CN113874519A - 在高密度生长平台上选择微生物分离物的方法 - Google Patents

Abstract

本公开提供了一种使用包括多个微型实验单位的装置的方法。在多个实验单位中的每个实验单位中装载至少一个细胞以及能够产生光信号的指示剂。培养具有装载内容物的装置以生长出多个细胞。在培养期间的多个时间点测量多个实验单位中的每个实验单位的内容物的至少一个光学特性，从而获得随时间变化曲线。对多个实验单位的随时间变化曲线进行分析，分析结果可用于从特定实验单位中选择/转移内容物以供进一步培养和/或分析，或以确定特定实验单位是否包括任何所关注的生物实体。

Description

在高密度生长平台上选择微生物分离物的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2019年3月11日提交的美国临时专利申请第62/816,854号的优先权，其公开内容据此以引用方式整体并入本文。

背景技术

在培养细胞的研究中，人们经常需要测量这些细胞分裂或增殖的速率。测量生长(或细胞分裂)的速率可以提供有关基本健康和细胞维持以及对特定药物的反应的有价值信息。

评估细胞增殖的一种常用方法是观察细胞中的整体DNA含量，无论是随着时间的推移还是作为终点分析。另一种测量增殖的方法是基于细胞的代谢，例如，通过使用四唑盐，诸如MTT、MTS或XTT(代谢活跃的细胞将这些盐还原为有色甲瓒，然后使用分光光度计检测)。

刃天青是一种蓝色染料，也是细胞增殖或活力测定中常用的氧化还原指示剂。它呈弱荧光，直到在代谢活跃的细胞周围被不可逆转地还原为粉红色和高度红色的荧光试卤灵。

发明内容

在一方面，本公开提供一种使用包括多个微型实验单位的装置的方法。该方法包括：在多个实验单位的每个实验单位中，提供至少一个细胞以及能够产生光信号的指示剂；在预定条件下将装置培养一段时间，以使得多个实验单位中的每个实验单位中的至少一个细胞生长出多个细胞；在培养期间的多个时间点测量多个实验单位中的每个实验单位的内容物的至少一个光学特性，从而获得多个实验单位中的每个实验单位的光学特性的随时间变化曲线；并且对多个实验单位的至少一个光学特性的随时间变化曲线进行分析。该方法可以进一步包括：基于对多个实验单位的至少一个光学特性的随时间变化曲线的分析，确定在多个实验单位中的至少一个实验单位中是否存在所关注的生物实体，诸如真核细胞或细菌细胞。

在一些实施例中，对多个实验单位的至少一个光学特性的随时间变化曲线的分析包括对多个实验单位的至少一个光学特性的随时间变化曲线进行比较。在特定实施例中，该方法进一步包括：如果确定多个实验单位中的两个或多个实验单位的至少一个光学特性的随时间变化曲线足够相似，则仅将来自两个或多个实验单位中的一个实验单位的多个细胞中的一些细胞转移到目标位置，或仅将来自两个或多个实验单位的每个实验单位的较小子集的多个细胞中的一些细胞转移到相应的目标位置。

在一些实施例中，对多个实验单位的至少一个光学特性的随时间变化曲线的分析包括识别随时间变化曲线的一个或多个特征。该一个或多个特征可包括以下中的一者或多者：在特定时间点的光学特性的强度、在不同波长下的至少一个光学特性的强度比、以及至少一个光学特性随时间的变化率。

在一些实施例中，该方法进一步包括：基于对多个实验单位的至少一个光学特性的随时间变化曲线的分析，将来自从多个实验单位中的至少一个实验单位的多个细胞中的一些细胞转移到至少一个目标位置。

在一些实施例中，该方法进一步包括：如果确定多个实验单位中的两个实验单位的至少一个光学特性的随时间变化曲线足够不同，则将来自两个实验单位中的每个实验单位的多个细胞中的一些细胞转移到相应的目标位置。

在一些实施例中，指示剂的至少一个光学特性包括荧光。在一些实施例中，指示剂能够在不同氧化还原状态下发射不同波长的荧光信号。在一些实施例中，指示剂是刃天青。在一些实施例中，指示剂对pH敏感。

在一些实施例中，提供至少一个细胞包括仅将一个细胞装载到多个实验单位中的每个实验单位中。

在一些实施例中，该装置是具有顶面的微制造装置，该顶面将微孔阵列限定为实验单位。多个微孔中的每个微孔的直径可为约25μm至约500μm。多个微孔的表面密度可为至少750个微孔/平方厘米。

在另一方面，本公开提供一种使用包括多个微型实验单位的装置的方法。该方法包括：在多个实验单位的每个实验单位中，提供至少一个细胞以及能够产生光信号的指示剂；在预定条件下将装置培养一段时间，以使得多个实验单位中的每个实验单位中的至少一个细胞生长出多个细胞；在培养期间或培养之后测量多个实验单位中的每个实验单位的内容物的至少一个光学特性；对测量到的多个实验单位中的每个实验单位的至少一个光学特性进行分析；并且基于分析，选择多个实验单位中的一个或多个实验单位中的多个细胞中的一些细胞。

在一些实施例中，测量至少一个光学特性包括在培养期间的多个时间点测量多个实验单位中的每个实验单位的内容物的至少一个光学特性。

在一些实施例中，对测量到的多个实验单位中的每个实验单位的至少一个光学特性进行分析包括对在相同时间点测量到的多个实验单位中的每个实验单位的至少一个光学特性进行比较。

在一些实施例中，对测量到的多个实验单位中的每个实验单位的至少一个光学特性进行分析包括对在多个时间点测量到的多个实验单位中的每个实验单位的至少一个光学特性进行比较。

在一些实施例中，该方法进一步包括：如果确定测量到的多个实验单位中的两个或多个实验单位的至少一个光学特性满足相似性阈值，则仅将来自两个或多个实验单位中的一个实验单位的多个细胞中的一些细胞转移到目标位置，或仅将来自两个或多个实验单位的每个实验单位的较小子集的多个细胞中的一些细胞转移到相应的目标位置。

在一些实施例中，对测量到的多个实验单位中的每个实验单位的至少一个光学特性进行分析包括计算在同一时间不同波长下测量到的至少一个光学特性的强度比。

附图说明

图1是示出了根据本公开的一些实施例的微制造装置或芯片的透视图。

图2A至图2C分别是示出了根据本公开的一些实施例的微制造装置或芯片的尺寸的顶视图、侧视图和端视图。

图3A和图3B分别是示出了根据本公开的一些实施例的微制造装置或芯片的分解图和顶视图。

图4示出了根据本公开的一些实施例的使用刃天青作为微制造芯片上的两种不同菌株的指示剂的测试结果。

图5包括根据本公开的一些实施例的微制造芯片上的孔以及这些孔的刃天青的随时间变化的荧光信号的快照图像。

图6示出了根据本公开的一些实施例的具有刃天青作为指示剂的微制造芯片上的孔内容物随时间的推移在两个荧光通道(绿色/红色)处的时程行为。

具体实施方式

本公开一般涉及用于分离、培养、取样和/或筛选生物实体的系统和方法。所公开的主题的一个目的是提供一种基于在高密度细胞培养平台上的细胞生长、代谢活性和/或活力来追踪、分析和/或筛选细胞分离物的方法。

本公开的方法论基于高度分区的系统或平台，该系统或平台包括高密度阵列或微型实验单位阵列，其中每个微型实验单位可容纳一个或多个细胞并提供独立且与其他微型实验单位分开的环境，以供细胞生长和增殖。

在一些实施例中，高密度细胞培养平台可以是用于接收包括至少一种生物实体(例如，至少一种细胞)的样本的微制造装置(或“芯片”)。术语“生物实体”可包括但不限于生物体、细胞、细胞组分、细胞产物和病毒，术语“物种”可用于描述分类的单位，包括但不限于，操作分类单元(OTU)、基因型、系统发育型、表型、生态型、履历、行为或相互作用、产物、变体和进化显著单元。

如本文所用，微制造装置或芯片可限定微孔(或实验单位)的高密度阵列。例如，包括“高密度”微孔的微制造芯片可包括每平方厘米约150个微孔至每平方厘米约160,000个或以上的微孔(例如每平方厘米至少150个微孔、每平方厘米至少250个微孔、每平方厘米至少400个微孔、每平方厘米至少500个微孔、每平方厘米至少750个微孔、每平方厘米至少1,000个微孔、每平方厘米至少2,500个微孔、每平方厘米至少5,000个微孔、每平方厘米至少7,500个微孔、每平方厘米至少10,000个微孔、每平方厘米至少50,000个微孔、每平方厘米至少100,000个微孔，或每平方厘米至少160,000个微孔)。微制造芯片的基板可包括约10,000,000个或10,000,000个以上的微孔或位置。例如，微孔阵列可包括至少96个位置、至少1,000个位置、至少5,000个位置、至少10,000个位置、至少50,000个位置、至少100,000个位置、至少500,000个位置、至少1,000,000个位置、至少5,000,000个位置，或至少10,000,000个位置。微孔阵列可以形成网格图案，并分组成单独的区域或区段。微孔的尺寸范围可以从纳米级(例如，直径从约1纳米到约100纳米)到微米级。例如，每个微孔的直径可为约1μm至约800μm、约25μm至约500μm或约30μm至约100μm。微孔的直径可为约1μm或小于1μm、约5μm或小于5μm、约10μm或小于10μm、约25μm或小于25μm、约50μm或小于50μm、约100μm或小于100μm、约200μm或小于200μm、约300μm或小于300μm、约400μm或小于400μm、约500μm或小于500μm、约600μm或小于600μm、约700μm或小于700μm，或约800μm或小于800μm。在示例性实施例中，微孔的直径可为约100μm或更小，或50μm或更小。微孔的深度可为约25μm至约100μm，例如约1μm、约5μm、约10μm、约25μm、约50μm、约100μm。微孔还可以具有更大的深度，例如约200μm、约300μm、约400μm、约500μm。微制造芯片可具有两个主表面：顶面和底面，其中微孔在顶面具有开口。微孔中的每个微孔可具有任何形状的开口或横截面，例如圆形、六边形、方形或其他形状。每个微孔可包括侧壁。对于其开口或横截面不是圆形的微孔，本文所述的微孔的直径是指具有等效面积的圆形的有效直径。例如，对于边长为10微米×10微米的方形微孔，具有等效面积(100平方微米)的圆的直径为11.3微米。每个微孔可包括一个或多个侧壁。侧壁可具有笔直、倾斜和/或弯曲的横截面轮廓。每个微孔包括底部，底部可以是平的、圆形的或其他形状。微制造芯片(其上具有微孔)可由聚合物(例如环烯烃聚合物)通过精密注射成型或压花等一些其他工艺制造。也可以使用其他结构材料，诸如硅和玻璃。芯片可具有基本上平坦的主表面。图1示出了微制造芯片的示意图，其边缘大体上平行于芯片上微孔的行和列的方向。

在一些实施例中，高密度细胞培养平台可以是基于液滴的，例如，离散滴群可用作实验单位以保持细胞、培养基以及用于细胞培养的其他组分，以代替作为微制造芯片上的实验单位的孔阵列。液滴生成方法(尤其是与芯片上细胞分选仪类型的仪器结合使用时)可用于使复杂的环境样本中的微生物生长并对其进行筛选。可在几百赫兹下产生液滴，这意味着可在几个小时内产生数百万滴。可使用简单的基于芯片的装置来生成液滴，并且可以将液滴设计成包含单个细胞。用于生成含有细胞悬浮液的液滴的系统可含有一个细胞或少量细胞。液滴可以是乳液、双乳液、水凝胶、气泡和复合颗粒等。例如，水性液滴可悬浮在不混溶的液体中，使它们彼此分开并且不接触或污染任何表面。液滴的体积可介于10fl至1μL之间，高度单分散的液滴可制成直径为从几纳米至500μm的范围。

基于液滴的微流控系统可用于生成、操纵和/或培养小液滴。细胞存活和增殖可类似于本体溶液中的对照实验。可在芯片上以例如每秒500滴的速率进行液滴的荧光筛选。可将液滴合并以形成新液滴或添加到液滴中的试剂。可将液滴通过排成单行的微通道，并通过光谱法进行检测，例如，使用荧光检测器检测液滴发出的荧光，并且可通过分流至可汇集或收集液滴的分支通道来选择确定满足特定标准的液滴(例如，发出特定波长的荧光)。可通过阀门、泵、施加外部电场等来实现流体的分流或切换。

微制造芯片上的高密度微孔可用于进行各种实验，诸如各类物种的细菌和其他微生物体(或微生物)诸如需氧、厌氧和/或兼性需氧微生物的生长、培养或筛选。微孔可用于进行真核细胞诸如哺乳动物细胞的实验。此外，微孔可用于进行各种基因组或蛋白质组学实验，并可包含细胞产物或组分，或其他化学或生物物质或实体，诸如细胞表面(例如，细胞膜或细胞壁)、代谢物、维生素、激素、神经递质、抗体、氨基酸、酶、蛋白质、糖类、ATP、脂质、核苷、核苷酸、核酸(例如，DNA或RNA)、化学品，例如，染料、酶底物等。

细胞可以是古细菌、细菌或真核生物(例如真菌)。例如，细胞可以是微生物，诸如需氧、厌氧或兼性需氧微生物。病毒可以是噬菌体。其他细胞组分/产物可包括但不限于蛋白质、氨基酸、酶、糖类、三磷酸腺苷(ATP)、脂质、核酸(例如DNA和RNA)、核苷、核苷酸、细胞膜/细胞壁、鞭毛、菌毛、细胞器、代谢物、维生素、激素、神经递质和抗体。

通常提供营养物以培养细胞。营养物可以是限定的(例如限定化学成分培养基或合成培养基)或不限定的(例如基础培养基或复合培养基)。营养物可包括实验室配制的和/或商业制造的培养基(例如，两种或多种化合物的混合物)，也可以是其组分。营养物可包括液体营养培养基(即，营养肉汤)，诸如海洋肉汤、溶原肉汤(例如，Luria肉汤)等，也可以是其组分。营养物可包括与琼脂混合的液体培养基以形成固体培养基和/或市售制造的琼脂平板，诸如血琼脂，也可以是其组分。

营养物可包括选择性培养基，也可以是选择性培养基的组分。例如，选择性培养基可用于仅特定生物实体的生长或仅用于具有特定特性(例如，抗生素抗性或特定代谢物的合成)的生物实体的生长。营养物可包括差异培养基，也可以是其组分，以在存在特定指示剂(例如，中性红、酚红、曙红y或亚甲基蓝)的情况下，通过使用生化特征将一种类型的生物实体与另一种类型的生物实体或其他类型的生物实体区分开来。

营养物可包括源自自然环境的提取物或培养基，也可以是其组分。例如，营养物可源自对特定类型的生物实体而言是天然的环境、不同的环境或多个环境。环境可包括但不限于以下中的一者或多者：生物组织(例如，结缔组织、肌肉、神经、上皮、植物表皮、血管、地面等)、生物液体或其他生物产物(例如，羊水、胆汁、血液、脑脊液、耵聍、渗出液、粪便、胃液、间质液、细胞内液、淋巴液、牛奶、粘液、瘤胃内容物、唾液、皮脂、精液、汗液、尿液、阴道分泌物、呕吐物等)、微生物悬浮液、空气(包括例如不同的气体含量)、超临界二氧化碳、土壤(包括例如矿物质、有机物质、气体、液体、生物体等)、沉积物(例如农业、海洋等)、活有机物质(例如植物、昆虫、其他小生物和微生物)、死有机物质、饲料(例如草、豆类、青贮饲料、作物残余物等)、矿物、油或油产品(如动物、植物、石化)、水(例如天然淡水、饮用水、海水等)和/或污水(例如卫生、商业、工业和/或农业废水和地表径流)。

图1是示出了根据一些实施例的微制造装置或芯片的透视图。芯片100包括以显微镜载玻片形式成形的基板，在顶面102上具有注模特征结构。这些特征结构包括四个单独的微孔阵列(或微阵列)104以及喷射器标记106。每个微阵列中的微孔以网格图案排列，芯片100的边缘周围以及微阵列104之间具有无孔边缘。

图2A至图2C分别是示出了根据一些实施例的芯片100的尺寸的顶视图、侧视图和端视图。在图2A中，芯片100的顶部约为25.5mm×75.5mm。在图2B中，芯片100的端部约为25.5mm×0.8mm。在图2C中，芯片100的侧面约为75.5mm×0.8mm。

在将样本装载到微制造装置上之后，可将膜施用到微制造装置的至少一部分上。图3A是根据一些实施例从图3B的俯视图所示的微制造装置300的分解图。装置300包括具有孔阵列302的芯片，孔阵列302容纳有例如土壤微生物。膜304放置在孔阵列302的顶部。垫圈306放置在膜304的顶部。具有填充孔310的盖308放置在垫圈306的顶部。最后，将密封带312施用到盖308上。

膜可以覆盖包括一个或多个实验单位、孔或微孔的微制造装置的至少一部分。例如，将样本装载到微制造装置上之后，可将至少一张膜施用于高密度微孔阵列的至少一个微孔上。可将多张膜施用于微制造装置的多个部分上。例如，可将单独的膜施用于高密度微孔阵列的单独子区段上。

膜可以连接、附着、部分附着、贴附、密封和/或部分密封至微制造装置以将至少一种生物实体保持在高密度微孔阵列的至少一个微孔中。例如，可使用层压法将膜可逆地贴附到微制造装置上。可将膜刺破、剥离、分离、部分分离、移除和/或部分移除，以接近高密度微孔阵列的至少一个微孔中的至少一个生物实体。

可将至少一个实验单位、孔或微孔中的细胞群的一部分附着于膜(例如通过吸附)。如果是这样，可通过剥离膜来取样至少一个实验单位、孔或微孔中的细胞群，使得至少一个实验单位、孔或微孔中的细胞群的一部分保持附着于膜。

膜可以是不可渗透的、半渗透的、选择性渗透的、差异渗透的和/或部分渗透的，以允许至少一种营养物扩散到高密度微孔阵列的至少一个微孔中。例如，膜可包含天然材料和/或合成材料。膜可包括水凝胶层和/或滤纸。在一些实施例中，选择孔径足够小的膜，以将至少部分或全部细胞保持在微孔中。对于哺乳动物细胞，孔径可能只有几微米，但仍能保持细胞。然而，在一些实施例中，孔径可小于或等于约0.2μm，诸如0.1μm。不可渗透的膜的孔径接近于零。应当理解，膜可具有复杂的结构，其可能具有也可能不具有限定的孔径。

在一方面，本公开提供操作具有限定微孔阵列的顶面的微制造装置的方法，如本文所述的那些微制造装置。该方法可用于筛选或确定样本中的至少一种所关注的生物实体，或用于培养、分析和处理微生物的分离物。

如果多个孔(或液滴等)显示相似的荧光特性，则采用传统方法(诸如用于高密度细胞培养平台的刃天青)将难以区分一个实验单位与另一个实验单位的内容物。如果可以确定这些实验单位都包含相同物种的细胞，则可通过从这些实验单位中挑选/转移一些细胞来完成下游分析。本文公开的方法可用于实现该目的和其他目的。

在该方法的一些实施例中，在装置的多个实验单位中的每个实验单位中，装载以下物质：(a)来自样本的至少一个细胞；(b)任选一定量的营养物；(c)能够产生光信号的指示剂。如果该装置是微制造装置并且该实验单位是微制造装置上的微孔，则可将覆盖膜施用于微制造装置，以将至少一个细胞保持在多个微孔中的每个微孔中。然后，在预定条件下培养具有装载的物质的装置一段时间，以使得多个实验单位中的每个实验单位中的至少一个细胞生长出多个细胞。可在培养期间和/或培养之后的一个或多个时间点测量多个实验单位中的每个实验单位的内容物的一种或多种光学特性(或简称为实验单位的光学特性)。如果进行多个时间点测量(例如，从2到1000，或从2到100，或从2到10的任意数量的测量次数，例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10)，则可根据这些测量构建多个实验单位中的每个实验单位的至少一个光学特性的随时间变化曲线。在一些实施例中，进行至少3个时间点测量。在一些实施例中，进行至少4个时间点测量。在一些实施例中，进行至少5个时间点测量。在一些实施例中，进行至少10个时间点测量。在一些实施例中，进行至少20个时间点测量。在一些实施例中，进行至少30个时间点测量。在一些实施例中，进行至少50个时间点测量。在一些实施例中，进行至少100个时间点测量。在一些实施例中，进行至少200个时间点测量。在一些实施例中，进行至少500个时间点测量。在一些实施例中，进行至少1000个时间点测量。进行多个时间点测量的时间间隔可以是有规律的，例如可以每10分钟、每20分钟、每30分钟、每小时、每2小时、每3小时、每4小时等测量一次实验单位的光学特性(或多个特性)，或者时间间隔可以是不规律的或在观察过程中动态变化，并且基于之前的测量结果进行选择。

可分析多个实验单位的至少一个光学特性的随时间变化曲线或至少一个光学特性的单点测量结果。分析可提供丰富的信息，并且可采取不同的后续行动。在特定实施例中，可基于分析来确定在多个实验单位中的至少一个实验单位中是否存在所关注的生物实体(例如，如果事先已知所关注的生物实体的曲线)。此外或可选地，基于分析，可做出关于将选择多个实验单位中的哪个(多个)实验单位的决定，从中可挑选细胞的一部分并将其转移到新位置或生长环境以供下游工作和分析。例如，基于分析，可将实验单位(培养之后)中的细胞分离物分类为不同的组，并且可从每组中挑选/转移选定实验单位(不是所有实验单位)中的细胞分离物以供下游工作。

在一些实施例中，如果确定所关注的生物实体存在于至少一个实验单位中，则可将来自至少一个实验单位的多个细胞中的一些细胞转移到目标位置，例如转移到细胞培养基以供进一步生长/培养，或以供进一步识别和分析(例如，DNA测序)。如本文中与细胞数量相关而使用的，本申请中的“一些”一词是指一个或多个。

在一些实施例中，对多个实验单位的光学特性的随时间变化曲线的分析包括对多个实验单位的光学特性的随时间变化曲线进行比较。例如，在一些实施例中，如果确定多个实验单位中的两个或多个实验单位的光学特性的随时间变化曲线足够相似，则可仅将来自两个或多个实验单位中的一个实验单位的多个细胞中的一些细胞转移到目标位置，或者仅将来自两个或多个实验单位的每个实验单位的较小子集的多个细胞中的一些细胞转移到相应的目标位置。这样，微制造芯片的用户可以恢复具有更好多样性的细胞分离物，以供下游分析。两个随时间变化曲线或曲线的相似性(或不相似性)可以基于预定标准，诸如两条曲线之间信号强度坐标上的归一化均方距离、两条曲线下的归一化面积，或通过Kolmogorov–Smirnov检验。相似性测试的阈值可因具体应用而异。例如，其可取决于有多少目标位置或点可用于或需要用于转移细胞分离物。

在一些实施例中，对多个实验单位的至少一个光学特性的随时间变化曲线的分析包括识别随时间变化曲线的一个或多个特征。此类特征可包括：在特定时间点的至少一个光学特性的特点、在特定时间点的至少一个光学特性的强度、在不同波长下的至少一个光学特性的强度比、至少一个光学特性随时间的变化率、在特定时间窗口之间的至少一个光学特性的总体趋势、随时间变化曲线的拐点数量等。这些提取的特征可用于区分不同的随时间变化曲线，并且可被视为在对不同的随时间变化曲线进行比较之前的准备步骤。

在一些实施例中，如果确定多个实验单位中的两个实验单位的光学特性的随时间变化曲线不相似，则可将来自两个实验单位中的每个实验单位的多个细胞中的一些细胞转移到相应的目标位置，例如，转移到细胞培养基，以供进一步生长/培养，或以供进一步识别和分析(例如DNA测序)。鉴于目标位置的数量有限，人们可以选择高密度细胞培养装置上的具有最多样化观察到的光学特性或光学特性的时程曲线的那些实验单位，以转移到相应的目标位置，从而提高细胞分离物收获的多样性。

可以使用图像捕获和分析硬件和软件对每个实验单位的一种或多种光学特性进行单独监测。光学特性可以是荧光、磷光、其他发光特性、光密度、光散射特性、拉曼发射，或者仅仅是指示剂的颜色(即比色法)。可以组合使用相同指示剂(光学剂)的两种或多种光学特性，或具有不同光学特性的两种或多种指示剂，以产生更丰富的数据集以供分析。

可以在培养期间的一个或多个特定时间点同时(或在非常短的时间间隔内，例如在几秒内)测量每个实验单位的光学特性。如果进行多次测量(最好以较好的频率)，则可获得光学特性变化的时程曲线。

指示剂可以是能够在不同氧化还原状态下发射不同波长的荧光信号的化合物或物质。例如，指示剂可以是刃天青。在其他示例中，指示剂可以是对周围介质的pH敏感的pH指示剂。在进一步的示例中，实验单位的光密度可用作分析和确定后续采取什么行动的基础。

在一些实施例中，至少一种所关注的生物实体包括真核细胞或细菌。在一些实施例中，样本包含多个不同物种或属的微生物细胞。

在一些实施例中，装载方式是平均将一个细胞装载到多个实验单位中的每个单位中。优选地，每个实验单位装载一个细胞。或者，每个实验单位的子集仅装载一个细胞(而其他实验单位未装载任何细胞)。这样，保证每个实验单位中生长的细胞分离物是单一物种，而不是不同物种的混合物。

在一些实施例中，每个实验单位的直径为约25μm至约500μm。在一些实施例中，实验单位阵列的表面密度为每平方厘米至少750个微孔。在一些实施例中，微孔阵列中的两个相邻实验单位之间的间距小于500μm(中心到中心)。

实施例1.

刃天青/试卤灵系统的一个特点是试卤灵可被进一步还原成二氢试卤灵，二氢试卤灵本身是无荧光的。这通常是一个问题，因为这代表着系统中的信号丢失。然而，如果遵循荧光的时程，则可以区分不同的微生物。

第一个还原步骤的中点约为+380mV(在某种程度上取决于培养基)，这意味着它很容易被电子传输链的所有常用组分还原：FMNH₂、FADH₂、NADH、NADPH和细胞色素。然而，第二个步骤发生在-110mV，虽然不难实现，但并非在所有情况下都会发生。是否存在第二个还原步骤可用于区分微生物。

在微制造芯片上使用刃天青作为指示剂的测试中，两种不同的菌株(粘质沙雷氏菌和铜绿假单胞菌)在相同的R2A培养基中生长相同的48小时，产生明显不同的结果，如图4所示。含有沙雷氏菌的孔显示第一个还原步骤比相邻的孔更亮。含有假单胞菌的孔颜色更深，因为它们已经经历了第一个还原步骤和第二个还原步骤两者。通过选择一些显示一个还原步骤的孔以及一些显示两个还原步骤的孔以用于下游分析，可改善从多个微孔转移的物种/分离物的多样性。

生长动态显著地因物种而异。通常，当被放入新鲜培养基时，不同的菌株表现出延滞生长期(生长缓慢或无生长)、指数生长期(指数级生长)、稳定生长期(无生长)，然后是死亡/衰退。不同的微生物可能具有较长或较短的延滞时间或生长到更高或更低的稳定状态等。通过跟踪刃天青的信号的时程，获得了每个孔的这些阶段的图表。请参见图5。

有生长的孔不同于无生长的孔，但通过监测含有正在生长的细胞的孔随时间的推移产生的荧光，可提取到更多信息。这种微生物具有短暂的延滞期，然后在大约一天内快速生长并以高密度稳定下来。来自不同孔的不相似的时程信号可用于区分细胞分离物。当多个孔显示相似的荧光时程曲线时，这些孔中的生物可能是相同或密切相关的生物，但可能需要进一步分析。

在多个时间点监测多种波长的刃天青荧光，为从芯片中选择最大多样的微生物种群提供了有用的支持信息。这样，可在收获前确定大量分离物之间的多样性，从而减少下游分析的时间/成本。在测试中，微制造芯片上的微孔要么是空的，要么装载了沙雷氏菌，或要么装载了假单胞菌。最初，所有的微孔看起来都一样(每个孔均装载有刃天青)，但第2天获得的数据显示有细菌的孔和空孔之间存在很大差异，而到第3天，可通过指示剂的光学特性的变化来区分两种细菌菌株。图6显示了在以刃天青作为指示剂的微制造芯片上，在两个荧光通道(绿色/红色)处，这些微孔的孔内容物随时间推移的时程行为。在图6中，微孔1表示那些空的微孔(未装载细胞或无生长)；微孔2表示那些含有假单胞菌的微孔，其在第2天显示高绿色，到第3天显示低绿色；微孔3表示那些含有沙雷氏菌的微孔，其在第2天显示高绿色，在第3天仍然显示高绿色。

其他参数，诸如光学特性的变化率、光学特性的强度(其是在特定时间点的变化率的子集)、在不同波长通道中的信号强度的比率，可用于区分不同孔中的细胞分离物。

刃天青对pH也非常敏感。可通过观察刃天青信号的变化来研究微生物，微生物会改变其生长所在的培养基的pH。随着pH降至远低于其pKa(约6.5)，试卤灵的溶解性会变得越来越低。在低pH条件下，无论波长如何，都可以观察到荧光信号的强度急剧下降。

虽然本文已经描述和图示了各种实施例，但本领域普通技术人员将容易地设想用于执行本文所述的功能和/或获得本文所述的结果和/或实现本文所述的一个或多个优点的各种其他手段和/或结构，并且此类变化和/或修改中的每一者均视为落在本文所述的发明实施例的范围之内。更一般而言，本领域技术人员将易于理解，本文所述的所有参数、尺寸、材料和配置均是示例性的，并且实际的参数、尺寸、材料和/或配置将取决于使用本发明示教的一个或多个特定应用。本领域技术人员仅使用常规实验就会认识到或能够确定本文所述的本发明特定实施例的诸多等效实施方案。因此，应当理解，前述实施例仅通过示例的方式呈现，并且在所附权利要求书及其等效物的范围之内，可以以不同于具体描述和要求保护的方式来实施本发明的实施例。

Claims (28)

1.一种使用包括多个微型实验单位的装置的方法，所述方法包括：

在所述多个实验单位的每个实验单位中，提供至少一个细胞以及能够产生光信号的指示剂；

在预定条件下培养所述装置一段时间，以使得所述多个实验单位中的每个实验单位中的所述至少一个细胞生长出多个细胞；

在培养期间的多个时间点测量所述多个实验单位中的每个实验单位的内容物的至少一个光学特性，从而获得所述多个实验单位中的每个实验单位的所述光学特性的随时间变化曲线；以及

对所述多个实验单位的所述至少一个光学特性的所述随时间变化曲线进行分析。

2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括：

基于对所述多个实验单位的所述至少一个光学特性的所述随时间变化曲线的所述分析，确定在所述多个实验单位中的至少一个实验单位中是否存在所关注的生物实体。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，对所述多个实验单位的所述至少一个光学特性的所述随时间变化曲线的所述分析包括对所述多个实验单位的所述至少一个光学特性的所述随时间变化曲线进行比较。

4.根据权利要求3所述的方法，进一步包括：

如果确定所述多个实验单位中的两个或多个实验单位的所述至少一个光学特性的所述随时间变化曲线足够相似，则仅将来自所述两个或多个实验单位中的一个实验单位的所述多个细胞中的一些细胞转移到目标位置，或仅将来自所述两个或多个实验单位的每个实验单位的较小子集的所述多个细胞中的一些细胞转移到相应的目标位置。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，对所述多个实验单位的所述至少一个光学特性的所述随时间变化曲线的所述分析包括识别所述随时间变化曲线的一个或多个特征。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述一个或多个特征包括以下中的一者或多者：在特定时间点的所述光学特性的强度、在不同波长下的所述至少一个光学特性的强度比、以及所述至少一个光学特性随时间的变化率。

7.根据权利要求1所述的方法，进一步包括：

基于对所述多个实验单位的所述至少一个光学特性的所述随时间变化曲线的所述分析，将来自所述多个实验单位中的至少一个实验单位的所述多个细胞中的一些细胞转移到至少一个目标位置。

8.根据权利要求1所述的方法，进一步包括：

如果确定所述多个实验单位中的两个实验单位的所述至少一个光学特性的所述随时间变化曲线足够不同，则将来自所述两个实验单位中的每个实验单位的所述多个细胞中的一些细胞转移到相应的目标位置。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述至少一个光学特性包括荧光。

10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述指示剂能够在不同氧化还原状态下发射不同波长的荧光信号。

11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述指示剂是刃天青。

12.根据权利要求1所述的方法，其中，所述指示剂对pH敏感。

13.根据权利要求2所述的方法，其中，所述至少一种所关注的生物实体包括真核细胞。

14.根据权利要求2所述的方法，其中，所述至少一种所关注的生物实体包括细菌。

15.根据权利要求1所述的方法，其中，提供所述至少一个细胞包括仅将一个细胞装载到所述多个实验单位中的每个实验单位中。

16.根据权利要求1所述的方法，其中，所述装置是具有顶面的微制造装置，所述顶面将微孔阵列限定为实验单位。

17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述多个微孔中的每个微孔的直径为约25μm至约500μm。

18.根据权利要求16所述的方法，其中，所述多个微孔的表面密度为至少750个微孔/平方厘米。

19.一种使用包括多个微型实验单位的装置的方法，所述方法包括：

在多个实验单位的每个实验单位中，提供至少一个细胞以及能够产生光信号的指示剂；

在预定条件下培养所述装置一段时间，以使得所述多个实验单位中的每个实验单位中的所述至少一个细胞生长出多个细胞；

在培养期间或培养之后测量所述多个实验单位中的每个实验单位的内容物的至少一个光学特性；

对所述测量到的所述多个实验单位中的每个实验单位的至少一个光学特性进行分析；以及

基于所述分析，选择所述多个实验单位中的一个或多个实验单位中的所述多个细胞中的一些细胞。

20.根据权利要求19所述的方法，其中，测量至少一个光学特性包括在培养期间的多个时间点测量所述多个实验单位中的每个实验单位的内容物的所述至少一个光学特性。

21.根据权利要求19所述的方法，其中，对所述测量到的所述多个实验单位中的每个实验单位的至少一个光学特性进行分析包括对在相同时间点测量到的所述多个实验单位中的每个实验单位的所述至少一个光学特性进行比较。

22.根据权利要求19所述的方法，其中，对所述测量到的所述多个实验单位中的每个实验单位的至少一个光学特性进行分析包括对在多个时间点测量到的所述多个实验单位中的每个实验单位的所述至少一个光学特性进行比较。

23.根据权利要求19所述的方法，进一步包括：

如果确定所述测量到的所述多个实验单位中的两个或多个实验单位的至少一个光学特性满足相似性阈值，则仅将来自所述两个或多个实验单位中的一个实验单位的所述多个细胞中的一些细胞转移到目标位置，或仅将来自所述两个或多个实验单位的每个实验单位的较小子集的所述多个细胞中的一些细胞转移到相应的目标位置。

24.根据权利要求19所述的方法，其中，对所述测量到的所述多个实验单位中的每个实验单位的至少一个光学特性进行分析包括计算在同一时间不同波长下测量到的所述至少一个光学特性的强度比。

25.根据权利要求19所述的方法，其中，至少一个光学特性包括荧光。

26.根据权利要求19所述的方法，其中，所述指示剂能够在不同氧化还原状态下发射不同波长的荧光信号。

27.根据权利要求19所述的方法，其中，所述指示剂是刃天青。

28.根据权利要求19所述的方法，其中，所述指示剂对pH敏感。

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