CN113840829A - 从水溶液中去除去污剂的组合物和方法 - Google Patents
从水溶液中去除去污剂的组合物和方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113840829A CN113840829A CN202080033968.8A CN202080033968A CN113840829A CN 113840829 A CN113840829 A CN 113840829A CN 202080033968 A CN202080033968 A CN 202080033968A CN 113840829 A CN113840829 A CN 113840829A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- detergent
- surfactant
- detergents
- bont
- polysorbate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000003599 detergent Substances 0.000 title claims abstract description 137
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 44
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title abstract description 15
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 title abstract description 6
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims abstract description 75
- 239000000693 micelle Substances 0.000 claims abstract description 51
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 43
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 claims abstract description 36
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 claims abstract description 36
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 claims abstract description 36
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 claims abstract description 36
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims abstract description 13
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims abstract description 13
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims abstract description 13
- 229940068977 polysorbate 20 Drugs 0.000 claims abstract description 13
- PSBDWGZCVUAZQS-UHFFFAOYSA-N (dimethylsulfonio)acetate Chemical compound C[S+](C)CC([O-])=O PSBDWGZCVUAZQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 229940117986 sulfobetaine Drugs 0.000 claims abstract description 8
- UMWKZHPREXJQGR-UHFFFAOYSA-N n-methyl-n-(2,3,4,5,6-pentahydroxyhexyl)decanamide Chemical compound CCCCCCCCCC(=O)N(C)CC(O)C(O)C(O)C(O)CO UMWKZHPREXJQGR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- SBWGZAXBCCNRTM-CTHBEMJXSA-N n-methyl-n-[(2s,3r,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexyl]octanamide Chemical compound CCCCCCCC(=O)N(C)C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO SBWGZAXBCCNRTM-CTHBEMJXSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 150000008195 galaktosides Chemical class 0.000 claims abstract description 5
- JRFKIOFLCXKVOT-UHFFFAOYSA-N hydroxymethylnicotinamide Chemical compound OCNC(=O)C1=CC=CN=C1 JRFKIOFLCXKVOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 229950005422 hydroxymethylnicotinamide Drugs 0.000 claims abstract description 5
- GUQQBLRVXOUDTN-XOHPMCGNSA-N 3-[dimethyl-[3-[[(4r)-4-[(3r,5s,7r,8r,9s,10s,12s,13r,14s,17r)-3,7,12-trihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]pentanoyl]amino]propyl]azaniumyl]-2-hydroxypropane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CC(O)CS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 GUQQBLRVXOUDTN-XOHPMCGNSA-N 0.000 claims abstract description 4
- GCRLIVCNZWDCDE-SJXGUFTOSA-N n-methyl-n-[(2s,3r,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexyl]nonanamide Chemical compound CCCCCCCCC(=O)N(C)C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO GCRLIVCNZWDCDE-SJXGUFTOSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 108030001720 Bontoxilysin Proteins 0.000 claims description 30
- 231100001103 botulinum neurotoxin Toxicity 0.000 claims description 30
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 27
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 26
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 19
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 17
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 claims description 15
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 claims description 15
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 claims description 12
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 claims description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 6
- 108010057266 Type A Botulinum Toxins Proteins 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims 2
- RKWGIWYCVPQPMF-UHFFFAOYSA-N Chloropropamide Chemical compound CCCNC(=O)NS(=O)(=O)C1=CC=C(Cl)C=C1 RKWGIWYCVPQPMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 abstract description 27
- -1 BIGCHAPS) Chemical compound 0.000 abstract description 2
- 229930182478 glucoside Natural products 0.000 abstract description 2
- 150000008131 glucosides Chemical class 0.000 abstract description 2
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 abstract 1
- 101710117542 Botulinum neurotoxin type A Proteins 0.000 description 66
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 35
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 30
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 26
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 21
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 20
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 19
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 19
- ZWEVPYNPHSPIFU-AUGHYPCGSA-N (2r,3s,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxy-n-[3-[3-[[(2r,3s,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanoyl]amino]propyl-[(4r)-4-[(3r,5s,7r,8r,9s,10s,12s,13r,14s,17r)-3,7,12-trihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenan Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)N(CCCNC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO)CCCNC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 ZWEVPYNPHSPIFU-AUGHYPCGSA-N 0.000 description 18
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 18
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 9
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 9
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 9
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 8
- 239000004627 regenerated cellulose Substances 0.000 description 7
- 239000004695 Polyether sulfone Substances 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 6
- 229920006393 polyether sulfone Polymers 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 4
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 3
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 125000002147 dimethylamino group Chemical group [H]C([H])([H])N(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000011143 downstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 229930186900 holotoxin Natural products 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 229950008882 polysorbate Drugs 0.000 description 2
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 2
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 2
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 2
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000012421 spiking Methods 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 101150007809 BAM2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 101710138657 Neurotoxin Proteins 0.000 description 1
- 229920012266 Poly(ether sulfone) PES Polymers 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 238000010256 biochemical assay Methods 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 1
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000001236 detergent effect Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000010324 immunological assay Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000002161 motor neuron Anatomy 0.000 description 1
- GCRLIVCNZWDCDE-UHFFFAOYSA-N n-methyl-n-(2,3,4,5,6-pentahydroxyhexyl)nonanamide Chemical compound CCCCCCCCC(=O)N(C)CC(O)C(O)C(O)C(O)CO GCRLIVCNZWDCDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 239000002581 neurotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000618 neurotoxin Toxicity 0.000 description 1
- ZPIRTVJRHUMMOI-UHFFFAOYSA-N octoxybenzene Chemical compound CCCCCCCCOC1=CC=CC=C1 ZPIRTVJRHUMMOI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- KCXFHTAICRTXLI-UHFFFAOYSA-N propane-1-sulfonic acid Chemical compound CCCS(O)(=O)=O KCXFHTAICRTXLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 229940043517 specific immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/34—Extraction; Separation; Purification by filtration, ultrafiltration or reverse osmosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/34—Size selective separation, e.g. size exclusion chromatography, gel filtration, permeation
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D61/00—Processes of separation using semi-permeable membranes, e.g. dialysis, osmosis or ultrafiltration; Apparatus, accessories or auxiliary operations specially adapted therefor
- B01D61/14—Ultrafiltration; Microfiltration
- B01D61/16—Feed pretreatment
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/33—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Clostridium (G)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D2311/00—Details relating to membrane separation process operations and control
- B01D2311/12—Addition of chemical agents
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D61/00—Processes of separation using semi-permeable membranes, e.g. dialysis, osmosis or ultrafiltration; Apparatus, accessories or auxiliary operations specially adapted therefor
- B01D61/14—Ultrafiltration; Microfiltration
- B01D61/145—Ultrafiltration
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Water Supply & Treatment (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
描述了通过添加浓度超过第二去污剂或表面活性剂临界胶束浓度(CMC)的第二去污剂或表面活性剂来去除水溶液中第一去污剂或表面活性剂的组合物和方法。这些组合物和方法特别适用于含蛋白的溶液。典型的第一去污剂/表面活性剂包括聚山梨酯20、聚山梨酯80和TritonX‑100。合适的第二去污剂或表面活性剂可以是离子型、非离子型或两性离子型。典型的第二去污剂/表面活性剂包括但不限于半乳糖苷去污剂(例如辛基‑β‑半乳糖苷)、葡糖苷去污剂(例如MEGA8、MEGA9、MEGA10)、胆酰胺去污剂(例如CHAPS、CHAPSO、BIGCHAPS)和磺基甜菜碱去污剂(例如磺基甜菜碱3‑10)。
Description
本申请要求2019年3月14日提交的申请号为62/818,554的美国临时专利申请的权益。这些以及所有其他引用的外部材料全部通过引用并入本文。如果通过引用并入的引用中术语的定义或用法与本文规定的术语定义不一致或相反,则以本文规定的术语定义为准。
技术领域
本发明的领域是去污剂或表面活性剂的去除,尤其是从药物制剂中去除。
背景技术
以下描述包括可能有助于理解本发明的信息。这并不是承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明相关,也不是承认任何具体或隐含引用的出版物是现有技术。
辅料经常被添加到小分子(例如<500D)和/或蛋白质溶液(如药物制剂)中,以减少聚集,防止非特异性结合到容器表面,并以其他方式提高稳定性。传统辅料包括蛋白质(如人或牛血清白蛋白、卵清蛋白、免疫球蛋白等)、糖和多糖以及可溶性聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)。为了提供非免疫原性制剂,非离子和两性离子去污剂和表面活性剂正越来越多地用于此目的。然而,许多去污剂和表面活性剂会干扰用于此类溶液表征和/或质量控制的分析方法(如免疫测定、基于肽报告的测定、基于细胞的测定、质谱等)。
遗憾的是,一旦引入去污剂和表面活性剂,就很难从溶液中去除。离子交换可用于去除带电(如阳离子或阴离子)去污剂和表面活性剂,但许多常用表面活性剂不带形式上的电荷。疏水性介质可结合大量去污剂和/或表面活性剂,然而,此类疏水性介质也可结合大量目标蛋白(可能以低浓度存在)。透析用于去除去污剂或表面活性剂,但仅部分成功,因为去污剂或表面活性剂与胶束的自缔合减少了可通过透析去除的“溶剂化”表面活性剂或去污剂的量。因此,浓度梯度驱动透析去除去污剂和表面活性剂的速度非常缓慢。胶束的形成还干扰了通过更为活跃的基于尺寸的分离方法(如凝胶过滤和超滤)来去除表面活性剂和去污剂的工作,因为它们的尺寸会导致被超滤膜截留,并从凝胶过滤介质的内部体积中排除。
商用产品可用于去除水溶液中的表面活性剂和去污剂。例如,ThermoFisher公司的HiPPR树脂声称可从低浓度蛋白/肽溶液中去除95%的表面活性剂或去污剂,同时保持蛋白/肽的含量。G Biosciences公司提供了一种去污树脂,该树脂被描述为对大多数表面活性剂具有高亲和力,而对大多数蛋白和肽具有低亲和力。Calbiochem公司提供了一种疏水性CALBIOSORBTM树脂,用于分批去除表面活性剂,并建议在透析缓冲液中使用该树脂,以避免相关蛋白的非特异性结合。然而,目前尚不清楚这些产品是否能有效去除日益被用作辅料的聚山梨酯表面活性剂,或者在处理后所有蛋白/肽是否保留在溶液中。
在某些应用中,使用有机溶剂(如乙酸乙酯)提取肽溶液。在这种萃取中,相对疏水的去污剂转移到萃取混合物的相对不溶性有机层。然而,由于存在不可逆变性的可能,此类方法通常会随后对蛋白的物理性质进行表征(例如,通过质谱法),而这可能无法提供有关活性的信息。
因此,仍然需要一种简单方便的方法从水溶液中去除去污剂和/或表面活性剂,同时在溶液中保留功能蛋白和/或肽。
发明内容
本发明构思的组合物和方法提供了通过向溶液中直接添加第二表面活性剂或去污剂(例如,半乳糖苷去污剂,如辛基-β-半乳糖苷;葡糖苷去污剂,如N-辛酰基-N-甲基葡糖胺(MEGA 8)、N-壬酰基-N-甲基葡萄糖胺(MEGA 9)和/或N-癸酰基-N-甲基葡糖胺(MEGA10);胆酰胺去污剂,如3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(CHAPS)、3-[3-(胆酰胺基丙基)二甲氨基]-2-羟基-1-丙磺酸盐(CHAPSO)和/或(3a,5b,7a,12a)-N,N-双[3-(D-葡萄糖酰氨基)丙基]-3,7,12-三羟基胆甾烷-24-胺(BIGCHAPS);和/或磺基甜菜碱去污剂,如磺基甜菜碱3~10)从含有蛋白的溶液中去除表面活性剂或去污剂(例如聚山梨酯20、聚山梨酯80和/或聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100))的方法使第二表面活性剂或去污剂的添加浓度至少等于第二表面活性剂或去污剂临界胶束浓度,允许形成包括两种表面活性剂/去污剂的混合胶束,并使用基于尺寸的分离方法将蛋白从所得混合胶束中分离(如超滤和/或凝胶过滤)。一些实施方案包括在从混合胶束分离蛋白质之前或之时将超滤分离中使用的超滤膜封闭的步骤。一些实施方案包括在分离来自混合胶束的蛋白之前或之时将凝胶过滤分离中使用的凝胶过滤介质封闭的步骤。本发明构思的一些实施方案包括从基于尺寸的分离方法中收集包含蛋白的分析馏分的步骤,所述分析馏分可使用基于细胞的测定进行分析。所述蛋白可为肉毒杆菌神经毒素(例如,A型肉毒杆菌(Botulinum)神经毒素或BoNT/A)。
附图说明
图1:图1示意性地描述了从含蛋白溶液中去除去污剂的示例性过程。
图2:图2示出了CMC 535TM对经不同的第一和第二去污剂处理的水溶液中去污剂含量表征的典型结果。
图3A至图3C:图3A示出了在不同的第二去污剂存在情况下用渗滤从溶液中去除聚山梨酯20的典型结果。图3B示出了在不同的第二去污剂存在情况下用渗滤从溶液中去除聚山梨酯80的典型结果。图3C示出了在不同的第二去污剂存在情况下用渗滤从溶液中去除Triton X-100的典型结果。
图4A至图4C:图4A示出了用本发明构思的方法从溶液中获得的A型肉毒杆菌神经毒素(BoNT/A)的典型结果。上面的小图示出了从含有聚山梨酯20的BoNT/A样品中回收的BoNT/A。下面的小图示出了相对于含BoNT/A且不含第一去污剂(聚山梨酯20)对照样品进行归一化的数据。图4B示出了用本发明构思的方法从溶液中获得的A型肉毒杆菌神经毒素(BoNT/A)的典型结果。上面的小图示出了从含有聚山梨酯80的BoNT/A样品中回收的BoNT/A。下面的小图示出了相对于含BoNT/A且不含第一去污剂(聚山梨酯80)对照样品进行归一化的数据。图4C示出了用本发明构思的方法从溶液中获得的A型肉毒杆菌神经毒素(BoNT/A)的典型结果。上面的小图示出了从含有Triton X-100的BoNT/A样品中回收的BoNT/A。下面的小图示出了相对于含BoNT/A且不含第一去污剂(Triton X-100)对照样品进行归一化的数据。
图5A和图5B:图5A示出了用CMC 535TM方法测定的额外BigCHAP洗涤液对去除聚山梨酯80的影响的研究的典型结果。图5B示出了用CMC535TM方法测定的额外缓冲液洗涤对去除聚山梨酯80的影响的研究的典型结果。
图6A和图6B:图6A示出了从含聚山梨酯80的样品中回收BoNT/A的研究的典型结果,所述聚山梨酯80随后用含有BigCHAP的混合胶束萃取,用含有BigCHAP的缓冲液反复洗涤去除。上面的小图示出了相对添加到样本中的BoNT/A的结果。下面的小图示出了相对不含聚山梨酯80的BoNT/A样品回收率的结果。图6B示出了从含有聚山梨酯80的样品中回收BoNT/A的研究的典型结果,所述聚山梨酯80随后用与BigCHAP混合的胶束萃取,并用不含第二去污剂的缓冲液反复洗涤去除。左侧的小图示出了相对添加到样本中的BoNT/A的结果。右侧的小图示出了相对不含聚山梨酯80的BoNT/A样品回收率的结果。
图7A至图7C:图7A示出了用不同浓度的辛基-β-半乳糖苷(OBG)、BigCHAP或CHAPS从BoNT/A样品中提取聚山梨酯20的典型结果,如用CMC 535TM法所表征的。图7B示出了用不同浓度的辛基-β-半乳糖苷(OBG)、BigCHAP或CHAPS从BoNT/A样品中提取聚山梨酯80的典型结果,如用CMC 535TM方法所述。图7C示出了用不同浓度的辛基-β-半乳糖苷(OBG)、BigCHAP或CHAPS从BoNT/A样品中提取Triton X-100的典型结果,如用CMC 535TM法所表征的。
图8A至图8C:图8A示出了用不同浓度的辛基-β-半乳糖苷(OBG)、BigCHAP或CHAPS进行混合胶束萃取后,从含有聚山梨酯20的样品中回收BoNT/A的研究的典型结果,如使用Biosentel BoTestA/E试剂所表征的。上面的小图示出了BoNT/A回收率占添加量的百分比。下面的小图示出了BoNT/A回收率,即不含聚山梨酯20的对照BoNT/A样品的回收率百分比。图8B示出了用不同浓度的辛基-β-半乳糖苷(OBG)、BigCHAP或CHAPS进行混合胶束萃取后,从含有聚山梨酯80的样品中回收BoNT/A的研究的典型结果,如使用BioSentinel BoTestA/E试剂所表征的。上面的小图示出了BoNT/A回收率占添加量的百分比。下面的小图示出了BoNT/A回收率,即不含聚山梨酯80的对照BoNT/A样品的回收率百分比。图8C示出了用不同浓度的辛基-β-半乳糖苷(OBG)、BigCHAP或CHAPS进行混合胶束萃取后,从含有Triton X-100的样品中回收BoNT/A的研究的典型结果,如用BoTestA/ETM试剂所表征的。上面小图示出了BoNT/A回收率占添加量的百分比。下面小图示出了BoNT/A回收率,即不含Triton X-100的对照BoNT/A样品的回收率百分比。
图9A至图9D:图9A示出了用在不含表面活性剂的培养基或含聚山梨酯80赋形剂的培养基中制备的BoNT/A进行基于细胞的BoNT/A测定获得的典型结果。图9B示出了与图9A类似研究的典型结果,其中在测定之前对BoNT/A样品进行了透析。图9C示出了用第二表面活性剂从含BoNT/A的样品中去除聚山梨酯80赋形剂的研究的典型结果,特别是用第二表面活性剂提取的样品中的聚山梨酯80赋形剂和残余表面活性剂对Bioscontinel BoTestA/ETM测定中的细胞形态的影响。图9D示出了用在含表面活性剂的培养基中制备的BoNT/A和在含聚山梨酯80赋形剂的培养基中制备并进行混合胶束萃取的BoNT/A进行的BiosontinelBoTestA/ETM测定中BoNT/A的EC50测定的典型结果。
图10:图10示出了不同截留分子量(molecular weight cutoff,MWC)的Amicon再生纤维素超滤膜对聚山梨酯80和BigCHAP混合胶束的截留研究的典型结果。
图11:图11示出了聚山梨酯80和BigCHAP的混合胶束通过不同MWC的PES(Pierce,Sartoris)超滤膜的截留率的比较。
图12:图12示出了用不同截留分子量的再生纤维素(Amicon)和PES(Pierce,Sartoris)超滤膜,用BigCHAPS去除聚山梨酯80的混合胶束后BoNT/A回收研究的典型结果。
图13:图13示出了研究人血清白蛋白(HSA)预封闭以及组合预封闭和样品加标对混合胶束分离后第一去污剂和BoNT/A回收率的影响的典型结果。
图14:图14示出了Biosentel体内BoCellTM测定中人血清白蛋白(HSA)预封闭以及组合预封闭和样品加标对细胞的影响研究的典型结果。
具体实施方式
本发明主题提供了组合物和方法,其中通过直接添加浓度超过第二去污剂或表面活性剂临界胶束浓度(CMC)的第二去污剂或表面活性剂,至少部分去除第一去污剂或表面活性剂(例如作为赋形剂添加到蛋白或肽溶液中的去污剂或表面活性剂)。可选择第二去污剂或表面活性剂以形成具有低分子量(例如小于约500kD、200kD、150kD或100kD)和/或小流体动力学半径(例如小于目标蛋白的流体动力学半径)的胶束。在优选实施方案中,表面活性剂的第二去污剂的CMC为约3.5mM至约40mM,和/或形成平均分子量在约8kD至约40kD的胶束。典型的第一去污剂/表面活性剂包括但不限于聚山梨酯20、聚山梨酯80和Triton X-100。合适的第二去污剂或表面活性剂可以是离子型、非离子型或两性离子型。典型的第二去污剂/表面活性剂包括但不限于半乳糖苷去污剂(例如辛基-β-半乳糖苷)、葡糖胺去污剂(例如MEGA 8、MEGA 9、MEGA 10)、胆酰胺去污剂(例如CHAPS、CHAPSO、BIGCHAPS)和磺基甜菜碱去污剂(例如磺基甜菜碱3-10)。
在本申请中,术语“大约”定义了标称值20%的范围。
可选择第二去污剂或表面活性剂,以便对蛋白或肽的后续测定(例如免疫测定和/或基于细胞的测定)不产生干扰或提供可接受的干扰水平(例如,不干扰准确表征的干扰水平)。在将第二去污剂或表面活性剂直接添加到含有第一去污剂或表面活性剂的溶液中时,第一去污剂或表面活性剂的分子被并入第二去污剂或表面活性剂的胶束中以形成含有两种表面活性剂/去污剂物种的混合胶束。令人惊讶的是,发明人发现第二去污剂/表面活性剂种类及其浓度可被选择以形成相对较小的混合胶束。具体而言,可选择第二去污剂或表面活性剂,以便直接添加到包含第一去污剂或表面活性剂的溶液中,导致形成有效流体动力学半径小于待分析蛋白质或肽(例如肉毒杆菌神经毒素)的混合胶束并且存在于初始溶液中。应当理解,所用表面活性剂和/或去污剂可以作为赋形剂存在,用于减少许多药物制剂中蛋白治疗药物的聚集。
可通过基于尺寸的分离方法(例如超滤、凝胶过滤等)有效地将所得的小混合胶束与目标蛋白或分析物分离和/或分开,从而从含蛋白的溶液中去除至少一部分第一和第二去污剂。应当理解,在一些实施方案中,例如在那些结合超滤的实施方案中,在去污剂/表面活性剂去除过程中,可以参照原始样品体积中的浓度来浓缩目标蛋白或肽。在本发明构思的优选实施方案中,去除足够的第一去污剂/表面活性剂和第二去污剂/表面活性剂,以减少或消除对表征蛋白质量和/或活性的下游分析方法的干扰。由此产生的包括蛋白或肽的高分子量部分(例如,滞留物或流通部分)随后可以用可能会受到第一和/或第二表面活性剂或去污剂干扰的方法来表征。
本文公开的本发明的替代元件或实施方案的分组不应解释为限制。每个分组的成员可单独或与分组的其他成员或本文中发现的其他元素一起被提及和主张。出于方便和/或可专利性的原因,可以将一个组的一个或多个成员包括在一个组中或从中删除。当出现任何此类包含或删除时,本说明书被视为包含修改后的组,从而满足所附权利要求中使用的所有马库什组的书面描述。
在一些实施方案中,本发明构思的混合胶束可穿过截留肉毒杆菌神经毒素的膜(例如,超滤或透析膜),从肉毒杆菌神经毒素溶液中去除第一表面活性剂,同时保留活性蛋白。类似地,本发明构思的混合胶束可以进入适当选择的尺寸排阻层析介质的内部体积,其中溶液中目标蛋白或肽被排除,并在尺寸排阻色谱柱层析期间以排除(即流穿)的体积和/或早期部分出现。
在一些实施方案中,例如当待表征的蛋白或肽的浓度较低时,可在分离步骤之前和/或期间对膜或凝胶过滤介质的表面进行封闭。例如,可通过添加一种或多种不干扰下游表征方法的外源蛋白(例如,人血清白蛋白、牛血清白蛋白、禽血清白蛋白、乙酰化白蛋白、卵清蛋白、哺乳动物免疫球蛋白、禽免疫球蛋白、哺乳动物或硬骨鱼明胶、酪蛋白等)来封闭此类表面。在一些实施方案中,可通过添加长链聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇)来封闭此类表面。这种封闭可减少或消除因分离表面上的分析物的变性造成的损失和/或因非特异性结合至分离表面而造成的损失。封闭蛋白和/或聚合物可在0.1%到10%(w/v)的浓度范围内应用,并且可在分离步骤之前、期间,或之前和期间都应用。在一些实施方案中,封闭蛋白和/或聚合物可在使用前应用于尺寸分离膜或介质的表面,在给定时间封闭该表面,并在应用含有分析物的样品之前通过冲洗或洗涤去除多余材料。
图1所示示意图中提供了本发明构思的方法的示例,其描述了用超滤膜离心吸附柱(spin column)从含有肉毒杆菌神经毒素(BoNT)的溶液中分离混合胶束。如图所示,将第二去污剂直接添加到包含BoNT的溶液(也含有第一去污剂)中,从而形成混合胶束,相对于仅由第一去污剂形成的胶束,其流体动力学半径减小。在配备有适当截留分子量的超滤膜的离心吸附柱中离心导致混合胶束通过膜并保留BoNT。通过颠倒离心吸附柱中含样品部分的方向并进行短暂离心,可以很容易地回收被截留的含BoNT的溶液。应了解,以比所应用样品更小的体积回收BoNT可得到BoNT浓度,所述浓度可为分析(例如,使用基于细胞的测定或免疫分析)提供便利。
发明人发现,本发明构思的方法可有效去除干扰生化表征方法和基于细胞的测定方法的第一表面活性剂。发明人相信本发明构思的方法可以类似地应用于诸如质谱和毛细管电泳等物理方法。
在典型的表面活性剂/去污剂去除方案中,使用含有0.5%w/v人血清白蛋白(HSA)的封闭缓冲液将Amicon UFC离心吸附柱预封闭,并通过离心去除残余的封闭缓冲液。然后将100μL试样或药品(例如,50mM HEPES、140mM NaCl、0.5%HSA(人血清白蛋白)和0.1%第一去污剂中的100μMA型肉毒杆菌神经毒素(BoNT/A))与400μL含有第二去污剂的缓冲液混合,混合后第二去污剂的浓度被选定为匹配或超过第二去污剂的临界胶束浓度(CMC)(例如,约1%w/v或更高)。在一些实施方案中可省略HSA,因HSA已被发现会降低一些BoNT(例如BoNT/A)的回收率。
经过短暂的孵育期(例如约1分钟、2分钟、3分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟或1小时)后,将混合物应用到离心吸附柱中并离心。在一些实施方案中,可通过添加500μL体积的含有第二去污剂的缓冲液并施加离心力来清洗离心吸附柱。用500μL洗涤缓冲液洗涤离心吸附柱后,将离心吸附柱倒置并短暂离心,以回收代表去污剂提取样品的约15μL体积。该体积可稀释以进行分析和/或不同分析方法之间分摊(splitting)。
如图2所示,发明人发现用于表征去污剂浓度的商业产品(CMC 535TM)与许多已被发现可用作第二去污剂的去污剂无反应。如图所示,CMC 535TM测定产生了聚山梨酯20(P20)、聚山梨酯80(P80)和Triton X-100(X100)的剂量/反应曲线,但在试验浓度范围内对许多潜在的第二去污剂没有明显的反应。
使用上述方案去除第一去污剂的典型结果,并使用CMC 535TM进行表征如图3A至图3C所示,辛基-β-葡萄糖苷、BigCHAP和CHAPS能很好地去除聚山梨酯去污剂。Triton X-100的去除似乎与第二去污剂的选择无关。
对在含第一表面活性剂的缓冲液中含有BoNT/A的试样进行类似处理,并用BioSentinel BoTestTM活性测定对BoNT/A含量进行表征。BoTestTM活性测定利用一种报告肽,该肽含有BoNT/A底物的类似物,并带有一对由底物肽分离的FRET荧光基团。蛋白水解导致FRET对的分离和荧光的明显变化。通过将50μL提取样品与100μL 0.25μM BoTestTMA/E报告肽底物混合,并用剂量/反应曲线定量进行体外BoTestTM测定。结果如图4A至图4C所示。应了解,在某些情况下,第一去污剂可在一定程度上激活BoNT/A。因此,保留第一去污剂的对照样品可能会显示BoNT/A活性错误升高,从而产生测试样品中去除第一去污剂的混合胶束后回收率低的印象。同样,如果提供的对照没有第一去污剂,则可能会高估回收率。然而,使用某些第二去污剂可明显提高BoNT/A的回收率。如图所示,第二去污剂的选择可能对BoNT/A的回收产生影响。例如,去污剂SB-10可能与BoTestTM测定法不兼容。
在一些实施方案中,可向含有BoNT/a和第一去污剂(聚山梨酯80)的样品中加入额外体积的含第二去污剂(BigCHAP)的缓冲液,随后进行额外的多轮离心。如图5A所示,如CMC35TM测定所示,这可有效地进一步去除第一去污剂。图5B示出了用不含第二表面活性剂的缓冲液的类似研究的效果。如图所示,用含有第二去污剂的缓冲液进行额外清洗可以去除第一混合胶束萃取中未去除的额外第一去污剂。使用缓冲液进行额外清洗不会产生这种效果。
应当理解,改进初始去污剂的提取并不一定表明功能分析物回收性能的改进。上面在图5A和5B中评估的样品也使用如上所述的BoTestTMA/E试剂进行表征。结果在图6A和图6B中示出。如图所示,功能性BoNT/A的回收率随着额外的洗涤而降低。这可能是由于非特异性的结合而导致BoNT/A变性和/或损失。因此,混合胶束提取方案可适用于功能分析物的最优回收,这可能与去除主要洗涤剂的最有效方案相关,也可能不相关。在一些实施例中,可以免去初始混合胶束提取之后的额外洗涤。
图7A至图7C示出了针对含聚山梨酯20、聚山梨酯80和Triton X-100第一去污剂的BoNT/A样品开发的,并用辛基-β-半乳糖苷、BigCHAP和CHAPS作为第二去污剂的优化混合胶束萃取方案的结果,如用CMC 535TM所表征的(即检测残余第一去污剂)。使用前用人血清白蛋白将离心吸附柱预封闭;人血清白蛋白也被添加到BoNT/A制剂中。令人惊讶的是,发明人发现一些第一去污剂(例如Triton X-100)似乎能够通过渗滤从样品中去除,而无需形成混合胶束。如图所示,经CMC 535TM测定,用1%(w/v)和5%(w/v)第二去污剂去除第一去污剂的效果没有显著差异。
图8A至图8C示出了针对含聚山梨酯20、聚山梨酯80和Triton X-100第一去污剂的BoNT/A样品开发的,并用辛基-β-半乳糖苷、BigCHAP和CHAPS作为第二去污剂的优化混合胶束萃取方案的结果,如用BoTestA/E测定所表征的。使用前用人血清白蛋白将离心吸附柱预封闭;人血清白蛋白也被添加到BoNT/A制剂中。令人惊讶的是,发明人发现一些第一去污剂(例如Triton X-100)似乎能够通过渗滤从样品中去除,而无需形成混合胶束。如图所示,对于大多数第一/第二去污剂组合,随着第二去污剂浓度的增加,功能性BoNT/A的回收率有所提高。
虽然BoTestTMA/E试剂是一种溶剂化合成肽,在上述研究中用作生化试验来表征BoNT/A的回收率,但是在某些应用中,基于细胞的测定可用于表征含有分析物的样品,其中第一去污剂已通过混合胶束萃取去除。这种基于细胞的测定具有以选择性摄取分析物的形式提供额外选择性步骤的优点。例如,肉毒杆菌神经毒素(如BoNT/A)被培养的运动神经元和一些神经元源性细胞选择性吸收。用作赋形剂的第一去污剂会对此类细胞产生不利影响。
图9A中示出了这种干扰的示例。将在无表面活性剂的培养基中纯化的BoNT/A全毒素(holotoxin)样品和在含聚山梨酯80(P80)赋形剂培养基中的BoNT/A的类似浓度的商业产品应用于BioSentinel BoCellTMA/E基于细胞的测定,利用基因修饰的细胞表达包含FRET荧光基团对的BoNT/A敏感报告肽。这些荧光基团相对于BoNT/A浓度对数的发射比的结果如图9A所示。如图所示,基于细胞的测定对含有表面活性剂的BoNT/A样品基本无反应。图9B显示了类似研究的结果,其中样品在应用于细胞之前进行了透析。如图所示,透析几乎不产生改善作用。虽然可以通过透析样品来获得EC50,但当应用于相同的测定时,估计值比在各种无表面活性剂培养基中提供的BoNT/A高约10倍。
因此,用BoCellTMA/E测定中使用的细胞和培养基,以及含0.1%聚山梨酯80表面活性剂赋形剂的iBAM2细胞培养基中的BoNT/A样品,对混合胶束萃取在减少培养中对细胞的第一去污剂效应方面的效用进行了表征。用400μL的2%MEGA8或1%的其他第二表面活性剂提取该BoNT/A配方的小份(100μL),并使用Amicon UltraTM离心过滤器浓缩所得混合物。通过额外的一轮离心,用额外的450μL第二表面活性剂溶液清洗所得浓缩物,然后用450μLiBAM2培养基进行额外清洗。然后用iBAM2培养基将所得样品(约15μL)调节至100μL的体积,并将其添加到含培养板孔的BoCellTMA/E细胞中。细胞在37℃、5%CO2中24小时和48小时后进行表征和成像。48小时的结果如图9C所示。在图9C中,视觉上与对照细胞相似的细胞用星形表示。如图所示,MEGA 10、BIGCHAPS和CHAPS的结果与未经处理的对照细胞和仅经BAM2培养基处理的细胞相似。发明人认为,正常细胞分布和形态的维持表明成功去除了聚山梨酯80赋形剂并维持了细胞健康。
在含聚山梨酯80的培养基中,用含不同浓度BoNT/A的样品进行研究,以BIGCHAPS作为第二表面活性剂以相同方式进行处理,并将其应用于BioSentinel BoCellTMBoNTA/E基于细胞的测定。结果与在不含表面活性剂的培养基中用BoNT/A获得的结果进行了比较,如图9D所示。如图所示,在混合胶束萃取后,含有表面活性剂的样品在基于细胞的BoNT/A测定中提供了剂量/反应曲线,该曲线与从无表面活性剂样品获得的曲线非常相似。表1提供了获得的EC50值的比较。
表1
总的来说,从含表面活性剂的样品中获得的平均EC50为从对照样品中获得的平均EC50的50.5%(CV 4.8%),可用调整因子(例如0.5)进行校正。
在上述研究中,使用的超滤膜的截留分子量(MWC)为100kDa。然而,应了解,由于蛋白分子的形状和膜孔径的分布,分子量稍高的蛋白(例如,150kDa的BoNT/A)可能通过此类膜。因此,进行了进一步的研究,以表征用于混合胶束去除溶液中表面活性剂MWC的有效范围。对聚山梨酯80(作为第一去污剂)在存在或不存在BIGCHAPS(作为第二去污剂)的情况下的通过情况进行了研究。用CMC 535TM测定对通过再生纤维素超滤膜的材料进行了表征,材料对聚山梨酯80有反应,但对BigCHAP无反应。结果如图10所示。如图所示,100kDa和50kDa截留分子量(MWC)再生纤维素超滤器均允许混合胶束穿过,而当使用30kDa和10kDa MWC超滤器时,截留物显示聚山梨酯80的量增加。
应了解的是,虽然再生纤维素过滤器由于其高孔隙率和相对较低的非特异性结合而被通常使用,但超滤膜中使用的其他材料(例如聚醚砜(PES))是通过不同的方法制造的,在混合胶束排除方面可能表现出不同的性质。用不同MWC的PES超滤器进行的研究结果示例如图11所示。如图所示,100kDa和50kDa MWC的PES膜显示出比类似标称截留分子量的再生纤维素膜显著更大的混合胶束截留。
图12示出了不同超滤膜组成对从含聚山梨酯80的培养基中回收BoNT/A的影响,用BigCHAP作为第二去污剂。BoLISATM测定是一种免疫学测定,不受残留聚山梨酯80的显著影响,在这些研究中用于量化BoNT/A。如图所示,再生纤维素和PES超滤膜的BoNT/A回收率相似,PES的回收率稍低。
为了减少与超滤膜和其他表面的非特异性结合,通常使用诸如酪蛋白、明胶、卵清蛋白、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、非特异性免疫球蛋白等封闭这些表面上可用的非特异性结合位点。此类表面可在暴露于待处理样品之前通过蛋白质处理预封闭,或在处理过程中通过向待处理样品中添加蛋白质(通常为小体积浓缩储备溶液)进行封闭,或两者兼而有之。然而,这种封闭蛋白可能对下游过程(如用体外方法(如BoLISATM和BoTestTM)或基于细胞的测定(如BoCellTM)的表征)产生负面影响。
图13示出了用人血清白蛋白(2%w/v,过夜)混合胶束的处理中使用的超滤膜预封闭处理以及超滤膜结合将0.1%w/v人血清白蛋白加入处理样品的影响。用CMC 535TM测定对样品的第一去污剂含量进行表征,并用BoLISATM和BoTestTM测定对样品BoNT/A回收率进行表征。如图所示,将人血清白蛋白添加到样品中,随后采用超滤膜处理进行预封闭对去污剂去除几乎没有影响,并且当用BoLISATM和BoTestTM体外试验方法表征时,略微提高了BoNT/A的回收率。
图14示出了用BioSentinel BoCellTM测定人血清白蛋白添加到BoNT/A含量被表征的样品中的影响。如图所示,将人血清白蛋白添加到采用混合胶束法和预封闭的超滤膜处理的样品中对BoCellTM测定中使用的细胞的健康有负面影响。因此,添加到通过混合胶束分离方法处理的样品中的封闭蛋白质对下游工艺的影响是工艺依赖性的。
本领域技术人员应当清楚的是,在不脱离本文的发明构思的情况下,除了已经描述的更改之外,还可以进行更多的更改。因此,本发明的主题不限制所附权利要求书的精神内。此外,在解释说明书和权利要求时,应以与上下文一致的尽可能广泛的方式解释所有术语。尤其是,术语“包括(comprises)”和“包括(comprising)”应解释为以非排他性方式指代元件、组件或步骤,表示所引用的元件、组件或步骤可以与未明确引用的其他元件、组件或步骤而存在、使用或组合。如果说明书权利要求涉及从A、B、C……和N组成的组中选择的至少一种,应解释为只需要组中的一个元件,而不是A和N或B和N等。
Claims (15)
1.一种从包含蛋白的溶液中去除第一表面活性剂或去污剂的方法,所述方法包括:
向溶液中添加第二表面活性剂或去污剂,使其浓度至少等于第二表面活性剂或去污剂的临界胶束浓度;
提供足够的时间以允许形成包含第一表面活性剂或去污剂和第二表面活性剂或去污剂的混合胶束的悬浮液;以及
通过基于尺寸的分离方法从混合胶束悬浮液中分离蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述基于尺寸的分离方法为超滤法。
3.根据权利要求2所述的方法,包括将超滤法中所用的超滤膜进行封闭的步骤。
4.根据权利要求1所述的方法,其中所述基于尺寸的分离方法为凝胶过滤法。
5.根据权利要求4所述的方法,包括将凝胶过滤法中所用凝胶过滤介质进行封闭的步骤。
6.根据权利要求1至5任一项所述的方法,包括从所述基于尺寸的分离方法收集包含蛋白的分析馏分。
7.根据权利要求6所述的方法,包括用基于细胞的测定对分析馏分进行表征。
8.根据权利要求1至7任一项所述的方法,其中所述第一表面活性剂或去污剂选自聚山梨酯20、聚山梨酯80和Triton X-100。
9.根据权利要求1至8任一项所述的方法,其中所述第二表面活性剂或去污剂选自半乳糖苷去污剂、葡糖酰胺去污剂、胆酰胺去污剂及磺基甜菜碱去污剂。
10.根据权利要求9所述的方法,其中所述半乳糖苷去污剂为辛基-β-半乳糖苷。
11.根据权利要求9所述的方法,其中所述葡糖酰胺去污剂选自MEGA8、MEGA9和MEGA10。
12.根据权利要求9所述的方法,其中所述胆酰胺去污剂选自CHAPS、CHAPSO和BIGCHAPS。
13.根据权利要求9所述的方法,其中所述磺基甜菜碱去污剂为磺基甜菜碱3-10。
14.根据权利要求1至13任一项所述的方法,其中所述蛋白为肉毒杆菌神经毒素。
15.根据权利要求14所述的方法,其中所述肉毒杆菌神经毒素为A型肉毒杆菌神经毒素。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201962818554P | 2019-03-14 | 2019-03-14 | |
US62/818,554 | 2019-03-14 | ||
PCT/US2020/022703 WO2020186191A1 (en) | 2019-03-14 | 2020-03-13 | Compositions and methods for removal of detergents from aqueous solutions |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN113840829A true CN113840829A (zh) | 2021-12-24 |
Family
ID=72424983
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202080033968.8A Pending CN113840829A (zh) | 2019-03-14 | 2020-03-13 | 从水溶液中去除去污剂的组合物和方法 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US11578099B2 (zh) |
EP (1) | EP3931203B1 (zh) |
KR (1) | KR20210143808A (zh) |
CN (1) | CN113840829A (zh) |
AU (1) | AU2020234711A1 (zh) |
WO (1) | WO2020186191A1 (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR102590910B1 (ko) * | 2021-01-29 | 2023-10-18 | 연세대학교 산학협력단 | Wnt 단백질의 생체적합성 정제 방법 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5772888A (en) * | 1995-07-27 | 1998-06-30 | Massachusetts Institute Of Technology | Separation and/or concentration of an analyte from a mixture using a two-phase aqueous micellar system |
US20050170519A1 (en) * | 1997-11-07 | 2005-08-04 | Geno Technology, Inc. | Agent for protein precipitation, a method of protein precipitation, a method of protein assay using protein precipitation agent, and a kit for protein assay |
CN105263946A (zh) * | 2013-06-04 | 2016-01-20 | 新加坡科技研究局 | 蛋白质纯化方法 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4801691A (en) * | 1987-05-15 | 1989-01-31 | International Minerals & Chemical Corp. | Method for removing sodium dodecyl sulfate from sodium dodecyl sulfate solubilized protein solutions |
WO2003080651A1 (en) * | 2002-03-22 | 2003-10-02 | Mcgill University | Purification of proteins using ionic surfactants and polar solvents |
US8002988B2 (en) * | 2007-04-26 | 2011-08-23 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Removal of contaminants from water using sugar based surfactant enhanced ultrafiltration |
US8507291B1 (en) * | 2009-05-28 | 2013-08-13 | Pierce Biotechnology, Inc. | Detergent removal from protein samples prior to mass spectrometry analysis |
GB201318840D0 (en) * | 2013-10-24 | 2013-12-11 | Univ Leeds | Method and device for protein preparation |
-
2020
- 2020-03-13 CN CN202080033968.8A patent/CN113840829A/zh active Pending
- 2020-03-13 US US16/818,678 patent/US11578099B2/en active Active
- 2020-03-13 EP EP20769913.3A patent/EP3931203B1/en active Active
- 2020-03-13 KR KR1020217032808A patent/KR20210143808A/ko not_active Application Discontinuation
- 2020-03-13 AU AU2020234711A patent/AU2020234711A1/en active Pending
- 2020-03-13 WO PCT/US2020/022703 patent/WO2020186191A1/en unknown
-
2023
- 2023-01-09 US US18/094,663 patent/US20230143149A1/en active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5772888A (en) * | 1995-07-27 | 1998-06-30 | Massachusetts Institute Of Technology | Separation and/or concentration of an analyte from a mixture using a two-phase aqueous micellar system |
US20050170519A1 (en) * | 1997-11-07 | 2005-08-04 | Geno Technology, Inc. | Agent for protein precipitation, a method of protein precipitation, a method of protein assay using protein precipitation agent, and a kit for protein assay |
CN105263946A (zh) * | 2013-06-04 | 2016-01-20 | 新加坡科技研究局 | 蛋白质纯化方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
高艳秀等: "不同反胶束体系超声提取花生蛋白的研究", 《食品工业》, vol. 34, no. 5, pages 46 - 50 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP3931203A4 (en) | 2022-11-30 |
EP3931203C0 (en) | 2024-02-14 |
AU2020234711A1 (en) | 2021-10-21 |
US20200291065A1 (en) | 2020-09-17 |
EP3931203B1 (en) | 2024-02-14 |
US20230143149A1 (en) | 2023-05-11 |
EP3931203A1 (en) | 2022-01-05 |
US11578099B2 (en) | 2023-02-14 |
WO2020186191A1 (en) | 2020-09-17 |
KR20210143808A (ko) | 2021-11-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6363621B2 (ja) | チオ複素環カチオン処理によりタンパク質製剤中の凝集体レベルを低下させる方法 | |
US9695216B2 (en) | Materials and methods for removing endotoxins from protein preparations | |
EP3246703A1 (en) | Method and kit for capturing extracellular vesicles (evs) on a solid surface | |
US20110117628A1 (en) | Method for concentrating and isolating biomolecules or viruses | |
EP2271419B1 (de) | Verfahren zur stofftrennung unter verwendung einer cellulosehydrat-membran in der size exclusion chromatography | |
US20230143149A1 (en) | Systems for Removal of Detergents from Aqueous Solutions | |
CN106065029A (zh) | 一种牛血清白蛋白提取方法和牛血清白蛋白 | |
WO2009109086A1 (zh) | 一种提取狂犬病病毒的方法 | |
WO2014129964A2 (en) | Chromatographic purification of virus preparations with negatively charged particles | |
Nakao et al. | Microdetermination of protein not affected by the presence of various buffers, sucrose, ATP, and eluates from polysaccharide derivatives | |
CN102854272B (zh) | 膜蛋白分析鉴定用样品的处理方法 | |
Cheng et al. | Protein recovery from surfactant precipitation | |
WO2016162950A1 (ja) | IgM抗体の分離精製法 | |
CN109507127A (zh) | 一种用于检测人类血液中lbp含量的试剂盒 | |
TW200427696A (en) | Method for separating protein from animal milk | |
Pirie | Physical and chemical properties of tomato bushy stunt virus and the strains of tobacco mosaic virus | |
US20030049819A1 (en) | Method for the isolation of hydrophobic proteins | |
EP3421995B1 (en) | Immunochromatography analysis device for detecting gliadin, immunochromatrography analysis kit and immunochromatography analysis method | |
EP3116892A1 (en) | Methods for reducing aggregate content of protein preparations by treatment with aryl anions | |
WO2017117236A1 (en) | Non-recombinant human insulin-like growth factor binding protein concentrate | |
US8507291B1 (en) | Detergent removal from protein samples prior to mass spectrometry analysis | |
JP2019504987A (ja) | 非組み換えヒトインスリン様成長因子結合タンパク質の濃縮物 | |
CN115389291A (zh) | 一种尿液微量蛋白的富集、纯化和保护方法 | |
US20090286967A1 (en) | Protein precipitation method and kit | |
Nakahori et al. | Fractionation of caseins directly from skimmilk by gel chromatography. 1. elution with sodium dodecysulfate |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |