至关重要，尽管功能性蛋白质的某些部分可能保持未折叠状态。未能折叠成原生结构一般会产生无活性的蛋白质，但在某些情况下，错误折叠的蛋白质具有修正或有毒的功能。一些神经退行性疾病和其他疾病被认为是由错误折叠的蛋白质形成的淀粉样纤维堆积造成的。

更具体地，在某些条件下，蛋白质可能不会折叠成其生化功能形式，导致蛋白质变性。一个完全变性的蛋白质缺乏三级和二级结构，并以所谓的随机线圈形式存在。在某些条件下，一些蛋白质可以重新折叠；然而，在许多情况下，变性是不可逆转的。细胞可以用被称为伴侣或热休克蛋白的酶来保护它们的蛋白质免受热的变性影响，这些酶帮助其他蛋白质折叠和保持折叠。有些蛋白质在细胞中根本就没有折叠，除非有伴侣分子的帮助，伴侣分子要么隔离单个蛋白质，使其折叠不被其他蛋白质的相互作用所干扰，要么帮助展开错误折叠的蛋白质，使其有第二次机会重新正确折叠。这一功能对于防止沉淀为不溶性的无定形聚集体的风险至关重要。

目前已知，各种蛋白质的微量聚集可能会自发发生，特别是在老化过程中，而且这种聚集可能会导致细胞功能的细微损害，即使没有明显的淀粉样表型。与蛋白质错误折叠有关的疾病的一般模式是蛋白质因错误折叠而出现异常的聚集趋势。

因此，本文所使用的术语"与蛋白质错误折叠相关的疾病(disorder associatedwith protein misfolding)"是指直接或间接由器官或组织中错误折叠的蛋白质聚集物导致的疾病或失调。更具体地，聚集的蛋白质与朊病毒相关的疾病有关，如克雅氏病、牛海绵状脑病(疯牛病)，与淀粉样物质相关的疾病，如阿尔茨海默病和家族性淀粉样心肌病或多发性神经病，以及胞质内聚集疾病，如亨廷顿病和帕金森病。这些年龄段的退行性疾病与错误折叠的蛋白质聚集成不溶性的细胞外聚集物和/或包括交叉β片淀粉样纤维的细胞内包含物有关。目前还不完全清楚这些聚集物是原因还是仅仅反映了蛋白质平衡的丧失，即合成、折叠、聚集和蛋白质周转之间的平衡。错误的折叠和过度的降解而不是折叠和功能导致了一些蛋白病疾病，如抗胰蛋白酶相关的肺气肿、囊性纤维化和溶酶体储存疾病，其中功能的丧失是疾病的起源。

术语"与蛋白质错误折叠相关的疾病(disorder associated with proteinmisfolding)"还包括一组与β-淀粉样蛋白聚集有关的疾病，其中包括阿尔茨海默病(AD)，一种叫做β-淀粉样蛋白前体的沉积物在神经细胞之间的空间里堆积(称为斑块)，tau蛋白的扭曲纤维在细胞内堆积(称为缠结)。

更具体地，本文所用的"β-淀粉样蛋白聚集(Beta-amyloid proteinaggregations)"与充满β-淀粉样肽(Aβ)的大脑斑块和新皮层末端区域的萎缩性神经元以及内侧颞叶结构中突出的神经纤维缠结有关，这些都是阿尔茨海默病的重要病理特征。随后，神经元和白质的丧失，充血性(淀粉样)血管病变也会出现。

Aβ肽是新陈代谢的自然产物，由36至43个氨基酸组成。Aβ40的单体比容易聚集和具有破坏性的Aβ42种类要普遍得多。β-淀粉样肽起源于淀粉样前体蛋白的蛋白分解，由β-位点淀粉样前体蛋白清除酶1(BACE-1)、β-分泌酶和γ-分泌酶(一种以预设蛋白1为催化核心的蛋白复合物)的连续酶作用。生产和清除之间的不平衡，以及肽的聚集，导致Aβ积累，这种过剩可能是阿尔茨海默病的起始因素。

β-淀粉样蛋白也可以成长为纤维，它们排列成β-褶皱片，形成晚期淀粉样斑块的不溶性纤维。可溶性低聚物和中间型淀粉样蛋白是Aβ的最大神经毒性形式。在脑切片制备中，Aβ的二聚体和三聚体对突触是有毒的。实验证据表明，Aβ的积累先于并驱动tau蛋白的聚集。

本文所用的"Tau蛋白(Tau protein)"是指神经纤维缠结，它是锥体神经元中的丝状内含物，是阿尔茨海默病和其他称为tau蛋白病(tauopathies)的神经退行性疾病的特征。阐明它们的形成机制可能为未来的治疗提供目标。高磷酸化的Tau蛋白在锥体神经元中堆积成成对的螺旋状细丝是阿尔茨海默病(AD)的一个主要标志。除了超磷酸化，Tau蛋白的其他修饰，如交联，可能有助于形成成对螺旋丝的特征，包括其不溶性和抗蛋白水解。这些神经纤维缠结，由超磷酸化和聚集形式的微管相关蛋白tau组成。

在非病理条件下，tau是一种发育调节的磷蛋白，促进微管的组装和稳定，从而参与轴突运输。在AD和其他tau蛋白病(tauopathies)中，tau蛋白聚集并形成纤维状的不溶性细胞内包涵物，即所谓的神经纤维缠结。其意味着，离子相互作用和共价交联有助于病理性的Tau聚集和缠结形成。活性羰基化合物，在氧化应激条件下和在衰老中增加，被认为是造成Tau聚集的潜在化合物。

应该注意的是，本发明的所述方法在某些实施例中也可适用于治疗突触性疾病。本文所用的"α-突触核蛋白病症(Alpha-synuclein pathology disorders)"是指以存在特定的细胞内蛋白聚集物(包含体)为特征的疾病，这些聚集物被称为路易(Lewy)体，主要包含α-突触核蛋白。α-突触核蛋白由140个氨基酸组成，作为一种未折叠的细胞质蛋白自然存在于神经元突触区。

α-突触核蛋白的过度表达会中断正常的细胞功能，并导致神经元外植体和细胞粘附力的下降。由单体、中间低聚体或纤维状形式组成的α-突触核蛋白聚集物被认为涉及了帕金森病(PD)和其他α-突触核蛋白病的发病机制的关键步骤，如多系统萎缩(multiplesystem atrophy,MSA)和路易体痴呆(dementia with Lewy bodies,DLB)。这些中枢神经系统的慢性神经退行性疾病的特点是含有α-突触核蛋白的路易体的发展。在PD患者的脑脊液和血浆样本中都检测到低聚物和单体的α-突触核蛋白，这表明α-突触核蛋白的小聚集体进入了细胞外空间。

更进一步，如上所记载，本发明还提供了适用于防止任何神经变性或本文所讨论的任何神经元损伤的杜氏藻属藻类制剂、组成物、套件和方法。神经变性是许多神经系统疾病和失调的共同主题，如帕金森病、阿尔茨海默病、ALS、头部创伤和癫痫。

这些疾病和失调的一个共同主题是神经细胞功能的丧失和/或神经细胞的死亡或损伤。在此，发明人公开了杜氏藻属藻类制剂、组成物和方法，涉及将神经细胞暴露在杜氏藻属藻类制剂中，无论是直接还是通过给病人服用，用于神经保护或防止任何神经元损伤或伤害，从而预防和治疗导致神经细胞功能恶化和死亡的病症。

当提到细胞损伤时，术语"损伤(damage)"或伤害，与任何生理细胞功能的破坏或细胞死亡有关。生理细胞功能破坏的非限制性示例包括：氧化应激(例如，脂质过氧化、DNA和RNA氧化以及蛋白质氧化)、非特异性糖化、蛋白质错误折叠、DNA突变、任何细胞结构完整性的丧失、代谢应激、电离和非电离辐射损伤以及化学应激(例如，暴露于酸性或碱性物质)。

因此，"防止神经细胞功能恶化和死亡(protection from neural cell functiondeterioration and death)"是指防止或减少神经死亡，或防止或减少神经功能的恶化(例如通过神经递质的分泌、树突和轴突的生长、电脉冲的传递、对刺激的反应、维持髓鞘和郎飞结(Ranvier's nodes)的结构完整性等来说明)。

术语"神经细胞功能(neural cell function)"与任何正常的生理细胞活动有关，取决于具体的细胞类型。这种功能的非限制性例子包括细胞活力、神经递质的分泌、树突和轴突的生长、电脉冲的传递和对神经元刺激的反应、维持少突胶质细胞和许旺细胞的髓鞘和兰维埃结的结构完整性，以及供应营养物质和氧气，以及回收星形胶质细胞的神经递质。

应该理解的是，在本说明书中，术语"神经细胞(neural cell)"涉及的细胞可以是中枢神经系统神经元和胶质细胞、星形细胞、神经元细胞、少突胶质细胞、许旺(Schwann)细胞、卫星细胞、纺锤形细胞、柯蒂氏器的神经听觉内毛细胞、柯蒂氏器的听觉外毛细胞中的任意一种、嗅觉上皮的基底细胞、冷感初级感觉神经元、热感初级感觉神经元、表皮的梅克尔(Merkel)细胞、嗅觉受体神经元、痛感初级感觉神经元、光感杆细胞、眼睛的蓝感锥体细胞、眼睛的绿感锥体细胞、眼睛的红感锥体细胞、本体感初级感觉神经元、触觉初级感觉神经元、I型颈动脉体细胞、II型颈动脉体细胞、I型耳前庭器毛细胞、II型耳前庭器毛细胞、I型味蕾细胞、自主神经细胞、胆碱能神经细胞、肾上腺能神经细胞、肽神经细胞、感觉器官和周围神经元支持细胞、柯蒂氏器的内柱细胞、柯蒂氏器的外柱细胞、柯蒂氏器的内趾细胞、柯蒂氏器的外趾细胞、柯蒂氏器的边界细胞、柯蒂氏器的汉森(Hensen)细胞、前庭装置支持细胞、味蕾支持细胞、嗅觉上皮支持细胞和肠胶质细胞。

由于本发明提供了杜氏藻属藻类制剂、组成物和方法，用于保护、减少、预防或抑制有需要的受试者的神经细胞功能的恶化，因此必须明确界定"神经细胞功能(neuralcell function)"这一术语的范围。在此，此术语与任何正常的生理细胞活动有关，取决于具体的细胞类型。这种功能的非限制性例子包括细胞活力、神经递质的分泌、树突和轴突的生长、电脉冲的传递和对神经元刺激的反应、维持少突胶质细胞和许旺(Schwann)细胞中髓鞘和郎飞结(Ranvier's nodes)的结构完整性，以及供应营养物质和氧气，并在星形胶质细胞中回收神经递质。

如上文所公开的，神经退行是指神经元结构或功能的逐渐丧失，包括神经元的死亡的总称。许多神经退行性疾病，包括帕金森氏症、阿尔茨海默病、ALS和亨廷顿病都是由于神经退行性过程而发生。其他神经退行性疾病的例子包括弗里德里希共济失调症、路易体病、脊髓性肌肉萎缩症、多发性硬化症、额颞叶痴呆症、皮质基底层变性、进行性核上性麻痹、多系统萎缩、遗传性痉挛性瘫痪、淀粉样变和腓骨肌萎缩病(Charcot Marie Tooth)。不应被忽视的是，正常的衰老过程包括渐进性神经退行。

更进一步，应理解的是，本发明提供了治疗或预防任何神经病理条件的方法。术语"神经病理条件(neuro-pathological condition)"涉及由神经细胞失调引起的、或造成的、或与之相关的任何病理条件，如神经细胞功能或生存能力的任何恶化。正如本文所解释的，这种情况可能是神经退行性疾病、脑部创伤、影响神经系统的代谢性疾病，如苯丙酮尿症、影响大脑的免疫性疾病，如桥本甲状腺炎(Hashimoto's Thyroiditis)、影响神经细胞的遗传性疾病，如泰-萨克斯(Tay-Sachs)病、异染性脑白质病变(metachromaticleukodystrophy)、克拉伯(Krabbe)病、法布里病(Fabry)病、戈谢(Gaucher)病、法伯(Farber)病和尼曼-匹克(Niemann-Pick)病、营养缺乏症，如维生素B₆和D缺乏症，以及任何影响神经系统的后遗症。

应该进一步理解的是，本发明的杜氏藻属藻类制剂、方法和组成物可适用于治疗神经病理和神经退行性疾病或与之相关的任何病理条件。可以理解的是，当提及本文所述的病症时，可互换使用的术语"关联的(associated)"、"联系的(linked)"和"有关的(related)"是指至少有一种疾病、失调、条件或任何病症：共享因果关系，以高于巧合的频率共存，或至少有一种疾病、失调、条件或病症引起第二种疾病、失调、条件或病症。这种情况可以包括例如帕金森病、阿尔茨海默病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、头部创伤、癫痫、中风、神经肌萎缩/艾萨克斯(Isaacs)综合症、下运动神经元病变、韦德尼格-霍夫曼(Werdnig-Hoffman)病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、肯尼迪(Kennedy)病、有机磷酸盐中毒、苯二氮类药物戒断、镁缺乏、肌痛性脑脊髓炎、脱水、疲劳、莱姆病、重症肌无力、狂犬病、纤维肌痛、蛛网膜下腔出血、脑内出血、脑前动脉闭塞和狭窄、基底动脉闭塞和狭窄、颈动脉闭塞和狭窄、椎动脉闭塞和狭窄、脑动脉闭塞、脑血栓伴有或不伴有脑梗塞、脑栓塞伴有或不伴有脑梗塞、短暂性脑缺血、基底动脉综合征、椎动脉综合征，锁骨下盗血综合征、椎基底动脉综合征、短暂性脑缺血发作(TIA)、脑动脉硬化、高血压脑病、脑动脉瘤、脑动脉炎，脑底异常血管网(Moyamoya)病、颅内静脉窦非热源性血栓形成、动脉粥样硬化、肾动脉粥样硬化、四肢固有动脉粥样硬化、间歇性跛行、主动脉瘤、主动脉夹层、颈动脉夹层、髂动脉夹层、肾动脉夹层、椎动脉夹层、红斑狼疮和结节性多动脉炎。

术语"疾病(disease)"、"失调(disorder)"或"条件(condition)"是指正常功能受到干扰的状态。术语"至少一种(at least one)"在本文定义的"疾病(disease)"、"失调(disorder)"或"条件(condition)"的上下文中是指通过本公开的杜氏藻属藻类制剂可在至少一种，例如2、3、4、5或更多本文定义的疾病、失调或条件中实现有益的(治疗)效果。

本文所用的术语"治疗(treat)、治疗(treating)、治疗(treatment)"是指改善或减少具有本文定义的疾病或紊乱的受试者的一个或多个疾病活动的临床指标。疾病的临床指标的改善或减少可能是细微的或显着的。

预防或延缓神经退行性疾病、与蛋白质错误折叠相关的疾病、认知能力下降以及与之相关的任何条件或症状中的至少一者的方法，包括向所述受试者施用有效量的至少一种杜氏藻属藻类制剂或包含其的任何组成物，也包括在本公开中。

术语"预防(preventing)"是指提供"预防性治疗(preventive treatment)"或"预防性治疗(prophylactic treatment)"，即以保护的方式行事，抵御或防止某些东西，特别是本文定义的条件或疾病。

此处定义的疾病、失调或条件往往微妙地开始，但一直发展到严重阻碍受影响的人的生活质量。年龄、遗传和缺乏适当的营养物质等因素对于疾病的发展有贡献。在本文定义的失调、疾病或条件的背景下，术语"推迟发病(delaying the onset)"是指任何推迟、暂停、阻碍或延缓本文定义的疾病或与之相关的症状的表现。

本文所用的"有需要的受试者(Subject in need thereof)"是指温血动物(如人类、大鼠、小鼠、狗、猫、豚鼠和灵长类动物)。在一些实施例中，所述受试者被诊断出患有本文定义的疾病、失调或条件。此处定义的疾病、失调或条件的诊断可由熟练的医生进行，如本领域所知。

本公开的"杜氏藻属藻类制剂(Dunaliella algae preparation)"或"杜氏藻属制剂(Dunaliella preparation)"可通过任何已知方法制备。在一些实施例中，杜氏藻属藻类制剂的制备如下面的实施例所述，是杜氏藻属藻类粉末制剂。

在一些实施例中，本公开的杜氏藻属制剂是作为提取物制备的。术语"提取物(extract)"是指从杜氏藻属中提取的任何物质或物质的混合物，使用酶、有机溶剂或亲水溶剂进行提取。换句话说，术语"提取物(extract)"包括通过使用有机溶剂，例如酒精(如乙醇)、正己烷、乙酸乙酯或异丙醇，或通过亲水溶剂，如水，获得的物质。另外，提取物可以通过任何物理提取来制备，如切割、剁碎、研磨新鲜的、冷冻的或干燥的杜氏藻属材料。提取物可在所述提取后进行干燥，并可通过任何提取方法进一步处理(提取)，独立于先前的提取步骤。这些步骤可以独立重复。此外，还可以采用其他提取技术，其中非限制性的例子包括色谱法，包括尺寸排除法、疏水相互作用法和阴阳离子交换法、差速离心法、差速沉淀法(例如，使用硫酸铵)、差速过滤法和透析法。

如上所指出，在一些实施例中，新鲜的、冷冻的、干燥的或蒸发的杜氏藻属材料可用于上述任何制备程序。

在一些实施例中，本公开的杜氏藻属制剂是一种粉末制剂。

本文所用的"粉末制剂(powder preparation)"可通过本领域已知的任何方法制备。在一些实施例中，该粉末制剂是由美国专利8,722,057公开.更具体地，不同的制备方法将产生具有不同性质的粉末。为了制备由具有特定尺寸和形状的颗粒组成的粉末，必须仔细选择制备技术。研磨、固体的热分解和固体从液态或气态的沉积是制备粉末的最常用技术。任何药学上兼容的结合剂、赋形剂和/或佐剂材料都可以作为本文定义的粉末制备的一部分。

用于实施本发明生产方法的原料是微藻，且优选地是属于杜氏藻属的藻类，作为绿藻的一种类型。众所周知，属于杜氏藻属的藻类能在藻体中产生和储存大量的β-胡萝卜素。特别是，由于巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)和盐生杜氏藻(Dunaliella salina)在藻体中储存了大量的β-胡萝卜素，它们更优选地被使用。

属于杜氏藻属的藻类在一个培养装置中，例如在室外或室内的培养槽和培养池中培养预定的时间，然后通过使用泵等抽水装置从所述培养设施中抽出。抽出的培养液通过预定的网状物进行过滤，以去除培养装置中被污染的外来物质。

通过离心机对去除异物的培养液进行脱水，使培养液中的固体部分浓缩到预定的浓度。从培养液虽然被浓缩但仍具有流动性的角度来看，离心后培养液中固体部分的浓度优选为10-30％(重量)。在此需注意离心机优选为能够以批量或连续方式进行培养液离心的装置，从工作性和生产率的角度来看，更优选为能够连续进行离心的装置。此外，作为离心机，使用一般可用的离心机，离心机的转子的旋转速度没有特别的限制，但对于所使用的每个离心机来说，都是设定来以便使培养液的固体部分具有上述的浓度。

在本发明中，进行了pH值调节步骤，其中浓缩到预定浓度的培养液在碱性状态下被处理。在所述pH调节步骤中，向浓缩到预定浓度的培养液中加入碱性化合物及其水溶液等，并且优选地用搅拌装置如搅拌器在高碱性状态下搅拌和混合培养液，在高碱性状态下氢离子指数，即pH值为9.5或更高，温度约为25℃，更优选地在高碱性状态下搅拌和混合，pH值为10.0或更高，最优选地在高碱性状态下搅拌和混合，pH值为11.0或更高。若pH值低于9.5，其不是优选的，因为很难稳定地控制杜氏藻属粉末，以使其全年拥有160毫克％或更少的总脱镁叶绿素量以及100毫克％或更少的现有脱镁叶绿素量。

一般来说，在杜氏藻属粉末的生产步骤中，各种步骤通常在中性至弱碱性状态下进行。如果像本发明那样加入pH值调节处理，不仅要增加另一个步骤，而且必要时还要进行下面提到的中和处理步骤。由于这种原因，生产力等可能会受到影响。因此，传统上，让浓缩到预定浓度的培养液处于强碱性的想法还没有被达成。

在pH调节步骤中使用的碱性化合物的优选示例包括氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铷、氢氧化铯、四甲基氢氧化铵、氢氧化钙、氢氧化锶、氢氧化钡、氢氧化铊和胍。更优选的示例包括广泛使用的氢氧化钠、氢氧化钾和氢氧化钙。此外，它们中的两个或多个可以一起使用。此外，还可以使用其具有任意浓度的水溶液。

如果有必要，在进行pH值调节处理后，进行中和处理步骤，以使液体特性在25℃的温度下处于pH值7左右的中性范围。在例如所获得的杜氏藻属粉末作为健康食品或加工食品出售时，难以以如此高的pH值分配杜氏藻属粉末的情况下，这一步骤将是必要的。这里需要注意的是，如果在使用杜氏藻属粉末生产加工食品时进行另一个中和处理步骤，那么在本发明中不一定进行中和处理步骤。

作为在中和处理步骤中使用的化合物，使用无机酸或有机酸。无机酸的例子包括盐酸、磷酸、硫酸和硝酸。有机酸的例子包括甲酸、乙酸、柠檬酸和草酸。此外，其两个或更多可以一起使用。此外，还可以使用其具有任意浓度的水溶液。

然后，为了去除杜氏藻属培养液中的溶解盐或沉淀盐以及中和处理步骤中产生的盐，可以进行脱盐处理步骤。对于脱盐处理步骤，可以使用众所周知的方法。例如，可以使用日本专利公开号1995-000147中描述的使用壳聚糖溶液的脱盐处理。

然后，在本发明中，为了进一步减少对人体有害且包含在经过脱盐处理并浓缩到预定浓度的培养液中的脱镁叶绿素，或者为了杀死一般的细菌，可以在预定的温度和预定的时间进行热处理步骤。通过与上述调整pH值的处理步骤相结合，可以更有效地减少各种脱镁叶绿素的数量。热处理步骤优选地在70℃至140℃的温度范围内进行，更优选地在80℃至130℃的温度范围内进行。在低于70℃的温度下进行热处理不是优选的，因为需要很长的时间来减少各种脱镁叶绿素量或进行灭菌，并且由于氧化降解，杜氏藻属粉末中的β-胡萝卜素含量降低。此外，最好不要在超过140℃的温度下进行热处理，因为虽然可以在很短的时间内减少各种脱镁叶绿素的量或进行灭菌，但由于氧化降解，杜氏藻属粉末中的β-胡萝卜素的含量也会降低。此外，热处理步骤所需的时间优选地在2至80分钟之间，更优选地在5至60分钟之间。热处理时间少于2分钟不是优选的，因为不能减少各种脱镁叶绿素的量，或不能进行充分的消毒以作为健康食品等出售。热处理时间长于80分钟不是优选的，因为由于氧化降解，不能获得高含量的β-胡萝卜素。这里需注意的是，热处理步骤不一定是在脱盐处理步骤之后进行，而是可以按任意顺序进行，例如，在调整pH值的处理步骤之前进行。

然后，在中和处理步骤或必要时的热处理步骤之后得到的糊状物，通过众所周知的方法，如喷雾干燥，或在减压下冻干，从糊状物中去除水分，形成干燥的粉末产品。

在上述一系列方法中获得的杜氏藻属粉末具有160毫克％或更少的脱镁叶绿素量和100毫克％或更少的现有脱镁叶绿素量，并且在100克杜氏藻属粉末中含有3到20克的β-胡萝卜素。此外，在100克杜氏藻属粉末中含有的β-胡萝卜素的量，因属于杜氏藻属的不同藻类作为原料而不同，但所述β-胡萝卜素的量更优选地为5至15克，最优选地为6至10克。100克杜氏藻属粉末中含有的β-胡萝卜素量低于3克不是优选的，因为其商业价值降低。此外，为了达到20克或更高的含量，作为原料的属于杜氏藻属的藻类需要含有更多的β-胡萝卜素。

在又一些进一步的实施例中，本公开的杜氏藻属制剂是如下详述的基于巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)制备的。应该注意的是，杜氏藻科(Dunaliellaceae)家族，特别是杜氏藻属是一种单细胞、光合作用的绿藻，其特点是能够超越其他生物并在高盐环境中茁壮成长。杜氏藻属的某些物种可以在非常恶劣的生长条件下积累相对大量的β-类胡萝卜素和甘油，这些条件包括高光强度、高盐浓度以及有限的氧气和氮气水平。巴氏杜氏藻是众所周知的微藻，在限制生长的条件下积累高水平的β-胡萝卜素，主要是由异构体9-顺式和全反式组成。

在一些实施例中，本发明使用的杜氏藻属是在任何生长条件下生长的。例如，任何盐度条件，以及任何光照条件和任何温度条件。盐度条件的非限制性例子包括盐浓度为1M、2M、3M或更多的氯化钠，最高为4M。

应该理解的是，本发明中使用的杜氏藻属制剂是由任何杜氏藻属物种、菌株和分离物制备的。在一些具体和非限制性的实施例中，本发明使用的杜氏藻属制剂是以巴氏杜氏藻制备的。在一些更具体的实施例中，本文使用的巴氏杜氏藻是班·阿默兹(Ben-Amotz)和阿瓦隆(Avron)，在1976年从北希纳(North Sinai)的巴达威尔(Bardawil)泻湖附近的盐池中分离出来的。在一些进一步的具体实施例中，本文使用的巴氏杜氏藻是由

30861^TM表示的。应该理解的是，本发明进一步包括使用由

30861^TM表示的巴氏杜氏藻的任何后代、菌株、分离物、突变体或变体，用于本发明所述的任何方面。

巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil，以下简称"Db")在50,000平方米的大体量开放盐水池塘中生长和培养，以获得含有约8％(重量)的β-胡萝卜素(以下简称"BC")的海藻，BC的9-顺式和全反式异构体的比例约为1∶1(重量)，或大于1∶1的BC的9-顺式和全反式异构体。通过脱离离心机将海藻收获为浓缩的糊状物。糊状物被清洗以去除盐分并消毒，然后喷雾干燥，得到含有约8％BC和小于5％水分的Db粉末。所述Db粉末被包装在250-300毫克的海藻胶囊中，每个胶囊含有15-20毫克的BC，连同海藻的所有天然成分。胶囊中的BC保留了原有的异构体比例。胶囊被包装在真空封闭的泡罩中，保质期长达3年。

在具体的实施例中，本公开的杜氏藻属制剂是被封装的。封装是用于将一种物质(称为核心材料或活性剂)夹在另一种物质(涂层、外壳或载体/壁材)中的过程。更具体地，已知的有杜氏藻属藻类的干燥粉末，通过压缩和硬化杜氏藻属藻类的干燥粉末得到的片剂，或通过封装杜氏藻属藻类的干燥粉末得到的胶囊。在任何情况下，首先需要将杜氏藻属藻类的培养液干燥并形成干燥的粉末。

例如，日本专利e公开号1997-203公开了属于杜氏藻属的海藻的干粉产品，通过事先将培养的杜氏藻属藻体的培养液的水含量降低到，优选地，约50％，以便于干燥，然后进行雾化干燥、真空干燥或冷冻干燥而获得。

属于杜氏藻属的藻类的干燥粉末产品作为食品出售。为了满足预定的安全标准，有必要在从收获的属于杜氏藻属的海藻生产干粉产品的步骤中，进行减少可能对人体有害的化合物的步骤。

如上所述，在多个实施例中，本公开的杜氏藻属藻类制剂可以是巴氏杜氏藻制剂。

在具体的实施例中，本公开的杜氏藻属藻类制剂可适于添加到饮料、固体、半固体或液体食品、食品添加剂、食品补充剂、医用食品、植物药、药物和/或药物化合物中。

在更进一步的特定实施例中，本公开的杜氏藻属藻类制剂被用作功能性食品。术语"功能性食品(functional foods)"是指完整的、强化的、丰富的或增强的食品，当它们以有效的水平作为各种饮食的一部分定期食用时，它们提供的健康益处超出了提供必需的营养物质(如维生素和矿物质)。

在进一步的特定实施例中，本公开的杜氏藻属制剂被用作食品补充剂。食品补充剂，是欧洲食品和饲料安全委员会创造的术语，或膳食补充剂，是美国食品和药物管理局(FDA)采用的类似术语，涉及任何种类的物质，天然或合成，具有营养或生理效果，其目的是补充正常饮食。在这个意义上，这个术语也包括了食品添加剂和膳食成分。此外，根据1994年《膳食补充剂健康和教育法》(DSHEA)，美国联邦立法的一项法规，膳食补充剂一词被定义为旨在补充饮食的产品(烟草除外)，它含有或包含以下一种或多种饮食成分：一种维生素、一种矿物质、一种草药或其他植物、一种氨基酸、一种供人使用的饮食物质，通过增加总的饮食摄入来补充饮食，或一种浓缩物、代谢物、成分、提取物，或上述任何成分的组合。

食品或膳食补充剂是指那些以药丸、胶囊、粉末、饮料、能量棒和其他剂量形式销售的食品。欧洲和美国的法律对膳食补充剂的监管与涵盖"常规的"食品和药品的法规不同。据此，膳食补充剂必须标明为膳食补充剂，并用于摄取，且不得作为常规的食品或作为膳食或饮食的唯一项目使用。

在一些进一步的实施例中，本公开的杜氏藻属藻类制剂可作为医疗食品的附加物。所谓"医用食品(medical foods)"是指专门配制的食品，用于对某种疾病的饮食管理，这种疾病具有独特的营养需求，仅靠正常饮食无法满足。根据美国食品和药物管理局(FDA)1988年《孤儿药品法修正案》的定义，医疗食品是指完全在医生监督下食用或施用的食品，其目的是对某种疾病或病症进行特定的饮食管理，其独特的营养需求是基于公认的科学原则，并通过医学评估确定。

与本背景相关的还有植物药。在具体的实施例中，本公开的杜氏藻属藻类制剂可作为植物药的附加剂。本文所用的术语"植物药(botanical drug)"是指用于诊断、治愈、减轻、治疗或预防人类疾病的产品。植物药产品由植物材料组成，可包括植物材料、藻类、大型真菌或其组合。植物药产品可以作为(但不限于)溶液(例如茶)、粉末、片剂、胶囊、万能药、外用药或注射剂提供。植物药产品通常具有独特的特点，例如，复杂的混合物，缺乏独特的活性成分，以及先前大量的人类使用。发酵产品和高度纯化或化学改性的植物性物质不被视为植物性药物产品。根据美国食品和药物管理局(FDA)的行业指南，植物药产品可以是食品(包括膳食补充剂)、药物(包括生物药物)、医疗装置(如古塔波胶，gutta-percha)或化妆品。此外，植物药可以包括植物成分与合成或高度纯化的药物或生物技术衍生或其他天然衍生的药物相结合。同样，植物药也可以包含动物或动物部分(如昆虫、环带动物、鲨鱼软骨)和/或矿物质或其组合。

如上所指出，根据本公开的所述方法包括向受试者施用有效量的至少一种杜氏藻属藻类制剂或包含其的任何组成物。

术语"有效量(effective amount)"是指达到选定结果的必要量。有效量由疾病或病症的严重程度和类型以及预防或治疗目标、给药途径和病人的一般条件(年龄、性别、体重和主治医生已知的其他考虑因素)决定。有效量可根据动物模型来确定，如实施例中提出的这些模型。

在一些实施例中，本公开的杜氏藻属藻类制剂被包含在一种组成物中。

包含本公开的杜氏藻属藻类制剂的组成物可根据本领域中已知的任何方法制备。

在特定的实施例中，包含本公开的杜氏藻属藻类制剂的组成物是一种药物组成物。

包含本公开的杜氏藻属藻类制剂的药物组成物通常包括缓冲剂、调整其渗透压的药剂，以及可选的一种或多种本领域已知的药学上可接受的载体、赋形剂和/或添加剂。补充性的活性成分也可以被纳入组成物中。载体可以是溶剂或分散介质，含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其适当的混合物和植物油。适当的流动性可以通过使用涂层，如卵磷脂，在分散的情况下通过保持所需的颗粒大小和使用表面活性剂来保持。

因此，应该理解，本发明的药物组成物以及上述所有杜氏藻属藻类制剂可适用于上述讨论的任何神经退行性疾病，特别是与β-淀粉样蛋白聚集有关的任何情况，上述任何tau蛋白病(tauopathies)和/或与此有关的任何早期征兆或症状。

施用本公开的杜氏藻属藻类制剂或包含所述杜氏藻属藻类制剂的任何组成物可通过本领域已知的任何途径、肠道或肠外途径进行。在一些实施例中，根据本公开的所述方法，其中所述杜氏藻属藻类制剂是口服给药。

根据某些实施例，本发明的杜氏藻属藻类制剂或其任何组成物可通过口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、腹膜内注射、肠外注射、经皮注射、阴道内注射、鼻内注射、粘膜注射、舌下注射、局部注射、直肠注射或皮下注射，或其任何组合给药。

根据一个具体的实施例，本发明的组成物可能特别适用于口服或粘膜给药使用。口服制剂的有用性要求本发明的活性剂或制剂具有生物利用性。口服药物的生物利用度可受多种因素的影响，如整个胃肠道的药物吸收、药物在胃肠道的稳定性和首过效应。因此，活性剂或组成物的有效口服需要活性剂在胃和肠腔中有足够的稳定性以通过肠壁。然而，许多药物往往在肠道中迅速降解或在肠道中吸收不良，因此口服不是有效的给药方法。

更具体地，本发明的杜氏藻属藻类制剂和组成物可以适合于粘膜给药，例如，肺部、口腔、鼻腔、鼻内、舌下、直肠、阴道给药及其任何组合。

适合口服的药物组成物通常为固体剂型(如片剂)或液体制剂(如溶液、悬浮液或酏剂)。

固体剂型是可取的，因为它易于确定和管理活性成分的剂量，并且易于管理，特别是由受试者在家中管理。

液体剂型也允许受试者轻松服用所需剂量的活性成分。液体制剂可以配制成饮料，或通过鼻胃管(NG管)等进行给药。液体口服药物组成物通常需要合适的溶剂或载体系统，以溶解或分散活性剂，从而使该组成物能够被施用到受试者身上。合适的溶剂系统与活性剂相容，对受试者无毒。通常情况下，液体口服制剂使用水基或油基溶剂。

本发明的口服组成物也可以选择配制成减少或避免活性剂被胃肠系统降解、分解或失活，例如通过胃中的胃液。举例来说，所述组成物可以选择性地被配制成未改变地通过胃并在肠道中溶解，即肠衣组成物。

口服组成物也可以用赋形剂来制备。药学上兼容的结合剂，和/或佐剂材料可以作为组成物的一部分包括在内。包含杜氏藻属藻类制剂的口服剂型被提供，其中所述剂型在口服后为受试者提供治疗有效的杜氏藻属藻类制剂的血液水平。包含所述杜氏藻属藻类制剂的剂型也被提供，其中所述剂型在给药后向受试者提供治疗有效的杜氏藻属藻类制剂的血液水平。为了粘膜治疗的目的，活性组合化合物(例如杜氏藻属藻类制剂)可以与适合通过吸入或吸收给药的赋形剂或载体结合，例如通过鼻腔喷雾剂或滴剂，或直肠或阴道栓剂。

在一些进一步的具体实施例中，根据本公开的所述方法，其中所述杜氏藻属藻类制剂与至少一种额外的药剂联合施用。换句话说，本公开的所述方法包括与至少一种附加治疗剂的联合治疗，附加治疗剂的类型取决于被治疗的疾病或条件的类型。

术语"联合治疗(combination therapy)"可以指同时或连续施用两种或多种药剂。例如，同时给药可以指包含两种或多种药剂的一种剂型，而连续给药可以指在不同的时间和可选的不同给药途径对受试者的单独剂型。

在另一个方面，本公开进一步提供了至少一种杜氏藻属藻类制剂或包含其的任何组成物的用途，用于预防、治疗、改善、减少或推迟有需要的受试者中的神经退行性疾病、与蛋白质错误折叠相关的疾病、认知能力下降以及与此相关的任何条件或症状中的至少一者的发作的方法。

在一些实施例中，根据本公开内容使用的至少一种杜氏藻属藻类制剂或包含其的任何组成物的用途，所述方法导致有需要的受试者的与神经退行性疾病、与蛋白质错误折叠关联的疾病和认知能力下降中的至少一者关联的症状的改善或减少。

在其他实施例中，根据本公开的至少一种杜氏藻属藻类制剂或包含其的任何组成物的用途，所述症状是短期记忆损伤、长期记忆损伤、受损的认知功能、受损的学习功能、β-淀粉样蛋白沉积、焦虑、抑郁或其任何组合中的至少一者。

在进一步的实施例中，根据本公开的至少一种杜氏藻属藻类制剂或包含其的任何组成物的用途，所述方法导致有需要的受试者的认知功能、短期记忆、长期记忆及β-淀粉样蛋白的获取时间和清除率中的至少一者的改善。

在还进一步的实施例中，根据本公开的至少一种杜氏藻属藻类制剂或包含其的任何组成物的用途，所述神经退行性疾病是阿尔茨海默病、帕金森病、轻度认知障碍(MCI)、伴有轻度认知障碍(MCI)的帕金森病、亨廷顿病、路易体病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、朊病毒病、运动神经元病(MND)、脊髓小脑共济失调(SCA)、脊髓性肌肉萎缩(SMA)、弗里德里希共济失调及任何其他与神经退行性有关的痴呆或共济失调中的至少一者轻度认知障碍(MCI)中的至少一种。

在还进一步的具体实施例中，根据本公开的至少一种杜氏藻属藻类制剂或包含其的任何组成物的用途，所述神经退行性疾病是阿尔茨海默病。

在各种具体的实施例中，根据本公开的至少一种杜氏藻属藻类制剂或包含其的任何组成物的用途，是用于预防、治疗、改善、减少或推迟认知能力下降的所述发作，具体而言，如与本发明的其他方面有关的定义。

在各种具体的实施例中，根据本公开的至少一种杜氏藻属藻类制剂或包含其的任何组成物的用途，其中所述方法进一步包括施用至少一种附加剂。

再进一步，在一些实施例中，根据本公开的至少一种杜氏藻属藻类制剂或包含其的任何组成物的用途，所述杜氏藻属藻类是巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)。

在特定的实施例中，根据本公开的至少一种杜氏藻属藻类制剂或包含其的任何组成物的用途，所述杜氏藻属藻类制剂是口服地施用。

在另一个方面，本公开提供了至少一种杜氏藻属藻类制剂的用法，用于一组成物的制造，以用于预防、治疗、改善、减少或推迟有需要的受试者的一神经退行性疾病、与蛋白质错误折叠关联的一疾病、认知能力下降以及与此关联的任何条件或症状中的至少一者的发作。

在一些实施例中，根据本公开的所述用法，所述组成物改善或减少有需要的受试者的与一神经退行性疾病、与蛋白质错误折叠关联的一疾病及认知能力下降中的至少一者关联的至少一症状。

在其他实施例中，根据本公开的所述用法，所述症状是短期记忆损伤、长期记忆损伤、受损的认知功能、受损的学习功能、β-淀粉样蛋白沉积、焦虑、抑郁或其任何组合中的至少一者。

在进一步的具体实施例中，根据本公开的所述用法，所述组成物改善有需要的受试者的认知功能、短期记忆、长期记忆及β-淀粉样蛋白的获取时间和清除率中的至少一者。

在更进一步的特定实施例中，根据本公开的所述用法，其中所述神经退行性疾病是阿尔茨海默病、帕金森病、轻度认知障碍(MCI)、伴有轻度认知障碍(MCI)的帕金森病、亨廷顿病、路易体病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、朊病毒病、运动神经元病(MND)、脊髓小脑共济失调(SCA)、脊髓性肌肉萎缩(SMA)、弗里德里希共济失调及任何其他与神经退行性有关的痴呆或共济失调中的至少一者轻度认知障碍(MCI)中的至少一种。

在多种特定的实施例中，根据本公开的所述用法，其中所述神经退行性疾病是阿尔茨海默病。

在还进一步的实施例中，根据本公开的所述用法，是用于预防、治疗、改善、减少或推迟认知能力下降的所述发作，具体而言，如本文中与本发明的其他方面相关的描述。

在不同的实施例中，根据本公开的所述用法，其中所述杜氏藻属藻类制剂与至少一种附加剂联合施用。

在另外的实施例中，根据本公开的所述用法，其中所述杜氏藻属藻类是巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)。

在其他实施例中，根据本公开的所述用法，其中所述杜氏藻属藻类制剂是口服地施用。

在又一个方面，本发明进一步提供了至少一种杜氏藻属藻类制剂或包含其的任何组成物的用途，用于改善有需要的受试者的短期记忆损伤、长期记忆损伤、受损的认知功能、受损的学习功能、β-淀粉样蛋白沉积中的至少一者的方法。

在又一些方面，本发明提供了一种方法，用于改善有需要的受试者的短期记忆损伤、长期记忆损伤、受损的认知功能、受损的学习功能、β-淀粉样蛋白沉积中的至少一者。在一些实施例中，本发明的所述方法包括步骤：向所述受试者施用一有效量的至少一杜氏藻属藻类制剂或包含其的任何组成物。

在进一步的实施例中，根据本公开的所述方法，导致有需要的受试者的认知功能、短期记忆、长期记忆及β-淀粉样蛋白的获取时间和清除率中的至少一者的改善。

在其他实施例中，根据本公开的所述方法，是用于预防、治疗、改善、减少或推迟认知能力下降的所述发作。

在特定的实施例中，根据本公开的所述方法，其中所述杜氏藻属藻类是巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)。

在更进一步的具体实施例中，根据本公开的所述方法，其中所述杜氏藻属藻类制剂是口服地施用。

可以理解的是，本发明的某些特征，为了清楚起见，是在单独的实施例中描述的，也可以在单个实施例中组合提供。反之，为了简洁起见，在单一实施例的背景下描述的本发明的各种特征，也可以单独提供，或以任何合适的子组合提供，或在本发明的任何其他描述的实施例中合适地提供。在各种实施例的上下文中描述的某些特征不应视为这些实施例的基本特征，除非该实施例没有这些要素就无法操作。

除非另有说明，本文使用的所有科学和技术术语都具有本领域常用的含义。此处提供的定义是为了方便理解此处经常使用的某些术语，而不是为了限制本公开的范围。

此处使用的术语"大约(about)"表示可能偏离1％，更具体的是5％，更具体的是10％，更具体的是15％，在某些情况下比所指的值高或低20％，偏离范围包括整数值，如果适用，也包括非整数值，构成一个连续范围。在此，术语"大约(about)"指的是±10％。

术语"包括(comprises)"、"包括(comprising)"、"包括(includes)"、"包括(including)"、"具有(having)"及其共轭物指"包括但不限于(including but notlimited to)"。此术语包括术语"由…组成(consisting of)"和"基本上由…组成(consisting essentially of)"。短语"基本上由…组成(consisting essentially of)"意味着该组成物或方法可以包括额外的成分和/或步骤，但前提是这些额外的成分和/或步骤不会实质性地改变所要求的组成物或方法的基本和新颖特征。在本说明书以及后面的实施例和权利要求书中，除非上下文另有要求，否则"包括(comprise)"一词以及诸如"包括(comprises)"和"包括(comprising)"的变体将被理解为意味着包括所述的整数或步骤或一组整数或步骤，但不排除任何其他整数或步骤或一组整数或步骤。

应该注意的是，本发明的各种实施例可以用范围的形式呈现。应该理解的是，以范围格式描述仅仅是为了方便和简洁，不应该被理解为对本发明的范围的僵硬限制。因此，对一个范围的描述应被视为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，对一个范围的描述，如从1到6，应被视为具体披露了子范围，如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及该范围内的单个数字，例如，1、2、3、4、5和6。无论范围的广度如何，这都适用。每当这里指出一个数字范围时，它的意思是包括所指出范围内的任何引用的数字(分数或积分)。短语"范围介于(ranging/ranges between)"第一指示数字和第二指示数字之间和"范围介于(ranging/ranges from)"第一指示数字"到(to)"第二指示数字之间的范围在此可互换使用，意在包括第一和第二指示数字以及其间的所有分数和积分数字。

上文所述的本发明的多种实施例和方面，以及权利要求部分所要求保护的技术方案，在以下实例中找到了实验支持。

下面的例子是发明人在实施本发明的各个方面所采用的技术的代表。应该理解的是，虽然这些技术是实施本发明的优选实施例的典范，但本领域的技术人员根据本发明的公开内容，将认识到在不偏离本发明的精神和预期范围的情况下可以做出许多修改。

必须指出的是，在本说明书和所附权利要求书中使用的单数形式"一(a)"、"一(an)"和"所述(the)"包括复数的指称，除非内容明确规定。

实例

现在请参考以下实例，这些实例与上述描述一起以非限制性的方式说明了本发明的一些实施例。

实验程序

动物

使用了以下小鼠模型。

*Tg2576小鼠(塔康生物科学公司，Taconic Biosciences,Inc.)[27]和年龄、性别和品系匹配的C57Bl6野生型(WT)小鼠。Tg2576小鼠是在发明人的动物设施中自我喂养的。Tg2576小鼠表达含有瑞典双突变(APPswe)的淀粉样前体蛋白(APP)的人类695-aa异构体，由仓鼠朊病毒启动子驱动。选择Tg2576模型是因为它具有良好的特征。此外，在这个模型中，小鼠的病理发展相对缓慢，但速度快到足以获得实质性的发现，因此这个模型对未来的人类应用更有针对性。此外，这些小鼠的存活率相对较高(以前曾显示，到12个月时约有75％的小鼠存活)。由于Tg2576小鼠往往具有攻击性，动物被安置在SPF(无特定病原体)批准的谢巴动物设施(Sheba Animal Facility)中，每个笼子有一只动物。

*5XFAD小鼠。这些小鼠购自杰克逊实验室(Bar Harbor,ME,USA)。5XFAD小鼠过量表达具有瑞典(K670N，M671L)、佛罗里达(I716V)和伦敦(V717I)突变人淀粉样前体蛋白(APP)以及具有两个FAD突变(M146L和L286V)的突变人脯氨酸1(PS1)。

Tg2576小鼠被治疗了10个月(从2到12个月大)。每2个月获得一次体重。在牺牲前两周，进行行为测试(包括开放场地，测量一般运动器的活动、焦虑和探索意愿；Y型迷宫自发交替，测量探索性和空间工作记忆；巴恩斯迷宫，测量长期记忆)。动物在12个月大时被牺牲。

5XFAD小鼠被治疗6个月(从大约1到6个月大)。每月监测体重。在牺牲前两周，进行了行为测试(包括开放场地，测量一般运动器的活动，焦虑和探索意愿；Y型迷宫和新物体识别，测量探索性和空间工作记忆；新物体识别和巴恩斯迷宫，测量长期记忆)。动物在7个月大时被牺牲。

饮食条件

当动物达到8周龄时，Tg2576和WT对照小鼠被随机分配到两组(每组12只)，用8％杜氏藻属藻类制剂饮食(在此也称为"杜氏藻属饮食")或对照饮食喂养10个月。低脂饲料(18％蛋白质，5％脂肪；TD2018，哈兰·铁克拉德(Harlan Teklad))被用作基本(对照)饮食。为了准备食物，将750毫升蒸馏热水与28克明胶混合，直到溶液变清。然后，将1公斤的低脂饲料(对照组)或低脂饲料与杜氏藻类粉末(80克/公斤饲料)的粉末与温热的明胶溶液充分混合。凝固后，将食物分成片状，储存在零下80℃(因此，除了杜氏藻属藻类制剂的含量，两种食物的含量和质地基本相同)。每两天更换一次饲料，以减少成分的氧化和降解。

杜氏藻属藻类粉末的制备

巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil，以下简称"Db"，株式会社日健总本社，NikkenSohonsha Corporation)在50,000平方米的大体量开放盐水池塘中生长和培养，以获得含有约5-8％(重量)的β-胡萝卜素(以下简称"BC")的海藻，BC的9-顺式和全反式异构体的比例约为1：1(重量)，或BC的9-顺式和全反式的比例大于1：1。通过脱离离心机将海藻收获为浓缩的糊状物。糊状物经清洗以去除盐分并消毒，然后喷雾干燥，得到含有约5-8％BC和小于5％水分的巴氏杜氏藻粉末。该粉末被包装在250-500毫克的海藻胶囊中，含有BC(5-8％)以及海藻的所有其他天然成分(如蛋白质、脂类、碳水化合物)。胶囊中的BC保留了原有的异构体比例。胶囊被包装在真空封闭的泡罩中，保质期长达3年。

这里使用的杜氏藻属藻类粉末制剂含有约7％的β-胡萝卜素，由40％-50％的9-顺式β胡萝卜素(9βC)和50％-60％的全反式β胡萝卜素组成。

血脑屏障模型

使用了一个血脑屏障(blood brain barrier,BBB)的体外模型[28]。所述模型由单层内皮细胞和单层胶质细胞组成，前者来自于新鲜采集的猪脑建立的内皮细胞原代培养物，形成紧密连接，生长在微孔膜过滤器的培养插件上(图5中的"管腔侧")，后者是提取自新生大鼠皮质的单层胶质细胞，播种在过滤器的腹侧(图5中的"腔外侧")。将低密度脂蛋白(LDL，100微升，来自健康志愿者的1,600微克/毫升)加入到管腔侧。然后将细胞培养24小时，此后收集样品并使用高效液相色谱法进行分析。所述模型的制备方法是首先将胶质细胞播种在过滤器的腔外侧，一周后，将上述内皮细胞播种在过滤器的管腔侧，两天后将LDL加入过滤器的管腔侧，如上所示。

为了考察本发明的杜氏藻属藻类粉末制剂的9βC和全反式β-胡萝卜素(βC)异构体是否穿过血脑屏障，还在体内用高效液相色谱法(HPLC)测定了上述Tg2576和5XFAD小鼠模型的血浆、肝脏和不同脑区(海马体和额叶皮质)的β-胡萝卜素异构体水平，以及其他类胡萝卜素及其代谢物的含量。

还检查了视黄醇和视黄酸是否穿过血脑屏障，以发现哪些可以成为大脑中视黄醇的来源。此外，为了研究β-胡萝卜素是否能在大脑中转化为视黄醇，从大脑中分离出不同的细胞(海马神经元和星形胶质细胞)，并测量细胞中β-胡萝卜素15,15'-单氧酶1(BCMO1)的表达(mRNA和蛋白质)及其活性(视黄醇形成)。

用于血脑屏障体外模型的LDL分离

通过连续超速离心法(密度，1.063克/毫升)获得健康志愿者的LDL，并通过罗瑞(Lowry)法测定其浓度。

行为测试-学习和记忆测试

如上所述，30只8周大的Tg2576小鼠和30只C57Bl/6的野生型小鼠被随机分配到两组，分别在两种不同的饮食中放置10个月：普通饲料(对照)和杜氏藻属饮食(在1公斤饲料中含有8％的富含9-顺式β-胡萝卜素的杜氏藻属藻类粉末)。进行了以下行为测试：开放场地、Y型迷宫和巴恩斯迷宫。

巴恩斯迷宫

巴恩斯迷宫(Barnes maze)是一项空间学习任务，允许动物利用空间线索找到逃离轻微厌恶环境的方法[29]。巴恩斯迷宫和莫里斯水迷宫(MWM)都考察空间记忆，但与MWM不同的是，巴恩斯迷宫缺乏游泳所引起的压力。在这项任务中，小鼠被放置在一个圆柱形的暗室中，该暗室位于一个边缘有18个孔的圆形桌子的中心。10秒钟后，暗室被掀开，动物接受负强化，如亮光、响亮的蜂鸣器、暴露的环境和喷气机[30,31]，以激励它们找到通往其中一个洞下面的抽屉的逃生孔。动物在迷宫中探索，直到它在180秒内找到并进入逃生箱。如果小鼠未能在180秒内进入逃生箱，就会被轻轻地从尾巴根部拿起，放在手掌中，并在逃生洞的一侧放下来。小鼠进入逃逸箱并在那里再停留60秒，然后被移出并带到它的家庭笼子里。

每次测试后，用10％的酒精溶液彻底清洗迷宫和逃生箱，以去除气味。在180秒的逃脱潜伏期训练中，要测量错误次数和路径长度。逃逸潜伏期是指从移除圆筒到动物进入逃逸箱的时间长度。动物们将在4天内每天接受4次测试。在第五天，将进行回忆测试。逃生箱将被移走，同样的参数将被测量。在第12天，将进行第二次回忆测试，以评估目标逃脱箱的位置的长期保持。

Y型迷宫

Y型迷宫的自发交替是一种测量啮齿动物探索新环境意愿的行为测试。Y型迷宫测试可以评估依赖于海马体的空间工作记忆[32]。将12个月大的小鼠放在Y型迷宫的一臂末端，让其自由探索迷宫6分钟。交替将从连续进入三个臂的重叠三联组中确定，其中三个不同的臂被进入。一个实际的交替将被定义为连续进入所有三个臂(即ABC、CAB或BCA，但不是BAB)。进入的定义是将四只爪子都放在手臂的边界内。在两次任务之间，迷宫臂将用30％的乙醇清洗，以去除残留的气味。

开放场地测试

开放场地测试是一种常用的定性和定量措施，用于衡量啮齿动物的一般运动性活动、焦虑和探索意愿。小鼠被放置在测试箱的一角，允许其自由探索该区域5分钟。记录四个测量值：(a)总路径，表示一般活动和探索行为；(b)使用的细胞百分比，表示一般活动和探索行为；(c)移动的时间百分比，表示焦虑和一般活动；(d)中心总和，是小鼠在竞技场中心花费的时间总和，表示焦虑。该测试被记录和分析。这些测量中的每一项得分较高，反映了较低的焦虑和较高的运动性活动。

新物体识别

让小鼠接触两个相同的物体5分钟，3小时后进行短期记忆，24小时后进行长时记忆；其中一个物体被不同的物体取代。探索新物体所需的时间提供了一个识别记忆的指标。

测量海马体形成Aβ肽的情况

在小鼠(Tg2576和5xFAD)牺牲后，对它们的大脑提取物进行测量。脑组织被均质化，并对从中提取的蛋白质样本进行分析。使用人类β淀粉样蛋白(1-42)艾利莎套件(ELISAkit)(Wako)测量淀粉样蛋白的水平。简而言之，为了定量评估海马体形成的Aβ肽，冷冻粉碎的组织被两步提取。组织在1％的Triton X 100中均质化，在含有137毫米氯化钠和蛋白酶抑制剂鸡尾酒的25毫米磷酸盐缓冲盐水中稀释(Roche Biochemicals,Indianapolis,IN,USA)，并在4℃下以100,000克离心1小时。可溶性部分被命名为"Aβsol"。剩余的颗粒在5m胍盐酸与50mm Tris PH＝8和蛋白酶抑制剂鸡尾酒中超声处理，在25℃下孵育2小时，并在4℃下以13000克离心20分钟。后者(不溶性)部分被指定为"Aβinsol"。根据制造商的说明，用三明治艾利莎(ELISA)(WAKO，日本大阪)测量Aβ1 42。

在杜氏藻属藻类粉末制剂饮食喂养的动物中的RXR和下游基因的表达-NanoString nCounter基因表达分析

使用Nanostring方法研究了9-顺式βC(存在于杜氏藻属藻类粉末制剂饮食中)是否通过视黄酸X受体(RXR)影响大脑和其他组织中与炎症、血脑屏障突触可塑性和脂肪化有关的基因。为此，使用

RNA(Macherey-Nagel)或PARIS^TM套件(Invitrogene^TM)从小鼠海马体的一个半球提取总RNA，所述套件设计用于从同一组织提取RNA和蛋白质。提取的RNA进行了NanoString基因表达分析。遵循标准的NanoString协议。RNA(70纳克)被用来评估43个可能与阿尔茨海默氏症(AD)有关和受RXR影响的小鼠基因的表达，这些基因被分为不同的途径。炎症、脂化、血脑屏障和突触可塑性。纳入标准：比值高于1.4或低于0.7且p<0.05的数值被认为是显着的，并用于统计分析。

西方印迹分析(Western Blot Analysis)

使用PARIS^TM套件(Invitrogen^TM)或RIPA缓冲液裂解小鼠海马体。蛋白质裂解物在SDS-PAGE样品缓冲液中95℃下变性5分钟，并通过12％的SDS-PAGE分离。蛋白质被转移到硝酸纤维素膜上。将膜用阻断缓冲液孵育1小时，然后根据需要使用一级抗体孵育：抗GFAP(Abcam ab53554，1:500)，抗Synaptophysin(abcam[YE269]ab 32127，1:10000)，PBR(SantaCruz，FL-169:sc-20120，1:100)，α管蛋白(Santa Cruze，B-7:sc-5286，1:100)，GAPDH(1:150)。使用

680CW山羊抗兔(1:15000)和

680CW驴抗小鼠(1:15000)、

800CW驴抗山羊(1:15000)、

800CW山羊抗小鼠(1:15000)二级抗体对蛋白质进行可视化。图像是用奥德赛(Odyssey)系统(CLX)采集的。蛋白质用Image StudioVer 5.2软件进行了量化。

类胡萝卜素分析

小鼠脑组织用2mL含有10μM丁基羟基甲苯的乙醇均质，然后加入2mL己烷和1mL双蒸水(DDW)。将样品混合并在1000×g下离心5分钟，分离正己烷层并在N₂气流下干燥。将干燥的样品悬浮在100μL的甲基叔丁基醚中，用YMC C30色谱柱(CT995031546QT，150×4.6，3μm粒径；YMC Inc.，USA)通过反相HPLC测定βc的浓度。以甲醇/甲基叔丁基醚/水1.5％乙酸铵为流动相，流速为1毫升/分钟，通过监测其在450纳米的吸光度并与真实标准的保留时间进行比较来检测βc。

胆固醇和TG测量

采用比色酶法测量血浆总胆固醇(Chol,Roche/Hitachi,Roche Diagnostics)和甘油三酯(Infinity,Thermo Electron Corporation)。Cobas Mira自动分析仪(Roche)或Beckman coulter AU-480用于血脂测量。

统计学分析

数据以平均数±平均数的标准误差报告。结果通过学生t-测试进行分析。当p值小于0.05时，获得统计学上的意义。

实例1

使用杜氏藻属藻类粉末制剂喂养的小鼠的存活率和体重增加情况

如上所指出，30只Tg2576小鼠和30只C57Bl/6WT小鼠在两个月大时被随机分配到两组，并以2(小鼠类型)乘2(饮食类型)的设计方式在两种不同的饮食类型上放置10个月：常规饲料和杜氏藻属藻类粉末制剂饮食(在1公斤饲料中添加80克富含9-顺式β-胡萝卜素的杜氏藻属藻类粉末)。

如前所示，与野生型小鼠相比，Tg2576小鼠的存活率较低。然而，如下表1所示，与使用普通饮食的Tg2576小鼠相比，使用杜氏藻属藻类粉末制剂饮食的Tg2576小鼠的存活率大大增加(p＝0.052)。

表1--不同组别的存活率

在实验期间，每两个月测量一次动物的体重。如图1所示，在基线时，动物的体重相差无几，但在接下来的测量中，发现使用杜氏藻属藻类粉末制剂饮食的野生型小鼠(WTDuna.prep.)和其他组之间的差异越来越大。在实验结束时，使用杜氏藻属藻类粉末制剂饮食的野生型小鼠平均增加了12克，而其他组平均增加了22克。与野生型对照组小鼠(用普通饮食喂养的野生型小鼠)相比，用杜氏藻属藻类粉末制剂饮食喂养的野生型小鼠显示出显着差异(p<0.05)。

本领域已知，脂肪组织是类胡萝卜素和视黄醇储存的重要场所，有多项研究表明，视黄醇对肥胖症有抗脂肪和抗炎作用。因此，在本实验中，杜氏藻属藻类饮食对小鼠体重的影响是合理的。与使用对照组饮食的野生型小鼠相比，使用杜氏藻属藻类粉末制剂饮食的野生型小鼠的效果不同，其原因尚不清楚。尽管如此，杜氏藻属藻类粉末制剂处理的体重减少在以前没有被证明。

有趣的是，如图1所示，Tg Duna.Prep.小鼠和WT小鼠之间的体重增加没有显着差异。Prep.小鼠和WT对照小鼠之间，即用杜氏藻属藻类粉末制剂饮食喂养的Tg2576小鼠和野生型对照小鼠之间没有明显的区别。此外，显然杜氏藻属藻类粉末制剂饮食改善了Tg2576小鼠在常规饮食中观察到的体重增加。

实例2

使用杜氏藻属藻类粉末制剂喂养的小鼠的运动性活动、焦虑和探索性行为

在本例和后续的实例中，使用行为测试来研究杜氏藻属藻类粉末制剂饮食对阿尔茨海默病(AD)小鼠模型认知功能的影响。首先，用开放性场地测试来研究与对照组小鼠相比，用杜氏藻属藻类粉末制剂饮食喂养的野生型和Tg2576小鼠的一般运动器活动、焦虑和探索行为的情况。

如图2A和图2B所示，在这个行为模型中，杜氏藻属藻类粉末制剂饮食对"总路径"和"使用细胞的百分比"特性没有明显影响。然而，如图2C和图2D所示，对"移动时间百分比"(图2C)和"总中心"(图2D)有明显影响。与野生型小鼠相比，Tg2576小鼠的路径更长，但在竞技场中心的时间更少，这表明焦虑感更强。如图2C所示，在以杜氏藻属藻类粉末制剂饮食喂养的Tg2576小鼠(Tg Duna.Prep.)中，移动时间的百分比(表示焦虑和一般活动)与野生型小鼠大致相同。此外，尽管Tg Duna.Prep.小鼠在竞技场中心的时间低于野生型小鼠。Prep.小鼠在竞技场中心的时间低于野生型小鼠，如图2D所示，该分数高于Tg对照小鼠的分数。

实例3

以杜氏藻属藻类粉末制剂喂食的小鼠对新环境的探索意愿

在这个实例中，使用了Y型迷宫测试。为了测量小鼠(Tg2576)探索新环境的意愿和评估空间工作记忆，计算了连续进入Y型迷宫所有三臂的交替百分比。从图3可以看出，杜氏藻属藻类粉末制剂饮食并不影响两种类型小鼠的探索性和空间工作记忆。

实例4

用杜氏藻属藻类粉末制剂喂养的小鼠的空间学习和记忆

接下来通过巴恩斯迷宫测量空间学习和记忆。与阿尔茨海默氏症样小鼠模型(Tg2576)相比，预计野生型小鼠的潜伏期短。如图4所示，这个正在进行的实验的初步结果(n＝6-10)显示，在训练期后的第1天和第7天，与野生型小鼠相比，Tg2576对照小鼠的潜伏期更长。杜氏藻属藻类粉末制剂组的潜伏期较短，表明杜氏藻属藻类粉末制剂饮食改善了Tg2576小鼠的认知功能；在第7天，这种改善具有统计学意义(p<0.05)，且在第1天，潜伏期有缩短的趋势。有趣的是，在野生型杜氏藻属藻类粉末制剂组也发现了潜伏期降低的趋势。制剂组与野生型对照组相比，潜伏期有降低的趋势。

上述结果指示，杜氏藻属藻类粉末制剂改善了长期记忆，这一点在用本发明的杜氏藻属藻类制剂处理的Tg2576小鼠身上得到了证明。

实例5

9-顺式β-胡萝卜素穿过血脑屏障

为了到达大脑，β-胡萝卜素必须穿过血脑屏障(BBB)。一旦从食物中摄取，β-胡萝卜素就会被乳糜微粒和低密度脂蛋白(LDL)带入血流。

使用上述的"血脑屏障体外模型"和图5A、5B、5C所示的示意图，将胶质细胞和内皮细胞在LDL(本身含有全反式和9顺式β-胡萝卜素)的存在下培养24小时，然后收集样品，提取类胡萝卜素并使用HPLC进行分析。

如图6B所示，9-顺式β胡萝卜素以及全反式β胡萝卜素穿过了血脑屏障。如图6A所示，另一方面，番茄红素显然没有穿过血脑屏障，意味着所述模型的选择性。

此外，上述的"血脑屏障体外模型"也被用于评估从健康志愿者中提取的LDL中的胡萝卜素穿越血脑屏障的情况，这些志愿者被施以本文所述的杜氏藻属藻类饮食。

实例6

杜氏藻属的9-顺式β胡萝卜素穿过血脑屏障并在大脑和外周组织中积累

为了评估与对照组相比，用杜氏藻属饮食喂养的Tg2576小鼠的脑组织中类胡萝卜素水平是否更高，小鼠脑部类胡萝卜素被提取出来，然后用HPLC测定。如图7所示，在对照组饮食中，9-顺式β胡萝卜素的组织水平可以忽略不计，而在喂食杜氏藻属饮食的小鼠中，全反式和9-顺式β胡萝卜素的水平都高得多。特别是，在杜氏藻属饮食组的大脑中，类胡萝卜素水平明显高于对照组(图7C)。结果意味，暴露在富含类胡萝卜素的饮食中会导致其在身体组织中的积累，特别是肝脏(图7A)、脂肪(图7B)，包括大脑(图7C)，因此可能是大脑类胡萝卜素的来源，而这又可能是大脑类视黄醇的来源。

实例7

用杜氏藻属藻类粉末制剂喂养的Tg2576小鼠的不溶性和可溶性淀粉样β水平

AD的主要组织学特征之一是神经性斑块(淀粉样β，β-amyloids)。如上文所详述，视黄醇和β-胡萝卜素可能会抑制淀粉样β的形成曾被提出。发明人接下来研究了杜氏藻属藻类粉末制剂饮食对被测Tg2576小鼠海马体中Aβ肽水平(不溶性和可溶性)的影响。为了定量评估海马体中Aβ肽的形成，如上所述，用三明治艾利莎(ELISA)法测定总Aβ1-42。

如图8A所展示，用杜氏藻属藻类粉末制剂(Tg2576 Duna.Prep.)喂养的Tg2576小鼠的不溶性β-淀粉样蛋白水平比对照组(用常规饮食喂养)明显减少(p＝0.02)。如图8B所示，对可溶性β-淀粉样蛋白部分也有类似的效果。

实例8

用杜氏藻属藻类粉末制剂饮食喂养的Tg2576小鼠的基因表达分析

在不希望受到理论约束的情况下，本文所述的治疗方法可能通过三种可能的(假设的)途径影响阿尔茨海默病：通过ACB转运体和脂质、血脑屏障、可塑性和炎症。

因此，RXR和下游基因，即apoE、ABCA1和ABCG1的表达在喂食富含杜氏藻属藻类粉末制剂的饮食或对照饮食的动物的海马体中进行了评估，此外，上述基因的表达在体外，在海马体神经元培养中进行了测定。提取总RNA并通过RT-PCR进行分析。蛋白质表达的分析是通过定量西方印迹法测定的。

具体来说，在参与上述详细检测的Tg2576小鼠的海马体上进行了NanoString基因表达分析。只有符合上述方法部分规定的阈值标准的基因表达值才被认为是有统计学意义的。受本文详述的处理方法影响明显的基因表达水平是：Il-1α(比率1.4，P值＝0.01)(图9A)，Il-1β(比率0.54，P值＝0.04)(图9B)和TSPO(比率0.69，P值＝0.04)(图9C)。这三个都是炎症性基因。结果表明，如图9所示，杜氏藻属藻类粉末制剂饮食对AD背景下的神经炎症可能有好处。其他参与炎症的基因，其表达水平较高的是IL-6(约1.3)和MCP1(约1.5)。

实例9

TSPO蛋白水平

上面的基因表达结果表明，观察到的杜氏藻属藻类饮食的积极影响可能涉及炎症基因，在此基础上，研究了杜氏藻属藻类粉末制剂对TSPO蛋白表达的影响，其上调被认为是小胶质细胞激活的标志。为了评估TSPO蛋白水平，用西方印迹分析对Tg2576小鼠海马的蛋白提取物进行了量化(图10)。与管蛋白的归一化印迹显示，经治疗的小鼠TSPO水平明显下降(p＝0.01)，与Tg2576对照小鼠相比下降了25％，这表明杜氏藻属藻类粉末制剂具有抗炎作用。

实例10

用杜氏藻属藻类粉末制剂喂养的小鼠血浆中的胆固醇和甘油三酯水平

为了研究杜氏藻属藻类粉末制剂对Tg2576小鼠模型动物血浆胆固醇和甘油三酯的影响，测量了空腹血浆脂质水平。如图11所示，杜氏藻属饮食显着(p＝0.02)降低了接受治疗的野生型小鼠的血浆胆固醇水平，但不影响其中的甘油三酯水平。相反，在Tg2576处理的小鼠中，对胆固醇水平没有影响，但是杜氏藻属饮食对甘油三酯水平有影响(p＝0.07)。

综合来说，上述结果指示，饮食中的9-顺式β-胡萝卜素可以穿过血脑屏障，并可能通过酶的活性(如BCMO1酶)在脑细胞内转化为类视黄醇。图12显示了饮食中9-顺式β-胡萝卜素的拟议作用机制示意图。在不希望被理论束缚的情况下，类视黄醇水平的提高会加强对Aβ的清除，从而改善认知功能。本文所述的杜氏藻属藻类制剂可能是9-顺式β-胡萝卜素及其他异构体或物质的可用丰富来源。

实例11

使用杜氏藻属藻类粉末制剂喂养的5XFAD小鼠的大脑和周围组织中的β-胡萝卜素

接下来，杜氏藻属藻类粉末制剂对5XFAD小鼠模型的影响进行了研究。在第一个实验中，对喂食杜氏藻属藻类粉末制剂的5XFAD小鼠的脑提取物进行了检测，结果显示9-顺式β胡萝卜素和全反式β胡萝卜素穿过血脑屏障，如图13所示。如图13B所示，与普通饮食喂养的小鼠脑组织中上述β胡萝卜素异构体的含量相比，上述杜氏藻属藻类饮食喂养的小鼠脑组织中9-顺式β胡萝卜素和全反式β胡萝卜素的含量明显更高(图13A)。

此外，与为Tg2576模型进行的实验类似，类胡萝卜素被证明可以穿过血脑屏障，并在喂养杜氏藻属藻类粉末制剂的动物中以更高的水平积累。如图14所示，这些结果意味，与对照组相比，来自杜氏藻属藻类的全反式和9顺式β胡萝卜素穿过血脑屏障并在肝脏、脂肪和脑组织中积累(图14A、14B、14C，分别地)，在杜氏藻属饮食组的水平高得多。此外，所述模型中的类胡萝卜素水平与Tg2576小鼠模型中的水平相似。

在不希望被理论束缚的情况下，由于β-胡萝卜素在体外和体内都能穿过血脑屏障，它可以成为大脑中类视黄醇的局部生产来源。

实例12

用杜氏藻属饮食喂养的5XFAD小鼠血浆中的胆固醇和甘油三酯水平

为了研究杜氏藻属饮食对血浆胆固醇和甘油三酯的影响，如上述方法部分所述，测量空腹血浆脂质水平。如图15所示，杜氏藻属饮食明显降低了杜氏藻属饮食喂养的5xFAD小鼠的血浆胆固醇水平(p＝0.04)，但并不影响这些动物的甘油三酯水平。在野生型小鼠中，杜氏藻属饮食既不影响胆固醇也不影响甘油三酯。

实例13

用杜氏藻属藻类粉末制剂喂养的5XFAD小鼠的新物体识别

在本文所述的测试中，向小鼠展示两个相同的物体5分钟，3小时后(用于短期记忆)和24小时后，其中一个物体被不同的物体取代(用于长期记忆)。探索新物体的时间长度提供了一个识别记忆的指数。如上所述，所述测试是在用杜氏藻属藻类粉末制剂喂养的5XFAD小鼠中进行的，目的是探索杜氏藻属食物对记忆的影响。

如图16A所示，杜氏藻属藻类粉末制剂饮食改善了5XFAD小鼠的短期记忆，这可以从喂食杜氏藻属藻类粉末制剂饮食的5XFAD小鼠的新物体识别比例较高(5XFADDuna.Prep.)推断出来。

此外，如图16B所示，杜氏藻属藻类粉末制剂饮食也改善了5XFAD小鼠的长期记忆。

如图16C所示，用杜氏藻属藻类粉末制剂(Duna.Prep.)饮食喂养的5XFAD小鼠表现出改善长期记忆的积极趋势(P＝0.051)。

实例14

杜氏藻属藻类粉末制剂对空间工作记忆的影响

为了研究5xFAD小鼠的空间工作记忆，采用了Y型迷宫测试，并测量了小鼠探索新区域的先天偏好。具有正常认知能力的小鼠预计会在新的手臂上花费更多的时间。如图17所示，与对照组(平均PI＝-0.18±0.07)相比，喂食杜氏藻属藻类粉末制剂的5xFAD小鼠表现出明显的(p＝0.009)短期记忆改善(平均PI＝0.09±0.05)。

实例15

杜氏藻属藻类粉末制剂对长期记忆的影响

为了研究小鼠的长期记忆，采用了巴恩斯迷宫测试，如上面方法部分所阐述的。如图18所示，在实验的第1天和第7天，5xFAD对照组小鼠的潜伏期与喂食杜氏藻属藻类粉末制剂的5xFAD相比都更长。在实验第7天的第二次回忆测试中，与5xFAD对照组(114±15秒)相比，喂食杜氏藻属藻类粉末制剂的小鼠(61±16秒)显示出改善长期记忆的积极趋势(p＝0.051)。

实例16

杜氏藻属藻类粉末制剂对小鼠大脑海马体淀粉样蛋白β水平的影响

如上文方法部分所述，从5xFAD小鼠海马中提取淀粉样蛋白β，以评估其水平，并考察杜氏藻属藻类粉末制剂的可能影响。图19显示的结果显示，尽管对杜氏藻属藻类粉末制剂对不溶性Aβ没有影响(p＝0.5)，如图19A所示，但与对照组小鼠(3.4±0.4)相比，接受9CBC的小鼠的可溶性Aβ水平(1.7±0.2)有明显下降(p＝0.03)，如图19B。

Claims (34)

1.一种方法，用于预防、治疗、改善、减少或推迟有需要的受试者的一神经退行性疾病、与蛋白质错误折叠关联的一疾病、认知能力下降以及与此关联的任何条件或症状中的至少一者的发作，其特征在于：所述方法包括向所述受试者施用一有效量的至少一杜氏藻属藻类制剂或包含其的任何组成物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法导致有需要的受试者的与一神经退行性疾病、与蛋白质错误折叠关联的一疾病及认知能力下降中的至少一者关联的至少一条件或症状的改善或减少。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述条件或症状是短期记忆损伤、长期记忆损伤、受损的认知功能、受损的学习功能、β-淀粉样蛋白沉积、焦虑、抑郁或其任何组合中的至少一者。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于：所述方法导致有需要的受试者的认知功能、短期记忆、长期记忆及β-淀粉样蛋白的获取时间和清除率中的至少一者的改善。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于：所述神经退行性疾病是阿尔茨海默病、帕金森病、轻度认知障碍、伴有轻度认知障碍的帕金森病、亨廷顿病、路易体病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、朊病毒病、运动神经元病、脊髓小脑共济失调、脊髓性肌肉萎缩、弗里德里希共济失调及任何其他与神经退行性有关的痴呆或共济失调中的至少一者。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述神经退行性疾病是阿尔茨海默病。

7.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于：用于预防、治疗、改善、减少或推迟认知能力下降的所述发作。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于：所述杜氏藻属藻类是巴氏杜氏藻。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于：所述杜氏藻属藻类制剂是口服地施用。

10.至少一种杜氏藻属藻类制剂或包含其的任何组成物的用途，其特征在于：用于预防、治疗、改善、减少或推迟有需要的受试者的一神经退行性疾病、与蛋白质错误折叠关联的一疾病、认知能力下降以及与此关联的任何条件或症状中的至少一者的发作的方法。

11.根据权利要求10所述的至少一种杜氏藻属藻类制剂或包含其的任何组成物的用途，其特征在于：所述方法导致有需要的受试者的与一神经退行性疾病、与蛋白质错误折叠关联的一疾病及认知能力下降中的至少一者关联的至少一症状的改善或减少。

12.根据权利要求11所述的至少一种杜氏藻属藻类制剂或包含其的任何组成物的用途，其特征在于：所述症状是短期记忆损伤、长期记忆损伤、受损的认知功能、受损的学习功能、β-淀粉样蛋白沉积、焦虑、抑郁或其任何组合中的至少一者。

13.根据权利要求10至12中任一项所述的至少一种杜氏藻属藻类制剂或包含其的任何组成物的用途，其特征在于：所述方法导致有需要的受试者的认知功能、短期记忆、长期记忆及β-淀粉样蛋白的获取时间和清除率中的至少一者的改善。

14.根据权利要求10至13中任一项所述的至少一种杜氏藻属藻类制剂或包含其的任何组成物的用途，其特征在于：所述神经退行性疾病是阿尔茨海默病、帕金森病、轻度认知障碍、伴有轻度认知障碍的帕金森病、亨廷顿病、路易体病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、朊病毒病、运动神经元病、脊髓小脑共济失调、脊髓性肌肉萎缩、弗里德里希共济失调及任何其他与神经退行性有关的痴呆或共济失调中的至少一者。

15.根据权利要求14所述的至少一种杜氏藻属藻类制剂或包含其的任何组成物的用途，其特征在于：所述神经退行性疾病是阿尔茨海默病。

16.根据权利要求10至13中任一项所述的至少一种杜氏藻属藻类制剂或包含其的任何组成物的用途，其特征在于：用于预防、治疗、改善、减少或推迟认知能力下降的所述发作。

17.根据权利要求10至16中任一项所述的至少一种杜氏藻属藻类制剂或包含其的任何组成物的用途，其特征在于：所述杜氏藻属藻类是巴氏杜氏藻。

18.根据权利要求10至17中任一项所述的至少一种杜氏藻属藻类制剂或包含其的任何组成物的用途，其特征在于：所述杜氏藻属藻类制剂是口服地施用。

19.一种方法，用于改善有需要的受试者的短期记忆损伤、长期记忆损伤、受损的认知功能、受损的学习功能、β-淀粉样蛋白沉积中的至少一者，其特征在于：所述方法包括向所述受试者施用一有效量的至少一杜氏藻属藻类制剂或包含其的任何组成物。

20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于：所述杜氏藻属藻类制剂或其任何组成物改善患有一神经退行性疾病的受试者的认知功能、短期记忆、长期记忆及β-淀粉样蛋白的获取时间和清除率中的至少一者。

21.根据权利要求19至20中任一项所述的方法，其特征在于：所述神经退行性疾病是阿尔茨海默病、帕金森病、轻度认知障碍、伴有轻度认知障碍的帕金森病、亨廷顿病、路易体病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、朊病毒病、运动神经元病、脊髓小脑共济失调、脊髓性肌肉萎缩、弗里德里希共济失调及任何其他与神经退行性有关的痴呆或共济失调中的至少一者。

22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于：所述神经退行性疾病是阿尔茨海默病。

23.根据权利要求19至22中任一项所述的方法，其特征在于：所述杜氏藻属藻类是巴氏杜氏藻。

24.根据权利要求19至23中任一项所述的方法，其特征在于：所述杜氏藻属藻类制剂是口服地施用。

25.至少一种杜氏藻属藻类制剂或包含其的任何组成物的用途，其特征在于：用于改善有需要的受试者的短期记忆损伤、长期记忆损伤、受损的认知功能、受损的学习功能、β-淀粉样蛋白沉积中的至少一者的方法。

26.至少一种杜氏藻属藻类制剂的用法，其特征在于：用于一组成物的制造，所述组成物用于预防、治疗、改善、减少或推迟有需要的受试者的一神经退行性疾病、与蛋白质错误折叠关联的一疾病、认知能力下降以及与此关联的任何条件或症状中的至少一者的发作。

27.根据权利要求26所述的用法，其特征在于：所述组成物改善或减少有需要的受试者的与一神经退行性疾病、与蛋白质错误折叠关联的一疾病及认知能力下降中的至少一者关联的至少一症状。

28.根据权利要求27所述的用法，其特征在于：所述症状是短期记忆损伤、长期记忆损伤、受损的认知功能、受损的学习功能、β-淀粉样蛋白沉积、焦虑、抑郁或其任何组合中的至少一者。

29.根据权利要求26至28中任一项所述的用法，其特征在于：所述组成物改善有需要的受试者的认知功能、短期记忆、长期记忆及β-淀粉样蛋白的获取时间和清除率中的至少一者。

30.根据权利要求26至29中任一项所述的用法，其特征在于：所述神经退行性疾病是阿尔茨海默病、帕金森病、轻度认知障碍、伴有轻度认知障碍的帕金森病、亨廷顿病、路易体病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、朊病毒病、运动神经元病、脊髓小脑共济失调、脊髓性肌肉萎缩、弗里德里希共济失调及任何其他与神经退行性有关的痴呆或共济失调中的至少一者。

31.根据权利要求30所述的用法，其特征在于：所述神经退行性疾病是阿尔茨海默病。

32.根据权利要求26至31中任一项所述的用法，其特征在于：用于预防、治疗、改善、减少或推迟认知能力下降的所述发作。

33.根据权利要求26至32中任一项所述的用法，其特征在于：所述杜氏藻属藻类是巴氏杜氏藻。

34.根据权利要求26至33中任一项所述的用法，其特征在于：所述杜氏藻属藻类制剂是口服地施用。

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