CN113855803B - Prmt5抑制剂在用于制备听力保护药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药领域，公开了PRMT5作为药物靶点在听力保护中的应用，具体公开了PRMT5抑制剂在制备用于预防和/或治疗听力损伤的药物中的用途。作为听力保护的成分，PRMT5抑制剂能够有效预防听力损伤，或在听力损伤后给予有效治疗。本发明还公开了一种包含PRMT5抑制剂的用于听力保护的药物或试剂盒。本发明为听力损伤的预防、治疗提供新的思路，从而具有广泛临床应用前景。

Description

PRMT5抑制剂在用于制备听力保护药物中的用途

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及PRMT5抑制剂在用于制备听力保护药物中的用途。

背景技术

耳聋是人类最为常见的感觉障碍性疾病之一，在人生的各个阶段耳聋严重影响着患者的日常交流和工作，重度耳聋患者甚至因此失业、性格孤僻，婴幼儿、儿童和青少年耳聋患者影响语言发育及学习，对患者家庭和社会也造成了极大的负担。

内耳毛细胞(HCs)或螺旋神经节神经元(SGNs)死亡引起的听力损失称为感音神经性听力损失，是最常见的耳聋类型。目前已知感音神经性耳聋的病因有多种，包括耳毒性药物、噪声、遗传性、老年性、代谢性、自身免疫性疾病及肿瘤等。近年来，由于大量化疗药物和抗生素的广泛应用，药物性耳聋的发生率逐年上升，约占全部耳聋的30％-40％。药物性耳聋多表现以耳聋、耳鸣为主，一般在用药后1到2周出现，听力损伤从高频开始逐渐向低频发展。已知的能够诱发药物性耳聋的药物(耳毒性药物)有近百种，主要有氨基糖苷类抗生素(如庆大霉素、新霉素)、大环内酯类抗生素、髓袢利尿剂和以铂类为基础的抗肿瘤药物(如顺铂、卡铂)等。随着工作、生活、娱乐场所等噪音的不断增加，噪音的危害性也逐渐被认识，其中最主要的危害是因“噪”致聋，这在某些特定职业，如工厂工人、建筑工人、机场工作人员、炮兵、音乐人、酒吧等娱乐场所服务员工中发生率非常高。

感音神经性聋主要的病理改变是耳蜗毛细胞的不可逆损伤以及继发的螺旋神经节和听神经的凋亡和变性。成年哺乳动物的内耳毛细胞的一个关键特征便是损伤后难以自发性再生，从而可导致永久性的感音神经性聋。目前临床上还没有针对听力损失的预防或治疗药物，常用的治疗手段包括助听器和人工耳蜗植入虽能改善患者的听力，但均非真正意义上的自主听觉功能恢复，其临床效果受限于残留毛细胞和螺旋神经元的数量和质量。因此，为了避免发展成永久性的听力损害，探索感音神经性听力损伤机制，制备针对感音神经性听力损伤具有保护作用的药物，逆转耳毒性或噪声性等损伤引起的异常基因表达，防止耳蜗毛细胞及螺旋神经节神经元的死亡，具有重大的临床价值和广阔的应用前景。

发明内容

鉴于现有技术中存在的缺点，本发明的目的在于提供一种靶向PRMT5在预防/治疗听力损伤中的应用，为解决现有技术保护听力、治疗听力损伤提供新思路。

蛋白质精氨酸甲基转移酶(PRMT)能够使多种蛋白(包括组蛋白和非组蛋白)甲基化，并对多种生物学过程进行影响，比如参与基因转录，细胞信号转导，蛋白质稳定性，细胞增殖、分化、凋亡和肿瘤的形成等。目前，已发现了11种PRMT家族的成员，根据催化精氨酸甲基化方式的不同，可分为三类：PRMT1-4、PRMT6、PRMT8属于Ⅰ型，催化生成单甲基精氨酸和不对称二甲基精氨酸；PEMT5和PRMT9属于Ⅱ型，其催化生成对称二甲基精氨酸和单甲基精氨酸；PRMT7属于Ⅲ型，能够催化生成单甲基精氨酸。目前报道的PRMT5抑制剂主要用于抗肿瘤等，但尚未有报道记载PRMT5抑制剂在保护听力中的应用。

本发明旨在提供PRMT5抑制剂及其在制备预防和/或治疗听力损伤的药物中的应用，并提供听力损伤的新方法和药物组合物。

本发明一方面是提供PRMT5作为药物作用靶点在体外筛选预防和/或治疗听力损伤的药物中的应用。

本发明另一方面是提供PRMT5抑制剂或其药学上可接受的盐、酯、异构体、前药、多晶型物或溶剂化物在制备预防和/或治疗听力损伤的药物或试剂盒中的用途。

其中，所述听力损伤选自以下至少一种：

所述听力损伤是与耳蜗毛细胞、听神经和/或神经突触相关的听力损伤；其中耳蜗毛细胞包括内毛细胞和外毛细胞；

所述听力损伤是与H4R3me2s和H3R8me2s的异常表达相关的听力损伤；

所述听力损伤是与耳蜗毛细胞ROS的异常表达相关的听力损伤；

所述听力损伤是与神经轴突丢失、NF阳性耳蜗神经减少相关的听力损伤；

所述听力损伤是与ABR波I潜伏期和波幅偏移相关的听力损伤。

进一步地，所述听力损伤为感音神经性听力损伤，选自如下中的至少一种：耳毒性药物、噪声、遗传性、老年性、代谢性、自身免疫性疾病及肿瘤导致的听力损伤。

本发明另一方面是提供一种用于预防和/或治疗听力损伤的药物组合物，所述药物组合物包含如上所述应用中所述的PRMT5抑制剂或其药学上可接受的盐、酯、异构体、前药、多晶型物或溶剂化物，以及药学上可接受的载体、介质。

本发明另一方面是提供一种筛选预防和/或治疗听力损伤的药物的方法，所述方法包括：以PRMT5为药物靶点，寻找能够抑制或阻断PRMT5的表达和/或功能的物质作为候选药物。

本发明另一方面是提供一种预防性或治疗性治疗听力损伤的方法，它包括给予有需要的对象(如哺乳动物)施用有效量的PRMT5抑制剂或药学上可接受的盐、酯、异构体、前药、多晶型物、溶剂化物或药物组合物。所述方法也可以是体外的或非治疗性的。

相对于现有技术，本发明的有益效果在于：

本发明创造性地将PRMT5抑制剂用于抗听力损伤。通过体外和体内试验发现，PRMT5抑制剂产生了意想不到的好的保护听力的效果，可有效地预防、治疗听力损伤，且对于动物体没有毒副作用。

本发明提供了PRMT5抑制剂在治疗听力损伤中的用途，证实了其能够有效缓解因噪声所引起的听力损伤的各种相关症状，或调节因噪声所引起的听力损伤的各种相关指标，如显著降低PRMT5的表达，降低组蛋白H4(H4R3me2s)和组蛋白H3(H3R8me2s)的对称二甲基精氨酸的表达，降低耳蜗毛细胞损失的程度，提高内、外毛细胞数量，有效减轻顺铂导致的螺旋神经节神经元损伤，提高NF阳性耳蜗神经的数量，减弱噪声诱导的耳蜗突触病变，降低顺铂引起的耳蜗毛细胞、耳蜗神经(螺旋神经元)和突触损伤的敏感性，减轻听力损失发挥听力保护作用等。

本发明所述PRMT5抑制剂可以被用于制备药物或试剂盒，具有良好的产业化前景。

附图说明

图1为使用PRMT5抑制剂LLY-283可以保护耳蜗毛细胞免受顺铂损伤。A为蛋白印迹试验，顺铂作用后PRMT5蛋白水平显著升高，而LLY-283可显著降低顺铂诱导的PRMT5表达升高，进一步证实LLY-283可有效抑制PRMT5的催化产物：H4R3me2s和H3R8me2s的蛋白水平；B为蛋白印迹试验结果的统计分析图；C为免疫组化试验，顺铂处理后小鼠耳蜗基底膜底圈、中圈、顶圈内、外毛细胞损伤严重，数量显著缺失，而预先加入100μM和200μM剂量的LLY-283作用2h可以显著减轻顺铂对耳蜗毛细胞的毒性，增加内、外毛细胞对抗顺铂的存活率，此外单独使用200μM剂量的LLY-283对耳蜗毛细胞无任何毒副损伤作用；D为各个实验组内每200μm所包括的底圈、中圈、顶圈内所有毛细胞数值的统计分析，结果用均值±标准误体现；E为TUNEL法凋亡检测分析，顺铂处理后可见毛细胞数量明显减少且排列紊乱，其周围分布较多的小而致密的TUNEL阳性信号标记的凋亡细胞，相反LLY-283预处理后TUNEL标记的凋亡细胞数量较顺铂组明显减少，而毛细胞数量较顺铂组显著增多，证明PRMT5抑制剂能够有效抑制顺铂导致的耳蜗毛细胞凋亡；F为mitoSOX-red(mitoSOX红)探针染色活性氧水平检测法，顺铂损伤后耳蜗内、外毛细胞内能检测到更多的mitoSOX-red阳性细胞，而LLY-283预处理显著降低了mitoSOX-red的荧光强度，表明阻断PRMT5减少了顺铂诱导的ROS产生；G为TUNEL标记的毛细胞数量统计分析(纵坐标为TUNEL⁺-Myosin 7a⁺cells/200μm)；H为mitoSOX-red标记的毛细胞数量统计分析(纵坐标为mitoSOX-Red⁺-Myosin 7a⁺cells/200μm)。

图2为使用PRMT5抑制剂LLY-283可以保护耳蜗螺旋神经节神经元免受顺铂损伤。A为免疫组化试验，Tuj-1标记听神经纤维，TUNEL染色标记凋亡的细胞，顺铂处理后听神经纤维的密度及发射长度较对照组均显著降低，而且可以见到数量较多的细胞凋亡，而使用100μM和200μMLLY-283预处理后则能显著增加听神经纤维的数量和长度，并且可以见到清晰的神经纤维与毛细胞之间的连接，且与顺铂组相比TUNEL标记的细胞凋亡数量也显著减少，证实PRMT5抑制剂可保护听神经纤维免受顺铂损伤；B为免疫组化试验，Tuj-1标记听神经纤维及螺旋神经节神经元胞体，TUNEL染色标记凋亡的细胞，顺铂处理后神经元胞体崩解、碎片化，失去神经纤维，同时可见大量的TUNEL标记的凋亡细胞分布其中，而使用100μM和200μMLLY-283预处理后则能显著增加螺旋神经节神经元胞体密度，同时观察到相比顺铂组更少的TUNEL标记的凋亡细胞，证实PRMT5抑制剂可保护听神经纤维免受顺铂损伤，且高剂量(200μM)组对神经纤维的保护作用优于低剂量(100μM)组；C为放射状听神经纤维长度计数的统计分析；D为每10000μm²范围内螺旋神经节神经元分布密度计数的统计分析；E为每100μm神经纤维密度计数的统计分析。

图3为PRMT5抑制剂LLY-283可以保护耳蜗毛细胞免受顺铂损伤的体内实验实例。A为PRMT5抑制剂+顺铂组(LLY-283-Cis)实验流程示意图：在损伤前一天皮下注射1ml温的生理盐水，同时在顺铂给药前2小时腹腔内注射LLY-283(10mg/kg)，然后腹腔内注射30mg/kg顺铂；在顺铂注射后1天后接下来的连续7天每天注射两次预热的生理盐水，在LLY-283注射后第14天进行后续的实验分析；B为听性脑干诱发电位(ABR)检测，顺铂处理后所有测听频率下的听阈较对照组均显著增加，通过LLY-283预处理后在低频和中频(4kHz、8kHz、16kHz和24kHz)条件下的听力损失比单纯顺铂组显著降低，而在高频(32kHz)条件下的听力损失未见明显变化，说明LLY-283在低频和中频(4kHz、8kHz、16kHz和24kHz)范围内对听力的保护作用显著，而在高频下对听力的保护作用不显著；C为免疫组化实验，顺铂处理后耳蜗底圈、中圈和顶圈的内毛细胞(一排)、外毛细胞(三排)数均显著减少，LLY-283预处理可显著增加耳蜗底圈、中圈和顶圈的内、外毛细胞存活数，发挥显著对抗顺铂导致的毛细胞损伤的作用；D为每200μm所包括的底圈、中圈、顶圈内各组的毛细胞计数统计分析，可见顺铂体内注射处理后可显著降低小鼠耳蜗底圈、中圈、顶圈毛细胞的数量，然而PRMT5抑制剂LLY-283预处理则可显著减少顺铂对耳蜗毛细胞的损伤，底圈、顶圈、中圈耳蜗毛细胞的数量均显著高于顺铂损伤组；E为caspase-3/7标记的细胞凋亡检测分析，顺铂作用后诱导明显增多的caspase-3/7阳性细胞产生，伴随Myosin 7a标记的毛细胞信号降低，LLY-283预处理能够显著减少顺铂诱导的caspase-3/7阳性细胞并显著增加毛细胞的存活数量；F为每200μm范围内caspase-3/7阳性凋亡细胞数量统计分析。

图4为体内实验表明使用PRMT5抑制剂LLY-283可以保护小鼠耳蜗听神经纤维和螺旋神经节神经元免受顺铂损伤，同时可有效减轻顺铂导致的听力损失。A为免疫组化实验，CtBP2标记突触，在图中显示为圆形或类圆形胞体，NF标记神经轴突，在图中显示为从突触发出的放射状神经丝与内、外毛细胞相互交联，上图显示顺铂损伤小鼠耳蜗神经轴突丢失，LLY-283预处理显著增加了顺铂存在下NF阳性耳蜗神经的数量；下图为上图中相应白色框内的图像局部放大图，突触与神经轴突的形态；B为内毛细胞中CtBP2标记的突触胞体数量统计分析；C为各组ABR检测I波潜伏期时长统计分析，顺铂处理后ABR波I潜伏期在所有测试频点均显著延长，经LLY-283预处理后再给予顺铂刺激在4、8、16、24和32kHz所有测试点的ABR波I潜伏期均显著下降；D为各组ABR检测I波振幅大小统计分析，经LLY-283预处理小鼠的ABR振幅与Cis组顺铂处理小鼠相比显著增加。

图5为使用PRMT5抑制剂可减轻噪声引起的小鼠耳蜗毛细胞损伤和听阈提高。A为实验流程示意图：腹腔内注射10mg/kg LLY-283，2小时后将小鼠置于120dB SPL宽带白噪声中2小时，在噪声损伤后2天进行后续的实验分析；B为听性脑干诱发电位(ABR)检测，噪声暴露2天后各个测试频率(4、8、16、24和32kHz)的ABR阈值明显升高，LLY-283预处理，可显著减弱所有测试频率下噪声引起的听觉阈值升高偏移；C为免疫组化实验，Phalloidin标记毛细胞，噪声暴露2天后耳蜗底圈(Base)、中圈(Middle)、顶圈(Apex)的内、外毛细胞均显著减少，而经LLY-283预处理显著降低了耳蜗毛细胞损失的程度，毛细胞数量较噪声损伤组明显增加；D为每200μm所包括的底圈、中圈、顶圈内各组的毛细胞计数统计分析；E为caspase-3/7标记的细胞凋亡检测分析，噪声暴露后2天，中圈HCs中可检测到caspase-3/7阳性信号标记的凋亡细胞，但经LLY-283预处理可显著减少凋亡细胞数量；F为中圈每200μm caspase-3/7阳性细胞数量。

图6为使用PRMT5抑制剂可有效防止噪声引起的突触损失。A为免疫组化染色，CtBP2标记突触，Tuj-1标记听神经纤维，上图显示噪声暴露引起明显的突触损失，NF-阳性纤维也显著减少，然而经LLY-223预处理有效防止了噪声引起的突触损失，使每个内毛细胞的带状突触数接近于中间区域的非噪声暴露对照，LLY-283预处理也显著增加了NF阳性耳蜗神经的数量；下图是对上图中白色选框区域的局部放大；B为内毛细胞中CtBP2标记的突触胞体数量统计分析；C为各组ABR检测I波潜伏期时长统计分析，噪声暴露后ABR波I潜伏期在所有测试频点均显著延长，经LLY-283预处理后再给予噪声损伤在4、8、16、24和32kHz所有测试点的ABR波I潜伏期均显著下降；D为各组ABR检测I波振幅大小统计分析，经LLY-283预处理小鼠的ABR振幅与单纯噪声暴露损伤的小鼠相比显著增加。

具体实施方式

本发明人通过对PRMT5作用的多年研究，惊奇地发现通过抑制PRMT5，能够降低听力损伤，起到保护听力的作用。通过研究发现PRMT5的表达与听力损伤的关系，并从细胞到组织水平上进行分析，系统性模拟个体听力组织与噪声或药物相互作用，为听力损伤关联症状提供了可能的解释，为开发针对感音神经性听力损伤的药物提供了有用的借鉴。

本发明提供了PRMT5作为药物作用靶点在体外筛选预防和/或治疗听力损伤的药物中的应用。

所述药物以PRMT5作为药物靶点。

所述药物能够抑制或阻断PRMT5的表达和/或功能。

本发明还提供了PRMT5抑制剂或其药学上可接受的盐、酯、异构体、前药、多晶型物或溶剂化物在制备预防和/或治疗听力损伤的药物或试剂盒中的用途。

本发明应用中，所述听力损伤选自以下至少一种：

所述听力损伤是与耳蜗毛细胞、听神经和/或神经突触相关的听力损伤；其中耳蜗毛细胞包括内毛细胞和外毛细胞；

所述听力损伤是与H4R3me2s和H3R8me2s的异常表达相关的听力损伤；

所述听力损伤是与耳蜗毛细胞ROS的异常表达相关的听力损伤；

所述听力损伤是与神经轴突丢失、NF阳性耳蜗神经减少相关的听力损伤；

所述听力损伤是与ABR波I潜伏期和波幅偏移相关的听力损伤。

优选地，所述听力损伤为感音神经性听力损伤，选自如下中的至少一种：耳毒性药物、噪声、遗传性、老年性、代谢性、自身免疫性疾病及肿瘤导致的听力损伤。其中，所述噪声导致的听力损伤为噪声性听力损伤，包括噪声性耳聋和炮震性耳聋；所述PRMT5抑制剂能够降低噪声暴露后听觉脑干诱发电位阈移、提高噪声暴露后耳蜗毛细胞存活率，其中耳蜗毛细胞包括内毛细胞和外毛细胞。

其中，所述噪声为频率为4-24kHz和/或强度为100～120dB的广谱噪声。

其中，所述耳毒性药物包括氨基糖甙类耳毒性药物、大环内脂类耳毒性药物、阿司匹林；化疗药物、非类固醇抗炎药物、奎宁中的一种或几种。进一步地，所述耳毒性药物包括氨基糖甙类耳毒性药物如：链霉素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、妥布霉素、小诺霉素；大环脂类耳毒性药物如：红霉素、罗红霉素等；阿司匹林；化疗药物；非类固醇抗炎药物如：万古霉素、多粘菌素、洁霉素、白霉素；奎宁等中的一种或几种；优选为顺铂。

本发明应用中，所述药物以PRMT5作为药物靶点。所述药物预防和/或治疗听力损伤通过凋亡抑制介导。

本发明应用中，所述药物能够抑制或阻断PRMT5的表达和/或功能。

本发明应用中，所述药物能够改善：

与耳蜗毛细胞、听神经和/或神经突出相关的听力损伤；

与H4R3me2s和H3R8me2s的异常表达相关的听力损伤；

与耳蜗毛细胞ROS的异常表达相关的听力损伤；

与神经轴突丢失、NF阳性耳蜗神经减少相关的听力损伤；

与ABR波I潜伏期和波幅偏移相关的听力损伤；

噪声暴露后听觉脑干诱发电位阈移。

本发明应用中，所述药物为由PRMT5抑制剂和药用辅料制成的药物制剂。

本发明应用中，所述PRMT5抑制剂为单一有效成分或几种成分的组合。在一具体实施方式中，所述PRMT5抑制剂在制备用于预防和/或治疗听力损伤中的应用具体是指：将PRMT5抑制剂作为药物的主要有效成分用于制备用于预防和/或治疗听力损伤的药物。

本发明应用中，所述PRMT5抑制剂对于PRMT5的抑制效果包括但不限于：抑制PRMT5的活性或者抑制PRMT5的基因转录或者表达。所述PRMT5抑制剂能够抑制或阻断PRMT5的表达和/或功能，是指针对PRMT5具有抑制效果的化合物，该化合物能够降低细胞内PRMT5的含量和/或功能。例如，与对照组相比，在不影响细胞其他功能的情况下PRMT5抑制剂可以降低细胞中PRMT5含量的50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或者100％。所述PRMT5抑制剂可以是抗体或者小分子化合物。所述抗体是指能够与PRMT5结合的肽或者蛋白质。PRMT5抑制剂也可以是通过降低或者抑制PRMT5基因的表达或者转录的化合物，包括但不限于：核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白。所述核酸包括但不限于：反义寡核苷酸、双链RNA(dsRNA)、核酶、用于敲除或敲降PRMT5表达的物质、核糖核酸内切酶III制备的小干扰RNA或者短发夹RNA(shRNA)。

更进一步优选地，所述PRMT5抑制剂为LLY-283，化学式为C17H18N4O4，结构如下式I所示：

本发明还提供了一种用于预防和/或治疗听力损伤的药物组合物，所述药物组合物包含如上应用中所述的PRMT5抑制剂或其药学上可接受的盐、酯、异构体、前药、多晶型物或溶剂化物，以及药学上可接受的载体、介质。

进一步地，所述药物组合物和其他听力保护相关药物中的至少一种联合施用，所述其他听力保护相关药物包括但不限于左慈丸、六味地黄丸、尼麦角林片、谷维素、长春胺缓释胶囊、甲钴胺分散片、长春西汀注射液、脑苷肌肽注射液、曲克芦丁注射液、小牛血去蛋白提取物注射液、银杏叶提取物片、胞磷胆碱钠胶囊等。

进一步地，所述可接受的载体、介质例如无菌水或生理盐水、稳定剂、赋形剂、抗氧化剂(抗坏血酸等)、缓冲剂(磷酸、枸橼酸、其它的有机酸等)、防腐剂、表面活性剂(PEG、Tween等)、螯合剂(EDTA等)、粘合剂等。而且，也可含有其它低分子量的多肽；血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白等蛋白质；甘氨酸、谷酰胺、天冬酰胺、精氨酸和赖氨酸等氨基酸；多糖和单糖等糖类或碳水化物；甘露糖醇或山梨糖醇等糖醇。当制备用于注射的水溶液时，例如生理盐水、含有葡萄糖或其它的辅助药物的等渗溶液，如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇、氯化钠，可并用适当的增溶剂例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇，PEG等)、非离子表面活性剂(吐温80，HCO-50)等。

本发明药物组合物中，所述PRMT5抑制剂或其药学上可接受的盐、酯、异构体、前药、多晶型物或溶剂化物可以是单一有效成分，也可以与其他活性组分进行组合，构成联合制剂。

本发明药物组合物中，活性组分(PRMT5抑制剂或其药学上可接受的盐、酯、异构体、前药、多晶型物或溶剂化物)的含量通常为安全有效量，所述安全有效量对于本领域技术人员来说应该是可以调整的，例如，所述活性组分的施用量通常依赖于患者的体重、应用的类型、疾病的病情和严重程度，例如，作为活性成分的施用量通常可以为1～1000mg/kg/day、20～200mg/kg/day、1～3mg/kg/day、3～5mg/kg/day、5～10mg/kg/day、10～20mg/kg/day、20～30mg/kg/day、30～40mg/kg/day、40～60mg/kg/day、60～80mg/kg/day、80～100mg/kg/day、100～150mg/kg/day、150～200mg/kg/day、200～300mg/kg/day、300～500mg/kg/day、或500～1000mg/kg/day。

本发明所提供的活性成分或含所述活性成分的药物组合物可以适应于任何形式的给药方式，可以是口服或胃肠外给药，例如，可以是经肺、经鼻、经直肠和/或静脉注射，更具体可以是真皮内、皮下、肌内、关节内、腹膜内、肺部、口腔、舌下含服、经鼻、经皮、阴道、口服或胃肠外给药；注射给药包括静脉注射、肌内注射和皮下注射等，经皮给药等。

如本文所用，所述药物组合物的剂型选自：注射剂、注射用无菌粉末、片剂、丸剂、胶囊、锭剂、醑剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、酊剂、气雾剂、粉雾剂、或栓剂。本领域技术人员可根据给药方式，选择合适的制剂形式，例如，适合于口服给药的制剂形式可以是包括但不限于丸剂、片剂、咀嚼剂、胶囊剂、颗粒剂、溶液剂、滴剂、糖浆、气雾剂或粉雾剂等，再例如，适合于胃肠外给药的制剂形式可以是包括但不限于溶液、悬浮液、可复水的干制剂或喷雾剂等，再例如，适合于直肠给药的通常可以是栓剂，再例如，适合注射给药的可以是注射剂、注射用无菌粉末等。

其中，片剂、锭剂、丸剂、胶囊等也可含有下述组分：粘合剂，例如树胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，例如磷酸二钙；崩解剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸等；润滑剂，例如硬脂酸镁；可以加入甜味剂，例如蔗糖、乳糖或糖精，或调味剂，例如薄荷、冬青油或樱桃调味剂。当单位剂型是胶囊时，除上述物质之外，其可含有液体载体。各种其它物质可以包衣形式存在，或用来改进单位剂型的物理形式。例如，可用虫胶、糖或二者对片剂、丸剂或胶囊进行包衣。糖浆或酏剂可含有活性化合物，作为甜味剂的蔗糖，作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯，色素和调味剂，例如樱桃或橙味调味剂。用于制备任何单位剂型的任何物质应该是药学纯的，在用量中基本上无毒。此外，可将活性化合物掺入缓释制品或制剂。

本发明还提供了一种体外筛选预防和/或治疗听力损伤的药物的方法，所述方法包括：以PRMT5为药物靶点，寻找能够抑制或阻断PRMT5的表达和/或功能的物质作为候选药物。

进一步地，所述方法包括：在体外向细胞中施加待选药物，共培养后检测细胞中PRMT5的含量。所述细胞可以来自哺乳动物。

试验者可以通过检测共培养后PRMT5的含量判定药物是否是具有治疗意义的药物。通常来说，与对照组相比，可以使得PRMT5的含量分别降低了50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或者100％的药物，可以判定为具有治疗意义的药物。

进一步地，所述药物能够降低细胞中PRMT5至少50％，则判定为具有治疗意义的药物。

本发明进一步提供了一种治疗性或预防性治疗听力损伤的方法，它包括给予有需要的对象(如哺乳动物)施用有效量的PRMT5抑制剂或药学上可接受的盐、酯、异构体、前药、多晶型物、溶剂化物或药物组合物。所述方法也可以是体外的或非治疗性的。

进行治疗性或预防性治疗的对象或个体优选哺乳动物，例如但不限于人、灵长类、牲畜(如绵羊、牛、马、驴、猪)、宠物(如狗、猫)、实验室试验动物(如小鼠、家兔、大鼠、豚鼠、仓鼠)或被捕获的野生动物(如狐狸、鹿)。所述对象优选灵长类。所述对象最优选人。所述对象可以是听力损伤的患者或者期待预防听力损伤的个体。

所述PRMT5抑制剂或药物组合物可以在接受听力损伤治疗前、中、后向对象施用。

判断药物是否可抑制PRMT5活性，可以采用现有技术进行，包括：同位素标记测定法。

判断药物是否可抑制PRMT5基因转录或者表达亦可以采用现有技术。例如提供正常表达PRMT5的细胞，在待检测药物或携带待检测药物的载体存在情况下培养所述细胞，检测PRMT5转录或者表达水平是否发生变化。

本发明中，活性化合物即PRMT5抑制剂或药学上可接受的盐、酯、异构体、前药、多晶型物或溶剂化物具有预防和/或治疗听力损伤作用，是对听力保护有效的化合物。

本发明中，所述PRMT5抑制剂的盐、酯可以以药学或生理学上可接受的盐或酯的形式使用。述及“药学上可接受的盐”，通常指当以适当的方式用于治疗时(特别是在人类和/或哺乳动物中应用或使用时)在生理学上可耐受的任何盐(通常来说，这意味着它是无毒的，特别是作为抗衡离子的结果是无毒的)。这些生理上可接受的盐可以是与阳离子或碱形成的，并且在本发明的上下文中，尤其是在人类和/或哺乳动物中施用时，它们应该被理解为由按照本发明所提供的至少一种化合物，通常为酸(去质子化的)，如阴离子和至少一种生理学上耐受的阳离子(优选无机阳离子)形成的盐。在本发明的上下文中，具体地可以包括与碱金属和碱土金属形成的盐、以及与铵阳离子(NH4+)形成的盐，具体可以是包括但不限于与(单)或(二)钠、(单)或(二)钾、镁或钙形成的盐。这些生理上可接受的盐也可以是与阴离子或酸形成的，并且在本发明的上下文中，特别是在人类和/或哺乳动物中施用时，它们应该被理解为由按照本发明所提供的至少一种化合物，通常质子化的，如阳离子和至少一种生理上可耐受的阴离子形成的盐。所述PRMT5抑制剂的盐、酯包括但不限于与如下酸形成的盐或酯：氢氯酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、或羟乙磺酸。卤化物的盐同样适用。其他盐包括：与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐。

本发明中，所述“前药”指当用适当的方法服用后，该“前药”在人体内进行代谢或化学反应而转变成所述具有活性的PRMT5抑制剂或药学上可接受的盐、酯、异构体、前药、多晶型物或溶剂化物。

本发明中，所述活性化合物还可与其他治疗剂联用。例如与选自下组的一种或多种对于保护听力有用的成分联用：左慈丸、六味地黄丸、尼麦角林片、谷维素、长春胺缓释胶囊、甲钴胺分散片、长春西汀注射液、脑苷肌肽注射液、曲克芦丁注射液、小牛血去蛋白提取物注射液、银杏叶提取物片，胞磷胆碱钠胶囊等。

本发明中，当所述活性化合物与其他治疗剂联用时，所述活性化合物与其他治疗剂共同给予。“共同给予”表示在同一制剂中或在两种不同制剂中经由相同或不同途径同时给予，或通过相同或不同途径顺次给予。“顺次”给予表示在两种或多种不同化合物的给药之间具有以秒、分钟、小时或天计的时间差异。

本领域技术人员可以根据病症的严重程度和受者的健康情况及年龄的不同考虑施用的有效量。有效量通常可在0.01ng/kg体重-约100mg/kg体重之间变动。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

本文述及“包含”、“含有”等应理解为是包括性的意思，而没有排他性或穷尽的意思；即“包括但不限于”的意思。

本文述及“治疗有效量”通常指一用量在经过适当的给药期间后，能够达到治疗如上所列出的疾病的效果。

本文述及“治疗性”和“预防性”应理解为其最宽的意义。术语“治疗性”不一定暗示哺乳动物接受治疗直至完全恢复。类似地，“预防性”不一定表示对象最终不会感染疾病病症。因此，治疗和预防包括缓解具体病症的症状或防止或降低具体病症产生的风险。术语“预防”可理解为降低具体病症发作的严重程度。治疗也可降低已有病症的严重程度或急性发作的频率。

本文述及受听力损伤的“细胞”应理解为已受听力损伤的任何细胞，或可能遭受听力损伤的任何细胞，包括真核细胞或原核细胞。

本发明的化合物及其方法可用于预防和/或治疗听力损伤，不仅可用于听力损伤的早期阶段来防止损伤的扩大，还可以用于听力损伤后的修复，还可作为预防性治疗方法在接触噪声或药物之前施用或在接触噪声或药物一段时间后施用。

下面结合实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

顺铂是第一个具有抗癌活性的金属配合物，于1965年被发现，在卵巢癌、肺癌、鼻咽癌、乳腺癌、食道癌、淋巴瘤、头颈部鳞癌等多种实体肿瘤中被广泛应用，然而其导致的耳毒性和听力损伤尤为显著，有研究表明，顺铂治疗的患者中永久性听力损失者在成人中高达40-80％，在儿童中至少占比50％以上。本发明发现蛋白精氨酸甲基转移酶(proteinarginine methyltransferases,PRMTs)家族成员精氨酸甲基转移酶5(PRMT5)可以逆转耳毒性药物顺铂导致的耳蜗毛细胞(HCs)和螺旋神经节神经元(SGNs)损伤，发挥保护听力的作用。

实施例1PRMT5在小鼠内耳中的表达水平检测

1.1实验对象和分组

选用出生后2天的野生型C57BL/6小鼠，麻醉后进行内耳解剖取出耳蜗并进行体外培养，随机分为3组：

对照组(Con)(未受损伤)：未加入药物，在无血清的DMEM/F12培养液中共培养24小时；

顺铂损伤组(Cis)：采用含30μM顺铂的无血清DMEM/F12培养液处理24小时；

PRMT5抑制剂+顺铂组(LLY-283-Cis)：预先使用含有PRMT5选择性强效抑制剂式I所示的LLY-283(200μM)的无血清DMEM/F12培养液与小鼠耳蜗基底膜体外共培养2小时，然后再采用含有30μM顺铂和200μM LLY-283的无血清DMEM/F12培养液处理共同处理24小时。

1.2PRMT5在小鼠内耳中的表达水平检测

经过上述不同的处理后收取，对各组使用RIPA裂解液提取蛋白，使用BCA法检测蛋白浓度，然后加入相同量的蛋白后进行SDS-PAGE电泳分离，并转移至PVDF膜上，在TBST溶液中加入不同的一抗，在4℃进行共孵育24小时，使用到的一抗包括：anti-PRMT5(Santacruz；376937)，anti-H3R8me2s(Epigentek；A-3706)和anti-H4R3me2s(Sigma Aldrich；SAB4300870)，GAPDH作为内参。洗脱反应液后加入二抗，室温下共孵育2小时并终止反应，进行显色。

结果显示，PRMT5在小鼠内耳样本中有表达，与未受损对照组相比，顺铂作用组PRMT5的蛋白水平显著升高，而LLY-283可显著降低顺铂诱导的PRMT5表达升高，证实LLY-283是有效的PRMT5抑制剂(图1A)。进一步本发明对PRMT5催化的组蛋白对称性二甲基精氨酸修饰进行了分析，发现顺铂处理可显著增加组蛋白H4(H4R3me2s)和组蛋白H3(H3R8me2s)的对称二甲基精氨酸的表达，而与顺铂组相比，LLY-283预处理则能显著减少H4R3me2s和H3R8me2s的表达，进一步从检测PRMT5催化产物水平的角度证实了LLY-283可以有效抑制PRMT5的表达(图1A和1B)。

实施例2体外试验证实PRMT5抑制剂对小鼠耳蜗毛细胞的损伤具有保护作用

2.1实验对象和分组

选用出生后2天的野生型C57BL/6小鼠，麻醉后进行内耳解剖取出耳蜗并进行体外培养，随机分为3组：

对照组(Con)(未受损伤)：未加入药物，在无血清的DMEM/F12培养液中共培养24小时；

顺铂损伤组(Cis)：采用含30μM顺铂的无血清DMEM/F12培养液处理24小时；

200μM PRMT5抑制剂组(LLY-283 200μM)：采用含200μM LLY-283的无血清DMEM/F12培养液处理24小时。

100μM PRMT5抑制剂+顺铂组(LLY-283100μM-Cis)：预先使用含有PRMT5选择性强效抑制剂LLY-283(100μM)的无血清DMEM/F12培养液与小鼠耳蜗基底膜体外共培养2小时，然后再采用含有30μM顺铂和100μM LLY-283的无血清DMEM/F12培养液处理共同处理24小时。

200μM PRMT5抑制剂+顺铂组(LLY-283 200μM-Cis)：预先使用含有PRMT5选择性强效抑制剂LLY-283(200μM)的无血清DMEM/F12培养液与小鼠耳蜗基底膜体外共培养2小时，然后再采用含有30μM顺铂和200μM LLY-283的无血清DMEM/F12培养液处理共同处理24小时。

2.2、PRMT5抑制剂可保护小鼠内耳毛细胞免受顺铂损伤

哺乳动物的内耳毛细胞是声电换能的重要结构，由内、外毛细胞，支持细胞及盖膜组成。

收取2.1实验各组中的耳蜗标本，进行免疫组化检测，用4％多聚甲醛(PFA)固定后在1％TritonX-100溶液中室温渗透1小时。切片在0.01M PBS中洗涤三次，并在含10％山羊血清的0.01M PBS溶液中室温封闭1小时，4℃孵育过夜。Myosin 7a是毛细胞的标记(图1C，绿色)，在封闭后的标本中加入抗myosin7a(1:5000,Proteus Biosciences,25-6790)在37℃培养箱中共孵育1小时，4℃过夜。清洗一抗后加入二抗37℃共孵育1小时进行免疫组化显色。为了更好地观察和计数，本发明将耳蜗基底膜分成底圈(Base)、中圈(Middle)、顶圈(Apex)。与对照组(Control)相比，Cis组中，顺铂作用24小时后，可见内、外毛细胞数量显著缺失，以底圈为最严重，中圈次之(图1C和图1D)。通过LLY-283 100μM–Cis、LLY-283 200μM–Cis组，可以确定PRMT5抑制剂对顺铂导致的毛细胞损伤的影响，可见内、外毛细胞存活率显著高于单纯顺铂组。LLY-283 200μM–Cis组中，200μM LLY-283预处理对顺铂毒性的保护作用最强，单独使用200μMLLY-283处理的耳蜗基底膜对内耳毛细胞没有任何损伤(图1C和图1D)；因此，该浓度用于随后的体外实验。

2.3PRMT5抑制剂能够有效抑制顺铂导致的耳蜗毛细胞凋亡

细胞凋亡时会激活DNA内切酶，产生一些断裂的基因组DNA，暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,TdT)的催化下加上荧光素(FITC)标记的dUTP(fluorescein-dUTP)，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测，这就是TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法检测细胞凋亡的原理。

本实施例使用TUNEL分析进一步研究了LLY-283对顺铂诱导的耳蜗基底膜培养细胞凋亡的影响(图1E)。暴露于顺铂后，耳蜗基底膜免疫荧光染色出现明显的TUNEL阳性信号(红色，分布在排列紊乱、数量稀少的毛细胞周围)；相反，LLY-283 200μM-Cis组的耳蜗基底膜体外培养样本中TUNEL阳性标记的毛细胞数量与Cis组相比明显减少(图1E和图1G)；其中，图1G、1H中，横坐标LLY-283-Cis为LLY-283 200μM-Cis。

2.4PRMT5抑制剂可减少活性氧(ROS)水平

mitoSOX是一种透膜荧光染色剂，在线粒体氧化损伤条件下，产生红色荧光，来检测细胞内超氧阴离子活性氧族的生成。

本实施例使用mitoSOX-red探针来确定LLY-283治疗是否可以降低耳蜗毛细胞由于顺铂暴露产生的ROS水平升高现象(图1F)。结果显示，对照组内、外毛细胞内无mitoSOX-red(红色)信号分布；在顺铂损伤组(Cis)中，与对照组相比，检测到更多的mitoSOX-red阳性细胞。相反，LLY-283 200μM-Cis组中LLY-283预处理显著降低了mitoSOX-red的荧光强度，表明阻断PRMT5减少了顺铂诱导的ROS产生(图1F和图1H)。

实施例3.PRMT5抑制剂可有效减轻顺铂导致的螺旋神经节神经元损伤

3.1实验对象和分组

选用出生后2天的野生型C57BL/6小鼠，随机分为4组：

对照组(Con或Control)：未加入药物，在无血清的DMEM/F12培养液中共培养24小时；

顺铂损伤组(Cis)：采用30μM顺铂处理24小时；

低剂量PRMT5抑制剂组(LLY-283 100μM-Cis)：预先使用100μM PRMT5选择性强效抑制剂LLY-283与小鼠耳蜗基底膜体外共培养2小时，然后再给予30μM顺铂与100μMLLY-283共处理24小时。

高剂量PRMT5抑制剂组(LLY-283 200μM-Cis)：预先使用200μM PRMT5选择性强效抑制剂LLY-283与小鼠耳蜗基底膜体外共培养2小时，然后再给予30μM顺铂与200μMLLY-283共处理24小时。

3.2PRMT5抑制剂有效减轻顺铂导致的神经纤维损伤

本实施例选择耳蜗基底膜中圈进行免疫组化染色后在Leica SP8激光共聚焦显微镜下进行拍照，如图2A和图2B所示。

其中，图2A显示的是听神经纤维形态，由Tuj-1标记，可见对照组(Control)中其像扇形放射状由螺旋神经节神经元(SGNs)发出，与内毛细胞或外毛细胞建立突触连接，排列较为致密；而顺铂损伤组(Cis)中Tuj-1标记的听神经纤维受到明显损伤，神经纤维的密度(图2E)及发射长度(图2C)较对照组均显著降低，而且可见数量较多的TUNEL染色标记的细胞凋亡(图2A)；而LLY-283100μM-Cis/LLY-283 200μM-Cis组中，使用100μM和200μMLLY-283预处理后则能显著增加听神经纤维的数量和长度，并且可以见到清晰的神经纤维与毛细胞之间的连接，且与顺铂组相比TUNEL标记的细胞凋亡数量也显著减少(图2A)，证实PRMT5抑制剂可保护听神经纤维免受顺铂损伤。

图2B显示的是Tuj-1标记的SGNs形态，可见对照组中SGNs内有较大的圆形或椭圆形细胞体，排列致密，听神经纤维从SGNs内伸出，并且对照组未见TUNEL标记的凋亡细胞。而顺铂处理组神经纤维密度和神经元胞体密度均明显低于对照组，且神经元胞体崩解、碎片化，失去神经纤维，同时可见大量的TUNEL标记的凋亡细胞分布其中。相比之下，LLY-283100μM-Cis/LLY-283 200μM-Cis组中，LLY-283预处理能够保护神经纤维和SGN免受顺铂损伤，并且200μM剂量的LLY-283对抗顺铂诱导的神经损伤的保护作用较100μM剂量组更强，螺旋神经节神经元胞体密度(图2D)在LLY-283预处理后较顺铂损伤组显著增加，且高剂量(200μM)组对神经纤维的保护作用优于低剂量(100μM)组，同时高剂量组可检测到的TUNEL标记的细胞凋亡数量显著低于低剂量组。本实施例说明靶向PRMT5在螺旋神经节神经元(SGN)存活中起作用。

实施例4.体内试验测定PRMT5抑制剂对顺铂诱导的耳蜗毛细胞和螺旋神经节神经元损伤，以及听力损失的影响

4.1实验分组

本实施例选择7-8周龄的成年野生型C57BL/6小鼠进行试验，随机分为如下4组，结合图3A给药时间点，实验分组分别是：

对照组(Control)：皮下注射1ml温的生理盐水；

顺铂组(Cis)：皮下注射1ml温的生理盐水，1天后腹腔内注射30mg/kg顺铂；

PRMT5抑制剂+顺铂组(LLY-283-Cis)：在损伤前一天皮下注射1ml温的生理盐水，同时在顺铂给药前2小时腹腔内注射LLY-283(10mg/kg)，然后腹腔内注射30mg/kg顺铂；

PRMT5抑制剂单独作用组(LLY-283)：皮下注射1ml温的生理盐水，1天后腹腔内注射10mg/kg LLY-283。

为了减轻顺铂导致的潜在肾毒性，上述各实验组在顺铂注射后1天后接下来的连续7天每天注射两次预热的盐水(对照组在同样的时间点注射预热的盐水)。

4.2耳科听性脑干诱发电位(ABR)检测

在顺铂注射14天后进行ABR试验，测定小鼠的听阈。结果如图3B显示，与未受损对照组相比，LLY-283组在所有频率下的听阈未见明显变化，而顺铂组在所有频率下的听阈均增加。在LLY-283-Cis组中，通过LLY-283预处理，在低频和中频(4kHz、8kHz、16kHz和24kHz)条件下的听力损失比单纯顺铂组显著降低，而在高频(32kHz)条件下的听力损失未见明显变化，说明LLY-283在低频和中频(4kHz、8kHz、16kHz和24kHz)范围内对听力的保护作用显著，而在高频下对听力的保护作用不显著(图3B)。

4.3对耳蜗毛细胞的影响

在顺铂注射14天后对小鼠进行深度麻醉，断头后立即取颞骨解剖耳蜗，进行免疫组化检测。用4％多聚甲醛(PFA)在0.01M PBS(pH 7.4)中4℃固定耳蜗过夜。次日用0.01MPBS冲洗耳蜗，用10％乙二胺四乙酸(EDTA)(pH 7.4)脱钙72h，4℃保存。将耳蜗感觉上皮分为三部分(顶圈，中圈和底圈)，在1％TritonX-100溶液中室温渗透1小时。切片在0.01M PBS中洗涤三次，并在含10％山羊血清的0.01M PBS溶液中室温封闭1小时。4℃孵育过夜。主要使用以下抗体：抗myosin7a(1:5000,Proteus Biosciences,25-6790)；anti-cleavedcaspase-3antibody(1:200dilution；Cell Signaling Technology,Inc.,Danvers,MA,USA,9664s)。

Myosin 7a抗体标记的免疫荧光染色显示小鼠的耳蜗毛细胞，与未受损对照组相比，顺铂处理后耳蜗底圈、中圈和顶圈的内毛细胞(一排)、外毛细胞(三排)数均显著减少(图3C)。相比之下，与顺铂导致损伤相比，LLY-283预处理可显著增加耳蜗底圈、中圈和顶圈的内、外毛细胞存活数，发挥显著对抗顺铂导致的毛细胞损伤的作用，表明抑制PRMT5成功地保护了顺铂诱导的HC损失和听力损失(图3C，LLY-283-Cis组)，并且不会带来任何额外的细胞毒性(图3C，LLY-283组)。

利用美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)的Image J软件(Image J software)对共焦图像中形状完美、细胞核正常、myosin7a标记的毛细胞进行定量。在底圈，中圈，顶圈每200μm所包括的毛细胞数的平均值作为各圈的毛细胞数量。结果如图3D所示，分别显示底圈、中圈和顶圈中对照组、PRMT5抑制剂单独作用组(LLY-283)、顺铂组(Cis)、PRMT5抑制剂+顺铂组(LLY-283-Cis)中各组毛细胞的计数统计分析，可见顺铂体内注射处理后可显著降低小鼠耳蜗底圈、中圈、顶圈毛细胞的数量，然而PRMT5抑制剂预处理则可显著减少顺铂对耳蜗毛细胞的损伤，底圈、顶圈、中圈耳蜗毛细胞的数量均显著高于顺铂损伤组。

进一步，本实施例检测了上述各组处理后小鼠耳蜗基底膜中的细胞凋亡情况，用Myosin 7a标记毛细胞，并用caspase-3/7检测凋亡，结果如图3E所示，结果可知，对照组中，3排外毛细胞和1排内毛细胞排列整齐，内、外毛细胞内均无caspase-3/7阳性细胞分布；Cis组中，顺铂作用后诱导更多的caspase-3/7阳性细胞产生，伴随Myosin 7a标记的毛细胞信号降低；LLY-283-Cis组中，LLY-283预处理能够显著减少顺铂诱导的caspase-3/7阳性细胞并保护更多的毛细胞(图3F)。

4.4对耳蜗突触和神经丢失的影响

为了确定LLY-283对顺铂诱导的耳蜗突触和神经丢失的影响，本实施例用抗CtBP2和抗神经丝(NF)抗体对小鼠耳蜗切片进行联合染色，参考实施例4.3，在顺铂注射后14天进行内耳解剖，行免疫荧光染色，选择的一抗为：anti-neurofilament(1:500,Abcam,Cambridge,UK,ab72996)；anti-CtBP2 IgG1(1:500,BD Biosciences,612044)；anti-myosin7a(1:5000,Proteus Biosciences,25-6790)分别观察上述四组突触前带和传入神经支配情况，结果如图4A上图所示，图像取自耳蜗中圈，NF染色显示耳蜗神经轴突，与未经治疗的对照组小鼠相比，Cis组中顺铂损伤小鼠耳蜗神经轴突丢失；相反，LLY-283-Cis组中，LLY-283预处理显著增加了顺铂存在下NF阳性耳蜗神经的数量。此外，LLY-283单独作用，与对照组相比未见明显的NF标记的神经轴突异常，表明LLY-283没有毒性作用。CtBP2标记突触，在图中显示为圆形或类圆形胞体，且大多数与耳蜗内毛细胞共标，其上发出神经轴突，每组4个耳蜗，每个耳蜗计算16个内耳毛细胞范围内的突触数量，结果显示顺铂处理可以显著减少突触的数量，而PRMT5抑制剂的预处理可以显著增加突触的数量，对照组和LLY-283组小鼠的突触计数无明显差异(图4B，图像取自耳蜗中圈)。为了进一步观察突触与神经轴突的形态，本实施例选中图4A上图白色框内的图像进行局部放大，图4A上图的比例尺为20μm，图4A下图的比例尺为10μm。

4.5对ABR波I潜伏期和波幅的影响

由于波I潜伏期和波幅反映了其余听神经的全部活动，因此本实施例测定了ABR波I潜伏期和波幅的平均值。ABR波I潜伏期数值如图4C所示，与对照组相比，Cis组中，顺铂处理后，ABR波I潜伏期在所有测试频点均显著延长；与Cis组相比，LLY-283-Cis组经LLY-283预处理后再给予顺铂刺激，在4、8、16、24和32kHz所有测试点的ABR波I潜伏期均显著下降，说明LLY-283能有效减弱顺铂诱导的ABR波I潜伏期增加趋势。ABR波I振幅如图4D所示，类似地，LLY-283-Cis组经LLY-283预处理小鼠的ABR振幅与Cis组顺铂处理小鼠相比显著增加(图4D)。

这些体内试验结果表明，PRMT5抑制剂LLY-283治疗能显著有效降低顺铂引起的耳蜗毛细胞、耳蜗神经(螺旋神经元)和突触损伤的敏感性，可显著降低顺铂诱导的耳蜗毛细胞和螺旋神经元损伤，减轻听力损失，发挥听力保护作用。

实施例5.PRMT5抑制剂对噪声引起的毛细胞和突触损伤，听阈偏移的影响

5.1实验分组

本实施例选择7-8周龄的成年野生型C57BL/6小鼠，将其暴露于120dB声压级(SPL)的宽带白噪声中2小时进行噪声性听力损伤(NIHL)的造模(图5A)。根据不同的处理，分为四组，分别是：

对照组(Control)：未接受噪声暴露，与噪声组小鼠一样在同一房间无噪声情况下保持安静2小时；

噪声组(Noise)：将小鼠置于与小鼠体型完全匹配的金属丝笼中，120dB SPL强声暴露2小时；

PRMT5抑制剂组(LLY-283)：腹腔内注射10mg/kg LLY-283，未行噪声暴露；

PRMT5抑制剂+噪声损伤组(LLY-283-Noise)：腹腔内注射10mg/kg LLY-283，2小时后将小鼠置于120dB SPL宽带白噪声中2小时。

经上述各组处理后，分别进行以下实验：

5.2对不同频率ABR阈值的影响

结果如图5B显示，与未受损对照组相比，噪声组中噪声暴露2天后各个测试频率(4、8、16、24和32kHz)的ABR阈值明显升高(图5B)，表明噪声损伤后造成了严重的听力损失。PRMT5抑制剂+噪声损伤组(LLY-283-Noise)经10mg/kg剂量的LLY-283预处理，可显著减弱所有测试频率下噪声引起的听觉阈值偏移(图5B)，表明PRMT5抑制剂对噪声造成的听力损伤具有保护作用。实验定量数据的结果显示的形式是平均值±标准误。

5.3对毛细胞数量的影响

经固定和渗透后，用Alexa Fluor 647-偶联的Phalloidin(1:1000稀释)避光孵育30分钟，然后分别用细胞核染料DAPI染色10分钟，观察毛细胞F-actin和细胞核的荧光，测定毛细胞数量，结果如图5C、5D所示，发现与非噪声暴露对照组相比，噪声组中噪声暴露2天后耳蜗底圈(Base)、中圈(Middle)、顶圈(Apex)的内、外毛细胞均显著减少；PRMT5抑制剂+噪声损伤组(LLY-283-Noise)中经LLY-283预处理显著降低了耳蜗毛细胞损失的程度(图5D)。

5.4LLY-283对听力保护作用的机制

本实施例用caspase-3/7探针对耳蜗上皮进行染色，试验流程参考实施例4.3(5.4与4.3两部分分别使用了噪声及药物两种活体损伤模型)，检测LLY-283对噪声性听力损失的保护作用是否通过凋亡抑制介导。结果显示，噪声组中噪声暴露完成后2天，中圈HCs中的caspase-3/7阳性信号增加，但PRMT5抑制剂+噪声损伤组中经LLY-283预处理可显著防止这种增加(图5E-F)，说明LLY-283对噪声性听力损失的保护作用通过可能时通过抑制细胞凋亡介导的。

5.5对突触的影响

噪声组中，噪声暴露引起明显的突触损失；而PRMT5抑制剂+噪声损伤组(LLY-283-Noise)中经LLY-223预处理有效防止了噪声引起的突触损失，使每个内毛细胞的带状突触数接近于中间区域的非噪声暴露对照(图6A、图6B)。其中图6A上图的比例尺为20μm，图6A下图是对图6A上图中白色选框内的图像进行局部放大，下图的比例尺为10μm。

此外，与未经处理的非噪声暴露对照组小鼠相比，NF免疫染色还显示噪声组噪声暴露小鼠耳蜗神经中的NF-阳性纤维显著减少；相反，PRMT5抑制剂+噪声损伤组(LLY-283-Noise)LLY-283预处理显著增加了NF阳性耳蜗神经的数量(图6A)。

另外，PRMT5抑制剂+噪声损伤组经LLY-283预处理，也观察到波I潜伏期的显著减少和波I振幅的增加，这表明抑制耳蜗中的PRMT5也可以减弱噪声诱导的耳蜗突触病变(图6C、图6D)。

综上，PRMT5抑制剂可有效防止噪声引起的毛细胞和突触损伤，减弱听阈偏移，起到保护听力的作用。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。

Claims (12)

1.PRMT5作为药物作用靶点在体外筛选预防和/或治疗听力损伤的药物中的应用。

2.PRMT5抑制剂或其药学上可接受的盐、酯、异构体、前药、多晶型物或溶剂化物在制备预防和/或治疗听力损伤的药物或试剂盒中的用途；

所述PRMT5抑制剂化学式为C₁₇H₁₈N₄O₄，结构如下式所示：

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述听力损伤选自以下至少一种：

所述听力损伤是与耳蜗毛细胞、听神经和/或神经突触相关的听力损伤；其中耳蜗毛细胞包括内毛细胞和外毛细胞；

所述听力损伤是与H4R3me2s和H3R8me2s的异常表达相关的听力损伤；

所述听力损伤是与耳蜗毛细胞ROS的异常表达相关的听力损伤；

所述听力损伤是与神经轴突丢失、NF阳性耳蜗神经减少相关的听力损伤；

所述听力损伤是与ABR波I潜伏期和波幅偏移相关的听力损伤。

4.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述听力损伤为感音神经性听力损伤，选自如下中的至少一种：耳毒性药物、噪声、遗传性、老年性、代谢性、自身免疫性疾病及肿瘤导致的听力损伤。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述噪声为频率为4-24kHz和/或强度为100～120dB的噪声；

所述耳毒性药物，包括氨基糖甙类耳毒性药物、大环脂类耳毒性药物、阿司匹林；化疗药物、非类固醇抗炎药物、奎宁中的一种或几种。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述耳毒性药物为顺铂。

7.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物为由PRMT5抑制剂和药用辅料制成的药物制剂。

8.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述PRMT5抑制剂能够抑制PRMT5的表达和/或功能；

所述PRMT5抑制剂预防和/或治疗听力损伤通过凋亡抑制介导。

9.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述PRMT5抑制剂为单一有效成分或几种成分的组合。

10.一种筛选预防和/或治疗听力损伤的药物的方法，所述方法包括：以PRMT5为药物靶点，寻找能够抑制或阻断PRMT5的表达和/或功能的物质作为候选药物。

11.根据权利要求10所述的方法，所述方法包括：在体外向细胞中施加待选药物，共培养后检测细胞中PRMT5的含量。

12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述药物能够降低细胞中PRMT5至少50％，则判定为具有治疗意义的药物。

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