CN113853871A

CN113853871A - 低频静磁场在提高粮食种芽多酚含量及活性的应用

Info

Publication number: CN113853871A
Application number: CN202111058912.0A
Authority: CN
Inventors: 蔡丹; 刘景圣; 刘回民; 修琳; 郑明珠; 刘美宏; 方晓敏; 任世达; 毛思凝; 刘立鹏; 刘倩男
Original assignee: Jilin Agricultural University
Current assignee: Jilin Agricultural University
Priority date: 2021-09-10
Filing date: 2021-09-10
Publication date: 2021-12-31

Abstract

本发明公开了一种低频静磁场在提高植物种芽多酚含量及活性的应用；提高植物种芽多酚含量及活性的方法，它包括：1）将植物种子放在磁场两极之间处理；所述磁场为低频静磁场；2）处理后的种子发芽；本发明优点在于：通过低频静磁场处理，玉米籽粒的芽长、发芽率显著提高；提高了多酚的降糖活性和多酚代谢关键酶PAL、4CL、C4H活力；显著促进了苯丙烷代谢途径，富集酚类物质含量和增加了植物种芽酚类物质降糖活性。

Description

低频静磁场在提高粮食种芽多酚含量及活性的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及低频静磁场在提高粮食种芽多酚含量及活性的应用。

背景技术

玉米籽粒富含蛋白质、脂肪、维生素、酚类物质等活性物质，具有开发高营养功能食品的巨大潜力。酚类物质是玉米中重要的活性成分之一，具有抗氧化、降血糖、降血脂等生理活性。发芽是一种简单、有效的处理方法，可以提高谷物的生物活性物质含量，目前常用于辅助发芽的非热物理技术有多色光辐照、非热等离子体、脉冲电场等，磁场作为一种简单、高效且对植物组织伤害小的方法，受到大量研究人员的关注。

研究表明植物酚类物质代谢的主要途径有莽草酸、苯丙烷代谢途径，其中苯丙烷代谢途径主要作用的酶有苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia lyase，PAL）、肉桂酸-4-羟化酶（Cinnamic acid 4-hydroxylase，C4H）、4-香豆酰-辅酶A连接酶（4-coumarate-CoA ligase，4CL）等，酚类物质的合成与这些酶密切相关。磁场作为一种外界物理刺激处理的方法，可以增强细胞内的酶活性，促进种子的萌发和生长，现有研究报道，棕榈油种子在磁场强度为9mT处理4h时，其发芽率显著高于对照组；向日葵种子在磁场强度为50mT处理2h时，发芽速度、幼苗长度和幼苗干重达到峰值，与对照组相比向日葵种子的α-淀粉酶、脱氢酶和蛋白酶的酶活性显著增大；大豆和玉米在200mT静磁场处理1h，可以有效缓解盐胁迫条件下种子的萌发和早期生长特性；番茄种子、鹰嘴豆、洋葱等其他作物，在磁场的作用下，种子的萌发速率得到显著的提高。目前磁场处理发芽主要集中在植物的生理变化上，对其活性成分酚类物质的研究报道较少。

发明内容

本发明目的是提供低频静磁场在提高粮食种芽多酚含量及活性的应用。

低频静磁场在提高粮食种芽多酚含量及活性的用途；

所述的粮食为玉米。

一种提高粮食种芽多酚含量及活性的方法，它包括：

1）将粮食种子放在磁场两极之间处理；所述磁场为低频静磁场；

2）处理后的种子发芽；

步骤1）所述的低频静磁场为2~5mT，处理12~72h；

所述的低频静磁场为3.5mT；

所述的处理，时间为60h；

步骤2）所述的发芽时间为4d；

所述的粮食为玉米。

本发明提供了低频静磁场在提高粮食种芽多酚含量及活性的用途；一种提高粮食种芽多酚含量及活性的方法，它包括：1）将粮食种子放在磁场两极之间处理；所述磁场为低频静磁场；2）处理后的种子发芽；本发明优点在于：通过低频静磁场处理，玉米籽粒的芽长、发芽率显著提高；提高了多酚的降糖活性和多酚代谢关键酶PAL、4CL、C4H活力；显著促进了苯丙烷代谢途径，富集酚类物质含量和增加了酚类物质降糖活性。

附图说明

图1 低频静磁场处理对发芽玉米根系的影响；

图2 低频静磁场处理对发芽玉米芽长的影响；

图3 低频静磁场处理对发芽玉米发芽率的影响；

图4 低频静磁场处理对发芽玉米鲜重的影响；

图5 磁场处理后发芽玉米多酚含量的变化；

图6 多酚标准品高效液相色谱图；1没食子酸；2丁香酸；3对香豆酸；4阿魏酸；5咖啡酸；6邻香豆酸；

图7 2.5mT处理PAL、C4H、4CL酶活力与多酚含量变化关系；

图8 3.5mT处理PAL、C4H、4CL酶活力与多酚含量变化关系；

图9 4.5mT处理PAL、C4H、4CL酶活力与多酚含量变化关系；

图10 发芽玉米酚类物质对α-葡萄糖苷酶活性的影响；A为游离酚，B为结合酚；

图11 发芽玉米酚类物质对α-淀粉酶活性的影响；A为游离酚，B为结合酚。

具体实施方式

本发明的材料与试剂：材料马齿形黄玉米吉单66（2020年10月份成熟采摘）吉林农业大学小麦和玉米深加工国家工程实验室提供；酚酸标品：没食子酸、阿魏酸、咖啡酸、对香豆酸、丁香酸、邻香豆酸（HPLC≥97%）上海源叶生物科技有限公司；甲醇、乙酸为色谱纯；α-葡萄糖苷酶（10U/g）、α-淀粉酶（10U/g） Sigma公司。

本发明的仪器与设备：Binder植物生长箱瑞汇企业有限公司；FLUO star Omega全自动多功能酶标仪德国BMGLabtech；Z36HK超高速冷冻离心机德国HERMLE公司；磁场催化光照培养箱MFOI-L1 英都斯特（无锡）感应科技有限公司；真空冷冻干燥机江苏天翎仪器有限公司；高效液相色谱仪美国Agilent公司。

实施例1 磁场处理玉米发芽

磁场处理玉米发芽的方法，它包括：

1）取籽粒饱满的玉米，用1%的次氯酸钠浸泡消毒30min，然后用蒸馏水冲洗后浸泡6 h；

2）在磁场催化光照培养箱中，将其放在磁场两极之间，磁场强度为3.5 mT，放置60h；

3）将磁场处理过的玉米籽粒均匀放入规格为34cm×25cm×4.5cm的发芽盘中，每盘放100粒，加入1000 mL水，放入植物生长箱中25 ℃避光发芽，发芽期间每12h换水一次。

实施例2 磁场处理玉米发芽的实验条件优化

一、磁场处理发芽

取籽粒饱满的玉米，用1%的次氯酸钠浸泡消毒30min，然后用蒸馏水冲洗后浸泡6h，将其放在磁场两极之间，设置不同实验条件：磁场强度分别为2.5 mT、3.5 mT、4.5 mT，分别放置12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h；将磁场处理过的玉米籽粒均匀放入规格为34cm×25cm×4.5cm的发芽盘中，每盘放100粒，加入1000 mL水，放入植物生长箱中25 ℃避光发芽至4 d取样（通过预实验发现玉米在发芽第4 d酚类物质含量最高），未经磁场处理发芽至4 d的玉米作为对照组，每12 h换水一次，将取好的样品进行冷冻干燥处理，研磨成粉后待测。

二、生长指标测定

发芽率：测定100粒玉米的发芽情况，种子出现肉眼可见的胚根萌芽时，且无霉变污染情况，则视为发芽；

芽长：随机取10粒玉米，用游标卡尺测定芽长，计算平均值；

鲜重：随机选取10粒玉米，用精密电子天平秤秤重，计算平均值。

上述实验均做三次平行；

结果：图1、2为磁场处理后发芽玉米的芽长的变化，图3为发芽率的变化，图4为鲜重的变化。由图可知，随着低频静磁场处理时间的增加，发芽玉米籽粒的芽长、发芽率、鲜重都呈先增加后下降的变化趋势，在3.5 mT处理60 h时，芽长、发芽率分别达到最大为(4.51±0.11) cm、96%，较对照组分别提高了24.44%、12.50%，在3.5 mT处理48 h发芽玉米籽粒的鲜重最大为(1.49±0.04)g/粒，较对照组提高了34%，且与对照组存在显著差异（P<0.05）。

玉米种子在磁场的作用下，增加了细胞膜的渗透性，加快了水和氧气进入种子的速度，提高呼吸氧化酶的活性，从而增强了胚的呼吸作用，因此促进了玉米籽粒的萌发，提高了玉米籽粒芽和根的长度，经磁场处理后的玉米种子根系更加发达（图1），且侧根增多，使得种子吸水面积增大，吸水能力增强，所以种子的鲜重被提高。但在磁场处理60 h后芽长、鲜重都有所下降，可能低频静磁场处理会产生临界效应，处理时间过长对玉米籽粒的生长产生了抑制作用，所以适宜的磁场处理条件可以促进种子的生长。

三、多酚的提取

游离酚的提取：取2 g发芽玉米粉，加入60 mL、70%的乙醇，在功率为300 W的超声波辅助条件下提取45 min，4000 r/min离心10 min，收集上清液，重复提取2次，45 ℃旋转蒸发至干，用5mL的甲醇溶解备用。

结合酚的提取：向上述提取游离酚剩下的残渣中，加入40 mL 2 mol/L的NaOH溶液，在25 ℃的摇床上反应1 h，用6 mol/L的盐酸调整pH至2-3，最后用乙酸乙酯进行萃取，每个样品萃取3次，合并上清液，置于旋转蒸发仪中旋干，用5 mL甲醇溶解备用。

四、酚类物质测定

1、多酚含量测定

多酚含量测定参考Luo的方法并稍作修改，精确吸取50 μL多酚标准液，加入200 μL蒸馏水和250 μL福林酚工作液，室温下避光静置5 min，然后加入250 μL 10% Na₂CO₃溶液，室温下避光反应1 h，吸取200 μL反应液置于96孔板中，测定765 nm处的吸光度值。以没食子酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，制作标曲为y=0.0057x+0.0746 R²=0.9991。

发芽玉米粉多酚提取量（mg/g）=

式中： C-为发芽玉米粉多酚浓度（mg/mL）；V-提取液体积（mL）；N-稀释倍数； M-发芽玉米粉质量（g）

结果：图2为磁场处理后发芽玉米结合酚和游离酚含量的变化，由图可知，在磁场的作用下，发芽玉米多酚含量得到显著提高，磁场处理时间在前48 h时多酚含量增长幅度较小，48 h后多酚含量有明显增长趋势，在磁场处理60 h强度为3.5 mT时，游离酚和结合酚含量增加最多，分别为(4.15 ±0.06)mg/g和(1.33 ±0.09)mg/g，较对照组分别提高了32.01%和40.69%，存在显著差异（P<0.05），说明磁场处理时间在60 h富集多酚含量效果最佳，所以在磁场处理60 h进行酚酸含量的测定。结果表明，静磁场处理可以有效的富集酚类物质含量，种子经磁场处理后，多种酶被激活，酶活力得到提高，促进植物体内的代谢过程，从而保证有充足的养料和较高的利用率，为酚类物质的富集提供了足够的物质基础和能量来源。

2、酚酸含量测定

本实验选取没食子酸、阿魏酸、咖啡酸、对香豆酸、丁香酸、邻香豆酸这6种酚酸类物质，这些酚酸类物质是苯丙烷途径代谢的关键酚类物质，采用高效液相色谱法对低频静磁场处理后的发芽玉米中酚酸类物质，进行定性定量分析。色谱柱：Zorbox SB-C18柱(150mm×4.6 mm，5 μm），DAD检测器，检测波长在280 nm。流动相分别为0.5%的冰乙酸（B相）和100%甲醇（A相），洗脱梯度见表1。

多酚标准品液相图和回归方程如图6和表2所示，由表2可知，低频磁场处理发芽玉米结合酚和游离酚含量变化存在显著差异（P<0.05），在游离酚中，丁香酸、对香豆酸、咖啡酸、邻香豆酸在磁场强度为3.5 mT时含量最大，分别为(206.72±8.26 )μg/g、(753.2 ±10.25)μg/g、(235.06±4.39) μg/g、(380.09±6.37 )μg/g，较对照组分别提高83.38%、59.85%、18.51%、2.36%，没食子酸在磁场强度为3.5 mT-4.5 mT，多酚含量变化为(158.20±4.25 )μg/g-(160.46±7.98 )μg/g，差异不显著（P>0.05）,但与对照组相比提高36.78%-37.68%，存在显著差异（P<0.05）,而检测到阿魏酸与含量对照组相比略微下降。

在结合酚中，磁场处理后没食子酸、邻香豆酸含量较对照组相比均有所下降，丁香酸、对香豆酸在磁场强度4.5mT含量最大，分别为(188.24±5.24) μg/g、(387.01±6.15) μg/g，与对照组相比分别提高了83.11 %、41.02 %，存在显著差异（P<0.05），阿魏酸和咖啡酸在磁场强度为3.5mT时含量达到最大，分别为(211.85±6.34) μg/g、(332.68±5.32) μg/g，但在对照组中这两种单酚未检测到，这可能是因为在种子发芽过程中受到多酚氧化酶、水解酶等影响，酚酸物质与木素质交联，参与植物细胞壁的形成所导致的。

五、多酚含量及关键酶活力变化关系

1、PAL酶活力的测定

参考丁雨宣等的方法，以每克发芽玉米鲜样每分钟在290 nm下吸光度增加0.01为一个PAL 活性单位（U）。

2、C4H酶活力的测定

参考wang的方法，以每克发芽玉米鲜样每分钟在340nm下吸光度增加0.01为一个C4H活性单位（U）。

3、4CL酶活力的测定

参考wei的方法，以每克发芽玉米鲜样每分钟在340nm下吸光度增加 0.01 为一个4CL活性单位（U）。

结果：低频静磁场处理总酚含量及关键酶PAL、C4H、4CL活力变化关系如图7-9所示，由图可知，2.5 mT、3.5 mT、4.5 mT处理后，总酚含量随着处理时间的增加均呈先增加后下降的变化趋势，在磁场强度为3.5 mT处理60 h时（图8），总酚含量最大为5.481 mg/g，此时PAL、C4H、4CL酶活力均达到最大值，分别为497 U/g、65 U/g、98 U/g，足以证明磁场处理后，发芽玉米总酚含量被提高，与其代谢的相关酶息息相关，首先影响了作用于多酚苯丙烷途径的关键酶和第一限速酶PAL，使得PAL酶活力被提高，为后续多酚代谢产生足够肉桂酸，这与周小理研究的结果一致，进而提高了C4H酶活力，促进了对香豆酸的合成，为下一步咖啡酸、阿魏酸等酚酸类物质提供足够的前体物质，这与上述发芽玉米酚酸类物质变化保持一致，也为苯丙烷代谢途径4CL的作用位点提供足够的物质基础，有助于黄酮类物质的生成。这些多酚代谢关键酶活力提高的原因可能是，酶的本质是蛋白质，蛋白质的空间结构是由氢键、范德华力和离子键相互作用等来维持的，磁场处理后，种子细胞中大量的带电离子和极性分子重新组合，加速酶分子氢键的合成，改变酶的空间结构，从而提高酶活力。此外，玉米发芽过程中，种子中的水分子和其它化合物水分子相互作用后产生超氧阴离子自由基，为抵抗自由基的侵害，基体自发产生抗氧化类物质，而磁场处理能够提高抗氧化物质的酶活力，从而提高抗氧化物质的含量，即发芽玉米中多酚的含量。

六、发芽玉米酚类物质体外降糖活性的测定

1、酚类物质对α-葡萄糖苷酶活性的测定

参考蒋鹏飞方法，取40 μL浓度为0.1 mol/L pH6.8的PBS，加入发芽玉米多酚提取液20 μL，0.4 U/mL的α-葡萄糖苷酶液10 μL，37 ℃保温10 min，再加入50 μL浓度为10mmol/L PNPG溶液，37 ℃反应20 min，最后加入0.2 mol/L的Na₂CO₃溶液终止反应，在405 nm测定其吸光度值。玉米多酚对α-葡萄糖苷酶的抑制率计算公式如下：

抑制率（%）=（1－

）×100%

A₁：10 μL α-葡萄糖苷酶溶液+20 μL提取物稀释液+50 μL底物+适量磷酸缓冲盐溶液的吸光度；A₂：适量磷酸缓冲溶液+20 μL提取物稀释液吸光度；A₃：适量磷酸缓冲溶液+10 μL α-葡萄苷酶溶液+50 μL底物的吸光度；

结果：图10为发芽玉米多酚对α-葡萄糖苷酶活性的抑制的影响，由图可知，低频静磁场处理后，发芽玉米游离酚对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用，显著高于结合酚（P<0.05)，在磁场强度为3.5 mT处理60 h，对α-葡萄糖苷酶的抑制作用下降最显著，游离酚的IC₅₀值为(18.21±0.52)μg/mL，较对照组下降了61.47%，表明此时游离酚对α-葡萄糖苷酶的抑制作用最大，在磁场强度为2.5mT时，结合酚的IC50值与对照组比差异不显著（P>0.05）,3.5 mT、4.5 mT与对照组比存在显著差异（P<0.05），在3.5 mT处理60 h，结合酚对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率最大，IC₅₀值为(52.77±1.85)μg/mL，与对照组比下降了31.95%，这与上述多酚含量变化一致，经磁场处理后，促进了种子的生长，同时促进了多酚的次级代谢，从而影响了多酚的含量、种类、结构，提高了对α-葡萄糖苷酶的抑制率，说明磁场处理发芽玉米酚类物质有良好的降糖效果。

2、酚类物质对α-淀粉酶活性的测定

参考乔锦莉方法，取发芽玉米多酚提取液20μL，加入20μL α-淀粉酶（酶活7U/L），混匀后在37℃的水浴锅中预热30min，加入40μL预热到37℃的1%的淀粉溶液，在37℃温度下反应3 min后加入80 μLDNS显示溶剂，沸水浴8 min，冷却至室温后，加入800 μL蒸馏水稀释，在450 nm下测定吸光度值，同时做样品对照。玉米多酚对α-淀粉酶的抑制率计算公式如下：

抑制率（%）=

×100%

A₀：不加多酚抑制剂时的吸光度；A₁：加入多酚抑制剂时的吸光度。

α-淀粉酶作用在小肠肠道中，是消化碳水化合物的关键酶，由图11可知，游离酚和结合酚对α-淀粉酶的抑制作用存在显著差异，随着磁场处理时间的增加，游离酚和结合酚的半抑制浓度均呈逐渐下降后上升的变化趋势。在磁场强度为3.5mT处理60h，游离酚的IC₅₀值为(35.89±1.46 )μg/mL，结合酚的IC₅₀值为(70.49 ±2.76)μg/mL,与对照组比存在显著差异（P<0.05）。Worsztynowicz^[32]等的结果，进一步证明了多酚中酚酸类物质，是抑制α-淀粉酶活力的主要物质，磁场处理玉米发芽，提高了酚酸类物质的含量，进而加强了其降糖活性。

综上结果表明：在磁场强度为3.5 mT、处理60 h时，玉米籽粒的芽长、发芽率显著提高，与对照组相比，结合酚、游离酚含量分别提高32.01%、40.69%，此时游离酚中，丁香酸和对香豆酸含量显著增大，分别增加了83.28%、59.85%，游离酚的α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的半抑制浓度分别为18.21 μg/mL、35.89 μg/mL，结合酚对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的半抑制浓度分别为52.77 μg/mL、70.19 μg/mL，低频静磁场处理提高了多酚的降糖活性和多酚代谢关键酶PAL、4CL、C4H活力。由此可以证明，低频磁场显著促进了苯丙烷代谢途径，富集酚类物质含量和增加了酚类物质降糖活性，为发芽玉米食品的开发提供必要的理论基础。

实施例3 磁场处理小麦发芽

磁场处理小麦发芽的方法，它包括：

1）取籽粒饱满的小麦，用1%的次氯酸钠浸泡消毒30min，然后用蒸馏水冲洗后浸泡6 h；

3）将磁场处理过的小麦均匀放入规格为34cm×25cm×4.5cm的发芽盘中，加入1000 mL水，放入植物生长箱中25 ℃避光发芽，发芽期间每12h换水一次。

实施例4 磁场处理大豆发芽

磁场处理大豆发芽的方法，它包括：

1）取籽粒饱满的大豆，用1%的次氯酸钠浸泡消毒30min，然后用蒸馏水冲洗后浸泡6 h；

3）将磁场处理过的大豆均匀放入规格为34cm×25cm×4.5cm的发芽盘中，加入1000 mL水，放入植物生长箱中25 ℃避光发芽，发芽期间每12h换水一次。

实施例5 磁场处理水稻发芽

磁场处理水稻发芽的方法，它包括：

1）取籽粒饱满的水稻，用1%的次氯酸钠浸泡消毒30min，然后用蒸馏水冲洗后浸泡6 h；

3）将磁场处理过的水稻均匀放入规格为34cm×25cm×4.5cm的发芽盘中，加入1000 mL水，放入植物生长箱中25 ℃避光发芽，发芽期间每12h换水一次。

Claims

1.低频静磁场在提高粮食种芽多酚含量及活性的应用。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的粮食为玉米。

3.一种提高植物种芽多酚含量及活性的方法，它包括：

2）处理后的种子发芽。

4.根据权利要求3所述的一种提高粮食种芽多酚含量及活性的方法，其特征在于：步骤1）所述的低频静磁场为2~5mT，处理12~72h。

5.根据权利要求4所述的一种提高粮食种芽多酚含量及活性的方法，其特征在于：所述的低频静磁场为3.5mT。

6.根据权利要求3、4或5所述的一种提高粮食种芽多酚含量及活性的方法，其特征在于：所述的处理，时间为60h。

7.根据权利要求6所述的一种提高粮食种芽多酚含量及活性的方法，其特征在于：步骤2）所述的发芽时间为4d。

8.根据权利要求7所述的一种提高粮食种芽多酚含量及活性的方法，其特征在于：所述的粮食为玉米。