CN113840619A - Sglt2抑制剂和肠促胰岛素肽的基于环糊精的可注射共配制品 - Google Patents
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Abstract
本文提供了包含环糊精的共配制品，这些共配制品允许同时皮下施用钠葡萄糖共转运蛋白2抑制剂(SGLT2i)例如达格列净和肠促胰岛素肽例如GLP‑1/胰高血糖素双重激动剂肽。
Description
对以电子方式提交的序列表的引用
与本申请一起提交的ASCII文本文件的以电子方式提交的序列表内容(名称：GLPGG-202-US-PSP_SL.TXT；大小：4,096千字节；以及创建日期：2019年5月21日)通过引用以其全文并入本文。
背景技术
包括哮喘、癌症和糖尿病(仅列举数个)在内的许多复杂的进展性疾病正在造成世界范围内的疾病负担。为了充分控制这些异质性疾病的进展，组合疗法已被证明是一种有效的药物治疗策略。典型地，患者开始使用单一药物来控制症状和拖延疾病进展，随着潜在的病理生理学随着时间的推移而恶化并且症状变得更难控制，再添加另外的药物。
2型糖尿病(T2D)是一种代谢障碍，其特征是高血糖水平，如果控制不良，可导致危及生命的健康并发症。如果不能单独进行饮食和运动的初始干预，则在患者开始二甲双胍单一疗法治疗时开始使用抗糖尿病药物。随着疾病的进展和血糖回到糖尿病范围，添加具有不同作用机制的另外药物。最终，T2D患者接受双联或三联疗法，其含有二甲双胍或胰岛素作为其药物“混合物(cocktail)”的活性成分之一。这种巨大的药物负担往往导致依从性低。
不坚持进行糖尿病治疗是公认的挑战并且是患者未能控制血糖的主要原因之一。典型地，超过一半的接受抗糖尿病治疗的患者控制不足，定义为HbAlc水平大于7.5％。这是由潜在疾病进展和依从性差这两者的组合驱动的。根据英国的临床数据，少于15％的患者能够坚持他们的糖尿病药物治疗。坚持率与方案的复杂性相关，并且从单一疗法到组合疗法降低，其中与口服和注射药物的组合疗法相关的坚持率最低。
两种最新代的抗糖尿病药物，钠葡萄糖共转运蛋白2抑制剂(SGLT2i)和肠促胰岛素激动剂，分别以口服和注射药物施用。因此，需要共配制品，这些共配制品可以通过为两种在其他情况下需要单独服用(例如，一种口服，另一种注射)的药物提供便利的和同时的施用来显著有助于提高依从性。
发明内容
本文提供了药物共配制品，其包含(i)肠促胰岛素肽，尤其包括脂化的肠促胰岛素肽，(ii)钠葡萄糖共转运蛋白2抑制剂(SGLT2i)和(iii)环糊精。
在一个例子中，液体药物组合物包含(i)脂化的肠促胰岛素肽，(ii)钠葡萄糖共转运蛋白2抑制剂(SGLT2i)和(iii)环糊精。
在一个例子中，肠促胰岛素肽是单脂化的。在一个例子中，肠促胰岛素肽是GLP-1/胰高血糖素双重激动剂肽。在一个例子中，肠促胰岛素肽是MEDI0382、利拉鲁肽或索马鲁肽。
在一个例子中，SGLT2i是达格列净。
在一个例子中，环糊精是β环糊精。在一个例子中，β环糊精是羟丙基-β-环糊精。在一个例子中，环糊精是磺丁基醚环糊精。
在一个例子中，脂化的肠促胰岛素肽以约0.5mg/mL的浓度存在。在一个例子中，SGLT2i以约17mg/ml的浓度存在。在一个例子中，环糊精以约7％w/v的浓度存在。
在一个例子中，SGLT2i和环糊精具有约1∶1的化学计量。
在一个例子中，组合物的pH是约6.5至约8。在一个例子中，组合物的pH是约7至约8。在一个例子中，组合物的pH是约7。
在一个例子中，组合物具有1mL或更小的体积。
在一个例子中，组合物用于肠胃外施用。在一个例子中，肠胃外施用是皮下施用。
在一个例子中，组合物含有包合络合物，这些包合络合物包含脂化的肠促胰岛素肽、SGLT2i和环糊精。
在一个例子中，组合物不包含脂化的肠促胰岛素肽的原纤维。
在一个例子中，组合物不降低脂化的肠促胰岛素肽对GLP-1受体和/或胰高血糖素受体的亲和力。
在一个例子中，给大鼠施用组合物产生约390ng/ml的脂化的肠促胰岛素肽Cmax、约1小时的脂化的肠促胰岛素肽Tmax、约5小时的脂化的肠促胰岛素肽半衰期和/或约3500-4000ng.hr/mL的脂化的肠促胰岛素肽AUC0-inf。
本文还提供了包含本文提供的任何组合物的注射笔。在一个例子中，注射笔递送约600μL的组合物。
本文还提供了在有需要的受试者中治疗2型糖尿病的方法，该方法包括向该受试者施用本文提供的任何组合物。在一个例子中，受试者超重或肥胖。
本文还提供了在有需要的受试者中治疗非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的方法，该方法包括向该受试者施用本文提供的任何组合物。在一个例子中，受试者超重或肥胖。
本文还提供了在有需要的受试者中减少肝脂肪的方法，该方法包括向该受试者施用本文提供的任何组合物。在一个例子中，受试者超重或肥胖。
在方法的一个例子中，施用向患者递送约10mg的SGLT2i和/或约300μg的脂化的肠促胰岛素肽。在一个例子中，施用是饮食和运动的辅助。
附图说明
图1示出了MEDI0382(SEQ ID NO：4)的化学结构、化学式(C167H252N42O55)和分子量(3728.09)。
图2提供了达格列净(DPZ)：羟丙基-β-环糊精(HPβCD)络合物和恩格列净(EPZ)：HPβCD络合物的相溶解度图。DPZ和EPZ的表观溶解度随HPβCD浓度的增加而增加。(参见实例1。)
图3显示了MEDI0382(SEQ ID NO：4)在各种配制品中(包括在缓冲液中，在7％HPβCD中，以及与DPZ共配制在7％HPβCD中)的聚集动力学研究的结果。(A)图显示了原纤维形成的时间过程，随后是ThT荧光强度测量。结果表明，在存在和不存在DPZ的情况下，添加环糊精后均完全抑制原纤化。数据表示为平均值±SD(n＝3)。(B)图显示了在37℃孵育前后通过远UV圆二色性表征在缓冲液和7％HPβCD中的MEDI0382的二级结构。缓冲液中的MEDI0382在T0处显示出典型的α-螺旋谱，在Tend(218nm)处β-片结构初现，从而证实了原纤维的存在。当配制在HPβCD中时，观察到CD光谱发生了变化，但在整个孵育期间保持不变。(参见实例2。)
图4显示了MEDI0382在37℃孵育前后的代表性TEM图像，证实了仅在MEDI0382于缓冲液中的配制品中形成原纤维(比例尺＝200nm)。(参见实例2。)
图5显示了Tht测定后缓冲液中和HPβCD及相关媒介物中利拉鲁肽的代表性TEM图像，证实仅在利拉鲁肽于缓冲液中的配制品中形成原纤维。(比例尺＝200nm)(参见实例2。)
图6显示了Tht测定后的利拉鲁肽FTIR光谱。(参见实例2。)
图7显示了MEDI0382-HPβCD相互作用的特征。(A)图通过ANS荧光测量提供了对环糊精腔占有的定性评估。由于ANS具有与HPβCD络合后发出荧光的特性，因此，ANS被用作探针来评估各种配制品(包括7％HPβCD媒介物、在7％HPβCD中的MEDI0382、在7％HPβCD中的DPZ和在7％HPβCD中的MEDI0382+DPZ)中的自由腔的程度。缓冲液媒介物和在缓冲液中的MEDI0382用作对照。较低的荧光指示较高的占用率。数据表示为平均值±S.D.(n＝3)。(B)图显示了固有色氨酸(Trp)荧光测量。Trp荧光发射光谱根据配制品提供微环境变化的信息。由于DPZ的干扰，未测量MEDI0382+DPZ配制品。数据表示为平均值±S.D.(n＝3)。(参见实例3和4。)
图8显示了MEDI0382在缓冲液和7％HPβCD中的近UV圆二色性光谱。芳香族残基的贡献是突出的，如下：对于色氨酸(Trp)而言285-310nm，对于酪氨酸(Tyr)而言275-285nm，以及对于苯丙氨酸(Phe)而言255-270nm。(参见实例4。)
图9显示了对应于(A)HPβCD：DPZ和(B)HPβCD：MEDI0382的滴定的典型ITC等温线。HPβCD：DPZ的滴定结果为放热谱，而HPβCD：MEDI0382的滴定结果为吸热等温线。(参见实例3。)
图10显示了具有10％HPβCD(NMR水抑制)的MEDI0382的1H-1H NOESY光谱区域。(A)聚焦于芳香族残基与HPβCD之间的相互作用的NOESY区域。(B)与Trp相互作用的示意图。(C)聚焦于棕榈脂质链之间的相互作用的NOESY区域。(D)相互作用的示意图。(参见实例4和5。)
图11显示了(A)从HPβCD停靠到肽上开始，MEDI0382：HPβCD络合物的100ns模拟后的快照。脂质链与HPβCD形成包合络合物。(B)还显示了HPβCD与肽残基之间相互作用类型的定量。在整个模拟过程中，平均而言，HPβCD和侧链原子之间形成特定的氢键(灰色柱)，并且在许多情况下，水分子(黑色柱)正在对相互作用进行桥接。(参见实例5。)
图12显示了在存在和不存在环糊精的情况下在pH 6.5和pH 8，Trp荧光(左)和通过远UV圆二色性对MEDI0382的表征。(参见实例6。)
图13显示了在存在和不存在环糊精的情况下在pH 6.5和pH 8，MEDI0382的聚集动力学谱随后是Tht荧光。(参见实例6。)
图14显示了在Tht测定后在pH 6.5和pH 8.0下，在缓冲液中和在HPβCD中的MEDI0382的AFM和TEM图像。(参见实例6。)
图15显示了在存在和不存在环糊精的情况下在pH 6.5和pH 8，Tht测定后MEDI0382的远UV CD光谱。表中列出了二级结构的组成(参见实例6。)
图16显示了在存在和不存在环糊精的情况下在pH 6.5和pH 8，MEDI0382聚集动力学测定的结果。(参见实例6。)
图17显示了在存在和不存在环糊精的情况下在pH 6.5和pH 8，利拉鲁肽的聚集动力学谱随后是Tht荧光。(参见实例6。)
图18显示了在存在和不存在环糊精的情况下在pH 6.5和pH 8，Tht测定后利拉鲁肽的远UV CD光谱。(参见实例6。)
图19显示了共配制品的体外和体内性能。对(A)GLP1受体(GLP1 R)和(B)胰高血糖素受体(GluR)的体外效力测定。大鼠皮下注射后(C)MEDI0382和(D)达格列净的血浆浓度相比于时间的谱。(参见实例7。)
具体实施方式
应该领会的是本文示出且描述的这些具体的实现方式是实例，并且不旨在以任何方式在其他方面限制本申请的范围。
本文提及的这些公开的专利、专利申请、网站、公司名称、以及科学文献特此通过引用以其全文结合，达到如同每个被确切并单独地表明而通过引用结合的相同程度。本文引用的任何参考文件与本说明书的具体传授内容之间的任何冲突应以有利于后者的方式来解决。同样，在单词或短语的领域理解的定义与如在本说明书中确切传授的该单词或短语的定义之间的任何冲突应以有利于后者的方式来解决。
I.定义
如在本说明书中所使用的，单数形式“一个/种(a/an)”以及“该”具体地还涵盖它们所提及的术语的复数形式，除非本内容清楚地另外指明。因此，术语“一个/种(a或an)”、“一个/种或多个/种”和“至少一个/种”在本文可互换地使用。
本文使用术语“约”来意指大约(approximately)、在......附近(in the regionof)、粗略地(roughly)、或在......左右(around)。当术语“约”与数值范围结合使用时，它通过扩展列举的数值的上限和下限将该范围加以修饰。通常，除非另外说明，否则本文使用术语“约”以将数值以高于和低于该规定值的20％的变化加以修饰。
此外，本文使用“和/或”应当理解为在有或没有另一者的情况下，两个指定的特征或组分中的每一者的特定披露。因此，如本文在诸如“A和/或B”的短语中使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)、以及“B”(单独)。同样，如在诸如“A、B和/或C”的短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下方面中的每一个：A、B、和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
本文使用的技术术语和科学术语具有由本申请涉及的领域的普通技术人员通常理解的含义，除非另外定义。本文参考了本领域的技术人员已知的各种方法和材料。阐述肽合成的一般原理的标准参考著作包括W.C.Chan和P.D.White.，“Fmoc Solid PhasePeptide Synthesis：A Practical Approach[Fmoc固相肽合成：实用方法]”，OxfordUniversity Press[牛津大学出版社]，牛津(2004)。此外，Concise Dictionary ofBiomedicine and Molecular Biology[简明生物医学和分子生物学词典]，Juo，Pei-Show，第2版，2002，CRC出版社；Dictionary of Cell and Molecular Biology[细胞和分子生物学词典]，第3版，1999，Academic Press[学术出版社]；以及Oxford Dictionary OfBiochemistry And Molecular Biology[生物化学和分子生物学牛津词典]，修订版，2000，Oxford Universtty Press[牛津大学出版社]为技术人员提供在本披露中使用的许多术语的通用词典注释。
单位、前缀和符号是以它们的国际单位系统(Système International deUnites)(SI)接受的形式表示。数值范围包括定义范围的数字。除非另外说明，否则氨基酸序列是以氨基至羧基取向从左向右书写。本文提供的小标题不是本披露的不同方面的限制，可以通过作为一个整体参考本说明书来获得这些方面。因此，通过以其全文参考说明书，更充分地定义了紧接着在下文中定义的术语。
术语“肽”、“多肽”、“蛋白质”以及“蛋白质片段”本文可以互换地使用以便指示两个或更多个氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，并且适用于天然存在的氨基酸聚合物以及非天然存在的氨基酸聚合物。术语“肽”进一步包括已经历翻译后或合成后修饰的肽，这些修饰例如，糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/阻断基团进行的衍生、蛋白水解裂解或通过非天然存在的氨基酸进行的修饰。“肽”可以是包含用来增加半衰期的另外的组分(如Fc结构域或白蛋白结构域)的融合肽的一部分。如本文描述的肽还可以许多不同的途径衍生。
术语“氨基酸”是指天然存在的以及合成的氨基酸，连同与天然存在的氨基酸功能类似的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是通过遗传密码编码的那些氨基酸，以及随后被修饰的那些氨基酸，例如羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸盐、以及O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指以下化合物，这些化合物具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构，例如与氢相结合的α碳、羧基基团、氨基基团、以及R基团，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物可以具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽主链，但保留了与天然存在氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指以下化学化合物，这些化合物具有不同于通常的氨基酸化学结构的、但与天然存在的氨基酸功能类似的结构。术语“氨基酸”和“氨基酸残基”通篇可互换地使用。
术语“分离的”是指肽或核酸通常将根据本披露的状态。分离的肽和分离的核酸不含或基本上不含在天然状态下与其相关联的材料，例如在其天然环境下，或在此制备是通过在体外或在体内实施的重组DNA技术时在其制备环境(例如细胞培养物)中与其一起存在的其他肽或核酸。肽和核酸可以用稀释剂或佐剂配制，并且仍然为了实用目的可以被分离-例如如果这些肽用于包被微量滴定板用于免疫测定，则这些蛋白质通常将与明胶或其他载剂混合，或者当用于诊断或治疗时将与药学上可接受的载剂或稀释剂混合。
“重组”肽是指经由重组DNA技术产生的肽。如同已经通过任何适合的技术分离、分级或部分纯化或基本上纯化的天然或重组多肽一样，出于本披露的目的，在宿主细胞中表达的重组产生的肽也被视为分离的。
当提及肠促胰岛素肽时，术语“片段”、“类似物”、“衍生物”或“变体”包括保留至少某种期望的活性(例如，结合到胰高血糖素和/或GLP-1受体上)的任何肽。本文提供的肠促胰岛素肽的片段包括在表达、纯化、和/或施用给受试者的过程中展现出所希望的特性的蛋白水解片段、缺失片段。
如本文使用的，术语“变体”指的是由于氨基酸取代、缺失、插入、和/或修饰而不同于所列举肽的肽。变体可以使用本领域已知的诱变技术来产生。变体还可以，或可替代地，含有其他修饰-例如肽可以是缀合或偶联的，例如融合到异源氨基酸序列或其他部分上，例如用于增加半衰期、溶解度、或稳定性。缀合或偶联到本文提供的肽上的部分的实例包括，但不限于，白蛋白、免疫球蛋白Fc区、聚乙二醇(PEG)等等。该肽还可以与便于该肽的合成、纯化或鉴定或增强该多肽结合到固相支持物上的接头或其他序列(例如，6-His)缀合或产生偶联。
术语“药物共配制品”是指含有肠促胰岛素肽和SGLT2i以及例如药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂的组合物，用于施用给需要治疗的受试者例如患有2型糖尿病的人受试者。
术语“药学上可接受的”是指以下组合物，这些组合物在合理的医学判断范围内适合于与人以及动物的组织接触而没有过度的毒性或与合理的利益/风险比相当的其他并发症。
术语“药学上可接受的载剂”是指不会干扰肠促胰岛素肽和/或SGLT2i的生物活性的有效性的一种或多种非毒性材料。
“有效量”是肠促胰岛素肽和/或SGLT2i量，以单个剂量或作为系列的一部分将该量施用给受试者对于治疗是有效的，例如对于治疗2型糖尿病是有效的。这个量可以是对于所有被治疗的受试者而言的固定剂量，或者可以取决于被治疗的受试者的重量、健康、和身体状况、所希望的体重减轻或体重维持的程度、以及其他相关因素而改变。
术语“受试者”意指需要用本文提供的药物共配制品进行治疗的任何受试者，尤其是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括，但不限于，人、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、熊、母牛、猿类、猴子、猩猩和黑猩猩等。在一个例子中，受试者是人受试者。
如本文使用的，“有需要的受试者”是指希望治疗的个体，例如患有2型糖尿病的受试者。
术语如“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”或“治疗(totreat)”是指治愈和/或停止已诊断的病理病症或障碍的进展的治疗性措施。术语如“预防”是指预防和/或减缓所靶向的病理病症或障碍发展的防治性或预防性措施。因此，需要治疗的那些包括已患有疾病或病症的那些。需要预防的那些包括容易患上疾病或病症的那些以及有待预防疾病或病症的那些。例如，短语“治疗患有2型糖尿病的患者”是指将疾病或病症的严重程度降低到受试者不再遭受由此引起的不适和/或功能改变的程度。治疗包括减慢或减轻经诊断的病理病症或障碍的症状的治疗措施。
如本文使用的，“GLP-1/胰高血糖素激动剂肽”是嵌合肽，其展现出相对于天然胰高血糖素的至少约1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或更高的在胰高血糖素受体上的活性，并且还展现出相对于天然GLP-1的至少约1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或更高的在GLP-1受体上的活性。
如本文使用的，术语“天然胰高血糖素”指的是天然存在的胰高血糖素，例如，人胰高血糖素，其包含HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQW LMNT的序列(SEQ ID NO：1)。术语“天然GLP-1”指的是天然存在的GLP-1，例如，人GLP-1，并且是涵盖例如，GLP-1(7-36)酰胺(HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR；SEQ ID NO：2)、GLP-1(7-37)酸(HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG；SEQ ID NO：3)或者这两种化合物的混合物的通用术语。如本文使用的，在没有任何进一步指定的情况下，对“胰高血糖素”或“GLP-1”的一般参考旨在分别表示天然的人胰高血糖素或天然的人GLP-1。除非另外指出，“胰高血糖素”指的是人胰高血糖素，并且“GLP-1”指的是人GLP-1。
II.肠促胰岛素肽
本文提供的药物共配制品包含肠促胰岛素肽，尤其包括脂化的肠促胰岛素肽。肠促胰岛素肽是GLP-1的激动剂，并且它们包括经批准的GLP-1单激动剂以及双或三激动剂，如MEDI0382、GLP-1/胰高血糖素受体双激动剂。(参见Henderson SJ等人，Diabetes ObesMetab.[糖尿病肥胖与代谢]18：1176-90(2016)，其通过引用以其全文并入本文。)脂化可以延长肠促胰岛素肽的血液循环。此外，如本文所示，脂质链中的芳香残基可以以降低肠促胰岛素肽聚集的方式与环糊精(例和，HPβCD)相互作用。
在一个例子中，用于本文提供的药物共配制品的肠促胰岛素肽是MEDI0382。MEDI0382是具有HSQGTFTSDX10SEYLDSERARDFVAWLEAGG-酸序列的30个氨基酸的线性肽(SEQID NO：4)，其中X10＝具有通过γ谷氨酸接头与ε氮缀合的棕榈酰基的赖氨酸(即K(gE-棕榈酰基))。MEDI0382被棕榈酰化以通过与血清白蛋白结合来延长其半衰期，从而降低其肾脏清除倾向。MEDI0382已被设计用于引发与GLP-1类似物相关的所有积极治疗属性(参见Meier JJ.，Nat Rev Endocrinol.[自然综述内分泌]8：728-42.(2012)，其通过引用以其全文并入本文)，包括有效的血糖控制、胃排空延迟、饱腹感的诱导和体重的减轻、以及胰高血糖素对能量消耗和代谢率的附加作用。为了延长该肽的全身循环时间，在其氨基酸序列上共价附接C16链，允许其可逆地与血清白蛋白结合。该策略先前已成功应用于利拉鲁肽，利拉鲁肽是经批准的GLP-1肽单激动剂，以商品名
上市。在临床前研究中，重复注射MEDI0382导致DIO小鼠和非人灵长类动物显著的体重减轻和稳健的血糖控制。目前正在进行治疗具有2型糖尿病的超重或肥胖患者的临床评估，MEDI0382已显示出在具有2型糖尿病的超重和肥胖患者中的降低血糖、体重和肝脏脂肪的功效。(请参阅Ambery P，等人，Lancet.[柳叶刀]391：2607-18(2018)，其通过引用以其全文并入本文。)
在一个例子中，肠促胰岛素肽是MEDI0382、索马鲁肽或利拉鲁肽。
另外的肠促胰岛素肽也可用于本文提供的药物共配制品中。示例性的脂化的肠促胰岛素肽提供于例如Wang等人，J.Control Release[控释杂志]241：25-33(2016)，其通过引用并入本文。在某些例子中，用于本文提供的药物共配制品中的脂化的肠促胰岛素肽是单脂化的肠促胰岛素肽。
用于本文提供的药物共配制品中的肠促胰岛素肽可以酰化的。
用于本文提供的药物共配制品中的肠促胰岛素肽可与异源部分相关联例如以延长半衰期。该异源部分是蛋白质、肽、蛋白质结构域、接头、有机聚合物、无机聚合物、聚乙二醇(PEG)、生物素、白蛋白、人血清白蛋白(HSA)、HSA FcRn结合部分、白蛋白结合结构域、酶、配体、受体、结合肽、非FnIII支架、表位标签、重组多肽聚合物、或此类部分的两种或更多种的组合。
肠促胰岛素肽可以通过任何合适的方法制备。例如，在某些实施例中，通过本领域普通技术人员熟知的方法，例如通过如Merrifield描述的固相合成(1963，J.Am.Chem.Soc.[美国化学学会杂志]85：2149-2154)，化学合成肠促胰岛素肽。可以例如，通过使用自动合成仪，使用标准试剂完成固相肽合成，如WO 2014/091316的实例1中所解释的。
可替代地，可以使用如本领域普通技术人员熟知的合宜的载体/宿主细胞组合以重组方式产生肠促胰岛素肽。用于以重组方式产生肠促胰岛素肽的许多种方法是可得的。通常，将编码肠促胰岛素肽的多核苷酸序列插入适当的表达媒介物，例如，含有用于该插入的编码序列的转录和翻译的必需元件的载体。将编码肠促胰岛素肽的核酸插入载体的正确阅读框中。然后将表达载体转染到适合的表达肠促胰岛素肽的宿主细胞中。适合的宿主细胞包括但不限于细菌、酵母、或哺乳动物细胞。许多种可商购的宿主-表达载体系统可以用来表达肠促胰岛素肽。
III.共配制品
本文提供了包含肠促胰岛素肽(如上所讨论)、钠葡萄糖共转运蛋白2抑制剂(SGLT2i)和环糊精的共配制品。
SGLT2i是一类与饮食和锻炼使用以降低2型糖尿病成年人的血糖的药物。SGLT2i通过阻断葡萄糖从肾脏的重吸收来降低血糖。由于这一机制独立于胰岛素并且与血糖水平直接相关，因此SGLT2i提供了一种持久的降糖方法，该方法还使低血糖发作最小化。
示例性SGLT2i包括达格列净(DPZ)、恩格列净(EPZ)和坎格列净。在某些例子中，SGLT2i是DPZ或EPZ。在某些例子中，SGLT2i是DPZ。
在某些例子中，SGLT2i(例如，DPZ)以约17mg/ml的浓度存在于本文提供的药物共配制品中。
环糊精是含有吡喃葡萄糖单元的环状寡糖。环糊精包括α、β和γ环糊精，它们具有不同数量的吡喃葡萄糖单元。在某些例子中，环糊精是β环糊精。示例性的环糊精是羟丙基-β-环糊精(HPβCD)。另外的示例性环糊精是磺丁基醚环糊精。
在某些例子中，环糊精(例如HPβCD)以约7％w/v的浓度存在于本文提供的药物共配制品中。
在本文提供的药物共配制品的某些情况下，SGLT2i(例如，DPZ)和环糊精(例如，HPβCD)具有约1∶1的化学计量。
本文提供的药物共配制品可以具有约0.5mg/mL的浓度的脂化的肠促胰岛素肽(例如MEDI0382)。
如本文所证明，肠促胰岛素肽(例如MEDI0382)、SGLT2i(例如DPZ)和环糊精(例如HPβCD)能以包合络合物存在于本文提供的药物共配制品中。
本文提供的药物共配制品可具有至少6.5的pH。本文提供的药物共配制品可具有至少7的pH。
本文提供的药物共配制品可具有约6.5至约8的pH。本文提供的药物共配制品可具有约7至约8的pH。本文提供的药物共配制品可具有约7的pH。
共配制品可以用于肠胃外例如皮下递送。共配制品可以例如用于经由笔装置递送。因此，本文还提供了包含本文提供的药物共配制品的注射笔。
在共配制品中，SGLT2i和肠促胰岛素肽可以共享相同的注射体积。在大体积情况下可能引起疼痛和耐受性问题。因此，共配制品可以具有1mL或更小的体积。因此，可以将共配制品设计为以约600μL的体积施用。如本文所证明，环糊精(例如，羟丙基-β-环糊精(HPβCD))可用作溶解度增强剂，以在所需体积中容纳治疗有效剂量的SGLT2i。
众所周知，肠促胰岛素肽难以配制，这是由于其固有的自缔合和聚集特性以及其pH依赖性溶解度和稳定性。如本文所证明，环糊精(例如HPβCD)可用于防止肠促胰岛素肽的聚集。因此，本文提供的组合物可缺少肠促胰岛素肽的原纤维(例如，MEDI0382)。可以例如使用透射电子显微镜(TEM)或硫黄素T(ThT)测定(例如，如本文实例2中所示)来评估原纤维的存在。
如本文所证明，共配制品中与肠促胰岛素肽一起存在的环糊精和/或SGLT2i不会降低肠促胰岛素肽(例如MEDI0382)的效力。肠促胰岛素肽(例如MEDI0382)的效力可以例如使用体外和/或体内测定来评估。例如，肠促胰岛素肽(例如，MEDI0382)的活性可基于其对GLP-1和/或胰高血糖素受体的活性来评估(例如，通过cAMP累积测定中的EC50测量，任选如本文实例7所示。)
IV.治疗方法
本披露提供了一种治疗2型糖尿病的方法，该方法包括向需要治疗的受试者施用本文提供的包含脂化的肠促胰岛素肽(例如，MEDI0382)和SGLT2i(例如，DPZ)的药物共配制品。在某些例子中，施用是饮食和运动的辅助。在某些例子中，受试者具有27至40kg/m2的BMI。在某些例子中，受试者具有30至39.9kg/m2的BMI。在某些例子中，受试者具有至少40的BMI。在某些例子中，受试者超重。在某些例子中，受试者是肥胖的。
本披露提供了一种减少肝脂肪的方法，该方法包括向需要治疗的受试者施用本文提供的包含脂化的肠促胰岛素肽(例如，MEDI0382)和SGLT2i(例如，DPZ)的药物共配制品。肝脏脂肪的减少可以导致胰岛素敏感性增强和/或肝功能改善。在某些例子中，施用降低血红蛋白A1c(HbA1c)水平。在某些例子中，施用是饮食和运动的辅助。在某些例子中，受试者具有27至40kg/m2的BMI。在某些例子中，受试者具有30至39.9kg/m2的BMI。在某些例子中，受试者具有至少40的BMI。在某些例子中，受试者超重。在某些例子中，受试者是肥胖的。在某些例子中，受试者患有2型糖尿病。
本披露提供了一种治疗非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的方法，该方法包括向需要治疗的受试者施用本文提供的包含脂化的肠促胰岛素肽(例如，MEDI0382)和SGLT2i(例如，DPZ)的药物共配制品。在某些例子中，施用是饮食和运动的辅助。在某些例子中，受试者具有27至40kg/m2的BMI。在某些例子中，受试者具有30至39.9kg/m2的BMI。在某些例子中，受试者具有至少40的BMI。在某些例子中，受试者超重。在某些例子中，受试者是肥胖的。在某些例子中，受试者患有2型糖尿病。
本披露提供了一种治疗非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的方法，该方法包括向需要治疗的受试者施用本文提供的包含脂化的肠促胰岛素肽(例如，MEDI0382)和SGLT2i(例如，DPZ)的药物共配制品。在某些例子中，施用是饮食和运动的辅助。在某些例子中，受试者具有27至40kg/m2的BMI。在某些例子中，受试者具有30至39.9kg/m2的BMI。在某些例子中，受试者具有至少40的BMI。在某些例子中，受试者超重。在某些例子中，受试者是肥胖的。在某些例子中，受试者患有2型糖尿病。
本披露提供了一种方法，该方法治疗肥胖症或肥胖症相关疾病或障碍，减少体重，减少体脂，防止体重增加，防止脂肪增加，促进体重减少，促进脂肪减少，治疗由体重过量或体脂过量引起或特征为体重过量或体脂过量的疾病或病症，管理体重，改善血糖控制或实现血糖控制，其中该方法包括向需要治疗的受试者施用本文提供的药物共配制品，该药物共配制品包含脂化的肠促胰岛素肽(例如，MEDI0382)和SGLT2i(例如，DPZ)。在某些例子中，施用是饮食和运动的辅助。在某些例子中，受试者具有27至40kg/m2的BMI。在某些例子中，受试者具有30至39.9kg/m2的BMI。在某些例子中，受试者具有至少40的BMI。在某些例子中，受试者超重。在某些例子中，受试者是肥胖的。在某些例子中，受试者患有2型糖尿病。
其他肥胖症相关(体重过重相关)疾病的实例包括但不限于：胰岛素抵抗、葡萄糖耐受不良、糖尿病前期、空腹血糖增加、2型糖尿病、高血压、血脂异常(或这些代谢危险因素的组合)、胰高血糖素瘤、心血管疾病例如充血性心力衰竭、动脉硬化、动脉粥样硬化、冠心病、或外周动脉疾病；中风、呼吸功能障碍、或肾脏病。
在某些例子中，本文提供的包含脂化的肠促胰岛素肽(例如MEDI0382)和SGLT2i(例如DPZ)的药物共配制品的施用途径是肠胃外的。在某些例子中，本文提供的包含脂化的肠促胰岛素肽(例如MEDI0382)和SGLT2i(例如DPZ)的药物共配制品的施用途径是皮下的。在某些例子中，本文提供的包含脂化的肠促胰岛素肽(例如，MEDI0382)和SGLT2i(例如，DPZ)的药物共配制品是通过注射例如从笔注射来施用的。在某些例子中，本文提供的包含脂化的肠促胰岛素肽(例如，MEDI0382)和SGLT2i(例如，DPZ)的药物共配制品是通过皮下注射施用的。
在某些例子中，本文提供的包含脂化的肠促胰岛素肽(例如，MEDI0382)和SGLT2i(例如，DPZ)的药物共配制品可以每天施用一次。在某些例子中，本文提供的包含脂化的肠促胰岛素肽(例如，MEDI0382)和SGLT2i(例如，DPZ)的药物共配制品可以每天通过注射施用(例如，皮下施用)一次。在某些例子中，本文提供的包含脂化的肠促胰岛素肽(例如，MEDI0382)和SGLT2i(例如，DPZ)的药物共配制品可以每天通过注射施用(例如，皮下施用)一次，经至少一周的时间段、经至少两周的时间段、经至少三周的时间段或经至少四周的时间段。
实例
材料
HPLC水和乙腈购自VWR(VWR公司，拉德纳(Radnor)，宾夕法尼亚州，美国)。达格列净由阿斯利康公司(AstraZeneca)提供。
HPB(2-羟丙基-β-环糊精)由罗氏(罗氏盖特公司(Roquette Freres)，莱斯特朗(Lestrem)，法国)提供。
(磺基丁基醚-β-环糊精)由莱葛蓝制药公司(莱葛蓝制药公司(Ligand Pharmaceuticals)，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国)提供。8-苯胺基-1-萘磺酸(ANS)和硫磺素t(ThT)购自西格玛奥德里奇公司(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，圣路易斯，密苏里州，美国)。七水磷酸氢二钠和一水磷酸二氢钠由J.T.贝可公司(J.T.贝可化学公司(J.T.Baker chemical co)，菲利普斯堡(Phillipsburg)，新泽西州，美国)提供。
溶解度筛选
将达格列净(DPZ)称重入玻璃小瓶中。将适当的水性媒介物添加到粉末上，以使最终浓度达到17mg/mL，涡旋混合并超声处理。通过目测观察确定配制品的通过/失败标准。
DPZ相在HPβCD(Kleptose HPB)中的溶解度
在水中制备了5％至20％(w/v)的增加浓度的各种HPβCD(Kleptose HPB，罗氏公司)溶液。简而言之，将HPβCD称重入容量烧瓶中，并添加纯净水，直至最终体积的80％(v/v)。将烧瓶混合直至完全溶解，并用纯净水补足至最终体积。将约30mg DPZ称量入每个HPLC玻璃小瓶中，并向其中添加500uL的合适的HPβCD溶液和磁跳变(magnetic flea)。每个浓度一式两份进行。将配制品在磁力搅拌下放置21小时40分钟。然后将每个样品转移至1.5mL微量离心管中，并且以13,000rpm离心10分钟。然后从上清液中取200uL，并在1.5mL微量离心管中以13,000rpm再次离心30分钟。最后将样品稀释在缓冲液A(95％HPLC水/5％ACN+0.03％TFA)中，并通过UPLC根据经质量对照验证的校准曲线测量浓度。
等温滴定量热法
通过采用Microcal Auto ITC 200(马尔文公司(Malvern))将环糊精滴定到肽或DPZ溶液中，在25℃下进行等温滴定量热法(ITC)测量。MEDI0382和DPZ溶液分别以0.13mM和0.12mM制备，并且环糊精(HPβCD)在匹配缓冲液中以3mM制备。实验一式三份进行，并且每次运行包括2uL的20次注射(第一次注射仅0.4uL)，搅拌速度设定为750rpm。通过MalvernOrigin软件使用一组结合位点模型拟合等温线。
色氨酸荧光
荧光测量在F-7000FL分光光度计上在室温下进行。一式三份地将100μL肽配制品添加到96孔板(半面积)中。激发波长设置为277nm，以选择性激发色氨酸荧光。在285nm至385nm之间扫描荧光发射光谱。激发和发射狭缝均设置为2.5nm。每个光谱是三个扫描的平均值。
圆二色性(CD)
用Jasco J-815分光光度仪在室温下获得了在20mM磷酸钠(NaP)缓冲液(pH 7.0)中或在7％HPβCD/20mM NaP缓冲液(pH 7.0)中以0.5mg/mL新鲜制备的肽溶液的圆二色性光谱。使用0.1mm路径长度比色皿从180nm-260nm采集远UV CD数据，并使用CDPro软件用CONTINLL、SELCON3和CDSSTR算法对光谱进行解卷积。使用1cm路径长度的比色皿从250nm至350nm采集近UV CD数据。
聚集动力学
对于聚集动力学实验，MEDI0382在整个硫黄素T(ThT)结合测定过程中进行监测，并在存在和不存在环糊精的情况下进行比较。在Fluostar Optima酶标仪(BMG实验室技术公司(BMG Labtech)，奥芬堡(Offenburg)，德国)上进行荧光测量，该酶标仪恒温在37℃。通过在440nm处使用激发滤光片并在480nm处记录发射荧光来监测ThT与原纤维的结合。所测试的配制品是20mM NaP缓冲液pH 7.0(具有和不具有7％w/v的环糊精)。将MEDI0382配制为0.5mg/mL，并且将DPZ配制为17mg/mL。将100μl配制品移液入由黑色聚苯乙烯制成的96孔半面积板(康宁公司(Corning)3881，美国)的孔(向该孔中添加10uL 0.5mM ThT水溶液)中。每个样品一式三份制备。使用密封带和密封箔(Costar温度计保护管)以防止蒸发。每30分钟进行一次板底读取，其中每次测量前振荡5分钟。每个循环用定轨振荡器以350rpm、5闪/孔执行。
NMR
2D NOESY NMR光谱在水抑制下从在NaP缓冲液(pH 7.6)中4.3mg/ml的具有或不具有10％HPpCD的MEDI0382溶液获得。所有的NMR实验都是在装有5mm TCI低温探针的600MHzBruker Avance-III HD NMR光谱仪(布鲁克拜厄斯宾公司(Bruker-Biospin))上在300K的温度下使用来自Bruker库(TopSpin 3.5)的标准脉冲序列运行的。使用用于溶剂抑制的激发雕塑法获得相敏NOESY实验(脉冲程序“noesyesgpph”)(Hwang T.L SAJ.Journal ofMagnetic Resonance[磁共振杂志]，Series A.[系列A]112(2)：275-9(1995))。光谱在如下条件下采集：1.5s的弛豫延迟，使用4K×512个数据点，在谱宽10ppm上，以States-TPPI模式(Dominique Marion Mk，等人，Journal of Magnetic Resonance[磁共振杂志]85(2)：393-9(1989))，在F2和F1中采集时间分别为0.341s和0.043s(在F1中零填充到1K)。每个F1增量收集128次扫描和16次假扫描，其中混合时间为0.15s。使用Topspin 3.5软件(布鲁克拜厄斯宾公司)处理数据，在F1和F2维中的傅里叶变换之前应用正弦-贝尔平方窗函数(sine-bell squared window function)。
透射电子显微镜(TEM)
将在37℃孵育前后的MEDI0382配制品吸附到400目铜/碳膜网格(EM分辨率)上，用去离子水洗涤两次，然后在去离子水中使用1.5％乙酸铀酰进行负染。样品在FEI TecnaiG2电子显微镜(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))(在120keV下运行，使用20μm物镜孔径以提高对比度)中观察。图像是使用AMT相机拍摄的。
分子建模
使用Desmond软件(ACM/IEEE超级计算会议论文集(SC06)(Proceedings of theACM/IEEE Conference on Supercomputing(SC06))，坦帕(Tampa)，佛罗里达州，2006年11月11日至17日)进行了分子动力学(MD)模拟。初始几何形状如下所述针对每种情况生成。使用胰高血糖素类似物(PDB代码1BH0)的x射线结构构建MEDI0382肽(Sturm NS，等人，J MedChem.[医药化学杂志]41(15)：2693-700(1998))。使用Maestro中的肽编辑工具手动突变氨基酸(薛定锷公布2018-1：Jaguar(
Release 2018-1：Jaguar)，薛定锷公司(
LLC)，纽约，纽约州，2018)。朝向C末端缺失氨基酸是在没有模板的情况下构建的。将Tyr10的侧链去掉，并且人工用K(γE-棕榈酰基)C-16脂肪酸模型代替。除质子化的C末端外，所有羧酸均保持带电状态。MEDI0382的最终3D模型被允许在NPT分子动力学(MD)模拟中弛豫10ns。平衡模型被用作所有进一步模拟的起点。HPβCD的3D模型是根据从CSD数据库(BCDEXD10)提取的β-环糊精(β-CD)的x射线结构建立的(Klaus Lindner WS，Carbohydrate Research.[碳水化合物研究]99(2)：103-15(1982)。将四组2-羟丙基手动添加到原始β-CD结构中。这个几何结构被弛豫到最接近的能量最小值。HPβCD的弛豫的3D模型被用作所有进一步研究的起始几何。
将肽同源性模型插入含有50000个TIP3水分子模型的系统中，该系统具有
模拟盒。通过添加Na+离子中和该系统。肽浓度设定为0.55mM，并且钠浓度设定为2.76mM。所有模拟都使用针对肽、环糊精和Na离子的OPLS3力场(OPLS3e，薛定锷公司(
Inc.)，纽约，纽约州，2013)(Shivakumar D，等人，J Chem TheoryComput.[化学理论与计算杂志]８(8)：2553-8(2012))进行。允许初始系统经过弛豫序列：a)100ps布朗动力学NVT T＝10K；b)对溶质重原子小时间步长，12ps NVT MD T＝10K限制；c)对溶质重原子，12ps NPT MD T＝10K限制；d)对溶质重原子，12ps NPT MD T＝300K限制；以及e)NPT MD T＝300K无限制。在弛豫方案之后，使用NPT集合开始生产模拟，调用Nose-Hoover chian恒温器(弛豫时间为1ps)将温度保持在300K，并且调用Martyna-Tobias-Klein气压计(弛豫时间为2ps)将压力保持在1大气压。RESPA算法用于以2fs的时间步长积分运动方程。
体外效力测定
稳定表达GLP-1或GCG受体的CHO-K1细胞系用与萤光素酶报告基因连接的cAMP应答元件稳定地转导，以测定MEDI0382在缓冲液中、在环糊精中和与DPZ共配制中的体外激动剂效力。简言之，以每孔20,000个细胞将细胞涂布在96孔白色微量滴定板(康宁公司，美国)中，并在裂解和使用Steady-Glo萤光素酶底物(普洛麦格公司(Promega)，美国)测量cAMP依赖性萤光素酶活性之前与连续稀释的肽样品孵育4小时。在SpectraMax Paradigm读板器(分子仪器公司(Molecular Devices)，美国)上读取板，并一式三份地产生10点浓度-应答曲线。在使用SoftMax Pro软件(分子仪器公司，美国)进行平行性测试后，通过计算来自4-PL拟合的参考和样品EC50值的比率，将结果表示为测试样品与参考配体相比的相对效力，并且所报告的数据是两个独立测定的平均值。使用GradhPad Prism软件6.03(GraphPad公司，美国)中的非线性回归分析拟合曲线。
用于PK研究的MEDI0382和DPZ配制品
对于PK研究，在50mM磷酸钠缓冲液(pH 7.8)+1.85％丙二醇(PG)(J.T.贝可公司(J.T.Baker))中以0.5mg/mL制备单独存在于缓冲液中的MEDI0382。此缓冲液允许将PK谱与历史数据进行比较。
用于PK研究的环糊精媒介物是在50mM磷酸钠(pH 7.8)+0.5％v PG中的7％w/v HPβCD。添加PG以将配制品的渗透压调节至260mOsm。简而言之，将DPZ以5mg/mL的浓度溶解在(50mM NaP缓冲液(pH 7.8)+0.5％v/v PG中的7％w/v HPβCD)媒介物中，然后添加MEDI0382以达到0.5mg/mL的浓度。平行地，在50mM NaP缓冲液(pH 7.8)+1.85％v/v PG中以0.5mg/mL制备单独在缓冲液中的MEDI0382。然后将配制品用其相应的媒介物稀释至1/10。
PK研究的剂量设定为对于DPZ和MEDI0382是0.5mg/kg和0.05mg/kg，其中剂量体积为1mL/kg。
每组包括三只动物，并且在给药后0.5、1、2、4、7和24小时进行系列血液采样以进行PK评估。使用经过验证的方法(由血浆蛋白速成样品制备随后LC-MS/MS组成)，从血浆样品中分析了MEDI0382和DPZ两者。
实例1：环糊精增加SGLT2i的溶解度
DPZ的推荐剂量为10mg片剂，每日一次，用于单一疗法和与其他降糖药物的组合疗法(欧洲药物局(EMA)推荐)。考虑到经口施用后DPZ吸收良好(达到78％的绝对生物利用度)，而且预计皮下注射也会有类似的暴露，因此将共配制品的DPZ剂量固定为10mg。因此，筛选测定被设计为目标浓度为17mg/mL，相当于600μL剂量体积中的10mg剂量。基于几个标准(例如，皮下给药的批准状态、与肽的相容性、和/或增加DPZ溶解度的优先级)选择赋形剂。所筛选的赋形剂包括PEG400、PG、DSPE-PEG 2000、甘油、Kolliphor 188、HPβCD、和BSA。大多数赋形剂不能达到所需的浓度或在溶液中维持DPZ。只有含有环糊精的配制品是成功的，因此作为潜在的共配制品媒介物进行进一步评估。
为了更好地了解环糊精的增强能力，我们进行了DPZ在HPβCD中的相溶解度研究(图2)。实验测量DPZ的水溶解度为1.6mg/mL。添加HPβCD后，DPZ溶解度随HPβCD浓度的增加而线性增加，表明形成了化学计量为1∶1的包合络合物。由线性回归确定的结合常数为4.7x103M-1。根据相溶解度图，增加溶解度至17mg/mL所需的HPβCD量为5.5％(w/v)。但是，对于溶液配制品，建议不要超过饱和溶解度的80％以确保稳定性，将其设置为7％w/v的水平。为了证实HPβCD可应用于其他SGLT2i配制品，用恩格列净(EPZ)进行了相溶解度图解，其也显示在HPβCD存在下溶解度线性增加(图2)。
实例2：HPβCD抑制MEDI0382聚集并诱导构象变化
肽例如MEDI0382的聚集倾向是肽配制品开发中的主要问题之一。为了评估MEDI0382在共配制品中的物理稳定性，使用硫黄素T(ThT)测定进行聚集动力学研究，其依赖于ThT染料在与原纤维结合后发射高度增强的荧光的性质(Biancalana M等人，BiochimBiophys Acta.[生物化学与生物物理学学报]1804(7)：1405-12(2010))。ThT测定用于比较在37℃下，在各种配制条件下，包括在有环糊精和无环糊精以及在不存在或存在DPZ的情况下，MEDI0382的聚集情况(图3A)。MEDI0382的浓度设置为0.5mg/mL，这相当于临床剂量300μg。
在进行聚集测试之前，通过远UV CD分析新制备的配制品的二级结构(图3B)，并获取TEM照片(图4)。在缓冲液中的MEDI0382溶液显示出α-螺旋结构的CD光谱特征，其中在192nm处有一个阳性带并且在207nm和222nm处有2个阴性带(图3B)。利用CDpro对光谱进行反卷积，证实了大部分的α-螺旋构象(51％)和少量β-片结构(11％)的存在。(请参阅下面的表1。)当配制进入HPβCD后，观察到显著的结构修饰，其中在190nm处有强度较在缓冲液中更低的阳性带，在203nm处的阴性带，以及在224nm处的低强度带。使用CDPro对二级结构的测定表明，螺旋度损失，降低至18％，这可以通过β-片和无规卷曲的增加来补偿。(请参阅下面的表1。)
表1：MEDI0382 CDPro
由于具有手性中心的DPZ，无法获得共配制品的CD光谱。在所有三种MEDI0382配制品中，通过TEM照片证实不存在原纤维(图4)。
然后通过ThT荧光测量监测MEDI0382在缓冲液中、在环糊精中以及与DPZ在HPβCD中共配制中的聚集动力学(图3A)。MEDI0382在缓冲液中的ThT谱为S形曲线，这表明原纤维形成具有50小时的初始滞后期和随后的伸长期，该伸长期似乎朝向测定结束达到平台。在最后时间点拍摄的TEM照片证实了原纤维的存在(图4)。ThT测定后的远UV CD光谱表明原纤维的β-片含量如预期的那样增加，但它也显示出表明原纤维的结构的、合理高百分比的螺旋度。
有趣的是，添加环糊精后，在测定过程中观察到原纤化的完全抑制。TEM照片上不存在原纤维(图4)以及ThT测定后CD光谱不变(图3A)排除了由于环糊精的存在而产生假阴性的可能性，并证实了大环分子的抑制作用。有趣的是，对于另一种脂化的GLP1类似物利拉鲁肽，也观察到了限制原纤维生长的能力(图5和6)。
最后，还对在pH 7的HPβCD媒介物中的含有MEDI0382和DPZ的共配制品进行了ThT测定，以评估DPZ的存在对肽物理稳定性的影响。有趣的是，如通过TEM照片所证实的，DPZ不妨碍环糊精的抑制作用，并且没有发生原纤化(图4)。
为了确定HPβCD的聚集抑制作用背后的机制，进行了彻底的表征，以评估大环与活性分子之间的相互作用。
实例3：环糊精与MEDI0382和DPZ形成包合络合物
ANS是两亲性染料，其优先结合疏水性空腔并且其荧光取决于其环境。在极性环境中，荧光产量保持较低，而与疏水性表面相互作用后会增加。由于ANS可以与环糊精形成包合络合物(Nishijo J，等人，J Pharm Sci.[药物科学杂志]80(1)：58-62(1991))，因此其用于定性地比较各种配制品中可用的疏水性核(图7A)。当添加到环糊精媒介物中时，与缓冲液相比，ANS荧光由于与环糊精腔的相互作用而大大增强。有趣的是，当DPZ或MEDI0382与环糊精配制时，荧光强度降低，这表明两种药物分子与环糊精形成包合络合物，导致ANS探针可获得的疏水性表面减少。在环糊精配制品中，对于DPZ和肽的共配制品观察到最低的强度，这表明这两种分子在尽管另一对方存在的情况下能与环糊精相互作用(图7A)。ANS也在缓冲液中与MEDI0382孵育，但信号保持较低，因为肽主要包含α螺旋结构并且因此具有低疏水性表面(图7A)。
通过等温滴定微量量热实验(ITC)进一步表征与HPβCD的络合(图9)。ITC是一种无需标记的技术，其可以通过测量结合过程中释放或吸收的热量来确定生物分子相互作用的热力学参数。(参见Claveria-Gimeno R，等人，Expert Opin Drug Discov.[药物发现专家意见]12：363-77(2017)和Klebe G.，Nat Rev Drug Discov.[自然综述药物发现]14：95-110(2015))。近十年来，ITC因其高灵敏度而日益成为表征环糊精-客体相互作用的首选技术。这种高灵敏度使得能够测量从毫摩尔到纳米摩尔范围内的解离常数(Bouchemal K，等人，Drug Discov Today[今日药物发现]17(11-12)：623-9(2012))。因此，这一方法用于研究MEDI0382与HPβCD之间的相互作用，并与具有HPβCD情况下的DPZ进行了比较。从HPβCD滴定到DPZ或肽中可得到两个相反的热力学谱(图9)。HPβCD：DPZ的结合表现出放热谱，其中焓和熵的贡献相等，这表明有利的氢键和疏水相互作用。由ITC(6.6x103M-1)测定的DPZ：HPβCD络合物的亲和力常数与从相溶度图(4.7x103M-1)计算出的值非常一致。先前通过相溶解度图确定的HPβCD∶DPZ的1∶1化学计量由ITC确认，如下表2所示。
与DPZ相比，HPβCD：MEDI0382的相互作用表现为吸热，特征是以疏水作用为主导的熵驱动相互作用。ITC测量的曲线拟合表明化学计量3∶1。相比之下，还用胰高血糖素以及MEDI0382的非脂化的类似物进行了滴定。在这两种情况下，均未观察到热力学信号，这表明脂质链是环糊精与MEDI0382之间相互作用的关键驱动因素。
表2：HPβCD：MEDI0382和HPβCD：DPZ相互作用的ITC热力学参数
实例4：HPβCD通过与芳香族残基和脂质链的相互作用与MEDI0382形成络合物
为了深入了解HPβCD和MEDI0382之间的相互作用，对配制品进行了近UV CD分析。由于近UV CD主要由芳香族发色团酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)和色氨酸(Trp)驱动，因此信号变化可以提供有关其微环境的信息。缓冲液中的MEDI0382和环糊精中的MEDI0382的光谱对每个芳香族氨基酸区域显示出不同的吸收模式(图8)，其中受影响最大的是Trp。这表明由于二级结构变化和/或与HPβCD的直接相互作用，所有三个发色团的局部环境均发生了变化。
为了进一步评估与Trp的相互作用，监测固有Trp荧光，以提供关于在环糊精中配制后的变化的信息(图7B)。用0和7％的环糊精进行测量。在缓冲液中在342nm处测得的固有色氨酸荧光最大值表明溶剂暴露的Trp残基，如先前针对变性蛋白质(如胰高血糖素(352nm)和蜂毒肽(346nm))所报道(Ghisaidoobe AB，等人，Int J Mol Sci.[分子科学杂志国际版]15：22518-38(2014))。有趣的是，当在环糊精中配制时，观察到Trp荧光强度增加约2倍。缓冲液中较低的荧光强度可能是由于Trp暴露于水而产生的猝灭效应(Muino PL，等人，J Phys Chem B.[物理化学学报]113：2572-7(2009))，而荧光的增加可能与向极性更低的环境(如HPB的空腔)的转变有关。在存在环糊精的情况下，游离Trp分子观察到类似的增强的荧光发射。这一观察结果表明HPβCD和MEDI0382的Trp残基之间存在相互作用。
为了确认环糊精和肽之间的相互作用位点，与缓冲液中的MEDI0382相比，对MEDI0382环糊精配制品进行了2D NOESY NMR分析。2D NOESY NMR光谱在水抑制下从在缓冲液中4.3mg/ml的具有或不具有10％HPβCD的MEDI0382溶液获得。与配制品相比，MEDI0382：环糊精的比例必须降低，以避免NOESY NMR光谱中的动态范围问题。由于NMR技术的不灵敏性，MEDI0382的浓度被大幅增加(比配制品高约10倍)，而环糊精的量仅被轻微增加以避免动态范围问题和掩盖肽NMR信号。CD分析证实，尽管改变了比例，二级结构也同样受到从α螺旋到β-片的转化的影响。肽的NMR光谱已预先验证。然而，在目前的溶液中，所有的氨基酸还没有被完全归属。环糊精共振归属基于文献值(Schneider等人Chemical Reviews[化学综述]，199８，第98卷，第5期)。在存在HPβCD的情况下的MEDI0382的光谱显示出HPβCD的H-5和H-6质子(图10B)与来自肽的几个质子之间的强相互作用。F2中的约7.55ppm、7.40ppm、7.1ppm、7.05ppm和F1中的3.80ppm处的交叉峰(图10A)表明HPβCD的H5/H-6与Trp的芳香族质子43、40、41、42之间的NOE(图10B)。F2中约7.25ppm和F1中3.80ppm处的交叉峰(图10A)表明HPβCD的H5/H-6与Trp的芳香族质子36和Phe的芳香族质子之间的NOE。F2中的3.75ppm和F1中的1.20ppm处观察到另一个NOE(图10C)，表明环糊精和脂质链之间的NOE(图10D)。
实例5：原纤化抑制机制是由防止П-П堆积以及防止静电吸引和脂质相互作用的空间位阻驱动
环糊精对肽的稳定作用先前已在针对胰岛素、淀粉样蛋白-β和胰高血糖素的文献中报道(见Kitagawa K，等人，Amyloid.[粉样蛋白]22：181-6(2015)；Matilainen L，等人，JPharm Sci.[药物科学杂志]97：2720-9(2008)；和Ren B，等人，Phys Chem Chem Phys.[物理化学与化学物理学杂志]18：20476-85(2016))。但是，只有通过将滞后时间延迟几个小时或减少原纤维的量才能证明效果；尽管在胰岛素和胰高血糖素的情况下使用了类似比例的肽：环糊精，但没有实现完全抑制。这种差异可能是由于肽的原纤化过程以及环糊精与肽之间的相互作用类型所致。对于文献中报道的肽，Trp和Phe是与β-环糊精共同的优先相互作用位点(见Kitagawa(2015)；Matilainen(2008)；Ren(2016)；和Qin XR，等人，BiochemBiophys Res Commun.[生物化学与生物物理学研究通讯]297：1011-15(2002))。在环糊精和芳香族残基之间形成包合络合物可能防止分子间/分子内的П-П相互作用。通过近UV、Trp荧光和NMR分析清楚地证明了MEDI0382与Trp和Phe的相互作用。此外，在环糊精中配制后，观察到二级结构发生了深刻的变化，其中α螺旋的减少被CD pro估计的高β-片含量所补偿。这种转化表明，当在环糊精中配制时，通常稳定螺旋结构的H键网络可能由于HPβCD与多个氨基酸之间的优先H键而被破坏。由于肽NMR的归属尚未完全解决，因此相互作用的分析仅限于已归属的氨基酸。因此，运行计算模型来预测HPβCD和MEDI0382之间发生的进一步相互作用。有趣的是，模拟显示脂质链的热运动导致与环糊精腔形成包合络合物，其在整个模拟过程中一直存在。此外，对模拟的分析揭示了HPβCD与包括天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)和N-末端组氨酸(His)在内的若干个氨基酸残基之间发生了许多氢键相互作用(图11)。除了证实由氢键驱动的二级结构修饰的假设外，这一观察还提供了有关原纤化机制的新见解。酸性残基Glu和Asp作为侧链的pKa分别为3.9和4.0，而N-末端His具有两个碱性基团，α-氨基和咪唑基。在具有与MEDI0382相似的结构的胰高血糖素中，来自His的2个官能团的pKa据报道分别为7.6和7.4(Hefford MA，等人，Biochemistry[生物化学]24(4)：867-74(1985))。因此，在pH 7时，Glu和Asp均带负电，而His带正电，这可通过静电相互作用促进原纤维形成。但是，当将MEDI0382在环糊精中配制时，带有带电荷残基的包合络合物可能会在空间上阻止自组装。最后，虽然对脂质链在聚集过程中的作用还不甚了解，但通过NMR、ITC和模拟证实的与环糊精的相互作用可能对自组装产生进一步的空间位阻。
实例6：pH对在环糊精中与DPZ共配制的肠促胰岛素肽的影响
为了评估pH对在环糊精中在具有DPZ情况下的肠促胰岛素肽的影响，使用(i)固有trp荧光，(ii)Tht前后的圆二色性(CD)，以及(iii)Tht测定后的TEM和原子力显微镜(AFM)照片，在pH 6.5和8下评估了共配制品。
在存在和不存在环糊精的情况下，使用固有Trp荧光比较pH 6.5和pH 8时的MEDI0382的配制品。在不存在环糊精的情况下，pH从6.5增加到8分别与trp荧光红移从344nm到348nm有关。相反，当在环糊精中配制时，无论pH如何，在346nm处测量到trpλmax。另外，荧光强度增加2倍(图12，左)。有趣的是，当在环糊精中配制时，远UV CD光谱也显示出显著的结构修饰，其中螺旋度损失，降低至18％-19％，这可通过β-片和无规卷曲的增加来补偿(图12，右)。
在pH 6.5时，Tht谱显示出非常短的滞后时间，随后是30小时的生长阶段，然后达到平台(图13)。在测定结束时拍摄的AFM照片证实了纤维的存在(图14)，Tht测定后的远UVCD光谱表明螺旋度损失(图15)。当将pH增加至8时，Tht荧光保持在缓冲液对照的水平(图13)，表明没有纤维形成，如通过在AFM图片上不存在有序聚集体所证实的(图14)。
有趣的是，在pH 6.5下添加环糊精候，尽管在缓冲液中MEDI0382的原纤化迅速发生(滞后时间＝3小时)，但在测定过程中环糊精完全抑制了聚集(图13)。在AFM照片上没有纤维(图14)以及在Tht测定前后CD光谱不变(图15)排除了由于环糊精的存在而产生假阴性的可能性，并证实了大环分子的抑制作用。
还在ph 6.5和pH 8下使用共配制品进行了聚集动力学测定。在pH 6.5下的Tht测定显示，对于共配制品，在75小时时荧光增加，这对于单独在环糊精中的MEDI0382是看不到的(图16)。然而，与缓冲液中的MEDI0382相比，共配制品的滞后阶段更长，这意味着原纤化仍被延迟(图16)。与pH 6.5相反，在pH 8下，共配制品被证明是稳定的(图16)。
使用利拉鲁肽共配制品也进行了类似的实验。如在Tht测定中所测量的，环糊精似乎减少了在pH 6.5下的利拉鲁肽原纤化(图17)。与MEDI0382相似，环糊精在pH 6.5和pH 8下均改变了利拉鲁肽的二级结构，Tht后在pH 6.5下的CD证实缓冲液和环糊精配制品中存在纤维(图18)。
这些结果表明，环糊精至少在pH 6.5至8时可以增加脂化的肠促胰岛素肽的稳定性。
实例7：MEDI0382与DPZ在环糊精中共配制保持效力
尽管HPβCD增强了肽的物理稳定性，但α-螺旋的损失可能会对肽的效力产生重大影响。确实有若干项研究证明，GLP-1和GLP-1类似物的二级结构在与相应受体的结合和激活中起着根本性的作用(见例如Donnelly D.，Br J Pharmacol.[英国药理学杂志]166：27-41(2012))。更具体地，α-螺旋结构似乎是驱动肽的亲和力和效力的关键因素(AdelhorstK，等人，J Biol Chem.[生物化学杂志]269：6275-8(1994))。因此，在体外评估了MEDI0382对GLP1和胰高血糖素受体的生物活性，以评估环糊精和DPZ的存在对其激动剂特性的影响。对过表达人重组GLP-1或胰高血糖素受体的CHO细胞进行体外效力评估，并在测量cAMP累积后以EC50值报告活性。如图19A和19B中所示，无论配制品如何，均未观察到任一种受体的EC50改变。另外，值得注意的是，媒介物和媒介物中的DPZ均未显示对受体的活性。共配制品与MEDI0382和DPZ的每日一次剂量频率兼容。
最后，在体内评估MEDI0382在共配制品中的性能，以评估环糊精以及存在DPZ的影响(图19C和19D)。在大鼠皮下注射后，在环糊精中单独地或与DPZ共配制地进行了MEDI0382的药代动力学研究，并将其与缓冲液中的MEDI0382的药代动力学进行了比较。血浆浓度相比于时间谱、以及MEDI0382的相关PK参数在图19C和表3中报告。DPZ的血浆浓度时间谱在图19D中示出。
表3：MEDI0382的平均PK参数
Cmax＝最大血浆浓度；Tmax＝最大血浆浓度的时间；AUCinf＝血浆浓度时间曲线下至无穷大的面积；SD＝标准偏差
(1)Tmax报告为中值
缓冲液中的MEDI0382显示缓慢的吸收动力学，其中在注射后4小时达到最大浓度。当单独在环糊精中配制时，Tmax显著缩短(对于HPB和缓冲液配制品分别为1小时和4小时)，并且Cmax比缓冲液配制品高约1.5倍。类似地，在环糊精存在下，总暴露增加1.2倍。与环糊精中的MEDI0382相比，在共配制品组中DPZ的存在没有引起PK的任何进一步变化。在所有三种配制品中，MEDI0382的消除阶段均保持相似，这表明这些配制品不影响主要由与白蛋白结合驱动的MEDI0382的消除。
另外，在MEDI0382存在下，DPZ的PK不变。
这些数据表明，环糊精中MEDI0382和DPZ的共配制品可在体外和在体内维持MEDI0382对GLP1和胰高血糖素受体的稳定性和生物效力。因此，对于MEDI0382和DPZ，这些共配制品与每日一次的剂量频率兼容。
Claims (24)
1.一种液体药物组合物，该液体药物组合物包含(i)脂化的肠促胰岛素肽，(ii)钠葡萄糖共转运蛋白2抑制剂(SGLT2i)和(iii)环糊精。
2.如权利要求1所述的组合物，其中该肠促胰岛素肽是单脂化的。
3.如权利要求1或2所述的组合物，其中该肠促胰岛素肽是GLP-1/胰高血糖素双重激动剂肽。
4.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中该肠促胰岛素肽是MEDI0382、利拉鲁肽或索马鲁肽。
5.如权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中该SGLT2i是达格列净。
6.如权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中该环糊精是β环糊精，任选地其中该β环糊精是羟丙基-β-环糊精。
7.如权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中该环糊精是磺丁基醚环糊精。
8.如权利要求1-7中任一项所述的组合物，其中该脂化的肠促胰岛素肽以约0.5mg/mL的浓度存在。
9.如权利要求1-8中任一项所述的组合物，其中该SGLT2i以约17mg/ml的浓度存在。
10.如权利要求1-9中任一项所述的组合物，其中该环糊精以约7％w/v的浓度存在。
11.如权利要求1-10中任一项所述的组合物，其中该SGLT2i和该环糊精具有约1∶1的化学计量。
12.如权利要求1-11中任一项所述的组合物，其中该组合物具有约6.5至约8或约7至约8的pH，任选地其中该组合物具有约7的pH。
13.如权利要求1-12中任一项所述的组合物，其中该组合物具有1mL或更小的体积。
14.如权利要求1-13中任一项所述的组合物，其中该组合物用于肠胃外施用，任选地其中该肠胃外施用是皮下施用。
15.如权利要求1-14中任一项所述的组合物，其中该组合物含有包合络合物，这些包合络合物包含该脂化的肠促胰岛素肽、该SGLT2i和该环糊精。
16.如权利要求1-15中任一项所述的组合物，其中该组合物不包含该脂化的肠促胰岛素肽的原纤维。
17.如权利要求1-16中任一项所述的组合物，其中该组合物不降低该脂化的肠促胰岛素肽对GLP-1受体和/或胰高血糖素受体的亲和力。
18.如权利要求1-17中任一项所述的组合物，其中给大鼠施用该组合物产生约390ng/ml的脂化的肠促胰岛素肽Cmax、约1小时的脂化的肠促胰岛素肽Tmax、约5小时的脂化的肠促胰岛素肽半衰期和/或约3500-4000ng.hr/mL的脂化的肠促胰岛素肽AUC0-inf。
19.一种注射笔，该注射笔包含如权利要求1-18中任一项所述的组合物，任选地其中该注射笔递送约600μL的该组合物。
20.一种在有需要的受试者中治疗2型糖尿病的方法，该方法包括向该受试者施用如权利要求1-18中任一项所述的组合物，任选地其中该受试者超重或肥胖。
21.一种在有需要的受试者中治疗非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的方法，该方法包括向该受试者施用如权利要求1-18中任一项所述的组合物，任选地其中该受试者超重或肥胖。
22.一种在有需要的受试者中减少肝脂肪的方法，该方法包括向该受试者施用如权利要求1-18中任一项所述的组合物，任选地其中该受试者超重或肥胖。
23.如权利要求20-22中任一项所述的方法，其中该施用向该患者递送约10mg的该SGLT2i和/或约300μg的脂化的肠促胰岛素肽。
24.如权利要求20-23中任一项所述的方法，其中该施用是饮食和运动的辅助。
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| ANDREAS EVERS等: "Design of Novel Exendin-Based Dual Glucagon-like Peptide 1 (GLP-1)/Glucagon Receptor Agonists", 《J. MED. CHEM.》, vol. 60, no. 10, 27 April 2017 (2017-04-27), pages 4293 - 4303, XP055394035, DOI: 10.1021/acs.jmedchem.7b00174 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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