CN113840617A - 用于使用经改造的泛素连接酶的遗传编码的高电压激活钙通道阻断剂的组合物和方法 - Google Patents

用于使用经改造的泛素连接酶的遗传编码的高电压激活钙通道阻断剂的组合物和方法 Download PDF

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Abstract

本公开内容尤其提供了靶向CaVβ辅助亚基的纳米抗体及其组合物。本发明还提供了用于通过使用此类组合物来阻断高电压激活钙通道(High‑Voltage Activated Calcium Channel；HVACC)的方法，用于选择性地靶向受试者中的细胞群体的方法，和用于治疗或改善在受试者中疾病的影响的方法。

Description

用于使用经改造的泛素连接酶的遗传编码的高电压激活钙通 道阻断剂的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年8月14日提交的美国临时专利申请系列号62/886,733、2019年8月6日提交的美国临时专利申请系列号62/883,637、2019年5月30日提交的美国临时专利申请系列号62/854,688、2019年4月5日提交的美国临时专利申请系列号62/830,142和2019年3月28日提交的美国临时专利申请系列号62/825,784的权益，这些申请通过提及而以其整体合并入本文。
公开内容的领域
本公开内容尤其提供了遗传编码的高电压激活钙通道(High-Voltage ActivatedCalcium Channel；HVACC)抑制剂(包括靶向CaVβ辅助亚基的纳米抗体)及其组合物。本发明还提供了使用其的治疗方法。
政府资助
本发明用在由美国国立卫生研究院(NIH)授予的基金号GM107585、DK118866和HL142111之下的政府资助来完成。政府拥有本发明中的某些权利。
序列表通过提及而合并
本申请包含对于已经作为序列表TXT文件“CU19283-pro4-seq.txt”(文件大小43KB，于2019年8月6日创建)与本文同时提交的氨基酸和/或核酸序列的引用。上面提及的序列表依照37C.F.R.§1.52(e)(5)通过提及而以其整体合并入本文。
公开内容的背景
高电压激活钙通道(HVACC)对于可兴奋细胞例如神经元的功能是关键性的。它们允许神经递质、激素的释放，并且起始骨骼肌和心肌两者的收缩。因此，钙通道阻断剂已成为用于各种不同疾病诸如高血压、心律失常、糖尿病、帕金森病和慢性疼痛的突出的药物靶标。最后一种疾病据估计影响全球人口的20％，具有巨大的经济和社会后果。尽管该大的流行率，但是目前用于慢性疼痛的治疗仍然是不适当的，如用导致阿片样物质流行的用于慢性疼痛的常见治疗所例示的。
在HVACC之中，N-型钙通道是用于治疗慢性疼痛的主要靶标。已确立，这些通道在传递疼痛感觉的感觉神经元中表达，阻断这些通道可以使疼痛知觉中断，并且这些通道在多种疼痛模型中被上调。源自海洋蜗牛毒液的N-型钙通道阻断剂(Prialt)目前在有限的情形下用于疼痛管理，但是受限于狭窄的治疗窗。在特定组织中减少/抑制HVACC的治疗潜力超出了疼痛范围：钙通道阻断剂目前在临床试验中用于治疗糖尿病以及帕金森病。所有目前的药物都通过破坏其允许钙进入细胞的能力而在其功能位置(质膜)处阻断所述通道。鉴于它们在许多细胞中的中枢重要性，对于所有目前的药理学HVACC阻断剂的主要关切是脱靶效应。
大多数针对HVACC的药物靶向所述通道的孔形成性α1亚基，从而破坏所述通道允许钙进入细胞的能力。HVACC也由辅助性β和α2-δ亚基组成，它们的功能是促进α1亚基运输至质膜，并且一旦在那里就微调其特性。作为通道功能的关键调节剂，这些辅助亚基是潜在的治疗靶标。事实上，加巴喷丁(普瑞巴林或乐瑞卡(Lyrica))用于治疗慢性疼痛，并且通过经由与所述通道的α2-δ亚基的联合下调N-型钙通道来工作(这如何发生的准确机制正在深入研究中)。相比于其他治疗选项例如阿片样物质或三环类抗抑郁药而言，基于加巴喷丁的治疗产生更少的副作用，但是完全缓解疼痛是很少见的。因此，非常需要经改进的用于这种常见状况的治疗选项。辅助性β亚基对于正确的通道运输是必须的。然而，尽管进行了靶向α1-β结合界面的努力，但是该亚基仍然是未利用的治疗靶标。
目前，还不存在有特异性地阻断所有HVACC的遗传编码的分子或工具。天然出现的遗传编码的抑制剂例如RGK蛋白结合其他蛋白质并且影响其他细胞过程，例如调节细胞骨架。这意味着，必须共施用HVACC阻断剂的混合物，其中一些是昂贵的源自毒液的肽。
因此，对于遗传编码的HVACC抑制剂以及用于治疗各种与HVACC相关的疾病的组合物和方法存在需要。本公开内容旨在满足这些和其他需要。
公开内容的概述
抑制高电压激活钙通道(HVACC；CaV1/CaV2)可治疗无数的心血管疾病和神经病学疾病。对于特定应用，遗传编码的HVACC阻断剂可以使得以比用小分子可取得的更大的组织特异性和通用性来进行通道抑制成为可能。在本公开内容中，通过首先分离结合辅助性HVACC CaVβ亚基的经免疫接种的美洲驼的纳米抗体(nb.F3)来改造遗传编码的HVACC抑制剂。nb.F3本身是在功能上惰性的，从而提供了方便的用于将活性部分靶向CaVβ-相关通道的运载体。与Nedd4L(一种E3泛素连接酶)的催化性HECT结构域相融合的nb.F3(CaV-消融剂(CaV-aβlator))除去来自在HEK293细胞中重构的各种各样HVACC以及来自在哺乳动物心肌细胞、背根神经节神经元和胰腺β细胞中的内源性CaV1/CaV2通道的电流。在心肌细胞中，CaV-消融剂将CaV1.2通道从二分体重新分配至Rab-7-阳性晚期内体。本公开内容引入CaV-消融剂作为强有力的遗传编码的HVACC抑制剂，并且描述了可以广泛地适应于产生用于大分子膜蛋白复合物的通用调节剂的一般方法。
因此，本公开内容的一个实施方案为能够与CaVβ辅助亚基相结合的纳米抗体，其包含SEQ ID NO:1-3、SEQ ID NO:5-7、SEQ ID NO:9-11、SEQ ID NO:13-15、SEQ ID NO:17-19、SEQ ID NO:21-23、SEQ ID NO:25-27、SEQ ID NO:29-31、SEQ ID NO:33-35、SEQ ID NO:37-39、SEQ ID NO:41-43、SEQ ID NO:45-47、SEQ ID NO:49-51、SEQ ID NO:53-54、SEQ IDNO:56-57、SEQ ID NO:59-61、SEQ ID NO:63-65、SEQ ID NO:67-69、SEQ ID NO:71-73、SEQID NO:75-77、SEQ ID NO:79-81、SEQ ID NO:83-85、SEQ ID NO:87-89、SEQ ID NO:91-93或SEQ ID NO:95-97。
本公开内容的另一个实施方案为组合物，其包含：(i)在本文中所公开的纳米抗体；和(ii)与所述纳米抗体可操作地相连的E3泛素连接酶的催化结构域。
本公开内容的另一个实施方案为组合物，其包含遗传编码的钙通道阻断剂，所述遗传编码的钙通道阻断剂包含编码下列组分的核酸：(i)在本文中所公开的纳米抗体；和(ii)E3泛素连接酶的催化结构域。
本公开内容的一个进一步的实施方案为在细胞中阻断高电压激活钙通道(HVACC)的方法，其包括使所述细胞与有效量的在本文中所公开的组合物相接触。
本公开内容的另一个实施方案为选择性地靶向受试者中的细胞群体的方法，其包括向所述受试者施用有效量的在本文中所公开的组合物。
本公开内容的另一个实施方案为用于在细胞中可诱导地抑制高电压激活钙通道(HVACC)的组合物，其包含：(i)在本文中所公开的纳米抗体；和(ii)与所述纳米抗体可操作地相连的来自蛋白激酶Cγ的C1结构域(C1PKC)；其中所述组合物对于在用佛波醇-12,13-二丁酸酯(PdBu)进行诱导后使所述HVACC失活来说是有效的。
本公开内容的一个另外的实施方案为组合物，其包含遗传编码的诱导型钙通道阻断剂，所述遗传编码的诱导型钙通道阻断剂包含编码下列组分的核酸：(i)在本文中所公开的纳米抗体；和(ii)与所述纳米抗体可操作地相连的来自蛋白激酶Cγ的C1结构域(C1PKC)。
本公开内容的另一个实施方案为在细胞中阻断高电压激活钙通道(HVACC)的方法，其包括下列步骤：(i)使所述细胞与有效量的在本文中所公开的组合物相接触；和(ii)使所述细胞与佛波醇-12,13-二丁酸酯(PdBu)相接触；其中步骤(i)和(ii)的接触对于将所述HVACC从其在细胞质膜上的功能位置处移除来说是有效的。
本公开内容的另外一个实施方案为用于治疗或改善在受试者中疾病的影响的方法，其包括向所述受试者施用有效量的在本文中所公开的组合物。
附图简述
申请文件包含至少一张以彩色制作的照片。在提出要求并支付必要的费用后，将由专利局提供带有彩色照片的该专利申请的副本。
图1A-1G显示了泛-CaVβ纳米抗体的开发。图1A显示了大小排阻色谱法和考马斯蓝凝胶(内嵌图)，其显示了来自经杆状病毒感染的HEK293 GnTl-细胞的经纯化的Cavβ1。图1B提供了根据本公开内容的纳米抗体产生的代表性流程图。图1C显示了噬菌体ELISA，其中使用CaVβ1(作为诱饵)和来自单个经感染的大肠杆菌(E.coli)克隆的周质提取物。红色条表示被选择用于随后的分析的克隆；蓝色条表示来自表达抗-GFP纳米抗体的大肠杆菌的阴性对照。图1D为显示了常规IgG抗体(左)和骆驼科动物重链抗体(中)的简图。右边是骆驼科动物重链抗体的可变重链(VHH或纳米抗体)的示意性图示。作为抗原结合的主要决定子的三个CDR环以红色、绿色和蓝色显示。图1E显示了来自所选择的克隆的CDR3的序列比对。在图1F中，左边是用于在HEK293细胞中测定纳米抗体/CaVβ相互作用的共转位测定法的示意图。右边是共聚焦图像，其显示了响应于用1μM的佛波醇酯(佛波醇-12,13-二丁酸酯(PdBu))进行的处理的CaVβX-YFP和nb.F3-CFP-C1PKCγ的膜共转位。在图1G中，左边显示了使用经纯化的CaVβ2b和nb.F3的示例性等温滴定量热法迹线。右边显示了ITC热力学参数的汇总。N，化学计量；Kd，解离常数；Ka，亲和力常数；ΔH，焓变；ΔS，熵变。T＝298K。
图2A-2L显示，nb.F3对于重构的CaV2.2通道在功能上是沉默的。图2A为根据本公开内容的实验策略的示意图，其中将BBS-α1B-YFP与α2δ、CaVβ和CFP或nb.F3-P2A-CFP一起转染入HEK293细胞中。图2B显示了表达BBS-α1B-YFP+CaVβ1+α2δ-1和CFP(左)或nb.F3-P2A-CFP(右)的细胞的代表性流式细胞术点图。在这里和自始至终呈现了大约100,000个细胞。水平线和垂直线分别表示关于YFP-阳性细胞和Alexa-647-阳性细胞的阈值，其用单色对照来测定。图2C显示了来自表达CFP(黑色)或nb.F3(红色)的细胞的Alexa-647(左)或YFP(右)荧光的累积分布直方图。选择YFP-阳性细胞用于分析；虚线表示关于高于背景的Alexa-647和YFP荧光信号的阈值。图2D显示了BBS-α1B-YFP的表面(647，填满的)和总(YFP，图案化的)水平的流式细胞术数据的汇总。将来自表达nb.F3的细胞的数据相对于CFP对照组进行标准化。每个实验分析n≥5,000个细胞，N＝4个独立实验，误差条，s.e.m.。图2E显示了根据本公开内容的代表性实验策略，其中用BBS-α1B+CaVβ-YFP+α2δ-1转染HEK293细胞。图2F-2H以与图2B-2D相同的样式，对于表达BBS-α1B+CaVβ-YFP+α2δ-1±nb.F3-P2A-CFP的细胞。图2I显示了在表达α1B+CaVβ1+α2δ-1和CFP(黑色)或nb.F3-P2A-CFP(红色)的HEK293细胞中代表性的全细胞Ba2+电流(上)和群体I-V曲线(下)。图2J-2L以与图2I相同的样式，对于表达CaVβ2(图2J)、CaVβ3(图2K)和CaVβ4(图2L)的细胞。比例尺条1nA，10ms。数据为平均值±s.e.m.，对于每个点n＝10。
图3A-3J显示了嵌合nb.F3-Nedd4L蛋白(CaV-消融剂)对于重构的Cav2.2通道的功能影响。图3A为根据本公开内容的代表性实验设计的示意图，其中用BBS-α1B+CaVβ-YFP+α2δ-1和nb.F3、nb.F3-Nedd4L或nb.F3-Nedd4L[C942S]转染HEK293细胞。图3B显示了测量CaVβ1b-YFP的总(YFP)水平的流式细胞术实验的代表性直方图(左)和汇总数据(右)。将每个数据集相对于表达CFP的对照组进行标准化。每个实验分析n>5,000个细胞，N＝3个独立实验，误差条，s.e.m.。图3C显示了测量BBS-α1B的表面(647)水平的流式细胞术实验的代表性直方图(左)和汇总数据(右)。白色虚线是关于高于背景的647信号的阈值。图3D显示了根据本公开内容的实验策略，其具有与在图3A中相同的样式，除了将YFP与BBS-α1B相融合，这使得能够测量α1B亚基的总水平。图3E-3F以与图3B-3D相同的样式，对于表达BBS-α1B-YFP+CaVβ+α2δ-1的细胞。图3G显示了来自在表达α1B+CaVβ1b+α2δ-1和nb.F3(黑色，I峰,0mV＝-103.5±39.5pA/pF，n＝10)、nb.F3-Nedd4L(红色，I峰,0mV＝-3±0.53pA/pF，n＝11)或nb.F3-Nedd4L[C942S](绿色，I峰,0mV＝-117±34.8pA/pF，n＝8)的HEK293细胞中的全细胞膜片钳测量的代表性迹线(上)和群体I-V曲线(下)。图3H-3J以与图3G相同的样式，对于用CaVβ2(图3H)、CaVβ3(图3I)和CaVβ4(图3J)重构的CaV2.2通道，采用nb.F3(黑色)或nb.F3-Nedd4L(红色)。比例尺条1nA，10ms。数据为平均值±s.e.m.，对于每个点n＝10。*P<0.05，相比于对照而言，用Tukey多重比较检验的单因素ANOVA。
Figure BDA0003355903100000071
P<0.01，相比于对照而言，未配对双尾Student t-检验。
图4A-4D显示，CaV-消融剂抑制不同的重构的HVACC。图4A显示了来自表达α1C+β1b+α2δ-1以及nb.F3(黑色，I峰,0mV＝-48.4±8.4pA/pF，n＝12)或CaV-消融剂(红色，I峰,0mV＝-0.93±0.16pA/pF，n＝8)的HEK293的群体I-V曲线。图4B-4D以与图4A相同的样式，对于表达重构的CaV1.3(图4B)、CaV2.1(图4C)或CaV2.3(图4D)通道的细胞。数据为平均值±s.e.m.。
Figure BDA0003355903100000072
p<0.01，相比于对照而言，未配对双尾Student t-检验。
图5A-5H显示了在心肌细胞中内源性CaV1.2的CaV-消融(CaV-aβlation)。图5A显示了来自未感染的(左)或者用表达CaV-消融剂(中)或nb.F3-Nedd4L[C942S](右)的腺病毒感染的豚鼠心肌细胞的全细胞记录的共聚焦图像(上)和代表性迹线。比例尺条0.2nA，10ms。图5B显示了来自表达CaV-消融剂(红色)或nb.F3-Nedd4L[C942S](绿色)的心肌细胞或者未感染的对照(黑色)的群体I-V曲线。在图5C中，左边显示了经固定并用α1C(绿色)和兰尼碱受体(RyR2，品红色)抗体进行免疫染色的心肌细胞的代表性共聚焦图像。黄色框指明了高倍放大合并图像的区域。在右边，图显示了在未感染的心肌细胞(灰色，PCC＝0.47±0.02，n＝15)和表达CaV-消融剂(红色，PCC＝0.24±0.02，n＝19)或nb.F3-Nedd4L[C942S](绿色，PCC＝0.50±0.01，n＝17)的心肌细胞中在α1C和RyR之间的共定位。在图5D中，左边显示了用α1C(绿色)和Rab7(品红色)抗体进行免疫染色的经固定的心肌细胞的代表性共聚焦图像。黄色框指明了高倍放大合并图像的区域。在右边，图显示了在未感染的心肌细胞(灰色，PCC＝0.29±0.02，n＝16)和表达CaV-消融剂(红色，PCC＝0.42±0.02，n＝18)或nb.F3-Nedd4L[C942S](绿色，PCC＝0.30±0.03，n＝16)的心肌细胞中在α1C和Rab7之间的共定位。图5E显示了在表达α1C，β1b，和CFP、nb.F3、CaV-消融剂或nb.F3-Nedd4L-[C942S]的HEK293细胞中α1C的Pulldown。上部图版显示了用α1C抗体的探查性Pulldown。下部图版显示了经剥离并用泛素抗体再探查的相同印迹。图5F显示了在图5E中进行的四个独立实验的定量。对于每个点，数据为平均值±s.e.m.。*p<0.05，相比于对照而言，用Tukey多重比较检验的单因素ANOVA。图5G显示了CaVβ1b的Pulldown，如在图5E中那样。左图版显示了用CaVβ1b进行的探查。右图版显示了经剥离并用泛素抗体再探查的相同印迹。图5H为图解说明了在心肌细胞中由CaV-消融剂诱导的CaV1.2从二分体重新定位至Rab7-阳性晚期内体的简图。
图6A-6G显示了在DRG神经元和胰腺β-细胞中HVACC的CaV-消融。图6A显示了用GFP(左图版)、F3-Nedd4L(中间图版)、F3-Nedd4L[C942S](右图版)感染的鼠类DRG神经元的代表性Fura-2迹线，其中共聚焦图像在内嵌图中。橙色条表示用40mM KCl进行的去极化。图6B显示了响应于40mM KCl来自用GFP(峰值应答＝1.25±0.04，n＝84)、F3-Nedd4L(1.04±0.01，n＝77)和F3-Nedd4L[C942S](1.30±0.05，n＝92)感染的神经元的最大应答的汇总。将峰值相对于基线进行标准化，所述基线被定义为在添加KCl之前1分钟。图6C显示了用GFP(左)、F3-Nedd4L(中)、F3-Nedd4L[C942S](右)感染的DRG神经元的代表性迹线。在-90mV(上)和-50mV(下)的保持电位处都采集迹线。值得注意的是，当保持在-90mV时，经CaV-消融剂感染的神经元仍然显示出稳固的T-型电流。图6D显示了来自如在图6A中那样进行感染的DRG神经元的群体I-V曲线。测量在-90mV的保持电位下进行。符号为从20ms测试脉冲的15至20ms计算的平均电流。数据为平均值±s.e.m.。图6E显示了来自用16.8mM葡萄糖(蓝色条)和40mM KCl(橙色条)激惹的用CaV-消融剂(左)或F3-Nedd4L[C942S](右)感染的分散的胰岛的代表性fura-2迹线。图6F显示了响应于16.8mM葡萄糖来自用GFP(峰值应答＝1.22±0.02，n＝53)、F3-Nedd4L(峰值应答＝1.04±0.01，n＝62)和F3-Nedd4L[C942S](峰值应答＝1.18±0.01，n＝122)感染的胰腺β-细胞的最大应答的汇总。图6G显示了响应于40mM KCl来自用GFP(峰值应答＝1.25±0.02，n＝77)、F3-Nedd4L(峰值应答＝1.04±0.01，n＝62)和F3-Nedd4L[C942S](峰值应答＝1.21±0.01，n＝122)感染的胰腺β-细胞的最大应答的汇总。数据为平均值±s.e.m.。*p<0.05，相比于对照而言，用Turkey多重比较检验的单因素ANOVA。
图7显示，nb.F3结合在哺乳动物细胞的胞质溶胶中的所有四种CaVβ亚基。左边是佛波醇的12,13-二丁酸酯(PdBu)转位测定法的示意图。右边显示了在添加1μM PdBu之前(上)和之后(下)表达nb.F3-CFP-C1PKCγ和YFP-CaVβ的HEK293细胞的共聚焦图像。
图8A-8F显示了关于具有YFP-CaVβ2-CaVβ4的BBS-α1B的代表性流式细胞术数据。图8A显示了用BBS-α1B、α2-δ、YFP-CaVβ2和CFP(左)或nb.F3(右)转染的细胞的代表性流式细胞术点图。图8B显示了来自图8A的来自表达CFP(黑色)或nb.F3(红色)的细胞的Alexa-647(左)或YFP(右)荧光的数据的累积分布直方图。选择YFP-阳性细胞(n≥5,000个细胞/实验)用于分析；关于高于背景的647标记和YFP荧光的阈值用虚线表示。图8C和8D以与图8A和8B相同的样式，对于表达YFP-CaVβ3的细胞。图8E和8F以与图8A和8B相同的样式，对于表达CaVβ4的细胞。
图9A-9E显示，nb.F3对于重构的CaV1.2通道在功能上是沉默的。图9A显示了根据本公开内容的实验策略的简图。将BBS-α1C与每种YFP-CaVβ和CFP或nb.F3-P2A-CFP一起转染入HEK293细胞中。图9B显示了用BBS-α1C、CaVβ1和CFP(左)或nb.F3(右)转染的细胞的代表性流式细胞术点图。图9C显示了来自表达CFP(黑色)或nb.F3(红色)的细胞的Alexa-647(左)或YFP(右)荧光的累积分布直方图。选择YFP-阳性细胞(n>5,000个细胞/实验)用于分析；关于高于背景的647标记和YFP荧光的阈值用虚线表示。图9D显示了BBS-α1C的表面(647，填满的)和总(YFP，图案化的)水平的流式细胞术数据的汇总。将来自nb.F3的数据相对于CFP对照组进行标准化。N＝4个独立实验，误差条，s.e.m.。图9E显示了来自在表达α1C、CaVβ2a和CFP(黑色，n＝9)或nb.F3(红色，n＝12)的HEK293细胞中的全细胞膜片钳测量的群体I-V曲线。数据为平均值±s.e.m.。
图10A-10H显示了关于用YFP-CaVβ2-CaVβ4的BBS-α1B的CaV-消融的代表性流式细胞术数据。图10A显示了用BBS-α1B，α2-δ，YFP-CaVβ1，和nb.F3(左)、nb.F3-Nedd4L(中)或nb.F3-Nedd4L[C942S](右)转染的细胞的代表性流式细胞术点图。图10B显示了在图10A中的来自样品的YFP(左)或Alexa-647(右)荧光的直方图。选择YFP-阳性细胞(n>5,000/实验)用于分析，关于高于背景的647标记的阈值用虚线表示。图10C和10D以与图10A和10B相同的样式，对于表达YFP-CaVβ2的细胞。图10E和10F以与图10A和10B相同的样式，对于表达YFP-CaVβ3的细胞。图10G和10H以与图10A和10B相同的样式，对于表达YFP-CaVβ4的细胞。
图11A-11D显示了嵌合nb.F3-Nedd4L蛋白(CaV-消融剂)对于重构的Cav1.2通道的功能影响。图11A显示了根据本公开内容的实验设计的示意图。用BBS-α1C，YFP-CaVβ，和nb.F3、nb.F3-Nedd4L或nb.F3-Nedd4L[C942S]转染HEK293细胞。图11B显示了用BBS-α1C，YFP-CaVβ1b，和nb.F3(左)、nb.F3-Nedd4L(中)或nb.F3-Nedd4L[C942S](右)转染的细胞的代表性流式细胞术点图。图11C和11D显示了在图11B中的来自样品的YFP(图11C)和Alexa-647(图11D)荧光的直方图，和来自N＝3个独立实验的汇总数据(右)。选择YFP-阳性细胞(n>5,000个细胞/实验)用于分析，关于高于背景的647标记的阈值用虚线表示。*p<0.05，相比于对照而言，用Tukey多重比较检验的单因素ANOVA。
图12A-12D显示，CaV-消融剂不使α1C重新分布至Rab5早期内体或溶酶体，也不使α1C或β2的总水平降低。图12A显示了在未感染的心肌细胞(灰色，n＝15)和用nb.F3-Nedd4L感染的心肌细胞(红色，n＝19)中总α1C水平的比较。图12B显示了在未感染的心肌细胞(灰色，n＝15)和用nb.F3-Nedd4L感染的心肌细胞(红色，n＝16)中总β2水平的比较，相对于未感染的对照进行标准化。数据为平均值±s.e.m.。图12C(左图版)显示了经固定并用针对α1C(左)和LAMP1(中)的抗体进行免疫染色的、未感染的(上)或经F3-Nedd4L感染的(下)豚鼠心肌细胞的代表性共聚焦图像。右图版显示了在未感染的心肌细胞(灰色，n＝7)和表达F3-Nedd4L的心肌细胞(红色，n＝7)中在α1C和Rab5之间的共定位。数据为平均值±s.e.m.。图12D以与图12C相同的样式，其显示了针对α1C和Rab5进行免疫染色的心肌细胞的免疫染色和共定位分析。
公开内容的详述
高电压激活钙通道(HVACC)的抑制对于各种各样的心血管疾病(高血压、心律失常、脑血管痉挛)和神经病学疾病(癫痫、慢性疼痛、帕金森病)来说是一种重要的盛行或有潜力的疗法(Zamponi等人,2015)。小分子HVACC抑制剂包括CaV1阻断剂(二氢吡啶类、苯并硫氮杂
Figure BDA0003355903100000121
类、苯基烷基胺类)和靶向CaV2.1(ω-美洲蜘蛛毒素)、CaV2.2(ω-食鱼螺毒素)和CaV2.3(SNX-482)通道的毒液肽。当被引入到机体中时，小分子HVACC阻断剂通常广泛地分布，从而导致脱靶效应，这可以使治疗窗变窄并且因此不利地影响疗法。遗传编码的HVACC抑制剂可以避开脱靶效应，因为它们可以在靶组织或细胞中选择性地表达；因此，它们可以是对于小分子疗法的有用的备选方案或补充(Yang等人,2013；Murata等人,2004)。
存在七种不同的HVACC(CaV1.1-CaV1.4；CaV2.1-CaV2.3)，它们作为包含与辅助蛋白质(其包括β、α2-δ和γ亚基)一起装配的孔形成性α1-亚基的多亚基复合物而存在于细胞中(Zamponi等人,2015；Buraei和Yang,2010；Dolphin,2012)。HVACC按照组分α1亚基(α1A-α1F；α1S)的身份来进行命名，其也包含电压感受器、选择性滤器和通道孔。各种辅助亚基通常调节HVACC运输、门控和调整，并且被认为用于开发HVACC定向治疗剂的潜在靶标。例如，在临床上用于治疗癫痫和神经性疼痛的加巴喷丁靶向HVACCα2-δ亚基(Gee等人,1996)。基于如由异源表达实验所指明的α1与β的联合对于表面靶向的功能性HVACC的形成是必须的这一假设(Buraei和Yang,2010)，破坏α1-β相互作用已经作为用于开发HVACC抑制剂的一种策略而被长期遵循(Young等人,1998；Findeisen等人,2017；Chen,2018；Khanna等人,2019)。为此目的，过表达源自包含负责高亲和力α1-β联合的氨基酸序列的α1-相互作用结构域(AID)的肽(Pragnell等人,1994；Van Petegem等人,2004；Chen等人,2004；Opatowsky等人,2003)已经被数个小组用作推定的遗传编码的HVACC抑制剂(Findeisen等人,2017；Yang等人,2019)。然而，该体内方法的效力可能是有限的，因为最近的数据暗示在一些成人组织中α1-β相互作用对于HVACC的表面运输不是绝对必需的(Yang等人,2019；Meissner等人,2011)。
Rad/Rem/Rem2/Gem/Kir(RGK)蛋白是内源性的小Ras-样G-蛋白，其当在异源细胞或天然组织中过表达时，极大地抑制所有HVACC(Béguin等人,2001；Finlin等人,2003；Chen等人,2005；Xu等人,2010)。它们通过结合至作为组成部分的β亚基而与HVACC形成三级复合物，并且通过多种机制(包括去除表面通道和削弱门控)来抑制电流(Yang和Colecraft,2013；Yang等人,2010)。尽管它们具有效力，但是RGK作为遗传编码的HVACC抑制剂的功用被潜在的脱靶效应搅乱，因为它们与其他结合伙伴例如细胞骨架蛋白、14-3-3、钙调蛋白和CaM激酶II相互作用并且调节它们(Yang和Colecraft,2013；Correll等人,2008；Royer等人,2018；Béguin等人,2005；Ward等人,2004)。一个关键的未满足的需要是开发遗传编码的HVACC抑制剂，其具有高的RGK效力，但没有成问题的与其他信号传导蛋白的相互作用。本公开内容通过下述方式而达成了该目标：将E3泛素连接酶(神经前体细胞在发育上被下调的蛋白4(neural precursor cell developmentally down-regulated protein 4；Nedd4-2或此后称为Nedd4L))的E6-AP羧基末端(HECT)催化结构域的同源物与CaVβ-靶向的纳米抗体相融合。所得的构建体(命名为CaV-消融剂)在重构的系统和天然的可兴奋细胞中都消除各种各样的HVACC，从而提供了独特的新工具用于在体内探查CaV1/CaV2信号传导和调节，并且可能开发成治疗剂。
泛素(Ub)是一种小的9kD的蛋白质，其作为翻译后修饰而共价附着至靶蛋白质。胞质溶胶Ub转移到蛋白质上是一个多步骤反应，其以介导Ub附着的最后步骤的称为E3泛素连接酶的一类酶结束。在人类基因组中存在超过600种E3泛素连接酶；该多样性可以部分地通过泛素密码子的多样性质来解释：Ub链通过随后将Ub添加到与靶蛋白质相结合的现存Ub上来形成。出现了复杂性，因为Ub本身具有7个可以潜在地被泛素化的赖氨酸残基(以及其N-末端甲硫氨酸)。所得的多聚泛素链的形状可以改变靶蛋白质的下游命运。例如，在体外已证明K48 E3连接酶将Ub添加到现存Ub的第48位残基上，形成K48多聚泛素链，其已被表征为关于靶蛋白质的蛋白体降解的信号。已经表征了关于泛素的另外的信号传导作用，例如协调质膜蛋白质的胞吞作用的K63分支。特别地，已充分表征了HECT家族连接酶Nedd4-2靶向质膜，在那里它介导许多包含PY的跨膜蛋白质例如ENaC、KCNQ1和NaV1.5的胞吞作用和最终溶酶体降解。
本公开内容尤其提供了用于遗传编码HVACC抑制剂的策略，从而提供了用于通过利用泛素途径来将疗法在空间上限制于某个组织或细胞群体的工具。根据一些实施方案，本公开内容的某些方面靶向β亚基并且利用泛素途径来从细胞表面上移除HVACC。
在一些实施方案中，本公开内容包含两个要素：1)新型纳米抗体，其能够结合所有四种CaVβ辅助亚基，并且连接至2)E3泛素连接酶的催化结构域。在一些实施方案中，不是物理地阻断通道发挥其功能，而是将通道从其功能目的地(质膜)移除。在一些实施方案中，以遗传编码的方式将通道从其功能目的地移除，从而允许用(但不限于)转染或基于病毒载体的方法取得细胞特异性。在一些实施方案中，利用在所有真核细胞中都存在的泛素信号传导系统，以便重新引导泛素化，和因此HVACC的功能敲低。
为了将泛素机器引导至HVACC，在一些实施方案中，本公开内容提供了针对HVACC的辅助性β亚基(CaVβ)而产生的纳米抗体。如在本文中所使用的，术语“纳米抗体(nanobody)”意指源自一类具有小尺寸(常规抗体的尺寸的1/10)的骆驼科动物抗体的小的抗体片段。根据一些实施方案，所述纳米抗体适合于遗传工程，并且进一步地他们能够用单个可变重链结合其抗原，从而赋予它们以在活细胞的还原环境内的独特稳定性。根据一些实施方案，本公开内容提供了在CaVβ纳米抗体上的HECT结构域E3泛素连接酶Nedd4-2的经改造的催化结构域，以产生遗传编码的钙通道阻断剂。在一些实施方案中，通过改造在纳米抗体上的泛素连接酶(包括但不限于Nedd4-2)的催化结构域，靶向了β辅助亚基的泛素化，这对于向质膜的正确的HVACC运输是必需的。在一些实施方案中，该靶向足以取消一些(包括少数，多数，甚至全部)HVACC的表面水平。在一些实施方案中，本公开内容提供了遗传编码的钙通道阻断剂。在一些实施方案中，本公开内容的钙通道阻断剂以在空间上确定的方式阻断HVACC。
根据一些实施方案，本公开内容提供了用于通过与典型的HVACC阻断剂根本不同的机制来阻断所有HVACC的新型工具。在一些实施方案中，本公开内容的HVACC阻断剂可以用于治疗糖尿病和帕金森病，并且用作用于许多疾病的基因疗法方法。在一些实施方案中，本公开内容进行了遗传编码以在空间上准确地进行递送，从而使脱靶效应最小化。
根据一些实施方案，本公开内容提供了识别一些或所有CaVβ亚基的纳米抗体，从而使得能够靶向内源性HVACC。在一些实施方案中，将E3泛素连接酶Nedd4-2的催化亚基与纳米抗体一起进行使用。
根据一些实施方案，本公开内容提供了：1)用于在无需几种药理学试剂(包括昂贵的源自毒液的肽)的情况下阻断所有HVACC以取得相似功能效果的工具；2)用于取得HVACC阻断的遗传编码的工具，其可以靶向特殊组织并且可以经由腺病毒/AAV或转染方法进行递送，从而提供用于靶向特定组织的工具；3)通过选择性地靶向介导疼痛感觉的神经元群体的基因疗法；和4)可以用于将其他活性蛋白质部分靶向HVACC的纳米抗体归巢装置。
根据一些实施方案，本公开内容提供了遗传编码的HVACC阻断剂(与几种昂贵的药理学试剂不同)。在一些实施方案中，本公开内容提供了用于在特定细胞群体中选择性地下调HVACC的功能的基因疗法。
特别地，开发了二十五种独特的CaVβ-靶向的纳米抗体，并且基于在互补性决定区域(CDR1-3)(抗原结合的主要决定子)内的独特序列进行了鉴定。这些纳米抗体可以被掺入CaV通道复合物中但是其在功能上是沉默的，并由此充当用于潜在地将不同的酶部分或感受器指引至内源性通道的运载体。
因此，本公开内容的一个实施方案为能够与CaVβ辅助亚基相结合的纳米抗体，其包含SEQ ID NO:1-3、SEQ ID NO:5-7、SEQ ID NO:9-11、SEQ ID NO:13-15、SEQ ID NO:17-19、SEQ ID NO:21-23、SEQ ID NO:25-27、SEQ ID NO:29-31、SEQ ID NO:33-35、SEQ ID NO:37-39、SEQ ID NO:41-43、SEQ ID NO:45-47、SEQ ID NO:49-51、SEQ ID NO:53-54、SEQ IDNO:56-57、SEQ ID NO:59-61、SEQ ID NO:63-65、SEQ ID NO:67-69、SEQ ID NO:71-73、SEQID NO:75-77、SEQ ID NO:79-81、SEQ ID NO:83-85、SEQ ID NO:87-89、SEQ ID NO:91-93或SEQ ID NO:95-97。
在一些实施方案中，所述纳米抗体包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:38、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:55、SEQ IDNO:58、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:78、SEQ IDNO:82、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:94或SEQ ID NO:98。
本公开内容的另一个实施方案为组合物，其包含：(i)在本文中所公开的纳米抗体；和(ii)与所述纳米抗体可操作地相连的E3泛素连接酶的催化结构域。在该情景下，术语“可操作地相连”意指，一个功能通过在例如单个多肽上与多肽序列的联合而被另一个事物所调节。
在一些实施方案中，所述组合物对于将高电压激活钙通道(HVACC)从其在细胞质膜上的功能位置处移除来说是有效的。在一些实施方案中，所述HVACC选自由下列各项组成的组：CaV1.1、CaV1.2、CaV1.3、CaV1.4、CaV2.1、CaV2.2、CaV2.3及其组合。在一些实施方案中，所述HVACC为CaV1.2、CaV1.3、CaV2.1和CaV2.3中的一种或多种。在一些实施方案中，所述组合物对于实现所述HVACC的功能敲低来说是有效的。在一些实施方案中，所述E3泛素连接酶包含Nedd4-2的催化结构域。在一些实施方案中，所述组合物对于削弱CaVβ辅助亚基将所述HVACC运输至质膜的功能来说是有效的。在一些实施方案中，所述组合物对于取消一些(包括少数，多数，甚至所有)HVACC的表面水平来说是有效的。在一些实施方案中，所述组合物对于降低或消除HVACC电流来说是有效的。
本公开内容的另一个实施方案为组合物，其包含遗传编码的钙通道阻断剂，所述遗传编码的钙通道阻断剂包含编码下列组分的核酸：(i)在本文中所公开的纳米抗体；和(ii)E3泛素连接酶的催化结构域。
在一些实施方案中，所述E3泛素连接酶包含Nedd4-2的催化结构域。在一些实施方案中，所述纳米抗体和所述E3泛素连接酶的催化结构域是可操作地相连的，即在功能上相连接的。在该情景下，术语“可操作地相连”意指，一个功能通过在例如单个多核苷酸上与多核苷酸序列的联合而被另一个事物所调节。在一些实施方案中，表达所述纳米抗体和所述E3泛素连接酶的催化结构域以形成连续多肽。在一些实施方案中，所述连续多肽对于将高电压激活钙通道(HVACC)从其在细胞质膜上的功能位置处移除来说是有效的。在一些实施方案中，所述HVACC选自由下列各项组成的组：CaV1.1、CaV1.2、CaV1.3、CaV1.4、CaV2.1、CaV2.2、CaV2.3及其组合。在一些实施方案中，所述HVACC为CaV1.2、CaV1.3、CaV2.1和CaV2.3中的一种或多种。在一些实施方案中，所述连续多肽对于实现在细胞中HVACC的功能敲低来说是有效的。在一些实施方案中，所述连续多肽对于削弱(例如，降低或取消)CaVβ辅助亚基将HVACC运输至质膜的功能来说是有效的。在一些实施方案中，所述连续多肽对于取消所有HVACC的表面水平来说是有效的。在一些实施方案中，所述连续多肽对于降低或消除HVACC电流来说是有效的。在一些实施方案中，编码(i)和(ii)的核酸被携带于表达载体上。在一些实施方案中，所述表达载体进一步包含组织特异性启动子。
本公开内容的一个进一步的实施方案为在细胞中阻断高电压激活钙通道(HVACC)的方法，其包括使所述细胞与有效量的在本文中所公开的组合物相接触。
在一些实施方案中，所述细胞为神经元或心肌细胞。
本公开内容的另一个实施方案为选择性地靶向受试者中的细胞群体的方法，其包括向所述受试者施用有效量的在本文中所公开的组合物。
在一些实施方案中，所述细胞为介导疼痛感觉的神经元，或心肌细胞。
在一些实施方案中，所述受试者为哺乳动物。在一些实施方案中，所述受试者为人。
本公开内容的另一个实施方案为用于在细胞中可诱导地抑制高电压激活钙通道(HVACC)的组合物，其包含：(i)在本文中所公开的纳米抗体；和(ii)与所述纳米抗体可操作地相连的来自蛋白激酶Cγ的C1结构域(C1PKC)；其中所述组合物对于在用佛波醇-12,13-二丁酸酯(PdBu)进行诱导后使所述HVACC失活来说是有效的。在本公开内容中，所述蛋白激酶Cγ的C1结构域可以通过使用已知的诱导试剂(例如佛波醇酯，包括PdBu)来诱导。虽然在本文中例示了PdBu，但是也可以使用其他的蛋白激酶Cγ诱导试剂，包括但不限于例如苔藓抑制素1、巨大戟二萜醇-3-当归酸酯(I3A，PEP005)、佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)、prostratin、SC-9、SC-10、1-油酰基-2-乙酰基-sn-甘油、(-)-吲哚内酰胺V、巨大戟二萜醇、1-硬脂酰基-2-花生四烯酰基-sn-甘油。
在一些实施方案中，所述组合物对于实现所述HVACC的功能敲低来说是有效的。在该情景下，术语“功能敲低”意指使用试剂例如根据本公开内容的组合物来造成HVACC的正常功能(包括例如，使神经元兴奋，释放神经递质、激素，或者起始骨骼肌和心肌两者的收缩等)的短暂丧失。HVACC的“功能敲低”可以通过常规技术例如RT-qPCR来进行定量。
本公开内容的另外一个实施方案为组合物，其包含遗传编码的诱导型钙通道阻断剂，所述遗传编码的诱导型钙通道阻断剂包含编码下列组分的核酸：(i)在本文中所公开的纳米抗体；和(ii)与所述纳米抗体可操作地相连的来自蛋白激酶Cγ的C1结构域(C1PKC)。
在一些实施方案中，表达所述纳米抗体和所述C1结构域以形成连续多肽。在一些实施方案中，编码(i)和(ii)的核酸被携带于表达载体上。在一些实施方案中，所述表达载体进一步包含组织特异性启动子。在本公开内容中，非限制性的示例性的组织特异性启动子包括例如，天然启动子例如B29启动子、CD14启动子、CD43启动子、CD45启动子、CD68启动子、结蛋白启动子、弹性蛋白酶-1启动子、内皮糖蛋白启动子、纤连蛋白启动子、flt-1启动子、GFAP启动子、GPIIb启动子、ICAM-2启动子、小鼠INF-β启动子、Mb启动子、NpshI启动子、OG-2启动子、SP-B启动子、SYN-1启动子、WASP启动子，和复合启动子例如SV40/bAIb启动子、SV40/hAIb启动子、SV40/CD43启动子、SV40/CD45启动子、NSE/RU5’启动子。
本公开内容的另一个实施方案为在细胞中阻断高电压激活钙通道(HVACC)的方法，其包括下列步骤：(i)使所述细胞与有效量的在本文中所公开的组合物相接触；和(ii)使所述细胞与蛋白激酶Cγ诱导试剂例如佛波醇-12,13-二丁酸酯(PdBu)相接触；其中步骤(i)和(ii)的接触对于将所述HVACC从其在细胞质膜上的功能位置处移除来说是有效的。如在本文中所使用的，术语“阻断”意指部分地或完全地干扰HVACC以便取得所希望的临床效果。
在一些实施方案中，所述细胞为神经元或心肌细胞。
本公开内容的另外一个实施方案为用于治疗或改善在受试者中疾病的影响的方法，其包括向所述受试者施用有效量的在本文中所公开的组合物。
在一些实施方案中，所述受试者为哺乳动物。在一些实施方案中，所述受试者为人。
在一些实施方案中，所述疾病与高电压激活钙通道(HVACC)的失调相关联。在一些实施方案中，所述HVACC选自由下列各项组成的组：CaV1.1、CaV1.2、CaV1.3、CaV1.4、CaV2.1、CaV2.2、CaV2.3及其组合。在一些实施方案中，所述HVACC为CaV1.2、CaV1.3、CaV2.1和CaV2.3中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述疾病选自由下列各项组成的组：心血管疾病、神经病学疾病及其组合。心血管疾病的非限制性例子包括：心绞痛、心肌梗死、中风、心力衰竭、高血压、心律失常、脑血管痉挛、风湿性心脏病、心肌病、异常心节律、先天性心脏病、瓣膜性心脏病、心脏炎、心内膜炎、心肌炎、嗜酸性粒细胞性心肌炎、主动脉瘤、外周动脉疾病、血栓栓塞性疾病、静脉血栓形成及其组合。在一些实施方案中，所述心血管疾病选自由下列各项组成的组：高血压、心律失常、脑血管痉挛及其组合。
神经病学疾病的非限制例子包括：癫痫、慢性疼痛、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、阿尔茨海默病、动脉瘤、背痛、贝尔麻痹、脑和脊髓的出生缺陷、脑损伤、脑肿瘤、脑性瘫痪、慢性疲劳综合征、震伤、痴呆、颈和腰的椎间盘疾病、头晕、吉-巴综合征、头痛和偏头痛、多发性硬化、肌营养不良、神经痛、神经病、神经肌肉及相关疾病、严重抑郁、强迫症、脊柱侧凸、癫痫发作、脊髓损伤、脊柱畸形和病症、脊柱肿瘤、中风、眩晕及其组合。在一些实施方案中，所述神经病学疾病选自由下列各项组成的组：癫痫、慢性疼痛、帕金森病及其组合。
如在本文中所使用的，术语“治疗”及其语法变化形式意指使个体受试者经历这样的方案、制度、过程或治疗法，其中希望在那个受试者例如患者中获得生理学应答或结果。特别地，本公开内容的方法和组合物可以用于减缓疾病症状的发展或者延迟所述疾病或状况的开始，或者使疾病发展的进程停止。然而，因为每个经治疗的受试者可以对于特殊的治疗方案、制度、过程或治疗法不发生应答，因此治疗并不要求在每个受试者或受试者群体(例如患者群体)中取得所希望的生理学应答或结果。因此，给定的受试者或受试者群体(例如患者群体)可以对治疗没有应答或应答不足。
如在本文中所使用的，术语“改善”及其语法变化形式意指降低在受试者中疾病症状的严重性。
如在本文中所使用的，“受试者”为哺乳动物，优选地人。除了人之外，在本公开内容的范围内的哺乳动物类别包括例如农业动物、兽医学动物、实验室动物等。农业动物的一些例子包括牛、猪、马、山羊等。兽医学动物的一些例子包括狗、猫等。实验室动物的一些例子包括灵长类动物、大鼠、小鼠、兔子、豚鼠等。
如在本文中所使用的，术语“接触”意指使组合物和任选地一种或多种另外的治疗试剂与需要调节例如阻断或抑制HVACC活性的细胞密切接近。这可以通过使用向受试者递送药物的常规技术，或者在体外情况下通过例如向细胞所位于其中的培养基提供所述化合物和任选地其他治疗试剂来完成。
在本公开内容中，组合物的“有效量”或“治疗有效量”是此类组合物的这样的量，所述量在当向受试者施用或与细胞相接触时足以实现在本文中所描述的有益的或所期望的结果。有效剂型、施用方式和用药量可以凭经验来确定，并且做出这样的决定是在本领域技术的范围之内。本领域技术人员将会理解，用药量将会随施用途径，排泄速率，治疗持续时间，正在施用的任何其他药物的身份，受试者的年龄、尺寸和物种，以及例如医学和兽医学领域中熟知的类似因素而变化。通常，根据本公开内容的组合物的合适剂量将会是所述组合物的这样的量，其是对于产生所希望的效应(没有或具有最小的副作用)来说有效的最低剂量。根据本公开内容的组合物的有效剂量可以作为在整个一天中以适当间隔分开施用的两个、三个、四个、五个、六个或更多个亚剂量来进行施用。
根据本公开内容的组合物的用量的合适的、非限制性的例子为大约1ng/kg至大约1000mg/kg，例如大约1mg/kg至大约100mg/kg，包括大约5mg/kg至大约50mg/kg。本公开内容的组合物的其他代表性用量包括大约1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、60mg/kg、70mg/kg、80mg/kg、90mg/kg、100mg/kg、125mg/kg、150mg/kg、175mg/kg、200mg/kg、250mg/kg、300mg/kg、400mg/kg、500mg/kg、600mg/kg、700mg/kg、800mg/kg、900mg/kg或1000mg/kg。
本公开内容的组合物可以以任何所希望的和有效的方式进行施用：用于口服摄入，或者作为用于向眼睛局部施用的软膏或滴剂，或者用于以合适的方式(例如，腹膜内、皮下、局部、真皮内、吸入、肺内、直肠、阴道、舌下、肌内、静脉内、动脉内、鞘内或淋巴管内)的肠胃外或其他施用。进一步地，可以将本公开内容的组合物与其他治疗相联合地进行施用。可以对本公开内容的组合物进行包囊或者针对胃或其他分泌物进行保护(如果希望)。
提供下面的实施例以进一步举例说明本公开内容的方法。这些实施例仅是举例说明性的而不意在以任何方式限制本公开内容的范围。
实施例
实施例1
材料和方法
蛋白质纯化
使用BacMam表达系统来纯化CaVβ1B和CaVβ3(Goehring等人,2014)。简而言之，使用BamHI和EcoRI位点，将全长CaVβ1b和CaVβ3克隆入经修饰的带有C-末端FLAG标签的pEGBacMam载体中。随后在Sf9细胞中产生BacMam病毒并且在三轮扩增后收获之。使用100mL的BacMam病毒来感染1L的HEK293 GnTI-细胞(N-乙酰葡糖胺转移酶I-阴性)并且在37℃下保持摇动。在18小时后，用10mM丁酸钠刺激细胞并且在72小时后收获之。使用AvestinEmulsiflex-C3匀浆器在包含50mM Tris、150mM KCl、10％蔗糖、1mM PMSF(苯甲基磺酰氟)和无EDTA的完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche)的缓冲液(pH 7.4)中裂解细胞。将裂解物以35,000g旋转离心1小时。随后用抗-FLAG抗体(M2)亲和色谱法从上清液中分离出CaVβ，并且用在50mM TrisHCl,150mM KCl,pH 7.4中的100μg/mL FLAG肽(Sigma Millipore)进行洗脱。然后，将蛋白质施加至离子交换柱(MonoQ,GE)并且用50mM至1M的线性KCl梯度进行洗脱。收集峰级分并且使其在包含20mM Tris、150mM KCl的缓冲液(pH 7.4)中经历大小排阻色谱法(Superdex 200,GE)。将蛋白质带至20％甘油，快速冷冻，并且贮存于-80℃。
对于等温滴定量热法实验，将CaVβ2b和nb.F3都通过Gibson组装(Gibson等人,2009)克隆入IPTG(异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷)可诱导的、卡那霉素抗性的pET衍生质粒(Novagen,Madison,Wisconsin)中(具有N-末端十组氨酸标签(His10))，并且遵循制造商的说明书转化入Rosetta DE3大肠杆菌(Millipore Sigma)中。使细胞在37℃下在1L2xTY培养基(其补充有50μg/mL羧苄青霉素和35μg/mL氯霉素)中生长并且在225rpm下摇动。当细胞达到0.6-0.8的OD时，用0.2mM IPTG诱导蛋白质表达。然后，使细胞在22℃下生长过夜。
如先前所描述的(McMahon等人,2018)那样来纯化nb.F3：简而言之，收获细胞，并且将其重悬浮在100mL的包含(mM)500蔗糖、200Tris(pH 8)、0.5EDTA的缓冲液中并且通过在搅拌下添加200mL水来进行渗透压休克。将裂解物带至(mM)150NaCl、2MgCl2和20咪唑的浓度，并且在4℃下以20,000g离心30分钟。将上清液与2mL Ni-NTA Sepharose树脂(Qiagen)分批组合，用70mM咪唑进行洗涤，并且用350mM咪唑进行洗脱。将洗出液透析入包含150mM NaCl、10mM HEPES的缓冲液(pH 7.4)中并且用S200大小排阻柱(GE Healthcare)进行纯化。
对于CaVβ2b的纯化，使细胞形成粒状沉淀，并且重悬浮在包含(mM)300NaCl、20TrisHCl、10％甘油、0.5PMSF和无EDTA的完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche)的缓冲液(pH 7.4)中。使用Avestin Emulisflex-C3匀浆器来裂解细胞并且将其以35,000g旋转离心30分钟。将溶解的蛋白质施加至Ni-NTA Sepharose(Qiagen)并且纯化为nb.F3。
纳米抗体产生
对美洲驼进行免疫接种，其中进行600μg经纯化的CaVβ1b和CaVβ3的初始注射，并且进行每隔一周施用的200ug每种蛋白质的四次加强免疫(Capralogics Inc,Hardwick,MA)。在首次免疫接种后87天，从血液中分离淋巴细胞并且用ProtoScript II逆转录酶(NewEngland Biolabs)构建cDNA文库。如先前所描述的(Pardon等人,2014)那样来分离纳米抗体，其中使用两步骤巢式PCR。将经扩增的Vhh基因克隆入噬菌粒质粒pComb3xSS中。使用电感受态TG1大肠杆菌细胞(Lucigen)来创建噬菌体展示文库。如先前所描述的(Pardon等人,2014)那样来进行三轮噬菌体展示，其中在包被有中性抗生物素蛋白(neutravidin)的Nunc-Immuno平板(Thermo Scientific)上使用100nM经生物素化的CaVβ3作为诱饵。随后将目的克隆克隆入哺乳动物表达系统中以用于进一步研究(见下面)。
等温滴定量热法
使用MicroCal Auto iTC 200(Malvern Panalytical)在25℃下进行等温滴定量热法测量。将样品透析入300mM NaCl,20mM HEPES,5％甘油,pH 7.5中，并且事先进行过滤。将2μL nb.F3注射入400μL的CaVβ2b中。数据用MicroCal Origin 7.0进行处理。
分子生物学和质粒构建
用位于其保守的构架(FW)区FW1和FW4侧翼的引物来对潜在的nb进行PCR扩增，并且使用HindIII和EcoRI位点将其插入哺乳动物表达质粒pcDNA3(Invitrogen)中。在PCR中包括额外的GSG连接体，并且将插入片段连接在增强型CFP和人PKCγ的C1结构域(残基51-180)的上游。
PCR扩增大鼠CaVβ1b以用于随后的与YFP的重叠PCR，其中在这两个蛋白质之间插入GSG连接体。将所得的CaVβ1b-GSG-YFP序列用BamHI和NotI进行消化并且连接入PiggyBacCMV哺乳动物表达载体(System Biosciences)中。对于CaVβ3和CaVβ4，使用相似的克隆策略。与N-末端YFP一起PCR扩增大鼠CaVβ2a以防止β2a亚基的棕榈酰化(Chien等人,1996)并且以相似的策略进行插入。
在pUC57载体中合成定制的双顺反子载体(xx-P2A-CFP)，其中将P2A肽的编码序列夹在上游多克隆位点和增强型青色荧光蛋白(CFP)(Genewiz)之间。通过PCR来扩增xx-P2A-CFP片段并且使用NheI/NotI位点克隆入PiggyBac CMV哺乳动物表达载体(SystemBiosciences)中。为了产生nb.F3-P2A-CFP，我们PCR扩增了nb.F3的克隆序列并且使用NheI/AflII位点将其克隆入xx-P2A-CFP中。在PiggyBac CMV哺乳动物表达载体中创建相似的骨架，其中CFP-P2A-xx包含在P2A位点下游的多克隆位点(Genewiz)。PCR扩增nb.F3并且用BglII/AscI位点连接入该载体中。PCR扩增由残基594-974组成的人Nedd4L的HECT结构域(Gao等人,2009)并且使用AscI/AgeI位点插入在nb.F3的下游。使用位点定向诱变来完成C942S的诱变。
获得了在结构域IV S5-S6细胞外环中具有两个串联的13残基银环蛇毒素结合位点(SWRYYESSLEPYPD)的α1B-BBS。α1C和α1C-BBS，和α1C-BBS-YFP先前已作过描述(Yang等人,2010；Kanner等人,2017)。
细胞培养和转染
获得人胚肾(HEK293)细胞。细胞是无支原体的，如通过MycoFluor支原体检测试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA)所测定的。将低传代HEK293细胞在37℃下在补充有5％胎牛血清(FBS)和100mg/mL的青霉素-链霉素的DMEM中进行培养。使用磷酸钙沉淀法来完成HEK293细胞转染。简而言之，将质粒DNA与7.75μL的2M CaCl2和无菌去离子水相混合(至62μL的最终体积)。将混合物逐滴地、不断轻敲地添加至62μL的包含(以mM)下列成分的2xHepes缓冲盐水中：Hepes 50、NaCl 280、Na2HPO4 1.5，pH 7.09。将所得的DNA-磷酸钙混合物在室温下温育20分钟，然后逐滴添加至HEK293细胞(60-80％汇合)。在4-6小时后用无Ca2+的磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞并且将其维持在经补充的DMEM中。
成年豚鼠心肌细胞的分离按照哥伦比亚大学动物护理和使用委员会(ColumbiaUniversity Animal Care and Use Committee)的指南来进行。在分离之前，用15μg/mL层粘连蛋白(Gibco)预包被铺板平皿。用5％异氟烷麻醉成年雌性Hartley豚鼠(CharlesRiver)，切下心脏，并且分离心室肌细胞，这通过使用Langendorff灌注设备首先在KH溶液(mM)：118NaCl、4.8KCl、1CaCl2、25HEPES、1.25K2HPO4、1.25MgSO4、11葡萄糖、.02EGTA(pH7.4)中，随后在没有钙的KH溶液中进行灌注来施行。在没有钙的KH缓冲液中进行采用0.3mg/mL 4型胶原酶(Worthington)以及0.08mg/mL蛋白酶和.05％BSA的酶促消化六分钟。在消化后，通过心脏灌注40mL的高K+溶液(mM)：120谷氨酸钾、25KCl、10HEPES、1MgCl2和.02EGTA，pH 7.4。随后将细胞分散在高K+溶液中。将健康的杆状肌细胞在补充有(mM)下列成分的培养基199(Life Technologies)中进行培养以促进附着至平皿：10HEPES(Gibco)、1x MEM非必需氨基酸(Gibco)、2L-谷氨酰胺(Gibco)、20D-葡萄糖(Sigma Aldrich)、1％(vol vol-1)青霉素-链霉素-谷氨酰胺(Fisher Scientific)、.02mg/mL维生素B-12(SigmaAldrich)和5％(vol/vol)FBS(Life Technologies)。在5小时后，将培养基转换至具有1％(vol/vol)血清但在其他方面如上面所描述的那样进行补充的培养基199。将培养物维持在处于37℃和5％CO2下的经加湿的培养箱中。
获得鼠类背根神经节(DRG)神经元。如先前所描述的(Albuquerque等人,2009)那样来分离DRG神经元。将DRG神经元铺在包被有15μg/mL层粘连蛋白(Corning)的玻璃盖玻片上，并且维持在补充有1x B-27(Thermo Fisher Scientific)、100μg mL-1青霉素/链霉素(Fisher Scientific)、0.29mg/mL L-谷氨酰胺(Gibco)、50ng mL-1NGF(Sigma Aldrich)、2ng mL-1GDNF(Sigma Aldrich)和10μMβ-D-阿拉伯呋喃糖胞苷(Sigma Aldrich)的Neurobasal培养基(Thermo Fisher Scientific)中。
胰腺β细胞分离和培养
获得来自与Rosa26-tdTomato(Jackson Laboratories Stock#007909)小鼠杂交的Rip-Cre(Jackson Laboratories Stock#003573)小鼠的鼠类胰腺β-细胞。如先前所描述的(Stull等人,2012)那样来分离胰岛，用0.05％胰蛋白酶EDTA(Gibco)进行分散，并且铺在用10mg/mL纤连蛋白(Sigma Aldrich)预包被的具有10mm微孔的35mm玻璃底平皿(Cellvis)上。将胰岛维持在补充有15％FBS和100μg mL-1青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基(Corning)中。在腺病毒感染后24-48小时对胰岛进行成像。
腺病毒产生
如先前所描述的(Kanner等人,2017；Subramanyam,2013)那样，使用pAdEasy系统(Stratagene)，按照制造商的说明书来产生表达GFP和CFP-P2A-nb.F3-Nedd4L[C942S]的腺病毒载体。用PmeI将包含关于CFP-P2A-nb.F3-Nedd4L[C942S]的cDNA的质粒穿梭载体(pShuttle CMV)线性化，并且电穿孔入用pAdEasy-1病毒质粒(Stratagene)预先转化的BJ5183-AD-1电感受态细胞中。将PacI限制酶切消化用于鉴定重组成功的转化体。使用XL-10-Gold细菌来扩增阳性重组体，并且通过PacI消化来使重组腺病毒质粒DNA线性化。用经PacI消化的经线性化的腺病毒DNA转染以70-80％汇合在60mm直径平皿中培养的HEK细胞。就致细胞病变效应(CPE)和腺病毒空斑来监测经转染的平板。收获细胞并且使其经历三个连续的冷冻-解冻循环，随后进行离心(2,500×g)以去除细胞碎片。将上清液(2mL)用于感染10cm平皿的90％汇合的HEK293细胞。在2-3天后观察到CPE之后，将细胞上清液用于再次感染HEK293细胞的新平板。病毒扩展和纯化如以先所描述的(Colecraft等人,2002)那样来进行。简而言之，用如上面所描述的那样获得的病毒上清液(1mL)感染在15cm培养平皿(x8)上生长的汇合的HEK293细胞。在48小时后，收获来自所有平板的细胞，通过离心形成粒状沉淀，并且重悬浮在8mL的包含(以mM)20Tris HCl、1CaCl2和1MgCl2的缓冲液(pH 8)中。通过四次连续的冷冻-解冻循环来使细胞裂解，并且通过离心来使细胞碎片形成粒状沉淀。将负载有病毒的上清液通过分层堆积三个密度的CsCl(1.25、1.33和1.45g/mL)在氯化铯(CsCl)不连续梯度上进行纯化。在离心(50,000rpm；SW41Ti转子，Beckman-Coulter Optima L-100K超离心机；1小时，4℃)后，移除在1.33和1.45g/mL层之间的界面处的病毒带，并且逆PBS进行透析(12小时，4℃)。将腺病毒载体等分试样在10％甘油中于-80℃进行冷冻直至使用。CFP-P2A-nb.F3-Nedd4L的产生由Vector Biolabs(Malvern,PA)来进行。
总和表面钙通道的流式细胞术测定法
如先前所描述的(Kanner等人,2017；Aromolaran等人,2014)那样，通过流式细胞术在活的、经转染的HEK293细胞中测定细胞表面和总离子通道池。简而言之，在转染后48小时，用包含Ca2+和Mg2+的冰冷PBS(以mM：0.9CaCl2,0.49MgCl2,pH 7.4)温和地洗涤在12-孔平板中培养的细胞，然后在4℃下在封闭培养基(具有3％BSA的DMEM)中温育30分钟。然后，在摇摆器上在4℃下在DMEM/3％BSA中与1μM的缀合有Alexa Fluor 647的α-银环蛇毒素(BTX647；Life Technologies)一起将HEK293细胞温育1小时，随后用PBS(包含Ca2+和Mg2+)洗涤三次。将细胞温和地收获在无Ca2+的PBS中，并且使用BD Fortessa细胞分析仪(BDBiosciences,San Jose,CA,USA)通过流式细胞术来进行检定。带有CFP和YFP标签的蛋白质分别在407和488nm处被激发，而Alexa Fluor 647在633nm处被激发。
电生理学
使用由Pulse软件(HEKA)控制的EPC-10膜片钳放大器(HEKA Electronics)，在转染后48小时进行HEK293细胞的全细胞记录。使用P97微电极拉制器(Sutter Instruments)从1.5mm薄壁玻璃(World Precision Instruments)制备微量移液管。内部溶液包含(mM)：135甲磺酸铯(CsMeSO3)、5CsCl、5EGTA、1MgCl2、2MgATP和10HEPES(pH 7.3)。系列电阻通常为1-2MΩ。不存在电子电阻补偿。外部溶液包含(mM)：140四乙铵-MeSO3、5BaCl2和10HEPES(pH7.4)。从一组阶跃去极化(-60mV至+80mV，来自-90mV的保持电位)产生全细胞I-V曲线。将电流在20kHz处进行采样并且在5kHz处进行过滤。以10秒的重复间隔获取迹线。通过使用P/4方案来减去泄露和电容暂态电流。
在感染后48小时进行心肌细胞和DRG神经元的全细胞记录。将HEK细胞内部和外部溶液用于DRG实验。对于豚鼠心肌细胞的全细胞记录使用包含(mM)下列成分的内部溶液：150CsMeSO3、10EGTA、5CsCl、MgCl2、4MgATP和10HEPES。对于千兆欧姆密封的形成和向全细胞构造的初始突入，将细胞在包含(mM)下列成分的Tyrode溶液中进行灌注：138NaCl、4KCl、2CaCl2、1MgCl2、0.33NaH2PO4和10HEPES(pH 7.4)。在成功突入后，将灌注介质转换至包含(mM)下列成分的外部溶液：155N-甲基-D-葡糖胺、10 4-氨基吡啶、1MgCl2、5BaCl2和10HEPES(pH 7.4)。将电流在20kHz处进行采样并且在5kHz处进行过滤。通过使用P/4方案来减去泄露和电容暂态电流。
免疫荧光染色
腺病毒感染后大约48小时，在室温下在4％低聚甲醛(wt/vol,在PBS中)中固定豚鼠心肌细胞20分钟。用PBS洗涤细胞两次，然后在室温下在0.1M甘氨酸(在PBS中)中温育10分钟以封闭游离的醛基团。然后，将经固定的细胞在室温下用0.2％Triton X-100(在PBS中)渗透化20分钟。通过在室温下在包含3％(vol vol-1)正常山羊血清(NGS)、1％BSA和0.1％Triton X-100的PBS溶液中温育1小时来封闭非特异性结合。然后，将细胞与在包含1％NGS、1％BSA和0.1％BSA的PBS中的一抗一起在4℃下温育过夜。用具有0.1％Triton X-100的PBS洗涤细胞三次(每次10分钟)，然后用二抗在室温下染色1小时。在包含1％NGS、1％BSA和0.1％Triton X-100的PBS溶液中制备抗体稀释物。然后，将细胞在具有0.1％TritonX-100的PBS中进行洗涤并且在相同溶液中进行成像。一抗和工作稀释度如下：α1C：Alomone，1:1000；UC Davis/NIH NeuroMab Facility，克隆N263/31，1:200。RyR：Sigma Aldrich，1:1000。CaVβ2：Alomone，1:200。Rab7：Cell Signaling Technology，1:100。Rab5：CellSignaling Technology，1:200。Lamp1：Developmental Studies Hybridoma Bank，由NIH的NICHD创建并维持于The University of Iowa,Department of Biology,Iowa City,IA52242，1:100。以1:1000的稀释度使用二抗(Thermofisher)。
共聚焦显微术
将细胞铺在35mm MatTek成像平皿(MatTek Corporation)上。在Nikon A1RMP共聚焦显微镜上用40x油浸物镜(1.3N.A.)来捕获图像。分别使用458、488、514和639nm激光线来对CFP、Alexa-488、YFP和Alexa-647进行成像。
Pulldown测定法
将在60mm平皿中培养的经转染的HEK293细胞收获于PBS中，以2,000g(4℃)离心5分钟，将粒状沉淀重悬浮在RIPA裂解缓冲液中，该RIPA裂解缓冲液包含(mM)：150NaCl、20Tris HCl、1EDTA、0.1％(wt vol-1)SDS、1％Triton X-100、1％脱氧胆酸钠，并且补充有蛋白酶抑制剂混合物(10μL mL-1，Sigma Aldrich)、1PMSF、2N-乙基马来酰亚胺、.05PR-619脱泛素酶抑制剂(LifeSensors)。在冰上裂解细胞1小时(其中间歇式地涡旋振荡)并且以10,000g离心10分钟(4℃)。收集可溶性裂解物并且用双金鸡纳酸蛋白质估计试剂盒(PierceTechnologies)来测定蛋白质浓度。
对于CaVβ1b Pulldown，在4℃下用10μL的蛋白A/G Sepharose珠粒(Rockland)来使裂解物预澄清1小时，然后在4℃下与2μg抗-CaVβ1抗体(UC Davis/NIH NeuroMab Facility，克隆N7/18)一起温育1小时。然后，将等量的蛋白质添加至具有25μL经平衡的蛋白A/GSepharose珠粒的旋转离心柱并且在4℃下旋转过夜。用RIPA缓冲液洗涤免疫沉淀物共五次，然后用30μL洗脱缓冲液(50mM Tris、10％(vol vol-1)甘油、2％SDS、100mM DTT和0.2mgmL-1溴酚蓝)在55℃下洗脱15分钟。对于α1C Pulldown，将裂解物添加至包含10μL的经平衡的RFP-捕集琼脂糖珠粒的旋转离心柱，在4℃下旋转1小时，然后如上面所描述的那样进行洗涤/洗脱。在4-12％Bis Tris梯度预制凝胶(Life Technologies)上在MOPS-SDS走样缓冲液(Life Technologies)中在200V恒压下解析蛋白质约1小时。在转移缓冲液(25mM TrispH 8.3,192mM甘氨酸、15％(vol/vol)甲醇和0.1％SDS)中，通过槽转移来将蛋白质条带转移到聚偏二氟乙烯(PVDF，EMD Millipore)膜上。在室温下用在Tris缓冲盐水-tween(TBS-T)(25mM Tris pH 7.4、150mM NaCl和0.1％Tween-20)中的5％脱脂乳(BioRad)溶液封闭所述膜1小时，然后在封闭溶液中与一抗(CaVβ1，UC Davis/NIH NeuroMab Facility。肌动蛋白，Sigma Aldrich)一起在4℃下温育过夜。用TBS-T洗涤印迹三次(每次10分钟)，然后与缀合有辣根过氧化物酶的二抗一起在室温下温育1小时。在TBS-T中洗涤后，用化学发光检测试剂盒(Pierce Technologies)使印迹显色，然后在凝胶成像仪上可视化。然后，将膜用严苛的剥离缓冲液(2％SDS、62mM Tris pH 6.8、0.8％β-巯基乙醇)在50℃下剥离30分钟，在流水下漂洗2分钟，并且用TBST进行洗涤(3x，10分钟)。将膜用0.5％戊二醛进行预处理，并且用抗泛素(VU1，LifeSensors)按照制造商的说明书进行重新印迹。
钙成像
将DRG神经元在包含(mM)：145NaCl、5KCl、2CaCl2、1MgCl2、1柠檬酸钠、10HEPES、10D-葡萄糖的基础溶液(pH 7.4)中洗涤两次，并且在包含5uM fura-2与0.05％PluronicF-127去污剂(Life Technologies)的相同溶液中在37℃和5％CO2下温育1小时。之后，将细胞在相同溶液中洗涤两次，并且放置在具有Nikon Plan fluor 20x物镜(0.45N.A.)的倒置Nikon Ti-eclipse显微镜上。使用EasyRatioPro(HORIBA Scientific)，在340和380nm的激发波长下记录fura-2测量结果。用其中NaCl减低至110mM且KCl增高至40mM的溶液来使DRG去极化。
用类似的实验方案对胰腺β-细胞进行成像。将细胞维持在包含(mM)下列成分的基础KRBH溶液中：134NaCl、3.5KCl、1.2KH2PO4、0.5MgSO4、1.5CaCl2、5NaHCO3、10HEPES、2.8D-葡萄糖，pH 7.4。刺激溶液包括16.8mM葡萄糖或40mM KCl，其中相应地调整NaCl浓度以平衡与KRBH溶液的渗透性。
数据和统计学分析
使用FloJo、PulseFit(HEKA)、Microsoft Excel、Origin和GraphPad Prism软件离线分析数据。使用内置函数在Origin或GraphPad Prism中进行统计学分析。对于两个组之间的比较使用Student t检验或者对于三个组之间的比较使用单因素ANOVA来确定平均值之间的统计学上显著的差异(p<0.05)，其中采用Tukey事后分析。数据以“平均值±s.e.m.”呈现。
实施例2
CaVβ-靶向的纳米抗体的分离和表征
本公开内容开发了靶向CaVβ的纳米抗体，其将会被掺入CaV通道复合物中但是其在功能上是沉默的，以充当用于潜在地将不同的酶部分或感受器指引至内源性通道的运载体。使用BacMam表达系统在HEK293细胞中表达CaVβ1b和CaVβ3，并且使用亲和纯化、离子交换法和大小排阻色谱法来纯化这些蛋白质(图1A)。将经纯化的β1和β3(每种1mg)用于美洲驼免疫接种，并且通过ELISA确证成功的血清转化(未显示)。从分离的淋巴细胞中提取信使RNA，进行PCR扩增，并且克隆入质粒载体(pComb3XSS)中以产生VHHS噬菌体文库(图1B)。使用三轮噬菌体展示和淘选(Pardon等人,2014)，从噬菌体文库中富集推定的纳米抗体结合剂。在经富集的噬菌体文库上进行96-孔ELISA，并且选择14个阳性克隆用于测序(图1C)。基于在互补性决定区域(CDR1-3)(抗原结合的主要决定子)内的独特序列，鉴定了至少七个不同类别的纳米抗体结合剂(图1D和1E)。将鉴定出的二十五种纳米抗体的序列信息在下面汇总于表1中。
采用小分子诱导的荧光共转位测定法来同时测定：(1)当在哺乳动物细胞中表达时，独个纳米抗体是否表现良好(即，不聚集)，和(2)是否结合CaVβ。将由与CFP和PKCγ的C1结构域相融合的独个纳米抗体组成的三分构建体克隆入CMV表达载体中，并且与带有YFP标签的CaVβ瞬时共转染入HEK293细胞中。在试验性实验后，我们选择了一个纳米抗体克隆，nb.F3，用于深入的表征和开发。nb.F3-CFP-C1和YFP-β1都在经转染的HEK293细胞的胞质溶胶中均匀地表达(图1F)。1μM佛波醇-12,13-二丁酸酯(PdBu)的施加导致nb.F3-CFP-C1从胞质溶胶快速且急剧地重新分布至质膜和核膜(图1F)。令人欣慰的是，YFP-β1相伴地重新分布至质膜和核膜，这提供了方便的目视确认：它在细胞内与nb.F3相联合(图1F)。用其他CaVβ(β2-β4)进行的类似实验显示，它们在细胞中都与nb.F3-CFP-C1相结合(图1F；图7)，这表明所述纳米抗体与在CaVβ之中保守的表位相互作用。使用经纯化的nb.F3和CaVβ2b的等温滴定量热法表明了高亲和力(Kd＝13.2±7.2nM)相互作用和1:1的化学计量(图1G)。
对于总体策略来说重要的是，nb.F3掺入经装配的HVACC复合物中而不影响通道功能或亚基稳定性。使用流式细胞术测定法来评估nb.F3对于重组CaV2.2运输、亚基表达水平和全细胞电流的影响，已知所有这些都由CaVβ调节(图2A-2L)(Waithe等人,2011)。将具有在细胞外结构域IV S5-S6环中的两个串联的高亲和力银环蛇毒素结合位点(2XBBS)和C-末端YFP标签的经改造的α1B用于使得能够同时检测在未渗透化的细胞中的表面(缀合有Alexa647的银环蛇毒素)和总(YFP荧光)通道群体(图2A)。将BBS-α1B-YFP和CaVβ与或不与nb.F3-P2A-CFP一起共表达，并且利用流式细胞术来快速测量表面和总通道表达。相比于对照而言，在表达BBS-α1B-YFP和β1b的细胞中nb.F3对于Alexa647或YFP荧光没有影响(图2B-2D)，这表明通道运输没有破坏或者对于α1B表达没有影响。当用其他CaVβ(β2-β4)亚基重构CaV2.2时，关于nb.F3对于α1B运输和稳定性的惰性，获得了相似的结果(图2D)。
为了检查nb.F3对于CaVβ自身的潜在的直接影响，对于表达BBS-α1B+β-YFP±nb.F3-P2A-CFP的细胞应用流式细胞术测定法(图2E)。不令人惊讶地，nb.F3不影响与所述四种CaVβ同种型中的任一种共表达的BBS-α1B的表面运输(图2F-2H和图8A-8F)。β1-YFP和β4-YFP的表达水平不受nb.F3影响，而β2和β3的水平适度地降低(虽然该影响未达到统计学显著性)，这暗示当被纳米抗体所结合时这两种同种型对于降解的易损性可能轻微增加(图2H)。在表达从BBS-α1C+β-YFP±nb.F3-P2A-CFP重构的CaV1.2通道的细胞中，关于nb.F3对于通道运输和亚基表达水平的影响的缺乏进行了类似的观察(图9A-9E)。
最后，使用膜片钳电生理学来评价nb.F3对于通过在HEK293细胞中重构的重组CaV2.2通道的全细胞电流的影响。表达α1B+β1b+α2δ的细胞展示出完全不受nb.F3影响的稳固的全细胞Ba2+电流(图2I；对于CFP，I峰,0mV＝-104.4±22.0pA/pF，n＝10，和对于nb.F3，I峰,0mV＝-103.5±39.5pA/pF，n＝10)。对于来自用其他β2-β4亚基重构的CaV2.2(图2J-2L)或者CaV1.2(α1C+β2a+α2δ)通道(图9A-9E)的电流，观察到nb.F3的影响的相似缺乏。
总之，这些结果表明，nb.F3在细胞中结合β1-β4亚基，并且以在功能上沉默的方式潜在地装配入CaV通道复合物中，基本上扮演不引人注目的过客的角色。然而，也可能的是，nb.F3对于CaV2.2和CaV1.2通道的明显的功能惰性具有更为平常的解释，即与孔形成性α1-亚基一起装配的CaVβ简单地对于nb.F3是无法接近的。我们可以通过测定nb.F3是否能够用于靶向生物活性分子以调节所装配的通道来区别这这两种可能的情形，如接下来我们所做的。
表1.所产生的纳米抗体的汇总
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实施例3
F3-Nedd4L嵌合蛋白对于Cav1/Cav2通道的强有力的功能影响
假设将E3泛素连接酶的催化结构域融合至nb.F3将会产生遗传编码的分子，其通过降低它们的表面密度来抑制Cav1/Cav2通道(Kanner等人,2017)。因此，通过将Nedd4L的催化性HECT结构域融合至nb.F3的C-末端来产生嵌合构建体(nb.F3-Nedd4L)。我们还产生了该嵌合构建体的在催化上无作用的突变体(nb.F3-Nedd4L[C942S])，以区分泛素化依赖性和非依赖性效应。这两种构建体均在P2A-CFP表达载体中产生，从而使得能够使用CFP荧光来确证蛋白质表达。
在模拟对于nb.F3所描述的那些的实验中，检查了nb.F3-Nedd4L和nb.F3-Nedd4L[C942S]对于重构的CaV2.2通道运输、亚基表达水平和全细胞电流的影响(图3A-3J)。鉴于E3泛素连接酶在介导靶蛋白质降解中的经典作用，首先评估了nb.F3-Nedd4L是否影响总CaVβ表达(图3A和3B)。在表达BBS-α1B+β1b-YFP+α2δ的细胞中，F3-Nedd4L和F3-Nedd4L[C942S]对于β1b总表达均不具有任何显著影响，如通过相比于阴性对照细胞而言未改变的YFP荧光所报告的(图3A和3B)。当用带有YFP标签的β2、β3或β4亚基重构BBS-α1B时，获得了相似结果，尽管用β2a和β4存在朝向更低荧光的趋势(图3B)。相反地，无论所共表达的带有YFP标签的CaVβ的身份为何，nb.F3-Nedd4L都显著地抑制BBS-α1B的表面密度(图3C，红色条；图10A-10H)。用nb.F3-Nedd4L[C942S]未观察到BBS-α1B表面密度降低(图3C，绿色条)，这表明它需要所附着的Nedd4L HECT结构域的催化活性。类似地，在表达BBS-α1C+βX-YFP的细胞中，nb.F3-Nedd4L以泛素依赖性方式强烈地降低CaV1.2表面密度(图11A-11D)。
鉴于nb.F3-Nedd4L对于通道的表面群体的引人注目的效应而不影响Cavβ的总水平，接下来评估nb.F3-Nedd4L对于总α1B亚基表达是否存在影响。与我们对于CaVβ的观察结果相似，相对于阴性对照(黑色条)或表达nb.F3-Nedd4L[C942S]的细胞(绿色条)而言，nb.F3-NeddL对于BBS-α1B-YFP的表达没有显著影响(图3E，红色条)。不令人惊讶地，nb.F3-Nedd4L明显地削弱了与任何CaVβ共表达的BBS-α1B-YFP的表面运输(图3F)。
最后，检查了nb.F3-Nedd4L对于重构的CaV2.2全细胞电流的功能影响。值得注意的是，nb.F3-Nedd4L基本上消除了从与所述四种CaVβ中的任一种共表达的α1B+α2δ重构的CaV2.2电流(图3G-3J)。进一步地，nb.F3-Nedd4L在消融在重构的CaV1.2、CaV1.3、CaV2.1和CaV2.3通道中的全细胞电流方面是同等有效的(图4A-4D)。
鉴于其通过经功能化的CaVβ-靶向的纳米抗体在消融全细胞HVACC电流方面的非凡效力，我们将nb.F3-Nedd4L命名为CaV-消融剂，并且将通过该分子的HVACC电流消除的过程描述为CaV-消融。
实施例4
在心肌细胞中内源性CaV1.2通道的CaV-消融
接下来测定CaV-消融剂是否能够在天然细胞(其中在CaV1/CaV2通道周围的微小环境通常比在异源细胞中更复杂)中有效地抑制HVACC电流。所培养的成年豚鼠心室心肌细胞(CAGPVC)提供了最初的非凡挑战，因为它们具有错综复杂的细胞结构并且表达主要被靶向特化的二分体接点的CaV1.2通道。此外，因为现在已经显示，在成年心肌细胞中，α1C与CaVβ的结合对于实质性的向表面肌膜的CaV1.2通道运输不是必须的(Yang等人,2019；Meissner等人,2011)，因此对于在心室肌细胞中的全细胞L-型电流(ICa,L)作出贡献的CaVβ-结合的CaV1.2通道的那一部分是不明确的。将腺病毒用于在保持了新鲜分离的心脏细胞的杆状表型和总体细胞结构的CAGPVC中表达CaV-消融剂或nb.F3-Nedd4L[C942S](图5A)。对照(未感染的)心肌细胞表达这样的ICa,L，其在0mV测试脉冲处达到峰值(图5A和5B；I峰,0mV＝-6.5±0.2pA/pF，n＝8)。相反地，在同时期的实验中，通过由腺病毒介导的感染而表达CaV-消融剂的心肌细胞几乎没有展示出CaV1.2电流，这证明了在该系统中非凡的CaV-消融效率(图5A和5B；I峰,0mV＝-1.0±0.3pA/pF，n＝9)。表达nb.F3-Nedd4L[C942S]的心肌细胞展示出与对照相似的ICa,L(I峰,0mV＝-5.1±0.6pA/pF，n＝10)，这表明在该系统中泛素化对于CaV-消融来说是必需的。
在心肌细胞中的CaV-消融的机制是什么？使用免疫荧光来探查CaV-消融剂如何在心肌细胞中分别影响CaV1.2α1C和β2亚基的表达水平和亚细胞定位。在未感染的心肌细胞中的CaVα1C呈现出与兰尼碱受体(RyR2)的那种共定位的特征性的有条纹的点状分布图式(图5C)，这反映了其众所周知的在二分体接点处的占优势的定位(Scriven等人,2000；Bers,2002)。在表达nb.F3-Nedd4L[C942S]的心肌细胞中对于α1C观察到相似的分布图式，这与该蛋白质对于ICa,L缺乏影响相一致。在表达CaV-消融剂的心肌细胞中，对于点状α1C染色的信号强度相对于对照细胞而言没有变化(图12A-12D)，这暗示假定的泛素化增加对于该蛋白质的稳定性没有影响。然而，存在α1C从二分体接点的重新分布，如通过在α1C和RyR2之间的共定位的急剧丢失所报告的(图5C)。更确切地，在表达CaV-消融剂的心肌细胞中的点状α1C信号与Rab7(但不与Rab5或LAMP1)免疫荧光信号相一致(图5D；图12A-12D)。因此，CaV-消融剂抑制ICa,L的机制是α1C从二分体接点重新分配至细胞内区室，特别是Rab7-阳性晚期内体(图5H)(Rink等人,2005)。
相比于未感染的或表达nb.F3-Nedd4L[C942S]的细胞而言，表达CaV-消融剂的心肌细胞在总CaVβ2水平方面也未显示出差异(图12A-12D)。因此，在心肌细胞中由CaV-消融剂介导的CaV1.2的重新分布不能被解释为仅由于CaVβ的缺乏。一个吸引人的可能性是，尽管CaV-消融剂特异性地被靶向在通道复合物中的CaVβ，但是它也能够直接催化在大分子复合物中的α1亚基的泛素化。事实上，在重组CaV1.2通道的Pulldown实验中，CaV-消融剂大量地增加了α1C(图5E和5F)和CaVβ1b亚基(图5G)两者的泛素化。然而，尽管泛素化增加，但是用CaV-消融剂未改变α1C表达的总体水平(图5E)。总之，我们的结果暗示，由CaV-消融剂对于α1C进行的直接泛素化可能是CaV1.2通道从二分体重新分布至Rab7-阳性晚期内体的基础(图5H)。
实施例5
在背根神经节(DRG)神经元和胰腺β细胞中的CaV-消融
接下来测试CaV-消融剂在鼠类背根神经节(DRG)神经元中抑制HVACC的效力，这些神经元是令人感兴趣的，因为它们表达多种CaV1/CaV2通道类型(Murali等人,2015；McCallum等人,2011)，并且还在有害信号(包括疼痛和搔痒)的处理中发挥关键作用(Han等人,2013；Kim等人,2016)。用表达GFP、CaV-消融剂或nb.F3-Nedd4L[C942S]的腺病毒感染经培养的DRG神经元。鉴于它们的异质性质，首先使用fura-2来测量响应于用40mM KCl进行的去极化而向DRG神经元群体中的钙流入(图6A和6B)。在5μM米贝拉地尔存在下进行记录，以阻断在这些细胞中也普遍存在的低电压激活T-型钙通道(Puckerin等人,2018；Jagodic等人,2008)。在表达GFP或nb.F3-Nedd4L[C942S]的神经元中，很大部分的细胞响应于40mMKCl而展示出由fura-2报告的Ca2+暂态值的大幅增加，这表明了CaV1/CaV2通道的开放(图6A和6B)。相反地，在表达CaV-消融剂的神经元中由去极化诱导的Ca2+流入几乎被消除，这证明在该系统中高度有效的CaV-消融(图6A和6B)。
使用全细胞膜片钳来进一步表征CaV-消融剂对于在DRG神经元中的钙电流的影响。特别令人感兴趣的是测定CaV-消融剂对于存在于DRG神经元亚组中的HVACC和LVA T-型通道的相对效应。我们记录了由来自-90mV或-50mV的保持电位(为了使所存在的任何T-型通道失活)的测试脉冲(从-40mV至+60mV，以10mV增量)引起的全细胞电流家族(图6C)。表达GFP(对照)或F3-Nedd4L[C942S]的细胞展示出大的IBa，无论保持电位为何(图6C和6D；I峰,-10mV＝-173.9±28.2pA/pF，n＝6，对于GFP，I峰,-10mv＝-206.7±36.4pA/pF，n＝5，对于F3-Nedd4L[C942S])，尽管用-50mV保持电位所记录的那些具有较低的幅度，其反映了T-型通道和还有一部分HVACC的失活。表达CaV-消融剂的细胞基本上不展示出HVACC电流(图6C和6D；I峰,-10mV＝-14.3±6.2pA/pF)，最明显的是从-50mV保持电位所记录的IBa不存在(图6C，中)。此外，在这些细胞中，当从-90mV保持电位记录电流时，它们展示出T-型通道的快速失活动力学特征(图6C)。总之，这些结果表明，CaV-消融剂选择性地消除在DRG神经元中的HVACC而不影响LVA T-型通道。
最后，测试了CaV-消融剂在鼠类胰腺β-细胞中是否也有效，所述鼠类胰腺β-细胞具有多种参与胰岛素释放的CaV通道类型(CaV1.2、CaV1.3和CaV2.1)(Yang和Berggren,2006)。使用腺病毒来感染经消化的从在胰腺β-细胞中表达tdTomato的转基因小鼠中分离出的胰岛。表达GFP或nb.F3-Nedd4L[C942S]的对照细胞展示出稳固的由葡萄糖或KCl引起的由fura-2报告的Ca2+暂态值，其在表达CaV-消融剂的细胞中基本上被取消(图6E-6G)。总之，这些结果揭示了CaV-消融剂作为遗传编码的HVACC抑制剂的非凡活性，其在各种不同的细胞情景下都是有效的。
实施例6
讨论
本公开内容介绍了作为新型的遗传编码的分子的CaV-消融剂，其通过靶向辅助性CaVβ亚基而强有力地抑制HVACC。CaV-消融剂组合了CaVβ-靶向的纳米抗体的精致的特异性和E3泛素连接酶的强大地随之出现的催化活性。基于从不同角度观察CaV-消融剂，讨论了本公开内容的四个不同方面：1)作为用于选择性地抹除在细胞中的HVACC的独特工具，2)作为用于探查HVACC调节和运输的机制的方法，3)作为潜在的治疗剂，和4)作为使得能够探查大分子膜蛋白信号传导的新维度的原型改造蛋白质。
Ca2+是对于几乎所有细胞的生物学来说至关重要的通用的第二信使。在可兴奋细胞中，LVACC和HVACC两者都将以动作电位编码的电信号转换为细胞内Ca2+的变化，其然后驱动许多生物学应答。在表达这两类通道的细胞中，可能难以解读在体内通过LVACC对通过HVACC特异性地介导的生理学效应。现在，CaV-消融剂作为可以在靶细胞中运用以几乎抹除所有HVACC而同时让LVACC作用保持完整的工具而呈现。可以类似地消除HVACC的最接近的现有蛋白质为RGK GTP酶，其当在靶细胞中过表达时能够强有力地抑制CaV1/CaV2通道(Murata等人,2004；Chen等人,2005；Xu等人,2010；Puckerin等人,2018；Bannister等人,2008)。然而，RGK的一个明显缺点是其脱靶效应的倾向，这归因于其已知的与细胞骨架蛋白和其他信号传导分子(包括14-3-3、钙调蛋白和CaM激酶II)的相互作用和对它们的调节(Yang和Colecraft,2013；Correll等人,2008；Royer等人,2018；Béguin等人,2005)。在过去的二十年中，几个小组寻求用小分子或者通过过表达AID肽作为CaVβ海绵来破坏α1-CaVβ相互作用(Findeisen等人,2017；Chen,2018；Khanna等人,2019；Yang等人,2019)。虽然该方法已在某些情况下显示出一些效力，但是HVACC抑制的效能远低于在此用CaV-消融剂所取得的。事实上，在成年心肌细胞中过表达AID肽在抑制CaV1.2通道方面不是有效的(Yang等人,2019)，因为在该情景下α1C与CaVβ的结合对于通道运输至表面来说不是绝对需要的(Yang等人,2019；Meissner等人,2011)。尽管如此，CaV-消融剂基本上根除在成年心肌细胞中的ICa,L的能力表明，在正常生理条件下，在心室心脏细胞中基本上所有α1C亚基都与CaVβ相联合。
CaV1/CaV2通道和其他表面膜蛋白在细胞内区室中度过其生命周期的很大部分，这反映了其生物发生、再循环和最终毁灭。调节HVACC降解和在区室之间运输的信号是神秘的并且知之甚少，但是可能突出地牵涉通道亚基的翻译后修饰。在此，我们显示，用CaV-消融剂在心肌细胞中对α1C/β2复合物进行靶向泛素化特异性地阻止在Rab7-阳性晚期内体中的CaV1.2通道。CaV-消融剂具有Nedd4L的催化性HECT结构域，已知其主要催化K63-连接多泛素链向靶蛋白质的添加(Kim和Huibregtse,2009；Scheffner和Kumar,2014)。因此，我们的结果暗示，在α1C/β2亚基上的K63-泛素链可能是将CaV1.2通道引导至晚期内体的关键信号。我们进一步发现，用CaV-消融剂对HVACCα1亚基进行靶向泛素化不导致其降解增加，无论是在异源细胞中还是在心肌细胞中。相反地，使用GFP纳米抗体来将Nedd4L HECT结构域靶向带有YFP标签的KCNQ1(内源性Nedd4L的一种已知底物)导致该K+通道孔形成性α1亚基的表达降低(Kanner等人,2017)。因此，Nedd4L HECT结构域对于膜蛋白的稳定性的影响可能是底物依赖性的。我们推测，用催化不同多泛素链的形成的其他类型E3连接酶的催化结构域武装nb.F3将会阐明指挥CaV1/CaV2通道降解和在不同区室之间运输的精确信号。除了泛素化之外，该方法也可以潜在地用于阐明其他翻译后修饰(例如，在CaV1/CaV2通道上的磷酸化/去磷酸化)的功能后果和机制，以及定位对于在活细胞中在HVACC纳米结构域(nano-domain)内的信号作出报告的感受器。
用小分子阻断特定HVACC的活性是用于许多心血管疾病和神经病学疾病(包括疼痛、高血压、心律失常、癫痫和帕金森病)的盛行或有潜力的疗法(Zamponi,2016)。用于HVACC的小分子或毒素阻断剂的限制是脱靶效应的倾向，这归因于当施用给患者时其不可避免的广泛分布。在一些情况下，这样的脱靶效应可能限制治疗窗，从而足以不利地影响治疗效力。遗传编码的HVACC抑制剂具有很大的潜力成为有用的治疗剂，优点是其表达可以被限制于靶组织/细胞类型，或者甚至在单个细胞内在空间上离散的通道(Murata等人,2004；Makarewich等人,2012)。鉴于其在使HVACC活性沉默方面的效能，CaV-消融剂能够成为先导分子，以用于未来发展成用于其中遗传编码的HVACC抑制剂得到准许的特殊应用的基因疗法。为此目的，可以希望的是产生其时间过程和作用程度可以通过小分子或光进行调谐的CaV-消融剂形式。事实上，这是正在进行的工作的焦点。
最后，一个令人兴奋的前景是CaV-消融剂作为原型的潜力，所述原型可以进一步进行开发以改造蛋白质，所述蛋白质以新的特异性维度调节CaV1/CaV2通道复合物。例如，一个盛行的想法是特定类型的CaV1/CaV2通道(例如，在心肌细胞中的CaV1.2通道)仍可以在单个细胞中形成具有不同功能输出的离散的信号传导单元，基于其掺入到趋异的大分子复合物中(Shaw和Colecraft,2013)。存在诱人的暗示，即不同的CaVβ同种型可以通过促进在分子上不同的HVACC大分子复合物的形成而成为信号多样化的节点(McEnery等人,1998；Brice和Dolphin,1999；Campiglio和Flucher,2015)。因此，基于作为组成部分的CaVβ的身份来抑制特定CaV通道大分子复合物的能力是在生物学上重要的，然而其是用常规的敲除/敲低方法不能严格地达到的。但是，该能力可以用针对特定CaVβ同种型的CaV-消融剂容易地取得。实现该可能性的一个挑战是开发CaVβ同种型特异性纳米抗体，鉴于在保守的src同源物3(SH3)和鸟苷酸激酶(GK)结构域之外在CaVβ之间存在序列趋异，这应当是可行的(Buraei和Yang,2010)。在更广泛的情景下，在独个细胞中与各种不同的辅助亚基一起进行装配的离子通道孔形成性α1亚基的现象在整个生物学中是常见的(O'Malley和Isom,2015；Copits和Swanson,2012；Trimmer,2015)。因此，受到CaV-消融剂启发的分子和方法可能有望阐明迄今为止仍然难以分析的离子通道大分子复合物信号传导的功能维度。
所引用的文献
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在本申请中所引用的所有文献均通过提及而合并入本文，如同在本文中全文记述一样。
虽然在本文中已描述了本公开内容的举例说明性实施方案，但是应当理解，本公开内容并不限于所描述的那些，并且可以由本领域技术人员做出各种其他变化或修饰而不背离本公开内容的范围或精神。
序列表
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<400> 8
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1 5 10 15
Ser Val Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
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Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ala Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ala Tyr
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Ala Asp Thr Tyr Tyr Gly Ser Arg Met Trp Asn Glu Tyr Asp Tyr
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<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
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<220>
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<223> 纳米抗体
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<220>
<223> 纳米抗体
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<223> 纳米抗体
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<223> 纳米抗体
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<223> 纳米抗体
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<223> 纳米抗体
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<223> 纳米抗体
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<223> 纳米抗体
<400> 44
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<220>
<223> 纳米抗体
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<223> 纳米抗体
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<220>
<223> 纳米抗体
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<223> 纳米抗体
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<223> 纳米抗体
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<223> 纳米抗体
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
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<212> PRT
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<220>
<223> 纳米抗体
<400> 58
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<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
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<220>
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<223> 纳米抗体
<400> 61
His Tyr Gln Gly Ser Tyr Gly Ser Ala Ser Ala
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<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 62
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
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<400> 66
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Ser Cys Ile Ser Ser Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Gly Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Val Val Gly Leu Arg Leu Pro Thr Tyr Ala Ser Asn Ser Cys
100 105 110
Lys Ile Val Ala Asp Phe Gly Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
115 120 125
Val Ser Ser
130
<210> 67
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 67
Val Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5 10
<210> 68
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 68
Ile Asp Trp Ser Gly Gly Thr Ala Ser His
1 5 10
<210> 69
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 69
Cys Ala Val Gly Gly Asp Trp Arg Val Tyr Asp Ile Ser Phe Tyr Tyr
1 5 10 15
Thr Ala His Gln Tyr Glu
20
<210> 70
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 70
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asp Trp Ser Gly Gly Thr Ala Ser His Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asp
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Val Gly Gly Asp Trp Arg Val Tyr Asp Ile Ser Phe Tyr Tyr Thr
100 105 110
Ala His Gln Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 71
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 71
Ser Gly Arg Thr Phe Ser Arg Asn Ala
1 5
<210> 72
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 72
Ile Ser Trp Ser Gly Arg Asn
1 5
<210> 73
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 73
His Tyr Gln Gly Ser Tyr Gly Ser Ala Leu Ala
1 5 10
<210> 74
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 74
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Arg Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Arg Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala His Tyr Gln Gly Ser Tyr Gly Ser Ala Leu Ala Tyr Asp Thr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 75
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 75
Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asn Phe Ala
1 5
<210> 76
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 76
Ile Thr Trp Ser Arg Gly Ser
1 5
<210> 77
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 77
Gly Leu Trp Arg Tyr Tyr Thr Glu Ser Tyr Phe Tyr Thr Glu Asp Arg
1 5 10 15
<210> 78
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 78
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asn Phe
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Thr Trp Ser Arg Gly Ser Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Gly Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Leu Trp Arg Tyr Tyr Thr Glu Ser Tyr Phe Tyr Thr Glu
100 105 110
Asp Arg Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 79
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 79
Ala Val Ser Gly Phe Thr Leu Asp Asn Tyr Ala Ile
1 5 10
<210> 80
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 80
Val Ser Cys Ile Ser Ser Ser Asp Gly Ser
1 5 10
<210> 81
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 81
Thr His Glu Gln Val Trp Lys Thr Leu Phe Ser Ser Cys Thr Val Glu
1 5 10 15
Arg Asp Asp
<210> 82
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 82
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Leu Asp Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Cys Ile Ser Ser Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Asp Lys Asn Met Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr His Glu Gln Val Trp Lys Thr Leu Phe Ser Ser Cys Thr Val
100 105 110
Glu Arg Asp Asp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser
130
<210> 83
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 83
Val Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5 10
<210> 84
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 84
Ile Asp Trp Ser Gly Gly Thr Ala Ser His
1 5 10
<210> 85
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 85
Ser Ser Tyr Trp Ser Arg Ser Val Asp Glu
1 5 10
<210> 86
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 86
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asp Trp Ser Gly Gly Thr Ala Ser His Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ser Ser Tyr Trp Ser Arg Ser Val Asp Glu Tyr Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 87
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 87
Ser Gly Phe Thr Leu Asp Asn Tyr Ala Ile Gly
1 5 10
<210> 88
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 88
Val Ser Cys Ile Ser Ser Ser Asp Gly Ser
1 5 10
<210> 89
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 89
Thr His Glu Gln Val Trp Lys Thr Leu Phe Ser Ser Cys Thr Val Glu
1 5 10 15
Arg Asp Asp
<210> 90
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 90
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Cys Ile Ser Ser Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr His Glu Gln Val Trp Lys Thr Leu Phe Ser Ser Cys Thr Val
100 105 110
Glu Arg Asp Asp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser
130
<210> 91
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 91
Ser Gly Phe Thr Leu Asp Asn Tyr Ala Ile Gly
1 5 10
<210> 92
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 92
Val Ser Cys Ile Ser Ser Ser Asp Gly Ser
1 5 10
<210> 93
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 93
Thr His Glu Gln Val Trp Lys Thr Leu Phe Ser Ser Cys Thr Val Glu
1 5 10 15
Arg Asp Asp
<210> 94
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 94
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Cys Ile Ser Ser Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr His Glu Gln Val Trp Lys Thr Leu Phe Ser Ser Cys Thr Val
100 105 110
Glu Arg Asp Asp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser
130
<210> 95
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 95
Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5
<210> 96
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 96
Ile Asp Trp Ser Gly Gly Thr Ser Val His
1 5 10
<210> 97
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 97
Thr Ser Tyr Trp Ser Thr Ala Glu Tyr Glu
1 5 10
<210> 98
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 98
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Thr Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asp Trp Ser Gly Gly Thr Ser Val His Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ala Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Thr Ser Tyr Trp Ser Thr Ala Glu Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120

Claims (49)

1.能够与CaVβ辅助亚基相结合的纳米抗体，其包含SEQ ID NO:1-3、SEQ ID NO:5-7、SEQID NO:9-11、SEQ ID NO:13-15、SEQ ID NO:17-19、SEQ ID NO:21-23、SEQ ID NO:25-27、SEQ ID NO:29-31、SEQ ID NO:33-35、SEQ ID NO:37-39、SEQ ID NO:41-43、SEQ ID NO:45-47、SEQ ID NO:49-51、SEQ ID NO:53-54、SEQ ID NO:56-57、SEQ ID NO:59-61、SEQ ID NO:63-65、SEQ ID NO:67-69、SEQ ID NO:71-73、SEQ ID NO:75-77、SEQ ID NO:79-81、SEQ IDNO:83-85、SEQ ID NO:87-89、SEQ ID NO:91-93或SEQ ID NO:95-97。
2.权利要求1的纳米抗体，其包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:38、SEQ IDNO:42、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:58、SEQ IDNO:62、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:82、SEQ IDNO:86、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:94或SEQ ID NO:98。
3.组合物，其包含：
(i)根据权利要求1-2中任一项的纳米抗体；和
(ii)与所述纳米抗体可操作地相连的E3泛素连接酶的催化结构域。
4.权利要求3的组合物，其中所述组合物对于将高电压激活钙通道(HVACC)从其在细胞质膜上的功能位置处移除来说是有效的。
5.权利要求4的组合物，其中所述HVACC选自由下列各项组成的组：CaV1.1、CaV1.2、CaV1.3、CaV1.4、CaV2.1、CaV2.2、CaV2.3及其组合。
6.权利要求5的组合物，其中所述HVACC为CaV1.2、CaV1.3、CaV2.1和CaV2.3中的一种或多种。
7.权利要求4的组合物，其中所述组合物对于实现所述HVACC的功能敲低来说是有效的。
8.权利要求4的组合物，其中所述E3泛素连接酶包含Nedd4-2的催化结构域。
9.权利要求4的组合物，其中所述组合物对于削弱CaVβ辅助亚基将所述HVACC运输至质膜的功能来说是有效的。
10.权利要求4的组合物，其中所述组合物对于取消所有HVACC的表面水平来说是有效的。
11.权利要求4的组合物，其中所述组合物对于降低或消除HVACC电流来说是有效的。
12.组合物，其包含遗传编码的钙通道阻断剂，所述遗传编码的钙通道阻断剂包含编码下列组分的核酸：
(i)根据权利要求1-2中任一项的纳米抗体；和
(ii)E3泛素连接酶的催化结构域。
13.权利要求12的组合物，其中所述E3泛素连接酶包含Nedd4-2的催化结构域。
14.权利要求12的组合物，其中所述纳米抗体和所述E3泛素连接酶的催化结构域是在功能上相连接的。
15.权利要求12的组合物，其中表达所述纳米抗体和所述E3泛素连接酶的催化结构域以形成连续多肽。
16.权利要求15的组合物，其中所述连续多肽对于将高电压激活钙通道(HVACC)从其在细胞质膜上的功能位置处移除来说是有效的。
17.权利要求16的组合物，其中所述HVACC选自由下列各项组成的组：CaV1.1、CaV1.2、CaV1.3、CaV1.4、CaV2.1、CaV2.2、CaV2.3及其组合。
18.权利要求17的组合物，其中所述HVACC为CaV1.2、CaV1.3、CaV2.1和CaV2.3中的一种或多种。
19.权利要求15的组合物，其中所述连续多肽对于实现在细胞中HVACC的功能敲低来说是有效的。
20.权利要求15的组合物，其中所述连续多肽对于削弱CaVβ辅助亚基将HVACC运输至质膜的功能来说是有效的。
21.权利要求15的组合物，其中所述连续多肽对于取消所有HVACC的表面水平来说是有效的。
22.权利要求15的组合物，其中所述连续多肽对于降低或消除HVACC电流来说是有效的。
23.权利要求12的组合物，其中编码(i)和(ii)的核酸被携带于表达载体上。
24.权利要求23的组合物，其中所述表达载体进一步包含组织特异性启动子。
25.在细胞中阻断高电压激活钙通道(HVACC)的方法，其包括使所述细胞与有效量的根据权利要求3-24中任一项的组合物相接触。
26.权利要求25的方法，其中所述细胞为神经元或心肌细胞。
27.选择性地靶向受试者中的细胞群体的方法，其包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求3-24中任一项的组合物。
28.权利要求27的方法，其中所述细胞为介导疼痛感觉的神经元，或心肌细胞。
29.权利要求27的方法，其中所述受试者为哺乳动物。
30.权利要求27的方法，其中所述受试者为人。
31.用于在细胞中可诱导地抑制高电压激活钙通道(HVACC)的组合物，其包含：
(i)根据权利要求1-2中任一项的纳米抗体；和
(ii)与所述纳米抗体可操作地相连的来自蛋白激酶Cγ的C1结构域(C1PKC)；
其中所述组合物对于在用佛波醇-12,13-二丁酸酯(PdBu)进行诱导后使所述HVACC失活来说是有效的。
32.权利要求31的组合物，其中所述组合物对于实现所述HVACC的功能敲低来说是有效的。
33.组合物，其包含遗传编码的诱导型钙通道阻断剂，所述遗传编码的诱导型钙通道阻断剂包含编码下列组分的核酸：
(i)根据权利要求1-2中任一项的纳米抗体；和
(ii)与所述纳米抗体可操作地相连的来自蛋白激酶Cγ的C1结构域(C1PKC)。
34.权利要求33的组合物，其中表达所述纳米抗体和所述C1结构域以形成连续多肽。
35.权利要求33的组合物，其中编码(i)和(ii)的核酸被携带于表达载体上。
36.权利要求35的组合物，其中所述表达载体进一步包含组织特异性启动子。
37.在细胞中阻断高电压激活钙通道(HVACC)的方法，其包括下列步骤：
(i)使所述细胞与有效量的根据权利要求31-36中任一项的组合物相接触；和
(ii)使所述细胞与佛波醇-12,13-二丁酸酯(PdBu)相接触；
其中步骤(i)和(ii)的接触对于将所述HVACC从其在细胞质膜上的功能位置处移除来说是有效的。
38.权利要求37的方法，其中所述细胞为神经元或心肌细胞。
39.用于治疗或改善在受试者中疾病的影响的方法，其包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求3-24和31-36中任一项的组合物。
40.权利要求39的方法，其中所述受试者为哺乳动物。
41.权利要求39的方法，其中所述受试者为人。
42.权利要求39的方法，其中所述疾病与高电压激活钙通道(HVACC)的失调相关联。
43.权利要求42的方法，其中所述HVACC选自由下列各项组成的组：CaV1.1、CaV1.2、CaV1.3、CaV1.4、CaV2.1、CaV2.2、CaV2.3及其组合。
44.权利要求43的方法，其中所述HVACC为CaV1.2、CaV1.3、CaV2.1和CaV2.3中的一种或多种。
45.权利要求39的方法，其中所述疾病选自由下列各项组成的组：心血管疾病、神经病学疾病及其组合。
46.权利要求45的方法，其中所述心血管疾病选自由下列各项组成的组：心绞痛、心肌梗死、中风、心力衰竭、高血压、心律失常、脑血管痉挛、风湿性心脏病、心肌病、异常心节律、先天性心脏病、瓣膜性心脏病、心脏炎、心内膜炎、心肌炎、嗜酸性粒细胞性心肌炎、主动脉瘤、外周动脉疾病、血栓栓塞性疾病、静脉血栓形成及其组合。
47.权利要求45的方法，其中所述心血管疾病选自由下列各项组成的组：高血压、心律失常、脑血管痉挛及其组合。
48.权利要求45的方法，其中所述神经病学疾病选自由下列各项组成的组：癫痫、慢性疼痛、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、阿尔茨海默病、动脉瘤、背痛、贝尔麻痹、脑和脊髓的出生缺陷、脑损伤、脑肿瘤、脑性瘫痪、慢性疲劳综合征、震伤、痴呆、颈和腰的椎间盘疾病、头晕、吉-巴综合征、头痛和偏头痛、多发性硬化、肌营养不良、神经痛、神经病、神经肌肉及相关疾病、严重抑郁、强迫症、脊柱侧凸、癫痫发作、脊髓损伤、脊柱畸形和病症、脊柱肿瘤、中风、眩晕及其组合。
49.权利要求45的方法，其中所述神经病学疾病选自由下列各项组成的组：癫痫、慢性疼痛、帕金森病及其组合。
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