CN113874525A - 使用无细胞信使rna的骨髓表征 - Google Patents

Abstract

本文描述了用于监测受试者骨髓的疾病状态的方法和系统。进一步地，本文公开了用于监测受试者器官的治疗状态的方法和系统。此外，本文公开了用于监测受试者骨髓的健康状态和测定活性剂的方法和系统。

Description

使用无细胞信使RNA的骨髓表征

交叉引用

本申请要求2018年10月29日提交的美国临时申请第62/752,155 号和2019年3月14日提交的美国临时专利申请第62/818,603号的权益，每件所述美国临时专利申请的全部内容通过援引并入本文。

援引并入

本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文，就好像每件单独的出版物、专利或专利申请被明确地并单独地指出通过援引并入一样。在通过援引并入的出版物和专利或专利申请与本说明书中包含的公开内容相抵触的程度上，本说明书旨在取代和 /或优先于任何此类相抵触的材料。

背景技术

血液是一种液体结缔组织，它灌溉所有器官，为身体细胞提供氧气和营养，同时收集它们的废物，包括脂质、蛋白质和核酸。这些循环生物分子包含与特定器官健康相关的信息。虽然研究集中在循环蛋白质和脂质上，但循环无细胞DNA(cfDNA)也已成为诊断和监测健康和疾病的非侵入性工具。例如，cfDNA已被用于产前诊断、移植排斥和癌症监测。尽管取得了这些进展，但cfDNA检测的价值通常局限于以遗传差异为特征的生理和疾病情况(即，妊娠、移植或肿瘤)。对于基于RNA的非侵入性生物标志物，包括miRNA和lncRNA的非编码RNA已在多种疾病中得到研究。

发明内容

在一个方面，本文提供了用于监测受试者骨髓的疾病状态的方法。该方法包括从患有疾病状态的受试者获得生物样本；以及检测从与第一多个基因相对应的驻留或源自骨髓的多个细胞衍生的第一多个无细胞mRNA(cf-mRNA)的cf-mRNA水平。

在一些实施方案中，生物样本包括血液样本。在一些实施方案中，血液样本包括血清样本、血浆样本或血沉棕黄层样本。

在一些实施方案中，疾病状态包括多发性骨髓瘤(MM)、白血病、骨髓增生性赘生物、骨髓增生异常综合征、淋巴瘤、血小板增多症、骨髓纤维化、真性红细胞增多症或贫血。在一些实施方案中，疾病状态包括MM。在一些实施方案中，当疾病状态包括MM时，第一多个基因包括IGHG1、IGHA1、IGKC、IGHV1、IGHV2、IGHV3、 IGHV4、IGHV5、IGHV6、IGHV7、IGHV8、IGHV9、IGHV10、IGHV11、 IGHV12、IGHV13、IGHV14、IGHV15、IGHV16、IGHV17、IGHV18、IGHV19、IGHV20、IGHV21、IGHV22、IGHV23、IGHV24、IGHV25、 IGHV26、IGHV27、IGHV28、IGHV29、IGHV30、IGHV31、IGHV32、 IGHV33、IGHV34、IGHV35、IGHV36、IGHV37、IGHV38、IGHV39、 IGHV40、IGHV41、IGHV42、IGHV43、IGHV44、IGHV45、IGHV46、 IGHV47、IGHV48、IGHV49、IGHV50、IGHV51、IGHV52、IGHV53、 IGHV54、IGHV55、IGHV56、IGHV57、IGHV58、IGHV59、IGHV60、 IGHV61、IGHV62、IGHV63、IGHV64、IGHV65、IGHV66、IGHV67、 IGHV68、IGHV69、IGKV2、IGKV3、IGKV4、IGKV5、IGKV6、IGKV7、 IGKV8、IGKV9、IGKV10、IGKV11、IGKV12、IGKV13、IGKV14、 IGKV15、IGKV16、IGKV17、IGKV18、IGKV19、IGKV20、IGKV21、 IGKV22、IGKV23、IGKV24、IGL1、IGLV 1-40或其组合。在一些实施方案中，疾病状态包括急性髓系细胞白血病(AML)。

在一些实施方案中，检测还包括将cf-mRNA转化为cDNA。在一些实施方案中，该方法还包括通过进行测序、阵列杂交或核酸扩增中的一种或多种来测量cDNA。

在一些实施方案中，该方法还包括提供治疗。在一些实施方案中，治疗包括电离辐射、美法仑介导的骨髓消融、白消安介导的骨髓消融、苏消安介导的消融、化学疗法介导的消融、同种异体移植、自体移植、生长因子刺激、自体或异源CAR-T细胞疗法、或其任何组合。在一些实施方案中，用生长因子刺激包括用促红细胞生成素(EPO)刺激。在一些实施方案中，用生长因子刺激包括用粒细胞集落刺激因子 (G-CSF)刺激。

在另一方面，本文公开了用于监测受试者器官的治疗状态的方法。该方法包括从具有治疗状态的受试者获得血浆样本；以及检测衍生自受试者器官的对应于第二多个基因的第二多个无细胞mRNA (cf-mRNA)的cf-mRNA水平。

在一些实施方案中，器官是骨髓。在一些实施方案中，生物样本包括血液样本。在一些实施方案中，血液样本包括血清、血浆样本或血沉棕黄层样本。

在一些实施方案中，治疗状态包括骨髓消融、骨髓重建、骨髓移植、用生长因子刺激、免疫疗法、免疫调节、泛素连接酶活性的调节、皮质类固醇、放射疗法或自体或异源CAR-T细胞疗法。在一些实施方案中，泛素连接酶活性的调节包括施用泛素连接酶抑制剂。在一些实施方案中，骨髓消融包括物理消融、化学消融或其组合。在一些实施方案中，物理消融包括电离辐射。

在一些实施方案中，化学消融包括美法仑介导的骨髓消融、白消安介导的骨髓消融、苏消安介导的消融、化学疗法介导的消融或其组合。在一些实施方案中，骨髓移植包括同种异体移植。在一些实施方案中，骨髓移植包括自体移植。在一些实施方案中，用生长因子刺激包括用促红细胞生成素(EPO)刺激。在一些实施方案中，用生长因子刺激包括用粒细胞集落刺激因子(G-CSF)刺激。

在一些实施方案中，当治疗包括骨髓消融时，对应于第二多个基因的第二多个cf-mRNA的水平降低，并且第二多个基因包含红细胞特异性基因。

在一些实施方案中，当治疗包括骨髓重建时，与在骨髓消融期间此类cf-mRNA水平相比，对应于第二多个基因的第二多个cf-mRNA 的水平增加，并且第二多个基因包括红细胞特异性基因。在一些实施方案中，红细胞特异性基因包含来自下组的一种或多种基因：GATA1、 SLC4A1、TF、AVP、RUNDC3A、SOX6、TSPO2、HBZ、TMCC2、 SELENBP1、ALAS2、EPB42、GYPA、C17orf99、HBA2、RHCE、 HBG2、TRIM10、HBA1、HBM、HBG1、UCA1、GYPB、CTD-3154N5.2 和Ac104389.1。

在一些实施方案中，当治疗包括骨髓重建时，对应于第二多个基因的第二多个cf-mRNA的水平增加，并且第二多个基因包括巨核细胞特异性基因。在一些实施方案中，巨核细胞特异性基因包含来自下组的一种或多种基因：ITGA2B、RAB27B、GUCY1B3、GP6、HGD、 PF4、CLEC1B、CMTM5、GP9、SELP、DNM3、LY6G6F、LY6G6D、 XXbac-BPG3213.19和RP11-879F14.2。

在一些实施方案中，当治疗包括骨髓消融时，对应于第二多个基因的第二多个cf-mRNA的水平降低，并且第二多个基因包含嗜中性粒细胞特异性基因。

在一些实施方案中，当治疗包括骨髓移植时，与在骨髓消融期间此类cf-mRNA水平相比，对应于第二多个基因的第二多个cf-mRNA 的水平增加，并且第二多个基因包括嗜中性粒细胞特异性基因。

在一些实施方案中，当治疗包括骨髓重建时，与在骨髓重建期间此类cf-mRNA水平相比，对应于第二多个基因的第二多个cf-mRNA 的水平增加，并且第二多个基因包括嗜中性粒细胞特异性基因。在一些实施方案中，嗜中性粒细胞特异性基因包括祖-嗜中性粒细胞特异性基因。在一些实施方案中，祖-嗜中性粒细胞特异性基因包括CTSG、 ELANE、AZU1、PRTN3、MMP8、RNASE、PGLYRP1或其组合。在一些实施方案中，检测到的与祖-嗜中性粒细胞特异性基因对应的 cf-mRNA比血液样本中的多个嗜中性粒细胞出现得更早。

在一些实施方案中，当治疗包括同种异体移植时，检测对应于第二多个基因的第二多个cf-mRNA的水平，并且第二多个基因包含来自供体细胞的祖-嗜中性粒细胞特异性基因。

在一些实施方案中，当治疗包括用G-CSF模拟时，检测对应于第二多个基因的第二多个cf-mRNA的水平，并且第二多个基因包含嗜中性粒细胞特异性基因。在一些实施方案中，嗜中性粒细胞特异性基因包含来自下组的一种或多种基因：PGLYRP1、LTF、ATP2C2、VNN3、 CRISP3、CTSG、OLFM4、KRT23、MMP8、ARG1、EPX、PI3、CRISP2、 STEAP4、LCN2、PRG3、KCNJ15、ALPL、FCGR38、S100A12、PROK2、 CXCR1、CAMP、RNASE3、CEACAM3、AZU1、ABCA13、CXCR2、 CTD-3088G3.8、PRTN3、ELAINE、CD177、LINC00671、ORM2、 ORM1、HP和RP11-678G14.4。

在另一方面，本文公开了用于监测受试者骨髓的健康状态的方法。该方法包括从具有健康状态的受试者获得生物样本；以及检测对应于第三多个基因的衍生自受试者骨髓及其衍生细胞的第三多个无细胞mRNA(cf-mRNA)的cf-mRNA水平。

在一些实施方案中，第三多个基因包含约至少45％、55％、65％或75％的衍生自骨髓及其衍生细胞的基因。在一些实施方案中，第三多个基因包含来自表7的一种或多种基因。在一些实施方案中，与对应于成熟嗜中性粒细胞特异性基因的cf-mRNA水平相比，对应于祖- 嗜中性粒细胞特异性基因的第三多个cf-mRNA的水平增加。

在一些实施方案中，生物样本包括血液样本。在一些实施方案中，血液样本包括血清样本、血浆样本或血沉棕黄层样本。在一些实施方案中，检测还包括将cf-mRNA转化为cDNA。在一些实施方案中，该方法还包括通过进行测序、阵列杂交或核酸扩增中的一种或多种来测量cDNA。

在另一方面，本文公开了用于测定活性剂的方法。该方法包括在第一时间点评估受试者的第一无细胞表达谱；向受试者施用活性剂；以及在第二时间点评估受试者的第二无细胞表达谱。

在一些实施方案中，第一或第二无细胞表达谱是骨髓特异性的。在一些实施方案中，该方法还包括将第一无细胞表达谱与第二无细胞表达谱比较。

在一些实施方案中，第一表达谱和第二表达谱之间的差异表明治疗的效果。在一些实施方案中，活性剂包括用于治疗疾病的药物化合物。

在一些实施方案中，该方法还包括在第三时间点评估受试者的第三无细胞表达谱。在一些实施方案中，评估包括测序、阵列杂交或核酸扩增中的一种或多种。在一些实施方案中，该方法还包括在额外的时间点评估受试者的额外的无细胞表达谱。

在一些实施方案中，第二时间点是第一时间点之后的一至四个星期。在一些实施方案中，该方法还包括在12至24个月时间段内评估额外的无细胞表达时间点。在一些实施方案中，该时期段为约18个月。

在一些实施方案中，该方法还包括跟踪和/或检测一种或多种无细胞表达谱以测量用于治疗和/或药物发现和/或开发的一种或多种感兴趣的靶标。在一些实施方案中，该方法还包括在治疗和/或药物发现和开发期间测量用于先导物优化和/或临床开发的药效学。

在一些实施方案中，该方法还包括创建基因表达谱以表征与用于治疗和/或药物发现和/或开发的特定靶标的接合相关的一种或多种药效学效应。在一些实施方案中，该方法还包括检测用于治疗和/或药物发现和开发的药效学靶标接合的变化。

附图说明

本公开的新颖特征在所附权利要求书中具体地阐述。通过参考以下详细描述和附图将获得对本公开的特征和优点的更好理解，所述详细描述阐述了其中利用本公开的原理的说明性实施方案，在附图中：

图1A-1G显示，与循环血细胞相比，cf-mRNA转录组富含来自骨髓的未成熟造血转录本；图1A的左小图显示来自健康受试者的 cf-mRNA转录组和全血转录组通过使用非负矩阵分解和使用公共数据库估计的组织贡献进行分解。对24名正常供体的Cf-mRNA进行测序，并从青少年慢性疲劳综合征中的全血基因表达获得来自19名健康个体的全血RNA-Seq数据：一项探索性横向研究表明改变的B细胞分化和存活。J Transl Med.2017；15(1):102(全文并入本文)。显示了每个样本的指定细胞类型/组织的估计贡献。右小图显示了每种生物流体(24个cf-mRNA和19个全血液样本品)的平均值。图1B显示在来自健康个体的3配对血浆和全血样本中进行RNA-seq。在 cf-mRNA和全血之间比较所有3个供体的指定细胞类型特异性转录本的水平。展示了3个个体之间的平均倍数变化(cf-mRNA/全血)(对数标度)(p值，Wilcoxon检验)。左侧的点，祖嗜中性粒细胞转录本。右侧的点，成熟的嗜中性粒细胞转录本。如实施例中解释的那样鉴定细胞类型特异性基因。也参见表7。图1C显示在来自健康个体的5配对血浆和血沉棕黄层样本中进行RNA-seq。比较血浆和匹配的血沉棕黄层样本中成熟嗜中性粒细胞转录本和祖嗜中性粒细胞转录本的水平。显示了五个配对样本中这些转录本(血浆/血沉棕黄层)的平均倍数变化(对数标度)。p值，Wilcoxon检验。图1D-1E显示箱线图，比较通过RNA-Seq测量(n＝5，p值：Wilcoxon检验)的配对的血沉棕黄层和cf-mRNA样本中的指示的转录本的归一化水平 (TPM)，表明cf-mRNA富含未成熟(PRTN3)造血转录本(E)并且已耗尽成熟转录本(CXCR2,D)。方框表示中位数、第25和第75 个五分位数，且晶须扩展到1.5倍四分位数范围(IQR)。图1F显示散点图，比较BM特异性基因(实线圆圈中)和外周血特异性基因(虚线圆圈中)的匹配cf-mRNA(Y轴)和全血(X轴)中的水平，其形成两个不同的群体(p<0.001)，并且其中骨髓特异性基因在cf-mRNA 部分中富集(也参见图6A-6F)。图1G显示图1A中列出的转录本的部分。

图2A-2D显示cf-mRNA转录组捕获衍生自多发性骨髓瘤患者的 BM的Ig转录本。图2A显示在BM消融之前(第2天)，通过RNA-Seq 分析来自多发性骨髓瘤患者的匹配的cf-mRNA和血沉棕黄层样本。显示了来自血浆和血沉棕黄层样本中鉴定的免疫球蛋白重链和轻链的可变区的转录本的部分(中小图和右小图)。克隆扩增的转录本显示在图案化部分中，并在MM患者的cf-mRNA中占主导地位。健康个体血浆中Ig转录本的水平(左小图)显示为参考。图2B显示在 MM患者中进行的治疗性治疗的示意图。美法仑介导的BM消融在第 2天开始，自体干细胞移植在第0天进行。然后给予类固醇和G-CSF 作为支持性护理。在该研究期间每天收集血液。图2C显示条形图，其显示在整个治疗过程中通过RNA-Seq在配对的血浆和血沉棕黄层样本中检测到的Ig转录本的归一化值(TPM，Y轴)。Ig重链和Igκ轻链的可变区库以彩色梯度显示。指出了在血浆中鉴定的显性转录本。X轴指出了与移植相关的采血日。图2D显示在BM消融和移植期间来自cf-mRNA中可变Ig区的转录本的部分。X轴指出了与移植相关的采血日。分别以标记有IGKV2-24和IGH3-15的实线显示的显性Ig转录本在美法仑介导的BM消融后降低。(也参见图7A-7C)。

图3A-3J显示cf-mRNA反映了在癌症患者中在BM消融和重建期间造血谱系的转录活性。图3A和3B分别显示了对经受BM消融，随后自体或同种异体干细胞移植(在第0天)的多发性骨髓瘤(MM) (A)和急性髓系细胞白血病(AML)(B)患者通过cf-mRNA-Seq 鉴定的时变转录本的热图。每列代表相对于移植时间的时间点，在底部指示。每行代表基因。指出了每簇转录本的富集基因本体术语(调整的p值)。图3C-3H显示在整个研究过程中MM(C、E、G)和AML(D、E、H)患者中红细胞(实线，C、D)、巨核细胞(实线， E、F)和嗜中性粒细胞(实线，G、H)特异性转录本水平的时间进程。表S3中提供了转录本身份。相应的外周血计数绘制在副轴上并用黑色虚线表示(RBC计数，百万/毫升(C、D)，血小板计数，千 /毫升(E、F)和嗜中性粒细胞计数，千/毫升(G、H)。X轴指出了与移植相关的采血日。图3I-3J显示了在整个研究中AML患者1(I) 和2(J)中祖嗜中性粒细胞转录本的相对变化。这些转录本的平均百分比变化用蓝色虚线表示。黑色虚线显示血液中的嗜中性粒细胞计数。在两名患者中，在BM重建过程中，血浆中的祖嗜中性粒细胞转录本回收在嗜中性粒细胞计数之前进行。

图4A-4E显示通过cf-mRNA的遗传差异来监测AML患者的BM 同种异体移植物移植。图4A显示了在3名AML患者的同种异体HSC 移植之前和之后，在cf-mRNA中的ELANE、AZU1和PRTN3嗜中性粒细胞祖转录本中检测到的SNP的参考等位基因的平均频率，显示了移植后新基因谱的植入。图4B和4C显示在AML患者1和2的与 (A)相同的转录本中检测到的SNP的参考等位基因的频率。X轴指示与移植时间相关的采血日。图4D和4E显示移植后在从参考纯合子变为杂合子(D)和从替代纯合子变为参考纯合子(E)的宿主 cf-mRNA中检测到的所有SNP的平均参考等位基因频率。X轴指示采血日，移植发生在第0天。

图5A-5D显示在刺激时cf-mRNA捕获造血谱系的转录活性。图5A显示在用单次EPO剂量治疗之前(第0天)和之后(第3、4天) 从9名患者获得血液。使用RNA-Seq分析cf-mRNA中的基因表达模式。第0天(EPO治疗前)用作每位患者的参考，并计算EPO治疗后红细胞特异性转录本水平的变化。显示了接受EPO治疗的所有9 名患者和2名未治疗的对照中红细胞转录本的平均倍数变化。误差棒代表标准误差(SE)。图5B显示了EPO治疗的患者在30天期间内红细胞转录本的时间进程分析。每条线代表一名患者，并显示在第0 天施用单次EPO给药后(其用作参考)，红细胞转录本随时间的平均倍数变化。标记为成熟的虚线周围的实线显示未受治疗的健康对照中相同转录本的波动。也参见图10。图5C显示从用G-CSF治疗的3 名健康患者(治疗前(第0天)和治疗后第1、4和10天)获得的血液。通过血浆中的RNA-seq分析循环转录组的变化。对于用G-CSF 治疗的代表性患者，显示在整个研究中未成熟的和成熟的嗜中性粒细胞特异性转录本的相对变化。标记为未成熟的虚线和标记为成熟的虚线指示每组转录本的平均值。嗜中性粒细胞计数的相对变化以黑色显示。图5D显示通过cf-mRNA-Seq测量的指示G-CSF应答基因的时间进程。绘图显示相对于第0天随时间的倍数变化。时间点由线连接，每条线代表一个患者。也参见图10。

图6A-6F显示与循环细胞转录组相比，cf-mRNA转录组在骨髓转录本中富集。图6A是全血、血浆和血沉棕黄层组成的示意图。图6B和6C显示比较嗜中性粒细胞特异性转录本和T细胞特异性转录本的外周血(X轴)和cf-mRNA(Y轴)中的水平的散点图。箭头指向嗜中性粒细胞祖转录本，也显示了成熟转录本。x轴和y轴均以log2刻度显示TPM。图6D-6E显示箱线图，比较通过RNA-Seq 在配对的血沉棕黄层和cf-mRNA样本(n＝5；p-值，t-检验)中测量的指示造血祖转录本的归一化水平(TPM)。方框表示中位数、第25 和第75个五分位数，且晶须扩展到1.5倍四分位数范围(IQR)。图 6F显示在3个个体的匹配血浆和全血中比较BM特异性基因(左) 和全血特异性基因(右)的水平。显示这些转录本的平均倍数变化(血浆/全血)。p值，t检验。

图7A-7E显示cf-mRNA包含衍生自多发性骨髓瘤患者的BM中的浆细胞的Ig转录本。图7A-7C显示在经受BM消融(第2天开始) 和自体干细胞移植(第0天)的MM患者的血浆和血沉棕黄层中通过 RNA-Seq测量的Ig转录本的水平。条形图显示在研究期间检测到的 Ig重链恒定区转录本(A)、轻链恒定区转录本(B)和λ轻链可变区转录本(c)的归一化水平(TPM)。X轴指示与移植时间相关的采血日。Ig转录本IGHG1和IGKC在血浆样本中占主导地位，与在该患者的BM活检中进行的分子检测获得的结果相匹配(表7)。图 7D-7E显示MM患者1和患者3的cf-mRNA中随时间的Ig重链和轻链可变链转录本的部分。优势转录本以实线702和实线704显示。显示了相对于移植日的时间。

图8A-8D显示了在经受BM消融和移植的急性髓系细胞白血病 (AML)患者中通过cf-mRNA监测BM造血谱系的转录活性。图 8A-8C显示了AML患者2中红细胞(A)、巨核细胞(B)和嗜中性粒细胞(C)特异性转录本的归一化水平(TPM)的时间进程。相应的外周血计数绘制在每个图的副轴上，并用黑色虚线表示(RBC计数(A)、血小板计数(B)和嗜中性粒细胞计数(C))。X轴指示相对于移植时间(第0天)的采血日。图8D显示AML患者中成熟的和未成熟的嗜中性粒细胞组分的时间进程。嗜中性粒细胞计数以虚线显示。在嗜中性粒细胞计数恢复之前的cf-mRNA天数中检测到未成熟的转录本。X轴指示与移植时间相关的采血日。

图9A-9F显示在BM消融和移植期间通过多发性骨髓瘤患者中的 cf-mRNA谱分析来监测BM转录活性。图9A和9B显示在化疗和BM 重建期间多发性骨髓瘤患者2中红细胞计数(RBC，黑色虚线)和血红蛋白转录本(实线)的时间进程(也参见图3)。X轴指示与移植时间相关的采血日。图9C-9F显示在cf-mRNA和匹配的血沉棕黄层样本中进行RNA-Seq。图表显示两个样本中关键红细胞(C)和巨核细胞转录本(D)以及成熟嗜中性粒细胞特异性转录本(E)和未成熟嗜中性粒细胞特异性转录本(F)相对于基线的倍数变化。在所有小图中，黑线代表相应循环血细胞计数的相对变化：RBC计数(C)、血小板计数(D)和嗜中性粒细胞计数(E、F)。X轴指示与移植时间相关的采血日。

图10A-10C显示EPO治疗后生长因子在cf-mRNA中的谱系特异性基因。图10A显示EPO治疗的患者中关键红细胞发育基因(指示的)相对于基线随时间的倍数变化。总体趋势表明EPO治疗后这些转录本的升高的水平，并在稍后的时间点恢复到基础水平。图10B和10C显示在用G-CSF治疗后患者的cf-mRNA中未成熟的(A)和成熟的(B)嗜中性粒细胞特异性转录本的倍数变化。第0天(治疗前) 用作参考。显示了3名患者的指示的转录本的倍数变化，患者1用虚线表示，患者2用灰色实线表示，患者3用深色实线表示。每个患者的时间点由线连接。X轴指示与治疗时间相关的采血日。

图11显示计算机系统，其被编程或以其他方式配置成测量和分析样本中本文所述的cf-mRNA转录本。

具体实施方式

循环中mRNA转录本存在的潜在生物学过程仍然未知。在cfDNA 的情况下，研究表明其机制是在细胞死亡时被动释放到循环中。相比之下，RNA分子可以从细胞中主动分泌。工作重点是将非编码和较小的RNA分子分泌到外泌体和其他脂质囊泡中。然而，在每个分子的基础上，mRNA可能占这种现象的小部分。

cfDNA技术的进步导致临床上可适用的基于cf-NA的生物标志物的开发。与侵入性组织活检相比，cfDNA可以提供潜在优势；然而， cfDNA分析可能依赖于突变、多态性或结构变异，这可能阻止其在与遗传差异无关的疾病和生理场景中使用。cfDNA甲基化分析已被用作组织特异性基因表达的替代。

尽管已经在本文中示出和描述了本发明的各个实施方案，但是对于本领域技术人员而言显而易见，这些实施方案仅作为实例提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员可以想到许多变化、改变和替换。应当理解，可以采用本文所述的本发明的实施方案的各种替代方案。

除非另外指明，否则本文所用的开放术语，例如“包含(contain)”、“包含(containing)”、“包括(include)”、“包括(including)”等，通常表示包括。

如本文所用，单数形式“一个”(“a”)、“一种”(“an”)和“该” (“the”)通常包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。因此，除非相反说明，否则本申请中提出的数值参数是近似值，其可根据本发明寻求获得的期望性质而变化。

除非另有说明，否则本文中的一些实例考虑了数值范围。当提供数值范围时，除非另有说明，否则该范围包括范围端点。除非另有说明，否则数值范围包括其中的所有值和子范围，就好像明确写出一样。除非另有说明，否则本文的任何数值范围和/或值，跟随或不跟随术语“约”，可以是数值范围和/或值的85-115％(即，加或减15％)。

如本文所用，术语“受试者”通常是指健康的或具有、可能具有或可能被怀疑具有疾病状况的任何个体。疾病状况可以包括器官衰竭，这可能需要器官移植，例如骨髓移植、肝移植、肺移植、心脏移植、面部移植等。受试者可以是动物。动物可以是哺乳动物，例如人、非人灵长类动物、啮齿动物例如小鼠或大鼠、狗、猫、猪、羊或兔。动物可以是鱼、爬行动物或其他。动物可以是新生儿、婴儿、青少年或成年动物。受试者可以是活生物体。受试者可以是人。人的年龄可以大于或等于1、2、5、10、20、30、40、50、60、65、70、75、80或更多岁。人的年龄可为约18至约90岁。人的年龄可为约18至约30 岁。人的年龄可为约30至约50岁。人的年龄可为约50至约90岁。受试者可能是健康的，可能需要监测受试者的器官状态。受试者可能具有病症的一种或多种风险因素并且可以是无症状的。受试者可能是无病症症状的。受试者可能具有病症的一种或多种风险因素。受试者可能是有病症症状的。受试者可能是有病症症状的并且具有该病症的一种或多种风险因素。受试者可能患有或怀疑患有疾病，例如关节炎。受试者可以是正在接受疾病例如关节炎治疗的患者。受试者可能倾向于发生疾病诸如关节炎的风险。受试者可以因对病症的治疗而缓解。治疗可以包括器官移植。

如本文所用，术语“样本”通常是指受试者的任何样本(例如血液样本、尿液样本、汗液样本、精液样本、阴道分泌物样本、无细胞样本、组织样本、肿瘤活检样本、骨髓样本或任何其他类型的生物流体)。基因组数据可以从样本中获得。血液样本可以是全血样本或外周血液样本。血液样本可以是血清样本。血液样本可以是血浆样本。血清和血浆都来自全血的一旦细胞被去除而剩余的液体部分。血清是血液已凝结后残留的液体。血浆是当添加抗凝血剂防止凝血时残留的液体。血液样本可以是血沉棕黄层样本。血沉棕黄层是抗凝结的血液样本的部分，其在全血液样本的密度梯度离心后包含大部分白细胞和血小板。

通常，如本文中可互换使用的，术语“无细胞多核苷酸”和“无细胞核酸”是指无需从细胞中提取多核苷酸即可从样本中分离的多核苷酸。本文公开的无细胞多核苷酸通常是已从健康组织、受损组织、健康器官或受损器官释放或分泌的多核苷酸。在一些情况下，在健康受试者或有病症的受试者中发现衍生自循环细胞和/或特定组织/器官驻留细胞的无细胞信使RNA。例如，对组织或器官的损伤可能是由于疾病、损伤或其他导致细胞溶解的病症，将无细胞多核苷酸从受损组织的细胞中释放到循环中。在一些情况下，本文公开的无细胞多核苷酸是组织特异性的。在其他情况下，无细胞多核苷酸不是组织特异性的。在一些情况下，无细胞多核苷酸存在于细胞中或与细胞接触。在一些情况下，无细胞多核苷酸处于与细胞器、囊泡或外泌体接触。在一些情况下，无细胞多核苷酸是无细胞的，意味着无细胞多核苷酸不与细胞接触。除非另有说明，否则本文所述的无细胞多核苷酸是自由循环的。在一些情况下，无细胞多核苷酸是自由循环的，即无细胞多核苷酸不与任何囊泡、细胞器或细胞接触。在一些情况下，无细胞多核苷酸与多核苷酸结合蛋白(转移酶、核糖体蛋白等)相关，但不与任何其他分子相关。了解循环中mRNA转录本存在的潜在机制可用于解释它们的临床价值。例如，cfDNA已被证明主要源自垂死的细胞；因此，这种“液体活检”的使用依赖于与细胞死亡相关的场景。 cf-mRNA水平的变化可能受到活细胞在成熟、增殖和对刺激的应答过程中的转录变化的影响，而不需要细胞死亡。

如本文所用，术语“标志物”通常包括多种生物分子。标志物在本文中还可称为疾病标志物、疾病的标志物或指示器官状态(例如，移植后器官是否功能正常)的标志物。在一些情况下，标志物用于与多种疾病相关的状况。例如，标志物可以用于炎症，其可能与癌症或移植的器官衰竭有关。标志物，通过非限制性实例包括肽、激素、脂质、维生素、病原体、细胞片段、代谢物和核酸。在一些情况下，标志物是无细胞核酸。在一些情况下，本文公开的标志物不是组织特异性的。然而，在一些情况下，标志物是组织特异性的。本文公开的标志物也可称为疾病和/或病症生物标志物。疾病生物标志物是由于疾病和/或病症而存在或产生的生物分子、由于疾病和/或病症而失调的生物分子、机制地涉及疾病和/或病症的生物分子、在疾病和/或病症状态中突变或修饰的生物分子，或其任何组合。标志物可由受试者产生。标志物也可能由其他物种产生。例如，标志物可以是由肝炎病毒或链球菌属(Streptococcus)细菌产生的核酸或蛋白质。鉴定此类标志物的方法还可以包括检测和/或定量组织特异性多核苷酸以确定哪些组织被这些病原体感染或影响，以及任选地，(多种)组织受损的程度。本文公开的疾病标志物通常不在未感染疾病的个体中循环。

如本文所用，术语“测序”可包括通过合成测序、高通量测序、下一代测序、Maxam-Gilbert测序、大规模平行签名测序、聚合酶克隆测序、454焦磷酸测序、pH测序、桑格测序(链终止)、Illumina测序、SOLiD测序、离子激流半导体测序、DNA纳米球测序、Heliscope 单分子测序、单分子实时(SMRT)测序、纳米孔测序、鸟枪法测序、 RNA测序、Enigma测序、杂交测序、连接测序或其任何组合。测序输出数据可能受到质量控制，包括过滤碱基读数的质量(例如，置信度)。示例性测序系统包括454焦磷酸测序(454Life Sciences)、 Illumina(Solexa)测序、SOLiD(Applied Biosystems)和离子激流系统的pH测序系统。在一些情况下，可以在没有相关标签或标记的情况下对样本的核酸进行测序。在一些情况下，样本的核酸可被测序，其核酸可具有与其相关的标签或标记。

本文公开了与使用组织和/或器官特异性无细胞mRNA (cf-mRNA)转录本来监测健康受试者的器官状态或患有病症的受试者和/或疾病的器官状态相关的方法、系统、数据库和组合物。此外，组织和/或器官特异性无细胞mRNA(cf-mRNA)转录本还可用于在受试者接受针对器官的治疗后监测受试者的器官。Cf-mRNA转录组可以被认为是从所有器官收集的转录本的汇编。由于这些循环转录本中的一些对应于充分表征的组织特异性基因，因此它们可用于监测个体起源组织的健康或状态。事实上，cf-mRNA也可用于反映胎儿发育、预测孕妇早产以及作为癌症生物标志物。

如本文所述，进行了概念验证研究。本公开提供了使用cf-mRNA 分析来监测骨髓(BM)活动的概念验证，这可以导致改善对患有BM 疾病的患者的治疗管理，并减轻对侵入性BM活检的需要。例如，进行了基于下一代测序(NGS)的cf-mRNA全转录组分析。将cf-mRNA 的表达水平与来自血液循环细胞(CC)的表达水平比较，以破译循环转录本的来源并更好地了解它们的潜在临床效用。大多数cf-mRNA 转录本可能是造血起源的。在健康受试者和多发性骨髓瘤患者中， cf-mRNA可以在BM特异性转录本中富集。此外，对经受BM消融和移植的癌症患者的纵向研究表明，cf-mRNA分析可以非侵入性地捕获 BM的时间转录活性。从机制上讲，用生长因子疗法刺激特定BM谱系表明cf-mRNA波动反映了活性谱系特异性转录活性。共同地，本公开提供了对cf-mRNA生物学起源的洞察，表明活细胞可以分泌 cf-mRNA。

此外，与其他非侵入性生物标志物相比，cf-mRNA分析可以提供更广泛的分子信息，并且可以构成非侵入性方法以检查场景中的组织功能，例如监测受试者的疾病和药物反应。例如，美法仑诱导的细胞凋亡并未显著增加cf-mRNA的水平。相比之下，在BM重建期间以及在用众所周知的促生存和抗凋亡生长因子刺激时观察到循环中转录本的大量增加。体外研究表明，细胞外mRNA水平和组成可以在细胞刺激下发生变化，并且活细胞可以分泌嵌入囊泡中的RNA分子。此外，本公开证明循环转录组可以是允许随时间持续测量组织功能的动态实体。这与cfDNA甲基化和突变事件形成对比，其可能动态较低，并且可能提供有关组织稳态的有限信息。

监测受试者的健康状态

cf-mRNA转录组可以提供对遗传信息以及与起源组织及其生理学有关的信息的直接访问。例如，cf-mRNA的基因改变可以为监测同种异体移植物提供信息，类似的方法可以诊断胎儿染色体异常。鉴于循环中的肿瘤衍生转录本已被鉴定，cf-mRNA捕获的遗传信息可能对癌症诊断和监测有利。此外，cf-mRNA可以提供组织特异性转录本，揭示有关起源组织的功能信息。cf-mRNA可以捕获转录本，其可以揭示健康受试者和癌症患者的BM生理机能。因此，cf-mRNA可能整合组织的功能和遗传信息。

非侵入性方法的另一方面可以是通过消除对外科手术组织获取的需要，非侵入性方法可以使得能够随着时间的推移重复评估患者的疾病状态。这在一些临床环境中可能具有重要意义，例如监测癌症患者的治疗，其中感染组织的活检可能仍然是金标准。在这方面，本文讨论的纵向cf-mRNA分析数据可以显示循环转录本捕获组织(例如 BM)中基因表达谱的快照。这可以允许BM消融效率的非侵入性时间描绘、移植物移植的早期检测和BM重建的监测。例如，在多发性骨髓瘤(MM)患者中，cf-mRNA分析可以将BM中恶性浆细胞产生的克隆Ig转录本的时间测量与详细的BM谱系转录活性和新免疫谱的建立相整合。与该恶性肿瘤中常用的其他非侵入性测试(例如MM 患者血清中的克隆抗体检测)相比，cf-mRNA分析揭示的全面图片可以提供额外的相关信息。事实上，鉴于这些抗体的普遍具有挑战性和主观性的定量和表征，BM活检仍然是MM患者治疗管理中的常见做法。此外，与抗体检测不同，cf-mRNA分析在次优BM重建的早期鉴定中起作用，如本文所讨论的，如AML患者2中缺乏巨核细胞谱系发育所示。

在一些情况下，本文公开了用于监测受试者骨髓的健康状态的方法和系统，包括：从具有健康状态的受试者获得生物样本；以及检测对应于第一多个基因的衍生自受试者骨髓及其衍生细胞的第一多个无细胞mRNA(cf-mRNA)的cf-mRNA水平。第一多个基因可以包含来自表7的一个或多个基因。例如，包含来自表7的至少1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、 65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、 170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、 290、300、310、320、330、340、350、360和370个基因的一组基因的cf-mRNA水平可用于监测受试者BM的健康状态。此外，包含来自表7的多达377、365、355、345、335、325、315、305、295、285、275、265、255、245、235、25、25、205、195、185、175、165、155、 145、135、125、115、105、95、85、75、65、55、45、35、25、15 和5个基因的一组基因的cf-mRNA水平可用于监测受试者BM的健康状态。

此外，第一多个基因可以包括来自表9的对造血细胞特异的基因。多个基因可以包括红细胞特异性基因，例如但不限于GATA1、 SLC4A1、TF、AVP、RUNDC3A、SOX6、TSPO2、HBZ、TMCC2、 SELENBP1、ALAS2、EPB42、GYPA、C17orf99、HBA2、RHCE、 HBG2、TRIM10、HBA1、HBM、HBG1、UCA1、GYPB、CTD-3154N5.2 和AC104389.1。多个基因可以包括巨核细胞特异性基因，例如但不限于ITGA2B、RAB27B、GUCY1B3、GP6、HGD、PF4、CLEC1B、 CMTM5、GP9、SELP、DNM3、LY6G6F、LY6G6D、XXbac-BPG3213.19 和RP11-879F14.2。多个基因可以包括如表9中所列的T细胞特异性基因。多个基因可以包括如表9中所列的嗜中性粒细胞特异性基因。多个基因可以包括祖和/或未成熟嗜中性粒细胞特异性基因，例如但不限于CTSG、ELANE、AZU1、PRTN3、MMP8、RNASE和PGLYRP1。包括来自表9的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、 30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、 110、120、130、140、150、160、170、180、190和200个基因的一组基因的cf-mRNA水平可用于监测受试者BM的健康状态。此外，包括来自表9的多达205、195、185、175、165、155、145、135、125、 115、105、95、85、75、65、55、45、35、25、15和5个基因的一组基因的cf-mRNA水平可用于监测受试者BM的健康状态。

在其他情况下，在此公开了用于监测受试者组织或器官的健康状态的方法和系统。该方法可包括从受试者获得生物样本并检测相应衍生自组织或器官的cf-mRNA水平。组织或器官衍生的cf-mRNA可以对应于组织或器官特异的基因。例如，组织可以是皮肤、骨骼肌、脂肪组织等。器官可以是肝脏、胰腺、肺、心脏、脑等。

监测受试者的器官的病症和/或疾病状态

在一些情况下，在此公开了用于监测受试者骨髓的疾病状态的方法和系统，包括从患有疾病状态的受试者获得生物样本；以及检测衍生自驻留或源自骨髓的多个细胞的与第二多个基因相对应的第二多个无细胞mRNA(cf-mRNA)的cf-mRNA水平。

在一些情况下，器官是骨髓。从生物样本(例如血液样本)中检测到的cf-mRNA可能对应于对患有特定病症或疾病的骨髓特异性的基因。在一些情况下，病症可以是贫血。贫血可以是一种常见的血液疾病，据美国国家心肺血液研究所称，贫血影响了超过300万美国人。红细胞可以携带血红蛋白，一种富含铁的蛋白质，其附接到肺部的氧，并将其运送到全身各处的组织。当受试者没有足够的红细胞或受试者的红细胞不能正常工作时，就可能发生贫血。当血液检查显示男性血红蛋白值低于13.5gm/dl或女性中低于12.0gm/dl时，即可诊断为贫血。监测与表9中红细胞特异性基因相对应的cf-mRNA水平可能比计算外周血液样本品中红细胞的细胞计数更短暂和动态。

在一些情况下，该疾病可以是多发性骨髓瘤(MM)。多发性骨髓瘤是一种血癌，可能与淋巴瘤和白血病有关。在多发性骨髓瘤中，一种类型的称为浆细胞的白细胞通常会异常增殖。正常情况下，浆细胞可能产生对抗感染的抗体。但在多发性骨髓瘤中，浆细胞可能向受试者的骨骼和血液中释放过多的蛋白质(称为免疫球蛋白)。免疫球蛋白可以在受试者全身积聚并导致器官损伤。多个基因可能与MM相关，例如但不限于IGHG1、IGHA1、IGKC、IGHV1、IGHV2、IGHV3、 IGHV4、IGHV5、IGHV6、IGHV7、IGHV8、IGHV9、IGHV10、IGHV11、 IGHV12、IGHV13、IGHV14、IGHV15、IGHV16、IGHV17、IGHV18、 IGHV19、IGHV20、IGHV21、IGHV22、IGHV23、IGHV24、IGHV25、 IGHV26、IGHV27、IGHV28、IGHV29、IGHV30、IGHV31、IGHV32、IGHV33、IGHV34、IGHV35、IGHV36、IGHV37、IGHV38、IGHV39、 IGHV40、IGHV41、IGHV42、IGHV43、IGHV44、IGHV45、IGHV46、 IGHV47、IGHV48、IGHV49、IGHV50、IGHV51、IGHV52、IGHV53、IGHV54、IGHV55、IGHV56、IGHV57、IGHV58、IGHV59、IGHV60、 IGHV61、IGHV62、IGHV63、IGHV64、IGHV65、IGHV66、IGHV67、 IGHV68、IGHV69、IGKV2、IGKV3、IGKV4、IGKV5、IGKV6、IGKV7、 IGKV8、IGKV9、IGKV10、IGKV11、IGKV12、IGKV13、IGKV14、 IGKV15、IGKV16、IGKV17、IGKV18、IGKV19、IGKV20、IGKV21、 IGKV22、IGKV23、IGKV24、IGL1和IGLV 1-40。通过检测对应于来自血液样本的与MM相关的那些基因的cf-mRNA的水平，可减轻获得BM活检以监测MM预后的需要。

此外，在一些情况下，该疾病可以是淋巴瘤、白血病、骨髓增生性赘生物或骨髓增生异常综合征。淋巴瘤是一种癌症，可以从免疫系统的抗感染细胞(称为淋巴细胞)开始。淋巴细胞可以存在于淋巴结、脾脏、胸腺、骨髓和身体的其他部位。当一个人患有淋巴瘤时，淋巴细胞发生变化并且可能失控生长。通过检测血液样本中与淋巴瘤特异性相关或相关联的基因对应的cf-mRNA的水平，可以消除获得BM 活检的需要。

白血病可以是早期造血细胞的癌症。通常，白血病是白细胞的癌症，但有些白血病可以从其他血细胞类型开始。有几种类型的白血病，可基于白血病是急性(快速增长)还是慢性(较缓慢增长)，以及白血病是从髓系细胞还是淋巴细胞开始进行划分。通过检测血液样本中与不同类型的白血病特异性相关或相关联的基因对应的cf-mRNA的水平，可以消除获得BM活检的需要。

骨髓增生性赘生物(MPN)可以是当身体产生过多白细胞或红细胞或血小板时发生的血癌。骨髓中血细胞的这种过度产生可能造成血流量问题并导致各种症状。通过检测血液样本中与MPN特异性相关或相关联的基因对应的cf-mRNA的水平，可以消除获得BM活检的需要。

此外，骨髓增生异常综合征(MDS)是一组癌症，其中骨髓中的未成熟血细胞可能不成熟，因此没有变成健康的血细胞。早期，通常没有症状。晚期的症状可能包括感觉疲倦、呼吸短促、容易出血或频繁感染。通过检测血液样本中与MDS特异性相关或相关联的基因对应的cf-mRNA的水平，可以消除获得BM活检的需要。骨髓纤维化是一种罕见类型的骨髓癌，其破坏您身体的正常血细胞生成。骨髓纤维化在您的骨髓中形成广泛的疤痕，导致严重的贫血，从而可能导致虚弱和疲劳。通过检测血液样本中与骨髓纤维化特异性相关或相关联的基因对应的cf-mRNA的水平，可以消除获得BM活检的需要。真性红细胞增多症是一种增长缓慢的血癌，其中您的骨髓产生过多的红细胞。这些多余的细胞会使您的血液变稠，减慢其流动。它们还引起并发症，例如血凝块，这可能导致心脏病发作或中风。通过检测血液样本中与骨髓纤维化特异性相关或相关联的基因对应的cf-mRNA的水平，可以消除获得真性红细胞增多症活检的需要。

此外，血小板增多症是一种疾病，其中您的骨髓产生过多的血小板。血小板是有助于凝血的血细胞碎片。血小板过多使您的血液难以正常凝结。这可能导致过多的凝结，或凝结不足。通过检测血液样本中与血小板增多症特异性相关或相关联的基因对应的cf-mRNA的水平，可以消除获得BM活检的需要。

此外，骨髓特异性无细胞多核苷酸可用于监测治疗骨髓疾病中的本文所列化合物/疗法。例如，某些骨髓特异性无细胞多核苷酸(例如，本文公开的cf-mRNA)可用于评估泛素连接酶抑制剂(例如，特异性靶向cereblon E3连接酶的iberdomide)在没有任何侵入性手术的情况下在不同时间点治疗MM的有效性。可以在第一时间点接受 iberdomide之前从受试者抽取血液样本以在该第一时间点评估骨髓特异性cf-mRNA。随后，可以在不同的时间点获得不同的血液样本，例如用iberdomide治疗受试者后2天、这种治疗后4天、治疗后8天、治疗后16天、治疗后30天、治疗后60天、治疗后120天、治疗后4 个月、治疗后6个月、治疗后12个月、治疗后18个月、治疗后24 个月、治疗后36个月、治疗后48个月以分别评估在这些不同时间点骨髓特异性cf-mRNA。此处列出的治疗开始后的不同天数和/或月数并不意味着是限制性的。研究人员/医务工作者可以基于不同的化合物、疗法、待治疗的疾病和其他参数选择不同的时间点。

在一些情况下，本文公开了用于监测受试者器官例如肝脏、心脏、中枢神经系统等的疾病状态的方法和系统。例如，当受试者患有非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)时，这可能需要健康护理提供者持续监测。通过从血液样本中检测肝特异性cf-mRNA，提供了一种监测NAFLD 病症的方便且非侵入性方法。对应于各种肝特异性基因的肝特异性 cf-mRNA也可用于监测化合物/疗法在治疗NAFLD中的有效性。

对于与受试者的心脏和心血管系统相关的各种病症和疾病，来自血液样本的心脏特异性cf-mRNA提供了方便且非侵入性方法来监测任何心血管病症和疾病。此外，对应于各种心脏特异性基因的心脏特异性cf-mRNA也可用于监测化合物/疗法在治疗特定心血管病症中的有效性。

对于任何中枢神经系统(CNS)病症或疾病，CNS特异性cf-mRNA 可用于提供一种方便且非侵入性方法来监测任何CNS病症和疾病。此外，对应于各种CNS病症和疾病的CNS特异性cf-mRNA可用于监测化合物/疗法在治疗特定心血管病症中的有效性。

监测受试者器官的治疗状态

在一些情况下，本文公开了用于监测受试者器官的治疗状态的方法和系统，包括：从具有治疗状态的受试者获得血浆样本；以及检测对应于第二多个基因的衍生自受试者器官的第三多个无细胞mRNA (cf-mRNA)的cf-mRNA水平。在一些情况下，器官是骨髓。在一些情况下，骨髓病症或疾病的治疗包括骨髓消融、骨髓重建、骨髓移植、用生长因子刺激、免疫疗法、免疫调节、泛素连接酶活性的调节、或自体或异源CAR-T细胞疗法。

骨髓消融通常在骨髓重建和骨髓移植之前进行，以治疗血液病症和疾病。骨髓消融可以包括物理消融，例如电离辐射；或化学消融，例如美法仑介导的骨髓消融、白消安介导的骨髓消融、苏消安介导的消融、化疗介导的消融等。利用本文提供的方法，骨髓消融手术是否成功可以通过测量与红细胞特异性基因、嗜中性粒细胞特异性基因、祖嗜中性粒细胞特异性基因、T细胞特异性基因和/或可用于表明原始患病骨髓已从血液样本中消融的其他基因对应的cf-mRNA水平以一种快速和非侵入性方式进行监测。在一些情况下，红细胞特异性基因可包含来自下组的一种或多种基因，该组包括但不限于如表9中所列的GATA1、SLC4A1、TF、AVP、RUNDC3A、SOX6、TSPO2、HBZ、 TMCC2、SELENBP1、ALAS2、EPB42、GYPA、C17orf99、HBA2、 RHCE、HBG2、TRIM10、HBA1、HBM、HBG1、UCA1、GYPB、 CTD-3154N5.2和Ac104389.1。在一些情况下，嗜中性粒细胞特异性基因可包含来自表9的嗜中性粒细胞列中列出的一种或多种基因。在一些情况下，祖-嗜中性粒细胞特异性基因可以包括来自下组中的一个或多个基因，该组包括但不限于表9中所列的CTSG、ELANE、 AZU1、PRTN3、MMP8、RNASE和PGLYRP1。在一些情况下，T 细胞特异性基因可包含来自表9的T细胞列中的一种或多种基因。

骨髓消融后，可以进行骨髓重建、同种异体骨髓移植或自体骨髓移植，以便向患有血液疾病的受试者补充健康的造血干细胞，其可以发育成调节免疫应答的红细胞、白细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞。本文公开的方法可用于监测对应于来自血液样本的不同细胞类型特异性基因的cf-mRNA水平以确定BM重建或移植手术是否成功。此外，cf-mRNA水平的测量(例如，重复测量)可用于监测受试者在BM重建或移植治疗后的预后。例如，可以测量与红细胞特异性基因、巨核细胞特异性基因、嗜中性粒细胞特异性基因、祖嗜中性粒细胞特异性基因、T细胞特异性基因或其他合适的细胞类型特异性基因对应的cf-mRNA水平。在一些情况下，巨核细胞特异性基因可包含来自包括但不限于如表9中所列的 ITGA2B、RAB27B、GUCY1B3、GP6、HGD、PF4、CLEC1B、CMTM5、 GP9、SELP、DNM3、LY6G6F、LY6G6D、XXbac-BPG3213.19和 RP11-879F14.2的基因组的一个或多个基因。在一些情况下，红细胞特异性基因可包含来自下组的一种或多种基因，该组包括但不限于如表9中所列的GATA1、SLC4A1、TF、AVP、RUNDC3A、SOX6、TSPO2、HBZ、TMCC2、SELENBP1、ALAS2、EPB42、GYPA、C17orf99、 HBA2、RHCE、HBG2、TRIM10、HBA1、HBM、HBG1、UCA1、 GYPB、CTD-3154N5.2和Ac104389.1。在一些情况下，嗜中性粒细胞特异性基因可包含来自表9的嗜中性粒细胞列中列出的一种或多种基因。在一些情况下，祖-嗜中性粒细胞特异性基因可包括但不限于如表9中所列的CTSG、ELANE、AZU1、PRTN3、MMP8、RNASE 和PGLYRP1。在一些情况下，T细胞特异性基因可包含来自表9的T 细胞列中的一种或多种基因。

免疫疗法和免疫调节治疗可用于增强受试者的免疫系统以治疗癌症，例如MM、白血病、淋巴瘤等。免疫疗法的类型包括但不限于，对有此需要的受试者施用单克隆抗体、免疫检查点抑制剂或癌症疫苗接种。嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法可以是另一种类型的免疫疗法。通常，对于自体CAR-T疗法，可以通过单采法从受试者收集T 细胞，可能去除在期间可以从身体中抽取血液和一种或多种血液组分 (例如血浆、血小板或白细胞)的手术。随后，可以将T细胞送到实验室或药物制造设施，在那里对它们进行基因工程化，例如通过将 DNA引入其中，以在细胞表面上产生嵌合抗原受体(CAR)。CAR 是蛋白质，其可以使T细胞能够识别被靶向的肿瘤细胞上的抗原。通过在实验室生长细胞，可以“扩增”受试者的基因修饰的T细胞的数量。当有足够的细胞时，可以将这些CAR T细胞冷冻和/或灌注到受试者中。

在免疫疗法和/或免疫调节治疗期间，与红细胞特异性基因、巨核细胞特异性基因、嗜中性粒细胞特异性基因、祖嗜中性粒细胞特异性基因、T细胞特异性基因或其他合适的细胞类型特异性基因对应的 cf-mRNA水平可用于监测治疗有效性。基于瞬时和/或非侵入性测量，可以调整具有不同剂量的不同类型的免疫疗法和/或免疫调节以在受试者中实现期望的反应。在一些情况下，巨核细胞特异性基因包含来自下组的一个或多个基因，该组基因包括但不限于如表9中所列的 ITGA2B、RAB27B、GUCY1B3、GP6、HGD、PF4、CLEC1B、CMTM5、GP9、SELP、DNM3、LY6G6F、LY6G6D、XXbac-BPG3213.19和 RP11-879F14.2。在一些情况下，红细胞特异性基因可包含来自下组的一种或多种基因，该组包括但不限于如表9中所列的GATA1、 SLC4A1、TF、AVP、RUNDC3A、SOX6、TSPO2、HBZ、TMCC2、 SELENBP1、ALAS2、EPB42、GYPA、C17orf99、HBA2、RHCE、 HBG2、TRIM10、HBA1、HBM、HBG1、UCA1、GYPB、CTD-3154N5.2 和Ac104389.1。在一些情况下，嗜中性粒细胞特异性基因可包含来自表9的嗜中性粒细胞列中列出的一种或多种基因。在一些情况下，祖 -嗜中性粒细胞特异性基因可包括但不限于如表9中所列的CTSG、 ELANE、AZU1、PRTN3、MMP8、RNASE和PGLYRP1。在一些情况下，T细胞特异性基因可包含来自表9的T细胞列中的一种或多种基因。

此外，对于生长因子刺激治疗，例如促红细胞生成素(EPO)和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，与红细胞特异性基因、巨核细胞特异性基因、嗜中性粒细胞特异性基因、祖嗜中性粒细胞特异性基因、 T细胞特异性基因或其他合适的细胞类型特异性基因对应的 cf-mRNA水平可用于监测治疗有效性。基于瞬时和/或非侵入性测量，可以使用生长因子的不同剂量和/或方案以在受试者中实现期望的反应。在一些情况下，巨核细胞特异性基因可包含来自以下基因组的一个或多个基因，该组包括但不限于如表9中所列的ITGA2B、RAB27B、GUCY1B3、GP6、HGD、PF4、CLEC1B、CMTM5、GP9、SELP、 DNM3、LY6G6F、LY6G6D、XXbac-BPG3213.19和RP11-879F14.2。在一些情况下，红细胞特异性基因可包含来自下组的一种或多种基因，该组包括但不限于如表9中所列的GATA1、SLC4A1、TF、AVP、 RUNDC3A、SOX6、TSPO2、HBZ、TMCC2、SELENBP1、ALAS2、 EPB42、GYPA、C17orf99、HBA2、RHCE、HBG2、TRIM10、HBA1、 HBM、HBG1、UCA1、GYPB、CTD-3154N5.2和Ac104389.1。在一些情况下，嗜中性粒细胞特异性基因可包含来自表9的嗜中性粒细胞列中列出的一种或多种基因。在一些情况下，祖-嗜中性粒细胞特异性基因可包括但不限于如表9中所列的CTSG、ELANE、AZU1、 PRTN3、MMP8、RNASE和PGLYRP1。在一些情况下，T细胞特异性基因可包含来自表9的T细胞列中的一种或多种基因。

分离、定量和检测

本文公开的一些方法包括分离至少一种组织特异性多核苷酸。在一些情况下，至少一种组织特异性多核苷酸包含无细胞多核苷酸。在一些情况下，分离无细胞多核苷酸可包括将来自受试者的样本分级。一些方法可包括从样本中去除完整细胞。例如，一些方法可包括离心血液样本并收集作为血清或血浆的上清液，或过滤样本以去除细胞。在一些实施方案中，可以分析无细胞多核苷酸而无需将来自受试者的样本分级。例如，尿液、脑脊液或包含很少或没有细胞的其他液体可能不需要分级。一些方法可包括充分纯化无细胞多核苷酸以检测、定量和/或分析无细胞多核苷酸。多种试剂、方法和试剂盒可用于纯化无细胞多核苷酸。试剂可包括但不限于苯酚、洗涤剂、离液盐、Trizol、苯酚-氯仿、糖原、碘化钠和胍树脂、亲和柱，脱盐柱试剂盒包括但不限于，Thermo Fisher

血清试剂盒、Qiagen RNeasy试剂盒、ZR血清DNA试剂盒、Puregene DNA纯化系统、QIAamp DNA BloodMidi试剂盒、QIAamp循环核酸试剂盒和QIAamp DNA Mini 试剂盒。

本文公开的一些方法可以包括富集用于无细胞多核苷酸的样本。例如，感兴趣的样本可能包含来自细菌的RNA和/或DNA。一些方法可以包括exomal捕获，从而消除或基本上消除不期望的序列并富集用于感兴趣的多核苷酸的样本。在一些情况下，exomal捕获包括基于阵列的捕获或溶液内捕获，与分别系在表面或珠上的感兴趣RNA对应的DNA的片段。一些方法还包括从样本中过滤或去除其他生物分子或细胞，例如蛋白质或血小板。在一些情况下，富集用于无细胞多核苷酸的样本包括防止血浆样本的血细胞RNA污染。在一些情况下，使用不含EDTA的试管可以防止或减少在血浆和/或血清样本中血细胞RNA的存在。

通常，本文公开的方法可包括检测或定量至少一种组织特异性多核苷酸。在一些情况下，定量和/或检测至少一种组织特异性多核苷酸可包括扩增至少一种组织特异性多核苷酸。在涉及无细胞RNA的一些情况下，定量和/或检测至少一种组织特异性多核苷酸可包括逆转录无细胞RNA。可以采用多种方法中的任一种来检测和/或定量样本中的标志物或组织特异性多核苷酸。在涉及无细胞、组织特异性RNA 的一些情况下，可以从样本中分离出RNA，并在进一步操作(例如扩增和/或测序)之前进行逆转录以产生cDNA。在一些实施方案中，扩增可以在样本中的整个转录组的3'端以及随机开始，以允许mRNA 和非聚腺苷酸化转录本的扩增。用于扩增cDNA的合适试剂盒包括，例如，

RNA-Seq系统。组织特异性RNA可以通过多种技术进行鉴定和定量，例如但不限于阵列杂交、定量PCR和测序。

定量本文公开的核酸的一些方法可包括测量至少一种核酸。测量可以通过测序来完成。测序可以是靶向测序。在一些情况下，靶向测序可包括特异性扩增本文公开的选择标志物或选择的组织特异性多核苷酸并对扩增产物进行测序。在一些情况下，靶向测序可包括特异性扩增本文公开的选定标志物的子集或选定的组织特异性多核苷酸的子集并对扩增产物进行测序。或者，包括靶向测序的一些方法可以不包括扩增标志物或组织特异性多核苷酸。一些方法可以包括非靶向测序。在一些情况下，非靶向测序可以包括对扩增产物进行测序，无细胞核酸的部分不是标志物或组织特异性多核苷酸。在一些情况下，非靶向测序可以包括扩增来自受试者的样本中的无细胞核酸并对扩增产物进行测序，无细胞核酸的部分不是标志物或组织特异性多核苷酸。在一些情况下，非靶向测序可包括扩增包含本文所述的标志物或组织特异性多核苷酸的无细胞核酸。测序可以提供对应于标志物或组织特异性多核苷酸的相对量的多个读数。在一些情况下，测序可提供对应于标志物或组织特异性多核苷酸的绝对量的多个读数。在一些实施方案中，扩增的cDNA可以通过全转录组鸟枪法测序(也称为“RNA-Seq”)进行测序。全转录组鸟枪法测序(RNA-Seq)可以使用各种下一代测序平台完成，例如但不限于Illumina基因组分析仪平台、 ABI固体测序平台或生命科学的454测序平台。在一些情况下，特定靶标的鉴定可以通过微阵列进行，例如肽阵列或寡核苷酸阵列，其中可寻址结合元件阵列特异性结合相应靶标，并且与结合程度成比例的信号用于确定样本中靶标的数量。在一些情况下，测序可以是一种优选的定量方法。在一些情况下，测序可允许在没有扩增子干扰的情况下平行询问数千个基因。在一些情况下，通过测序定量可以相比于通过Q-PCR定量是优选的。在一些情况下，通过Q-PCR准确定量基因表达可能需要如此多的对照基因，以至于用Q-PCR定量可能效率低下。在其他情况下，测序效率和通过测序准确定量可能不受分析的(对照)基因数量的影响。至少由于上述原因，当评估多个器官(例如，心脏、肾脏和肝脏)的健康状态时，测序对于本文公开的一些方法可能特别有用。

定量本文公开的核酸的一些方法可以包括定量PCR(q-PCR)。在一些情况下，Q-PCR可以包括本文所述的无细胞RNA的逆转录反应以产生相应的cDNA。在一些情况下，无细胞RNA可以包含标志物、组织特异性多核苷酸，以及既不是标志物也不是组织特异性多核苷酸的无细胞RNA。一些无细胞RNA包含本文所述的标志物、本文所述的组织特异性多核苷酸，和/或既不是标志物也不是本文所述的组织特异性多核苷酸的无细胞RNA。在一些情况下，Q-PCR可以包括将与标志物、组织特异性多核苷酸或管家基因(例如ACTB、ALB、GAPDH 等)对应的cDNA与对该标志物、组织特异性多核苷酸或管家基因特异的PCR引物接触。

本文公开的一些方法包括定量血细胞特异性多核苷酸。本文公开的包括Q-PCR的方法可包括将多核苷酸(RNA或DNA)与对应于组织特异性多核苷酸的引物接触。本文公开的一些造血细胞特异性多核苷酸可以是由一种或多种类型的细胞主要表达或甚至专门表达的核酸。血细胞的类型一般可分为白细胞(也称为白细胞(leukocyte))、红细胞(也称为红细胞(erythrocyte))和血小板。在一些情况下，血细胞特异性多核苷酸可作为对照用于包括定量本文公开的组织特异性多核苷酸和疾病标志物的方法中。在一些情况下，可以使用缺乏扩增产物和对应于血细胞特异性多核苷酸的引物来确认该方法正在检测血液、血浆或血清样本中的无细胞RNA，而不是血细胞中表达的RNA。作为非限制性实例，血细胞特异性多核苷酸可包括在白细胞、血小板或红细胞及其组合中表达的多核苷酸。白细胞包括但不限于淋巴细胞、T细胞、B细胞、树突细胞、粒细胞、单核细胞和巨噬细胞。作为非限制性实例，骨髓特异性多核苷酸可由选自表7的基因编码。

在一些情况下，Q-PCR可以是一种优选的定量方法。Q-PCR可能是一种更灵敏的方法，因此可以更准确地定量非常低水平的RNA。在一些情况下，通过Q-PCR定量可以优选于通过测序定量。在一些情况下，测序可能需要更复杂的RNA样本制备，并需要耗竭或富集核酸以提供准确的定量。

多核苷酸的存在和/或数量(相对或绝对)，以及由亚硫酸氢盐处理引起的序列变化，可以使用本文公开的任何合适的序列检测方法来检测。实例包括但不限于探针杂交、引物导向的扩增和测序。可以使用任何合适的低或高通量测序技术或平台对多核苷酸进行测序，包括但不限于Sanger测序、Solexa-Illumina测序、基于连接的测序 (SOLiD)、焦磷酸测序；选通测序(SMR)；和半导体阵列测序(Ion Torrent)。Illumina或Solexa测序基于可逆染料终止子。DNA分子通常与载玻片上的引物附接并进行扩增，从而形成局部克隆集落。随后，可以一次添加一种类型的核苷酸，并洗掉未掺入的核苷酸。随后，可以拍摄荧光标记的核苷酸的图像，并从DNA中化学去除染料，允许下一个循环。Applied Biosystems的SOLiD技术采用连接法测序。该方法基于固定长度的所有可能的寡核苷酸库的使用，这些寡核苷酸根据测序位置进行标记。此类寡核苷酸被退火并连接。随后，DNA连接酶对匹配序列的优先连接通常产生该位置处的核苷酸的信号信息。由于DNA通常通过乳液PCR扩增，因此产生的珠(各自仅包含相同DNA分子的拷贝)可以沉积在载玻片上，产生与Illumina测序相当的数量和长度的序列。设想的测序方法的另一个实例是焦磷酸测序，特别是454焦磷酸测序，例如，基于Roche 454基因组测序仪。这种方法在油溶液中扩增水滴内的DNA，每个液滴含有附着在然后形成克隆集落的单个引物涂覆的珠上的单个DNA模板。焦磷酸测序使用荧光素酶产生光来检测添加到新生DNA中的单独核苷酸，并使用组合数据来生成序列读数。另一种方法基于Helicos的Heliscope技术，其中片段由系在阵列上的聚T寡聚体捕获。在每个测序循环中，加入聚合酶和单个荧光标记的核苷酸，并对阵列进行成像。随后去除荧光标签，并重复该循环。合适的测序技术的其他实例是杂交测序、使用纳米孔测序、基于显微镜的测序技术、微流体Sanger测序或基于微芯片的测序方法。高通量测序平台可以允许在单个反应容器中生成多个不同的测序读数，例如10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷或更多。

无细胞表达谱

包含本文所述的多个差异表达基因的无细胞表达谱促进了灵敏且非侵入性的测试以监测治疗(例如，药物化合物)的有效性、测量用于治疗的一个或多个感兴趣的靶标的药效学、测量药物发现和开发过程中先导物优化的药效学、或在治疗过程中监测临床开发。包含多个差异表达的蛋白质编码基因的无细胞表达谱通常很容易通过从个体中抽取血液获得。使用本文公开的无细胞表达谱的益处包括快速方便的监测和测量，无需繁琐和不可靠的测试。

基于比单个基因的预测值更高的预测值，可以选择各种基因以包括在无细胞表达谱中。无细胞表达谱中的选定基因通常彼此不共变，以使得每个选定基因对无细胞表达谱的整体健康签名提供独立的贡献。

在一些情况下，用于不同监测或测量功能的各种无细胞表达谱，各自包括一组不同的选定基因，彼此独立地变化。每个无细胞表达谱可以包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、 40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、 165、170、175、180、185、190、195、200、300和400个本文公开的不同基因。包括特定组的选定基因的一些无细胞表达谱可用于检测开发的候选药物是否有效治疗旨在治疗的疾病。

计算机系统

本公开提供了被编程为实现本公开的方法的计算机系统。图11 示出了计算机系统201，其被编程或以其他方式配置为测量样本中的 AMH。计算机系统201可以调节本公开的方法的各个方面，例如生物样本中cf-mRNA的提取和检测。计算机系统201可以是用户的电子设备或相对于电子设备远程定位的计算机系统。电子设备可以是移动电子设备。

计算机系统201包括中央处理单元(CPU，本文也称为“处理器”和“计算机处理器”)205，其可以是单核或多核处理器，或者是用于并行处理的多个处理器。计算机系统201还包括存储器或存储器位置 210(例如，随机存取存储器、只读存储器、闪存)、电子存储单元215(例如，硬盘)、通信接口220(例如，网络适配器)以便与一个或多个其他系统通信，以及外围设备225，例如高速缓存、其他存储器、数据存储和/或电子显示适配器。存储器210、存储单元215、接口220和外围设备225通过通信总线(实线)诸如主板而与CPU 205 通信。存储单元215可以是用于存储数据的数据存储单元(或数据储存库)。计算机系统201可以借助于通信接口220而可操作地耦联到计算机网络(“网络”)230。网络230可以是因特网、互联网和/或外部网，或与因特网通信的内部网和/或外部网。在一些情况下，网络 230是电信和/或数据网络。网络230可以包括一个或多个计算机服务器，其可以启用分布式计算，例如云计算。网络230在某些情况下借助于计算机系统201可以实现对等网络，其可以使耦联到计算机系统 201的设备能够充当客户端或服务器。

CPU 205可以执行一系列机器可读指令，其可以体现在程序或软件中。指令可以存储在存储器位置诸如存储器210中。指令可以被定向到CPU 205，CPU 205可以随后对CPU205进行编程或以其他方式配置CPU 205以实现本公开的方法。由CPU 205执行的操作的实例可以包括获取、解码、执行和写回。

CPU 205可以是电路诸如集成电路的部分。系统201的一个或多个其他组件可以被包括在电路中。在一些情况下，电路是专用集成电路(ASIC)。

存储单元215可以存储文件，例如驱动程序、库和保存的程序。存储单元215可以存储用户数据，例如用户偏好和用户程序。在一些情况下，计算机系统201可以包括计算机系统201外部的一个或多个其他数据存储单元，例如位于通过内部网或因特网与计算机系统201 通信的远程服务器上。

计算机系统201可以通过网络230而与一个或多个远程计算机系统通信。例如，计算机系统201可以与用户的远程计算机系统通信。远程计算机系统的实例包括个人计算机(例如，便携式PC)、平板电脑或平板电脑(例如，

GalaxyTab)、电话、智能电话(例如，

启用Android的设备，

) 或个人数字助理。用户可以通过网络230访问计算机系统201。

可以通过存储在计算机系统201的电子存储位置(例如在存储器 210或电子存储单元215上)的机器(例如计算机处理器)可执行代码的方式来实现本文所述的方法。机器可执行或机器可读的代码可以以软件的形式提供。在使用期间，代码可以由处理器205执行。在一些情况下，可以从存储单元215检索代码并将其存储在存储器210上以供处理器205随时访问。在一些情况下，可以排除电子存储单元 215，并且将机器可执行指令存储在存储器210中。

可以对代码进行预编译并配置为与具有适配成执行代码的处理器的机器一起使用，或者可以在运行期间进行编译。代码可以以编程语言来提供，其可以被选择成使代码能够以预编译或编译时的方式执行。

本文提供的系统和方法(例如计算机系统1101)的各个方面可以体现在编程中。可以将技术的各个方面视为通常以机器可读介质的类型承载或体现的机器(或处理器)可执行代码和/或关联数据的形式的“产品”或“制品”。机器可执行代码可以存储在电子存储单元上，例如存储器(例如，只读存储器、随机存取存储器、闪存)或硬盘。“存储”类型的介质可以包括计算机、处理器等的任何或所有有形存储器，或其相关模块，例如各种半导体存储器、磁带驱动器、磁盘驱动器等，其可以提供非暂时性存储随时进行软件编程。软件的全部或部分有时可以通过因特网或其他各种电信网络进行通信。例如，这样的通信可以使得能够将软件从一个计算机或处理器加载到另一计算机或处理器，例如从管理服务器或主机加载到应用服务器的计算机平台。因此，可以承载软件元件的另一种类型的介质包括光波、电波和电磁波，例如通过有线和光学固网网络以及通过各种空中链路在本地设备之间的物理接口上使用的。诸如有线或无线链路、光链路等的运载这种波的物理元件也可以被视为承载软件的介质。如本文所用，除非限于非暂时性有形“存储”介质，否则诸如计算机或机器“可读介质”的术语是指参与向处理器提供指令以供执行的任何介质。

因此，机器可读介质诸如计算机可执行代码可以采取许多形式，包括但不限于有形存储介质、载波介质或物理传输介质。非易失性存储介质包括例如光盘或磁盘，例如任何一个或多个计算机中的任何存储设备等，诸如可用于实现附图中所示的数据库等。易失性存储介质包括动态存储器，例如这种计算机平台的主存储器。有形传输介质包括同轴电缆；铜线和光纤，包括包含计算机系统内的总线的电线。载波传输介质可以采用电或电磁信号或声波或光波的形式，例如在射频(RF)和红外(IR)数据通信期间生成的那些。因此，计算机可读介质的常见形式包括例如：软盘、可折叠磁盘、硬盘、磁带、任何其他磁介质、CD-ROM、DVD或DVD-ROM、任何其他光学介质、打孔卡纸磁带、带孔图案的任何其他物理存储介质、RAM、ROM、PROM 和EPROM、FLASH-EPROM、任何其他存储芯片或盒、用于传输数据或指令的载波、用于传输此类载波的电缆或链路、或计算机可以从中读取编程代码和/或数据的任何其他介质。这些形式的计算机可读介质中的许多可能涉及将一个或多个指令的一个或多个序列传送给处理器以执行。

计算机系统201可以包括或与电子显示器235通信，该电子显示器235包括用户界面(UI)240，用于提供例如，生物样本中如本文公开的cf-mRNA水平的测量。UI的实例包括但不限于图形用户界面 (GUI)和基于网络的用户界面。

本公开的方法和系统可以通过一种或多种算法来实现。可以在中央处理单元1105执行时通过软件来实现算法。例如，该算法可以确定生物样本中如本文所公开的cf-mRNA的水平。

分类器

本公开提供分类器，其用于处理或分析从生物样本产生的数据以产生输出。这样的输出可以导致对受试者的cf-mRNA谱的评估，用于在治疗前后监测受试者的器官或组织。

分类器可以是机器学习算法。机器学习算法可以是经过训练的机器学习算法。例如，机器学习算法可以通过有监督或无监督学习进行训练。例如，机器学习算法可以包括生成模型(例如，目标变量Y上的可观察变量X上的联合概率分布的统计模型；例如朴素贝叶斯分类器和线性判别分析)、判别模型(例如，给定可观察变量X的观察值 x，目标变量Y的条件概率模型；例如逻辑回归、感知器或支持向量机)、或强化学习(RL)。

如本文所用，术语“机器学习”、“机器学习程序”、“机器学习操作”和“机器学习算法”通常是指可以逐步(例如，迭代地)提高任务的计算机性能的任何系统或分析和/或统计程序。机器学习可以包括机器学习算法。机器学习算法可以是经训练的算法。机器学习(ML)可以包括一种或多种有监督、半监督或无监督的机器学习技术。例如， ML算法可能是经训练的算法，其可以通过监督学习进行训练(例如，将各种参数确定为权重或缩放因子)。ML可以包括回归分析、正则化、分类、降维、集成学习、元学习、关联规则学习、聚类分析、异常检测、深度学习或超深度学习中的一种或多种。Ml可以包括但不限于：k-均值、k-均值聚类、k-最近邻、学习矢量量化、线性回归、非线性回归、最小二乘回归、偏最小二乘回归、逻辑回归、逐步回归、多元自适应回归样条、岭回归、主成分回归、最小绝对收缩和选择操作、最小角回归、典型相关分析、因子分析、独立成分分析、线性判别分析、多维标度、非负矩阵分解、主成分分析、主坐标分析、投影寻踪、萨蒙映射、t-分布随机邻域嵌入、AdaBoosting、提升、梯度提升、自助聚合法、系综平均、决策树、条件决策树、提升决策树、梯度提升决策树、随机森林，堆叠泛化，贝叶斯网络、贝叶斯信念网络、朴素贝叶斯、高斯朴素贝叶斯、多项朴素贝叶斯、隐马尔可夫模型、层次隐马尔可夫模型、支持向量机、编码器、解码器、自动编码器、堆叠自动编码器、感知器、多层感知器、人工神经网络、前馈神经网络、卷积神经网络、递归神经网络、长短期记忆、深度信念网络、深度玻尔兹曼机、深度卷积神经网络、深度递归神经网络或生成对抗网络。

如本文所用，术语“强化学习”、“强化学习过程”、“强化学习操作”和“强化学习算法”通常是指可以采取一个或多个动作来增强或最大化其与环境交互的累积奖励的一些概念的任何系统或计算过程。执行强化学习(RL)过程的代理可能收到正或负强化，称为“即时奖励”，从在环境中采取一个或多个动作，因此将自身和环境置于各种新状态。

代理的目标可以是增强或最大化累积奖励的一些概念。例如，代理的目标可能是增强或最大化“折扣奖励函数”或“平均奖励函数”。“Q- 函数”可以表示从一个状态和在该状态下采取的动作可获得的最大累积奖励。“价值函数”和“广义优势估计器”可以表示从给定最优或最佳动作选择的状态中可获得的最大累积奖励。RL可以利用任何一种或多种此类累积奖励的概念。如本文所用，任何此类函数可被称为“累积奖励函数”。因此，计算最佳或最优累积奖励函数可能相当于为代理找到最佳或最优策略。

例如，代理及其与环境的交互可以被公式化为一个或多个马尔可夫决策过程(MDP)。RL过程可能不假设知道MDP的精确数学模型。 MDP可以是代理完全未知、部分已知或完全已知的。关于MDP的先验知识，RL过程可能位于“基于模型”或“无模型”两个范围之间的范围内。因此，RL过程可能针对大型MDP，其中由于MDP的未知或随机性质，确切的方法可能不可行或不可用。

RL过程可以使用本文描述的一个或多个计算机处理器来实现。数字处理单元可以利用进行训练、存储，然后部署“策略”以增强或最大化累积奖励的代理。可以在可能尽可能长或期望的时间段内寻求 (例如，搜索)该策略。这样的优化问题可以通过存储最优策略的近似、通过存储累积奖励函数的近似或两者来解决。在一些情况下，RL 过程可能存储此类函数的近似值的一个或多个表。在其他情况下，RL 过程可能使用一个或多个“函数逼近器”。

函数逼近器的实例可以包括神经网络(例如深度神经网络)和概率图形模型(例如，玻尔兹曼机、亥姆霍兹机和霍普菲尔德网络)。函数逼近器可以创建累积奖励函数的逼近的参数化。关于它的参数化函数逼近器的优化可以由以下组成：在增强或最大化累积奖励的方向上扰动参数，因此增强或优化策略(例如在策略梯度方法中)，或者通过扰动函数逼近器以更接近满足贝尔曼最优性准则(例如在时间差分方法中)。

在训练期间，代理可以在环境中采取动作以获得关于环境以及关于生存或更好效用的良好或最佳策略选择的更多信息。代理的动作可能是随机生成的(例如，尤其是在训练的早期阶段)，或者可能是由另一种机器学习范式(例如监督学习、模仿学习或本文描述的任何其他机器学习程序)规定的。可以通过选择更接近代理对增强或最佳策略是什么的感知的动作来改进代理的动作。就探索和开发之间的选择而言，各种训练策略可能位于政策外(off-policy)和政策上(on-policy) 方法的两个程度之间的范围中。

经训练的算法可被配置为接受多个输入变量并且基于多个输入变量产生一个或多个输出值。多个输入变量可以包括对应于特定基因的cf-mRNA转录本的存在或丰度，该基因是器官或组织特异性的。多个输入变量还可包括受试者的临床健康数据。一个或多个输出值可以包括受试者的状态或病症。例如，受试者的状态或病症可包括以下一项或多项：对骨髓消融、骨髓重建或骨髓移植的成功评估。此外，受试者的状态或病症可包括骨髓移植排斥、器官供体和受体匹配、肝移植、肝移植排斥、肺移植、肺移植排斥、心脏移植、心脏移植排斥、面部移植、面部移植排斥等。

经训练的算法可以包括分类器，以使得一个或多个输出值中的每一个包括固定数量的可能值中的一个(例如，线性分类器、逻辑回归分类器等)，指示通过分类器对受试者的状态或病症的分类。经训练的算法可以包括二元分类器，以使得一个或多个输出值中的每一个包括两个值(例如，{0、1}、{阳性、阴性}、{存在、不存在}或{高风险、低风险})之一，指示受试者的状态或病症的分类。经训练的算法可以是另一种类型的分类器，以使得一个或多个输出值中的每一个包括多于两个值(例如，{0、1、2}、{阳性、阴性、不确定}、{存在、不存在或不确定}或{高风险、中风险、低风险})之一，指示受试者的状态或病症的分类。

输出值可以包括描述性标签、数值或其组合。一些输出值可以包括描述性标签。这样的描述性标签可以提供受试者的状态或病症的鉴定或指示，并且可以包括例如阳性、阴性、存在、不存在、高风险、中风险、低风险或不确定。这样的描述性标签可以提供对受试者的状态或病症的治疗的鉴定，并且可以包括例如治疗性干预、治疗性干预的持续时间和/或适合治疗受试者的状态或病症的治疗性干预的剂量。此类描述性标签可提供可适合于对受试者进行的二次临床测试的鉴定，并且可包括例如血液测试、基因测试或医学成像。作为另一个实例，这样的描述性标签可以提供受试者的状态或病症的预后。作为另一个实例，这样的描述性标签可以提供受试者的状态或病症的相对评估。一些描述性标签可以映射到数值，例如，通过将“阳性”映射到1 和“阴性”映射到0。

一些输出值可以包括数值，例如二元、整数或连续值。这样的二元输出值可以包括例如，{0、1}、{阳性、阴性}、{存在、不存在}或 {高风险、低风险}。这样的整数输出值可以包括例如，{0、1、2}。这样的连续输出值可以包括例如，至少0且不大于1的概率值。这样的连续输出值可以包括例如，至少为0的未归一化的概率值。这样的连续输出值可以指示受试者的状态或病症的预后。一些数值可以映射到描述性标签，例如，将1映射到“阳性”或“存在”，和将0映射到“阴性”或“不存在”。

一些输出值可以基于一个或多个截止值来赋值。例如，如果受试者有至少50％的概率患有该状态或病症，则受试者的二元分类可以指定“阳性”、“存在”或1的输出值。例如，如果受试者有小于50％的概率患有该状态或病症，则受试者的二元分类可以指定“阴性”、“不存在”或0的输出值。在这种情况下，使用50％的单个截止值将受试者分类为两个可能的二元输出值之一。单个截止值的实例可包括约 1％、约2％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约 70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％和约99％。

作为另一个实例，如果受试者有至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、在至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更多的概率患有该状态或病症，则受试者的分类可以指定“阳性”、“存在”或1的输出值。如果受试者有大于约50％、大于约 55％、大于约60％、大于约65％、大于约70％、大于约75％、大于约 80％、大于约85％、大于约90％、大于约91％、大于约92％、大于约 93％，大于约94％、大于约95％、大于约96％、大于约97％、大于约 98％或大于约99％的概率患有该状态或病症，则受试者的分类可以指定“阳性”或1的输出值。

如果受试者有小于约50％、小于约45％、小于约40％、小于约 35％、小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约 10％、小于约9％、小于约8％、小于约7％、小于约6％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％或小于约1％的概率患有该状态或病症，则受试者的分类可以指定“阴性”、不存在或0的输出值。如果受试者有不大于约50％、不大于约45％、不大于约40％、不大于约 35％、不大于约30％、不大于约25％、不大于约20％、不大于约15％、不大于约10％、不大于约9％、不大于约8％、不大于约7％，大于约6％、不大于约5％、不大于约4％、不大于约3％、不大于约2％或不大于约1％的概率患有该状态或病症，则受试者的分类可以指定“阴性”或0的输出值。

如果受试者未被分类为“阳性”、“阴性”、“存在”、“不存在”、1 或0，则受试者的分类可以指定“不确定”或2的输出值。在这种情况下，两个截止值的集合用于将受试者分类为三个可能的输出值之一。截止值集合的实例可以包括{1％、99％}、{2％、98％}、{5％、95％}、 {10％、90％}、{15％、85％}、{20％、80％}、{25％、75％}、{30％、 70％}、{35％、65％}、{40％、60％}和{45％、55％}。类似地，可以使用n个截止值的集合将受试者分类为n+1个可能的输出值之一，其中 n是任何正整数。

可以用多个独立的训练样本来训练经训练的算法。每个独立的训练样本可以包含输入变量的数据集(例如，对应于在给定时间点从受试者收集的器官/组织特异性基因的cf-mRNA转录本的至少一个的存在或丰度，以及对应于受试者的一个或多个已知输出值(例如，状态或病症)。独立的训练样本可以包括从多个不同受试者获得或导出的输入变量和相关输出值的数据集。独立的训练样本可以包括在多个不同时间点(例如，定期地，例如每周、每两周或每月)从同一受试者获得的输入变量和相关输出值的数据集。独立的训练样本可以与状态或病症的存在相关联(例如，训练样本包括从已知具有状态或病症的多个受试者获得或导出的输入变量和相关输出值的数据集)。独立的训练样本可以与状态或病症的不存在相关联(例如，训练样本包括从已知没有状态或病症的先前诊断或已收到该状态或病症的阴性测试结果的多个受试者获得或导出的输入变量和相关输出值的数据集)。可以训练多个不同的经训练的算法，以使得多个经训练的算法中的每一个使用不同的独立训练样本集(例如，与不同状态或病症的存在或不存在对应的独立的训练样本集)来训练。

可以用至少约5、至少约10、至少约15、至少约20、至少约25、至少约30、至少约35、至少约40、至少约45、至少约50、至少约 100、至少约150、至少约200、至少约250、至少约300、至少约350、至少约400、至少约450、或至少约500个独立的训练样本来训练经训练的算法。独立的训练样本可以包括与状态或病症的存在相关联的输入变量的数据集和/或与状态或病症的不存在相关联的输入变量的数据集。经训练的算法可以用不大于约500、不大于约450、不大于约400、不大于约350、不大于约300、不大于约250、不大于约200、不大于约150、不大于约100或不大于约50个与状态或病症的存在相关联的独立训练样本来训练。在一些实施方案中，输入变量的数据集独立于用于训练经训练的算法的样本。

可以用与状态或病症的存在相关联的第一数量的独立训练样本和与状态或病症的不存在相关联的第二数量的独立训练样本来训练经训练的算法。与状态或病症的存在相关联的第一数量的独立训练样本可能不大于与状态或病症的不存在相关联的第二数量的独立训练样本。与状态或病症的存在相关联的第一数量的独立训练样本可能等于与状态或病症的不存在相关联的第二数量的独立训练样本。与状态或病症的存在相关联的第一数量的独立训练样本可能大于与状态或病症的不存在相关联的第二数量的独立训练样本。

机器学习算法可以用来自具有鉴定或诊断的病症的受试者(例如患有生殖障碍的女性)的样本的训练集来训练。机器学习算法可以用至少约5、10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、1000 或更多个样本进行训练。一经训练，机器学习算法就可用于处理从独立于来自训练集的样本的一个或多个样本生成的数据以至少约60％、 70％、80％、85％、90％、95％或更高的准确度鉴定一个或多个样本中的一个或多个特征(例如，cf-mRNA转录本水平、对应于基因的 cf-mRNA转录本的丰度或缺陷)。机器学习算法可用于处理数据以至少约60％、70％、80％、85％、90％、95％或更高的灵敏度鉴定一个或多个特征。机器学习算法可用于处理数据以至少约60％、70％、80％、 85％、90％、95％或更高的特异性鉴定一个或多个特征。

训练的算法可被配置为以至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更高的准确度鉴定本文公开的状态或病症；用于至少约5、至少约10、至少约15、至少约20、至少约25、至少约30、至少约35、至少约40、至少约45、至少约 50、至少约100、至少约150、至少约200、至少约250、至少约300、至少约350、至少约400、至少约450或至少约500个独立训练样本。通过训练的算法鉴定状态或病症的准确度可以计算为被正确鉴定或分类为具有或不具有状态或病症的独立测试样本(例如，已知具有该状态或病症的受试者或对于该状态或病症具有阴性临床测试结果的受试者)的百分比。

训练的算法可被配置为以至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更大的阳性预测值(PPV)鉴定状态或病症。使用经训练的算法鉴定状态或病症的PPV可以计算为被鉴定或分类为具有状态或病症的输入变量的数据集的百分比，其对应于真正具有该状态或病症的受试者。

训练的算法可被配置为以至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更大的阴性预测值(NPV)鉴定状态或病症。使用经训练的算法鉴定状态或病症的NPV可以计算为被鉴定或分类为不具有该状态或病症的输入变量的数据集的百分比，其对应于真正不具有该状态或病症的受试者。

经训练的算法可被配置为以至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约25％至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.1％、至少约99.2％、至少约99.3％、至少约99.4％、至少约至少约99.5％、至少约99.6％、至少约99.7％、至少约99.8％、至少约99.9％、至少约99.99％、至少约99.999％或更高的临床灵敏度鉴定状态或病症。使用经训练的算法鉴定状态或病症的临床灵敏度可以计算为与被正确鉴定或分类为具有该状态或病症的与该状态或病症的存在相关联的独立测试样本(例如，已知具有该状态或病症的受试者)的百分比。

经训练的算法可被配置为以至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.1％、至少约99.2％、至少约99.3％、至少约99.4％、至少约99.5％、至少约99.6％、至少约99.7％、至少约99.8％、至少约99.9％、至少约99.99％、至少约99.999％或更高的临床特异性鉴定状态或病症。使用经训练的算法鉴定状态或病症的临床特异性可以计算为被正确鉴定或归类为没有状态或病症的与该状态或病症的不存在相关的独立测试样本(例如，对于该状态或病症具有阴性临床测试结果的受试者)的百分比。

经训练的算法可被配置为以至少约0.50、至少约0.55、至少约 0.60、至少约0.65、至少约0.70，至少约0.75，至少约0.80，至少约 0.81，至少约0.82，至少约0.83，至少约0.84，至少约0.85，至少约 0.86，至少约0.87，至少约0.88、至少约0.89、至少约0.90、至少约 0.91、至少约0.92、至少约0.93、至少约0.94、至少约0.95、至少约 0.96、至少约0.97、至少约0.98、至少约0.99、或更大的接受者操作特征曲线下面积(AUROC)鉴定状态或病症。AUROC可以计算为与将输入变量的数据集分类为具有或不具有状态或病症的经训练的算法相关联的接受者操作特征(ROC)曲线的积分(例如，ROC曲线下的面积)。

可以调节或调整经训练的算法以改进鉴定状态或病症的性能、准确度、PPV、NPV、临床灵敏度、临床特异性或AUROC中的一个或多个。可以通过调节经训练的算法的参数(例如，用于对本文别处描述的输入变量的数据集进行分类的截止值的集合，或神经网络的参数或权重)来调节或调整经训练的算法。可以在训练过程中或在训练过程完成后不断调节或调整经训练的算法。

在最初训练经训练的算法之后，输入的子集可被鉴定为被包括的最有影响力或最重要的以进行高质量分类。例如，多个特征(例如，输入变量)的子集可以被鉴定为被包括的最有影响力或最重要的以对状态或条件进行高质量分类或鉴定。多个特征或其子集可以基于指示每个特征对进行状态或病症的高质量分类或鉴定的影响或重要性的分类度量来排序。在一些情况下，此类度量可用于显著减少输入变量 (例如，预测变量)的数量，这些输入变量可用于将经训练的算法训练到期望的性能水平(例如，基于期望的最小的准确度、PPV、NPV、临床灵敏度、临床特异性、AUROC或其组合)。例如，如果在经训练的算法中使用多个包含几十个或数百个输入变量来训练经训练的算法导致大于99％的分类准确度，则训练经训练的算法反而仅使用不大于约5、不大于约10、不大于约15、不大于约20、不大于约25、不大于约30、不大于约35、不大于约40、不大于约45、不大于约50 或不大于约100个在多个中这样最有影响或最重要的输入变量的选定子集可以产生降低但仍可接受的分类准确度(例如，至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％)。可以通过对整个多个输入变量进行排序并选择预定数量(例如，不大于约5个、不大于约10个、不大于约15个、不大于约20个、不大于约25个、不大于约30个、不大于约35个、不大于约40个、不大于约45个、不大于约50个或不大于约100个)的具有最佳分类度量的输入变量来选择该子集。

治疗靶标

疾病相关生物分子(例如，骨髓疾病相关生物标志物)的检测或定量可用于临床前治疗靶标发现。疾病相关生物分子的检测或定量可用于靶标接合的临床前测量。疾病相关生物分子的检测或定量可用于跟踪、检测和测量治疗/药物发现和开发的感兴趣靶标。

疾病相关无细胞mRNA(例如，骨髓疾病相关的无细胞mRNA) 的检测或定量可用于确定基因签名和生物标志物发现，用于临床前和临床研究中的患者分层。

疾病相关的无细胞mRNA(例如，骨髓疾病相关的无细胞mRNA) 的检测或定量可用于优化后期先导分子优化以用于进一步的临床开发。疾病相关无细胞mRNA的检测或定量可用于测量药效学，以在治疗/药物发现和开发过程中进行先导物优化和临床开发。此外，疾病相关无细胞mRNA的检测或定量可用于药代动力学(PK)和安全性和/或毒性评估。疾病相关无细胞mRNA的检测或定量可用于创建基因表达谱，其表征与用于治疗/药物发现和开发的特定靶点的接合相关的药效学效应。疾病相关无细胞mRNA的检测或定量可用于检测药效学靶标接合的变化以用于治疗/药物发现和开发。

疾病相关无细胞mRNA(例如，骨髓疾病相关的无细胞mRNA) 的检测或定量可用于测量在治疗该疾病的候选药物的早期临床开发中的靶标分子接合。疾病相关无细胞mRNA的检测或定量可用于选择IND申请的候选的方法中。疾病相关无细胞mRNA(例如骨髓疾病相关无细胞mRNA)的检测或定量可用于在设定的时间段内定期在时间点测量靶标分子接合。时间点可以等于或少于每1周、2周、3 周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周、15周、16周、17周、18周、19周、20周、21周、22 周、23周、24周或任何其他合适的时间段。时间点可以等于或大于每1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11 周、12周、13周、14周、15周、16周、17周、18周、19周、20 周、21周、22周、23周、24周或任何其他合适的时间段。设定的时间段可以小于或等于1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、 14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月、2年、3年、4年、5年或10年。设定的时间段可以大于或等于1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6 个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、 14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、 21个月、22个月、23个月、2年、3年、4年、5年或10年。

疾病相关的无细胞mRNA(例如，骨髓疾病相关的无细胞mRNA) 的检测或定量可用于制定终点以评估施用于受试者的治疗剂的相对治疗功效。

无细胞mRNA疾病签名(例如，无细胞mRNA骨髓疾病签名) 的发展可用于评估候选治疗剂的相对毒性或受试者对治疗剂的反应。例如，接受第一疾病的第一处方的受试者然后可以通过监测如本文公开的骨髓疾病相关的无细胞mRNA基因组来密切跟踪所给予的第一处方中的药物与候选治疗剂之间的毒性相互作用。

实施例

实施例1–不同的患者队列

适合自体骨髓移植的多发性骨髓瘤患者是从斯克里普斯骨髓移植中心(ScrippsBone Marrow Transplant Center)招募的。排除非分泌性疾病或浆细胞白血病患者。总共有3名患者参加了在整个细胞减灭调理和随后的住院期间每天采集的抽血。用大剂量美法仑进行为期 2天的调理方案消融骨髓，然后移植造血干细胞。连续每日收集，出院当天停止。随访骨髓活检发生在60-90天之间进行。作为该研究的部分，收集全血细胞计数(CBC)。血浆在采血后2小时内进行处理并储存。患者特征如表1所述。

表1：多发性骨髓瘤患者特征

招募促红细胞生成素(EPO)治疗的患者进行研究招募，条件是他们被给予促红细胞生成素作为常规医疗护理的一部分。排除潜在患者，如果他们：1)目前正在接受任何抗癌治疗；2)有任何原因引起的活动性溶血，或3)妊娠。从斯克里普斯诊所癌症中心的肾脏和血液学/肿瘤学诊所(Renal and Hematology/Oncology Clinics at Scripps ClinicCancer Center)征得患者同意并入组。根据标准临床护理，每月给予单剂量的促红细胞生成素。在第0天(EPO给药前)和EPO 给药后第1、4和10天采血。允许第4天和第10天的收集进行+/-1 天的调整以适应患者的日程安排。患者的子组同意扩大治疗方案，允许在多达30天内采集血液。也进行了CBC。在每个时间点测定无细胞血红蛋白(ARUP labs)和白蛋白水平(ARUP labs)。血浆在采血的2小时内进行处理，并储存在-80℃以进行批量处理。患者特征示出在表2中。

表2：EPO患者特征

PD-腹膜透析

健康对照。健康对照的全血从圣地亚哥血库获得。血浆/血清在采血2小时内进行处理，冷冻并储存在-80℃以进行批量处理。

G-CSF队列。从斯克里普斯招募准备捐赠外周收获的干细胞用于同种异体移植的正常健康个体，并登记为G-CSF队列的部分。总共有3名患者在其干细胞动员期间同意并献血。在第0天(G-CSF给药前)和G-CSF给药后第1、4、10天采集两管血液。允许第4天和第10天的收集进行+/-1天的调整以适应患者的日程安排，此外，第 10天的收集是任选的。通过白细胞去除术在第4天进行干细胞的外周收获。对每个样本进行CBC。血浆在采血的2小时内进行处理，并储存在-80℃以进行批量处理。患者特征示出在表3中。

表3：G-CSF患者特征

AML队列。已知患有急性髓系细胞白血病(AML)的患者，为准备进行亚清髓性治疗和同种异体干细胞移植作为标准护理的部分，在其整个治疗和干细胞移植过程中被招募进行每日抽血。本研究共入组3名患者(特征见表4)，亚清髓性治疗一般为6天，在移植前联用氟达拉滨和美法仑进行骨髓部分消融。在第0天施用从单个供体获得的造血干细胞，并在住院期间继续每天抽血。住院期间收集仅限于移植后第45天。进行随访常规骨髓活检。CBC是作为标准护理的部分收集的，数据被包含在本研究中。血浆在采血的2小时内进行处理，并储存以进行批量处理。其中两名AML患者接受约8周的监测，而收集第三名患者的血液样本直到移植后15天患者出院时。

表4：AML患者特征

*弥漫性大B-细胞淋巴瘤

**BM活检显示患者2缺乏巨核细胞发育

所有研究均得到其各自机构IRB的批准并且患者根据提交的研究方案同意。通过西方IRB协议#20162748维持血液采集和研究的批准，在该协议下收集健康对照样本。与斯克里普斯癌症中心和斯克里普斯绿色医院的血液和骨髓移植项目(Scripps CancerCenter and the Blood&Marrow Transplant Program at Scripps Green Hospital)合作下， G-CSF和EPO研究是在斯克里普斯机构审查委员会(Scripps Institutional ReviewBoard)批准的协议IRB-16-6808下进行的。涉及多发性骨髓瘤和急性髓系细胞白血病的造血骨髓移植的研究得到了斯克里普斯IRB协议IRB-17-6953的批准并与相同的小组合作进行。

实施例2–样本处理

将血液样本收集在EDTA管(BD#366643)中用于血浆处理或在 BD Vacutainer红顶凝血管(BD#367820)中进行血清处理。每个实验中使用的生物流体也在此实施例中的相应队列详细信息中指明。血液样本保存在室温下，并在抽血后两小时内处理样本。从500μl到1ml的血浆和血清体积用于提取。首先将样本以1900g离心10分钟。血浆和血清被分离到新管中。为了去除细胞碎片，将血清/血浆随后以 16000g离心。对于癌症患者血浆样本(多发性骨髓瘤和AML)，第二离心步骤以6000g进行。将血浆/血清样本立即冷冻并储存在-80℃下。避免冷冻/解冻循环。血沉棕黄层样本通过在血液样本初始离心后分离富含白细胞的血沉棕黄层获得。使用循环核酸试剂盒(Qiagen) 从血浆/血清中分离核酸。ERCC RNA Spike-混合料(Thermo Fisher Scientific,Cat.#4456740)在提取过程中根据制造商的说明(Ambion) 作为外源掺入对照添加。按照制造商的说明，用TRIzol LS (ThermoFisher)从全血和血沉棕黄层样本中提取核酸。随后，将RNA 和cf-RNA样本与3μl抑制剂抗性rDNase(Turbo DNase,Invitrogen) 一起孵育25分钟以去除任何残留的DNA，然后浓缩。将RNA在15μl 的无RNase的水中洗脱。cfRNA的数量、大小和完整性通过使用2100 生物分析仪(Agilent Technologies)在Agilent RNA 6000Pico芯片中运行1μl的样本来估计，并通过B-肌动蛋白qPCR确认。使用随机六聚体和NGS文库将25-30％的cf-RNA洗脱液转化为cDNA，并为 Illumina测序执行外显子组捕获。文库是使用Kapa定量试剂盒(Kapa) 通过qPCR和使用QuantiFluor ONE dsDNA试剂盒(Promega)在 Quantifluor(Agilent QuantusFluorometer,Promega)中进行定量，并在生物分析仪(Agilent Technologies)上使用高灵敏度DNA芯片 (Agilent Technologies)检测文库大小。根据制造商的说明，在NextSeq 500(Illumina)平台上合并和测序样本。

实施例3–序列数据处理、比对和转录组定量

使用FASTQ生成应用程序在Illumina BaseSpace平台上进行碱基判定。使用cutadapt(v1.11)去除衔接子序列，并修剪低质量碱基。短于15个碱基对的读数被排除在后续分析之外。然后使用STAR (v2.5.2b)和GENCODE 24版基因模型将读取序列与人类参考基因组GRCh38比对。通过调用samtools(v1.3.1)rmdup命令删除重复读取。使用RSEM(v1.3.0)从去重复的BAM文件中推断基因表达水平。

实施例4–差异表达分析

使用DESeq2(v1.12.4)进行不同条件之间的差异表达分析。RSEM 估计的读取计数用作DESeq2的输入。样本中读数少于20的基因被排除在此分析之外。使用R包limma(v3.28.21)检查差异表达基因的潜在基因本体富集。

实施例5–组织/细胞类型特异性基因

组织(细胞类型)特异性基因被定义为与其他组织(细胞类型) 相比在特定组织(细胞类型)中表现出高得多的表达的基因。组织(细胞类型)转录组表达水平的信息从以下两个公共数据库：用于51种人类组织的基因表达的GTEx(www.gtexportal.org/home/)和用于56 种人类造血细胞类型的基因表达的Blueprint Epigenome (www.blueprint- epigenome.eu/)获得。对于每个基因，将组织(细胞类型)按其特定基因的表达进行排序，如果顶部组织(细胞类型)的表达比所有其他组织(细胞类型)高>20倍，则该基因被认为特异于顶部组织(细胞类型)。为了建立BM富集的转录本，人BM RNA 从ThermoFisher购买并进行RNA-seq。随后，将BM转录组与全血转录组进行比较，以确定富集在BM和WB转录组的基因(倍数变化>5)。

实施例6–多发性骨髓瘤患者的免疫球蛋白基因库

对于克隆型组装，使用Trinity进行从头转录组组装。接下来，使用igBLAST(v2.5.1)将组装的重叠群与免疫球蛋白基因注释数据库 IMGT(www.imgt.org/)进行比较，以鉴定V(D)J组合。为了定量可变区基因的相对丰度，收集未与人类参考基因组对齐或与STAR注释的Ig基因对齐的读数，并使用igBLAST在IMGT数据库中映射序列。相对丰度计算为映射到特定Ig基因的读数数量与映射到任何Ig 基因的读数总数的比例。

实施例7–多发性骨髓瘤和AML样本的无监督聚类

选择满足以下两个标准的基因用于聚类：1)跨时间点的最大表达高于50TPM(每百万转录本)和2)最高表达与最低表达的比例大于5。对于每个选定的基因，通过将每个值除以所有时间点的最大值来归一化表达值。这种归一化的目的是使所有基因达到可比较的规模，并关注它们跨时间点的相对变化，而不是它们的绝对表达水平。然后进行K均值和层次聚类以找到具有相似时间表达模式的基因。

实施例8–使用非负矩阵分解(NMF)分解数据

在所有样本中表达低于20TPM的基因被排除在分解分析之外。对于每个剩余的基因，通过将每个值除以所有样本的最大值来归一化表达值。该归一化步骤的目的是使所有基因达到可比较的规模。然后对归一化值进行NMF以将基因分解为8-12个组分。NMF分解通过调用sciki-learn Python库中的“分解.NMF”类来实现。NMF分解以无监督的方式创建共享相似表达模式(跨样本相关)的基因组(组分)，从而揭示数据中的潜在结构。为了更好地注释发现的组分，选择富含特定组分的基因(即，组分中负载量最高的那些基因)并检查：1)它们在GTEx中的51个人体组织中的表达水平；2)它们在来自 Blueprint Epigenomeconsortium的55个人造血细胞类型中的表达水平；和3)它们的基因本体功能富集。如果这些基因中的大多数在某种细胞类型(例如，血小板)中表现出高表达或在某些生物过程中(例如，“血小板激活”和“凝血”)富集，则相应地命名该组分(例如，称其为“巨核细胞组分”)。通过整合这三个信息源，能够确定大多数组分的组织/细胞类型来源。

实施例9-cf-mRNA转录组富含造血祖细胞转录本

为了表征人类无细胞RNA转录组的景观，分离并测序了来自24 名健康供体的1ml血清的cf-mRNA。在该队列中，至少80％的样本中鉴定出10,357个>1TPM(每百万转录本)的转录本和7,386个>5 TPM的转录本，反映了健康受试者中cf-mRNA转录组的多样性和一致性。

表5：健康供体cf-mRNA中检测到的平均转录本数(n＝24)

TPM标准	>40％的样本	>60％的样本	>80％的样本
				TPM>1	12341	11393	10313
TPM>5	9414	8485	7334

表6：测序指标总结

*TPM大于等于2。A1和A2表示重复。PCC：皮尔逊相关系数

使用非负矩阵分解以无监督方式和基因表达参考数据库(GTEx 和Blueprint)分解cf-mRNA转录组，以估计不同组织和细胞类型的相对贡献(参见材料和方法)。在cf-mRNA中检测到的大多数转录本，平均-85％，是造血来源的(即，衍生自循环细胞和BM驻留细胞)，其余的-15％是非造血来源的(即，衍生自实体组织，图1A)。具体地，去卷积分析估计，平均地，-29％的转录本是巨核细胞/血小板来源(第一至第三四分位数范围23-36％)，-28％是淋巴细胞来源(范围18-30％)，12.8％是粒细胞来源(范围6-16％)、3％是嗜中性粒细胞祖细胞来源(范围0.2-3.7％)、11％是红细胞来源(范围8-14％) 和-15％％衍生自实体组织(范围11-20％)。(图1A)。为了深入了解这些转录本的来源，对来自先前报告的RNA-Seq数据的19名健康个体的全血液样本进行类似的去卷积分析。正如预期的那样，全血转录组主要由淋巴细胞(平均-69％)和粒细胞(平均-22％)转录本组成，另外还有-7％的红细胞来源的转录本，和少量来自其他细胞类型和组织的贡献(图1A)。这些分析代表对可能受不同因素影响的这些生物流体的转录组组成的估计。然而，数据显示cf-mRNA转录组的更高多样性，与全血相比，其包含更大比例的非造血转录本和衍生自BM的造血祖细胞基因。

为了确认循环中BM特异性转录本的存在，在来自健康供体的3 对全血(其包括血液的所有细胞组分)和血浆样本中进行RNA-Seq (图6A)并比较这些试样中主要的造血细胞类型特异性转录本(即，嗜中性粒细胞、红细胞、血小板/巨核细胞、T细胞)的水平(图1B、图6B-C)。在嗜中性粒细胞特异性转录本之间观察到显著差异(图 1B)。使用造血转录组学参考数据库(Blueprint)，与全血相比，在血浆中检测到显著更低水平的在成熟循环嗜中性粒细胞中表达的转录本(图1B)。相比之下，在BM驻留的嗜中性粒细胞祖细胞中表达的转录本在cf-mRNA中高度富集(图1B)。为了证实这些发现，对五个配对的血浆和血沉棕黄层样本(血沉棕黄层富含白细胞)进行 RNA-Seq。一致地，发现嗜中性粒细胞成熟和祖细胞转录本形成不同的群体(图1C)，其中与血沉棕黄层相比，cf-mRNA显示低水平的成熟转录本，例如趋化因子受体CXCR1和CXCR2(图1D，p<0.01)，但富含祖转录本例如PRTN3(成髓细胞素前体)、CTSG(组织蛋白酶G)和AZU1(天青杀素前体)(p<0.05，图1E，图6D和6E)。这些数据支持在cf-mRNA中存在BM转录本；事实上，对健康供体的造血转录本的二次编程去卷积分析表明，BM转录本贡献约9％的 cf-mRNA转录组，相比于全血中约1％。

为了进一步证实此结果，对人BM样本进行RNA-seq，并将其与全血转录组比较。鉴定BM转录组中富集的377个基因(>5倍，“BM 基因”)，如下表7所列，代表造血祖细胞(即，来自BM的嗜中性粒细胞祖细胞和间充质干细胞)。诸如PRTN3、CTSG和AZU1的祖转录本在BM转录组中富集的顶部转录本中。另外，鉴定出全血中富集的374个基因(>5倍，“WB基因”)(表8)，代表成熟循环血细胞基因，如预期(即，与成熟粒细胞和淋巴细胞相关)。随后，在三个匹配的全血和血浆样本中比较“BM基因”和“WB基因”的水平，其证实这些转录本分为两个群体(p<0.001)，其中与全血相比cf-mRNA 富集在造血祖基因(“BM基因”)中并且“耗竭”成熟基因(“WB基因”) (图1F和图6F)。总之，数据表明cf-mRNA转录组捕获了衍生自 BM的转录本，为非侵入性评估BM功能提供了窗口。

表7：与全血相比的骨髓富集基因列表

表8：与骨髓相比，全血中富集的基因列表

实施例10–在多发性骨髓瘤患者中通过cf-mRNA分析非侵入性测量骨髓特异性转录本

作为可以在cf-mRNA中检测到BM特异性转录本的进一步证据，为了评估它们的潜在效用，招募了三名多发性骨髓瘤(MM)患者。MM的特征是恶性浆细胞的克隆扩增和积累，几乎仅在BM中。这些细胞表达特异性免疫球蛋白(Ig)重排，与健康个体的浆细胞形成对比，其表达多种Ig组合。MM患者接受美法仑介导的BM消融(从第-2天开始)，然后自体造血干细胞(HSC)输注(第0天)(图2B)。在BM消融前(第-2天)从这些患者的1ml血浆中分离并测序 Cf-mRNA。对三名患者中的两名患者鉴定Ig重链(IgH)和Ig轻链 (IgL)转录本的克隆扩增。例如，在患者2中，检测到作为最普遍的Ig恒定区的IGHG1和IGKC转录本(图7A-7C)。对于可变区， Ighv3-15和Igkv2-24转录本在样本转录组中占主导地位，而未检测到克隆λ区(图2A、C和图7C)。相反，如预期的那样，在健康个体的血浆中没有观察到克隆转录本(图2A)。患者1中的类似分析揭示了由IgH恒定链IGHA1和可变区IGHV1-69，以及IgLλ链IGL1 和可变区IGLV1-40组成的克隆(图7D)。在这两种情况下，恶性克隆与从BM抽出物进行的分子检测一致(表1)。然而，对于患者3，没有检测到显性Ig重排(图7E)，可能是由于本研究开始时该患者 BM中的较少数量的浆细胞所致(表1)。MM患者的循环中很少发现恶性浆细胞；事实上，在化疗治疗前对患者2样本的匹配血沉棕黄层的RNA-Seq分析显示只有低水平的IgH和IgL转录本库，没有显性重排(图2A、C和图7A-7C)，突出了cf-mRNA捕获BM中浆细胞产生的克隆Ig转录本的独特能力。

表10：MM患者2血浆中BM消融和重建过程中血浆中的Ig转录本的水平(TPM)-κ轻链可变基因

表11：MM患者2血浆中BM消融和重建过程中血浆中的Ig转录本的水平(TPM)-重链可变基因

表12：MM患者2血浆中BM消融和重建过程中血浆中的Ig转录本的水平(TPM)-重链和轻链恒定区基因

表13：MM患者2血浆中BM消融和重建过程中血浆中的Ig转录本的水平(TPM)-λ轻链可变基因

表14：MM患者2血沉棕黄层中BM消融和重建过程中血浆中的Ig 转录本的水平(TPM)-重链和轻链恒定区基因

表15：MM患者2血沉棕黄层中BM消融和重建过程中血浆中的Ig 转录本的水平(TPM)-重链可变基因

表16：MM患者2血沉棕黄层中BM消融和重建过程中血浆中的Ig 转录本的水平(TPM)-λ轻链可变基因

表17：MM患者2血沉棕黄层中BM消融和重建过程中血浆中的Ig 转录本的水平(TPM)-κ轻链可变基因

为了测试cf-mRNA谱分析是否可用于监测恶性Ig克隆的水平，在化疗和移植后的两周内每天对来自这些患者血浆的cf-mRNA进行测序。虽然患者1在治疗后恶性克隆未见明显减少(图7D)，但是患者2显示在美法仑诱导的浆细胞凋亡后，cf-mRNA中降低水平的优势Ig变体(图2B-D和图7A-7C)。到第10天，免疫谱不再以克隆 Ig组合为主，表明成功的治疗和BM重建(图2B-D)。相比之下，在整个研究过程中，对匹配的血沉棕黄层级分进行的RNA-Seq显示关于恶性Ig转录本的非常有限的信息(图2C和图7A-7E)，支持 cf-mRNA非侵入性捕获BM活性的潜力。

实施例11–在BM消融和重建过程中cf-mRNA捕获造血谱系转录活性

为了进一步了解循环mRNA揭示BM转录活性的能力，使用原型 MM患者2在自体移植cf-mRNA后跟踪BM消融和重建动力学。此外，还研究了接受亚清髓性治疗，然后同种异体移植的急性髓系细胞白血病(AML)患者(参见实施例，对AML患者1和2监测8周，患者3在移植后2周出院)。在MM和AML患者的血浆cf-mRNA 中检测到的转录本的无监督聚类鉴定了几组基因的时间表达模式(图 3A、B)。基因本体富集分析和来自Blueprint Consortium的RNA-seq数据均表明许多已鉴定的组分对应于特定的造血谱系(图3A、B)。因此，在BM消融和重建过程中在循环中详细检查了表9中列出的造血谱系特异性转录本(即，红细胞、巨核细胞和嗜中性粒细胞)的动态。

表9：指定的造血谱系特异性转录本列表

首先，为了阐明红细胞循环转录本和RBC之间的关系，在血浆中检查红细胞谱系特异性转录本的水平，并在整个研究过程中研究 RBC计数。RBC是循环中的主要细胞类型，并且在血流21中稳定约 120天。事实上，在这些研究持续期间，在MM和AML患者中观察到RBC数量的非常小的变化(图3C-3D、图8A)。相比之下，所有患者中在化疗介导的BM消融后，cf-mRNA中的红细胞特异性转录本迅速减少，并在BM重建期间的较晚时间点恢复(图3C-D，图9A-9B、图8A)。cf-mRNA中RBC数量和红细胞转录本之间的巨大差异表明这些转录本不是衍生自循环的成熟RBC。因此，红细胞转录本衍生自BM或循环中的未成熟红细胞形式(网织红细胞)。对MM患者2的配对的血沉棕黄层样本进行RNA-Seq分析以进一步了解这些转录本的来源。化疗后CC中红细胞特异性基因的水平降低，类似于在 cf-mRNA中观察到的动态(图9C)，并表明网织红细胞是全血中大多数红细胞转录本的来源。然而，像GATA1这样的转录本是红细胞发育的关键转录调控因子，在BM重建过程中，在cf-mRNA中比在血沉棕黄层中更早地清楚地检测到(图9C)，表明它们的BM起源。总之，数据显示红细胞转录本衍生自驻留在BM和循环网织红细胞中的未成熟红细胞，而不是来自高度丰富的成熟RBC。

为了测试循环中CBC和谱系特异性转录本之间的差异是否扩展到其他造血细胞类型，比较了血小板计数和巨核细胞特异性转录本的动态。在MM患者2中，在移植后第9-10天，即在第12-13天发生的血小板计数恢复之前，在cf-mRNA中检测到巨核细胞特异性转录本水平的显著增加(图3E)。来自匹配的血沉棕黄层样本的RNA-Seq 显示，CC中的巨核细胞转录水平模仿了整个研究中血小板计数的动态(图9C)，并且与cf-mRNA不同，在BM重建期间，在CC中没有检测到巨核细胞转录本的早期恢复。这种差异表明在BM重建期间在cf-mRNA中检测到的巨核细胞转录本不是衍生自CC，而是衍生自 BM。支持这一观察结果，在AML患者1中，循环中的巨核细胞转录本在BM消融后减少并在第9天恢复，预示着血小板计数在第12-13出现增加(图3F)。令人惊讶地，AML患者2的cf-mRNA中没有出现该谱系的恢复(图8B)。随访BM活检证实该患者中缺乏巨核细胞发育(表1)，表明测量的巨核细胞信号的特异性。因此，数据表明cf-mRNA反映了BM在其重建过程中的巨核细胞转录活性。

最后，在治疗期间检查了MM和AML患者的循环中嗜中性粒细胞计数和特定转录本的动力学。在MM患者2中，嗜中性粒细胞计数显示两个峰值，一个在移植后立即出现，可能是由于G-CSF治疗，其随后由于BM消融而迅速下降，且第12天出现第二峰值，表明BM 重建(图3G)。这类似于手术过程中cf-mRNA和血沉棕黄层中嗜中性粒细胞特异性基因的整体动态(图3G、图9E)。然而，虽然在BM 重建过程中，血沉棕黄层和cf-mRNA中的嗜中性粒细胞转录本在与嗜中性粒细胞计数相似的时间达到峰值，但在干细胞移植后的第8-9 天，在cf-mRNA中大约提前2天嗜中性粒细胞前体基因如CTSG增加。支持这一观察结果的是，所有AML患者血浆中的祖嗜中性粒细胞转录本的水平在BM消融后降低，而在BM重建过程中cf-mRNA 的增加比嗜中性粒细胞计数早约5天(图3H-J和图8D)。这些数据进一步支持循环中的祖嗜中性粒细胞转录本并非衍生自CC，而是反映了粒细胞谱系的BM转录活性，提供了关于移植物移植和BM重建的有价值的信息。

还研究了正交方法以使用来自接受同种异体HSC移植的AML患者的cf-mRNA测量移植物移植，其中宿主和供体细胞之间存在遗传差异。使用SNP的参考数据库，在移植前在祖-嗜中性粒细胞转录本 (即，ELANE、AZU1和PRTN3)中鉴定了宿主特异性多态性。移植后，这些转录本被来自供体细胞的新遗传变异体取代(图4A)。事实上，cf-mRNA分析能够在患者1和2的治疗性治疗过程中监测这些转录本的变化(图4B-C)。对移植后宿主转变为不同遗传变异体 (即，从纯合子到杂合子)的所有检测到的SNP的综合分析表明，可以在cf-mRNA中鉴定出多种遗传差异以对移植物移植进行时间监测(图4D-E)。总而言之，数据显示cf-mRNA捕获了来自BM的遗传信息和转录活性，并能够监测来自供体细胞的移植物移植和BM重建。

实施例12–用生长因子刺激时谱系特异性转录活性反映在cf-mRNA 中

为了评估在用生长因子刺激后cf-mRNA监测特定BM谱系活性的潜力，从接受慢性维持促红细胞生成素(EPO)治疗的9名不同程度慢性肾衰竭患者获得血浆样本。EPO是一种肽激素，特异性提高BM 中红细胞的成熟和增殖速率。在EPO给药前(第0天)和治疗后长达30天的几个时间点获得样本。在研究持续期间，无血清血红蛋白和RBC数量显示出轻微瞬态变化。与RBC计数不同，EPO治疗后不久，9名患者的cf-mRNA中红细胞转录本的平均水平增加(图5A)。与未治疗的对照个体相比，在治疗后的最初几天期间，红细胞转录本的水平持续增加(图5A和5B)。事实上，参与血红素生物合成的关键红细胞发育转录本(即，ALAS2、HBB和HBA2)在几乎所有患者中都被诱导(9名患者中有8名患者)(图10A)。此外，在EPO治疗后第4天，血浆中鉴定出364个失调基因(p<0.05)。使用IPA (www.qiagenbioinformatics.com/ products/ingenuitypathway-analysis)的分析表明，“血红素生物合成II”是这些转录本的顶部富集途径 (p＝1.4e-9)，支持该细胞谱系的转录诱导。EPO治疗后30天，这些患者中的红细胞转录本恢复到基础表达水平(图5B和图10A-10C)。因此，纵向研究表明cf-mRNA水平反映了对红细胞谱系的特定瞬时刺激。

作为体内研究细胞谱系扰动时cf-mRNA变化的另一种方法，从接受G-CSF治疗(粒细胞集落刺激因子)的3名健康患者的收集样本，这是嗜中性粒细胞的一种众所周知的促生存因子。在治疗前及 G-CSF刺激后1、4、10天(10天时间点，仅2名患者可获得CBC) 抽血。正如预期的，G-CSF治疗后嗜中性粒细胞计数增加，在第4天达到峰值，并在第10天恢复到基础水平(图5C)。所有患者在G-CSF 治疗后血浆cf-mRNA中的嗜中性粒细胞特异性转录本均呈双峰增加 (图5C和图10B和10C)。由于G-CSF介导的粒细胞从BM转移到循环中，嗜中性粒细胞祖细胞特异性转录本在cf-mRNA中增加，与嗜中性粒细胞计数的峰值一致(图5C、图10B)。然而，在治疗后一天，成熟的嗜中性粒细胞转录本在cf-mRNA中迅速增加，预示着嗜中性粒细胞计数达到峰值(图5C、图10C)。这表明嗜中性粒细胞对G-CSF的直接和瞬时转录反应。事实上，先前报道的在体内和体外转录本响应于G-CSF在嗜中性粒细胞中增加(例如，IRAK3)或减少(例如，IFIT1)，遵循预期的趋势(图5D)。总而言之，结果表明cf-mRNA反映了对刺激的细胞类型特异性转录反应。

尽管已经在本文中示出和描述了本发明的优选实施例，但是对于本领域技术人员而言显而易见，这些实施方案仅作为实例提供。并非意图通过说明书中提供的特定实例来限制本发明。尽管已经参考前述说明书描述了本发明，但是本文中的实施方案的描述和图示并不意味着以限制性的意义来解释。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替换。此外，应当理解，本发明的所有方面不限于本文所阐述的具体描述、构造或相对比例，其取决于各种条件和变量。应该理解，本文描述的本发明的实施方案的各种替代方案可以用于实施本发明。因此，可以设想到，本发明还应涵盖任何这样的替代、修改、变化或等同形式。以下权利要求意在限定本发明的范围，并且由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同方案。

Claims (63)

1.一种监测受试者骨髓的疾病状态的方法，包括：

从具有所述疾病状态的所述受试者获得生物样本；和

检测衍生自驻留或源自所述骨髓的多个细胞的与第一多个基因相对应的第一多个无细胞mRNA(cf-mRNA)的cf-mRNA水平。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物样本包括血液样本。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述血液样本包括血清样本、血浆样本或血沉棕黄层样本。

4.根据权利要求1-3中的任一项所述的方法，其中所述疾病状态包括多发性骨髓瘤(MM)、白血病、骨髓增生性赘生物、骨髓增生异常综合征、淋巴瘤、血小板增多症、骨髓纤维化、真性红细胞增多症或贫血。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述疾病状态包括MM。

6.根据权利要求5所述的方法，其中当所述疾病状态包括MM时，所述第一多个基因包括IGHG1、IGHA1、IGKC、IGHV1、IGHV2、IGHV3、IGHV4、IGHV5、IGHV6、IGHV7、IGHV8、IGHV9、IGHV10、IGHV11、IGHV12、IGHV13、IGHV14、IGHV15、IGHV16、IGHV17、IGHV18、IGHV19、IGHV20、IGHV21、IGHV22、IGHV23、IGHV24、IGHV25、IGHV26、IGHV27、IGHV28、IGHV29、IGHV30、IGHV31、IGHV32、IGHV33、IGHV34、IGHV35、IGHV36、IGHV37、IGHV38、IGHV39、IGHV40、IGHV41、IGHV42、IGHV43、IGHV44、IGHV45、IGHV46、IGHV47、IGHV48、IGHV49、IGHV50、IGHV51、IGHV52、IGHV53、IGHV54、IGHV55、IGHV56、IGHV57、IGHV58、IGHV59、IGHV60、IGHV61、IGHV62、IGHV63、IGHV64、IGHV65、IGHV66、IGHV67、IGHV68、IGHV69、IGKV2、IGKV3、IGKV4、IGKV5、IGKV6、IGKV7、IGKV8、IGKV9、IGKV10、IGKV11、IGKV12、IGKV13、IGKV14、IGKV15、IGKV16、IGKV17、IGKV18、IGKV19、IGKV20、IGKV21、IGKV22、IGKV23、IGKV24、IGL1、IGLV 1-40或其组合。

7.根据权利要求4所述的方法，其中所述疾病状态包括急性髓系细胞白血病(AML)。

8.根据权利要求1-7中的任一项所述的方法，其中所述检测还包括将cf-mRNA转化为cDNA。

9.根据权利要求8所述的方法，还包括通过进行测序、阵列杂交或核酸扩增中的一种或多种来测量所述cDNA。

10.根据权利要求1-9中的任一项所述的方法，还包括提供治疗。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述治疗包括电离辐射、美法仑介导的骨髓消融、白消安介导的骨髓消融、苏消安介导的消融、化学疗法介导的消融、同种异体移植、自体移植、用生长因子刺激、自体或异源CAR-T细胞疗法、或其任何组合。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述用生长因子刺激包括用促红细胞生成素(EPO)刺激。

13.根据权利要求11所述的方法，其中所述用生长因子刺激包括用粒细胞集落刺激因子(G-CSF)模拟。

14.一种用于监测受试者器官的治疗状态的方法，包括：

从具有所述治疗状态的所述受试者获得血浆样本；和

检测衍生自所述受试者器官的对应于第二多个基因的第二多个无细胞mRNA(cf-mRNA)的cf-mRNA水平。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述器官是骨髓。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述生物样本包括血液样本。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述血液样本包括血清、血浆样本或血沉棕黄层样本。

18.根据权利要求15-17中的任一项所述的方法，其中所述治疗状态包括骨髓消融、骨髓重建、骨髓移植、用生长因子刺激、免疫疗法、免疫调节、泛素连接酶活性的调节、皮质类固醇、放射疗法，或自体或异源CAR-T细胞疗法。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述泛素连接酶活性的所述调节包括施用泛素连接酶抑制剂。

20.根据权利要求18所述的方法，其中所述骨髓消融包括物理消融、化学消融或其组合。

21.根据权利要求19所述的方法，其中所述物理消融包括电离辐射。

22.根据权利要求19所述的方法，其中所述化学消融包括美法仑介导的骨髓消融、白消安介导的骨髓消融、苏消安介导的消融、化学疗法介导的消融或其组合。

23.根据权利要求18所述的方法，其中所述骨髓移植包括同种异体移植。

24.根据权利要求18所述的方法，其中所述骨髓移植包括自体移植。

25.根据权利要求18所述的方法，其中所述用生长因子刺激包括用促红细胞生成素(EPO)刺激。

26.根据权利要求18所述的方法，其中所述用生长因子刺激包括用粒细胞集落刺激因子(G-CSF)模拟。

27.根据权利要求18所述的方法，其中当所述治疗包括骨髓消融时，对应于所述第二多个基因的所述第二多个cf-mRNA的水平降低，并且其中所述第二多个基因包含红细胞特异性基因。

28.根据权利要求18所述的方法，其中当所述治疗包括骨髓重建时，与在骨髓消融期间此类cf-mRNA水平相比，对应于所述第二多个基因的所述第二多个cf-mRNA的水平增加，并且其中所述第二多个基因包括红细胞特异性基因。

29.根据权利要求26或27所述的方法，其中所述红细胞特异性基因包含来自下组的一种或多种基因：GATA1、SLC4A1、TF、AVP、RUNDC3A、SOX6、TSPO2、HBZ、TMCC2、SELENBP1、ALAS2、EPB42、GYPA、C17orf99、HBA2、RHCE、HBG2、TRIM10、HBA1、HBM、HBG1、UCA1、GYPB、CTD-3154N5.2和Ac104389.1。

30.根据权利要求18所述的方法，其中当所述治疗包括骨髓重建时，对应于所述第二多个基因的所述第二多个cf-mRNA的水平增加，并且所述第二多个基因包含巨核细胞特异性基因。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述巨核细胞特异性基因包含来自下组的一种或多种基因：ITGA2B、RAB27B、GUCY1B3、GP6、HGD、PF4、CLEC1B、CMTM5、GP9、SELP、DNM3、LY6G6F、LY6G6D、XXbac-BPG3213.19和RP11-879F14.2。

32.根据权利要求18所述的方法，其中当所述治疗包括骨髓消融时，对应于所述第二多个基因的所述第二多个cf-mRNA的水平降低，并且其中所述第二多个基因包含嗜中性粒细胞特异性基因。

33.根据权利要求32所述的方法，其中当所述治疗包括骨髓移植时，与在骨髓消融期间此类cf-mRNA水平相比，对应于所述第二多个基因的所述第二多个cf-mRNA的水平增加，并且其中所述第二多个基因包括嗜中性粒细胞特异性基因。

34.根据权利要求18所述的方法，其中当所述治疗包括骨髓重建时，与在骨髓重建期间此类cf-mRNA水平相比，对应于所述第二多个基因的所述第二多个cf-mRNA的水平增加，并且其中所述第二多个基因包括嗜中性粒细胞特异性基因。

35.根据权利要求20-34中的任一项所述的方法，其中所述嗜中性粒细胞特异性基因包括祖-嗜中性粒细胞特异性基因。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述祖-嗜中性粒细胞特异性基因包括CTSG、ELANE、AZU1、PRTN3、MMP8、RNASE、PGLYRP1或其组合。

37.根据权利要求35或权利要求36所述的方法，其中检测到的对应于祖-嗜中性粒细胞特异性基因的所述cf-mRNA比所述血液样本中的多个嗜中性粒细胞出现得更早。

38.根据权利要求18所述的方法，其中当所述治疗包括同种异体移植时，检测对应于所述第二多个基因的所述第二多个cf-mRNA的水平，并且其中所述第二多个基因包含来自供体细胞的祖-嗜中性粒细胞特异性基因。

39.根据权利要求38所述的方法，其中当所述治疗包括用G-CSF模拟时，检测对应于所述第二多个基因的所述第二多个cf-mRNA的水平，并且其中所述第二多个基因包括嗜中性粒细胞特异性基因。

40.根据权利要求30-39中的任一项所述的方法，所述嗜中性粒细胞特异性基因包括来自下组中的一种或多种基因：PGLYRP1、LTF、ATP2C2、VNN3、CRISP3、CTSG、OLFM4、KRT23、MMP8、ARG1、EPX、PI3、CRISP2、STEAP4、LCN2、PRG3、KCNJ15、ALPL、FCGR38、S100A12、PROK2、CXCR1、CAMP、RNASE3、CEACAM3、AZU1、ABCA13、CXCR2、CTD-3088G3.8、PRTN3、ELAINE、CD177、LINC00671、ORM2、ORM1、HP和RP11-678G14.4。

41.一种监测受试者骨髓的健康状态的方法，包括：

从具有所述健康状态的所述受试者获得生物样本；和

检测衍生自所述受试者的骨髓及其衍生细胞的对应于第三多个基因的第三多个无细胞mRNA(cf-mRNA)的cf-mRNA水平。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述第三多个基因包含约至少45％、55％、65％或75％的衍生自骨髓及其衍生细胞的基因。

43.根据权利要求41所述的方法，其中所述第三多个基因包括来自表7的一种或多种基因。

44.根据权利要求41所述的方法，其中与对应于成熟嗜中性粒细胞特异性基因的cf-mRNA水平相比，对应于祖-嗜中性粒细胞特异性基因的所述第三多个cf-mRNA的水平增加。

45.根据权利要求41所述的方法，其中所述生物样本包括血液样本。

46.根据权利要求45所述的方法，其中所述血液样本包括血清样本、血浆样本或血沉棕黄层样本。

47.根据权利要求41所述的方法，其中所述检测还包括将cf-mRNA转化为cDNA。

48.根据权利要求47所述的方法，还包括通过进行测序、阵列杂交或核酸扩增中的一种或多种来测量所述cDNA。

49.一种测定活性剂的方法，包括：

评估在第一时间点受试者的第一无细胞表达谱；

向所述受试者施用活性剂；和

评估在第二时间点所述受试者的第二无细胞表达谱。

50.根据权利要求49所述的方法，其中所述第一无细胞表达谱或所述第二无细胞表达谱是骨髓特异性的。

51.根据权利要求49所述的方法，还包括将所述第一无细胞表达谱与所述第二无细胞表达谱进行比较。

52.根据权利要求49所述的方法，其中所述第一表达谱和所述第二表达谱之间的差异表明所述治疗的效果。

53.根据权利要求49-52中的任一项所述的方法，其中所述活性剂包括用于治疗疾病的药物化合物。

54.根据权利要求49-53中的任一项所述的方法，还包括评估在第三时间点所述受试者的第三无细胞表达谱。

55.根据权利要求49-54中的任一项所述的方法，其中评估包括测序、阵列杂交或核酸扩增中的一种或多种。

56.根据权利要求49-55中的任一项所述的方法，还包括评估在额外时间点所述受试者的额外的无细胞表达谱。

57.根据权利要求49-56中的任一项所述的方法，其中所述第二时间点是在所述第一时间点之后的一至四周。

58.根据权利要求49-57中的任一项所述的方法，还包括在12至24个月的时间段内评估所述额外的无细胞表达时间点。

59.根据权利要求58所述的方法，其中所述时间段为约18个月。

60.根据权利要求49-59中的任一项所述的方法，还包括跟踪和/或检测一种或多种无细胞表达谱以测量用于治疗和/或药物发现和/或开发的一种或多种感兴趣的靶标。

61.根据权利要求49-60中的任一项所述的方法，还包括在治疗和/或药物发现和开发期间测量用于先导物优化和/或临床开发的药效学。

62.根据权利要求49-61中的任一项所述的方法，还包括创建基因表达谱以表征与用于治疗和/或药物发现和/或开发的特定靶标的接合相关的一种或多种药效学效应。

63.根据权利要求49-62中的任一项所述的方法，还包括检测用于治疗和/或药物发现和开发的药效学靶标接合的变化。

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