CN113834871A

CN113834871A - 基于纸喷雾质谱快速分析低分子糖的方法及其应用

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Publication number: CN113834871A
Application number: CN202111111139.XA
Authority: CN
Inventors: 张玫
Original assignee: Beijing University of Chinese Medicine
Current assignee: Beijing University of Chinese Medicine
Priority date: 2021-09-18
Filing date: 2021-09-18
Publication date: 2021-12-24
Anticipated expiration: 2041-09-18
Also published as: CN113834871B

Abstract

本发明涉及一种基于纸喷雾质谱快速分析低分子糖的方法，所述方法是采用纸喷雾离子化质谱对含有特定糖的团簇离子(由糖分子、手性氨基酸配体及过渡金属离子形成)进行检测，然后计算R值作为区分常见低分子糖的判断依据；所述R值为团簇离子经过碰撞诱导解离失去一分子配体的产物离子的强度与失去一分子糖的产物离子的强度之比。本发明的方法是采用含有特定糖的团簇离子作为分析物，我们规定了"R值"的计算方法为两个产物离子之间的强度比，使方法不仅可以应用于单糖分析，也可以分析更复杂的寡糖。同时使用纸喷雾离子化质谱进行分析，具备直接分析复杂样本(无需前处理或仅需简单前处理)的能力，可实现对临床干血浆样品的直接快速分析。

Description

基于纸喷雾质谱快速分析低分子糖的方法及其应用

技术领域

本发明涉及低分子糖类结构的分析方法，具体涉及基于纸喷雾质谱快速分析低分子糖的方法及其应用。

背景技术

糖类也被称为碳水化合物，其定义为多羟基醛、多羟基酮以及能水解而生成多羟基醛或多羟基酮的有机化合物。复杂多样的糖类在自然界几乎在所有细胞中都普遍存在的，是所有生命形式必不可少的，它们在生物系统中起着主要的代谢、结构和物理作用。例如，糖类可以为细胞提供能量，并作为植物细胞壁的结构成分。通过与蛋白质和脂质结合，糖类广泛参与细胞内运输、细胞粘附、细胞间相互作用等。糖分子具有结构多样性，糖分子中羰基的位置、糖环内碳原子个数、构型等等，导致糖类有非常复杂多样的异构体。D-或L-构型由距离羰基最远的不对称碳原子决定：在标准Fisher投影中，羟基在右侧的是D-糖，而在左侧的是L-糖。在糖分析中，有必要确定每个单糖单元及其立体化学特性，以及寡糖的单糖组成、连接位点和糖苷键构型等。

糖结构分析常用的方法主要有核磁共振(NMR)、色谱和质谱(MS)。高维NMR是常规用来获取糖类详细结构信息的有力工具。然而，NMR分析通常需要毫克级的纯化后的样品，这意味着对样品量和样品纯度的要求都很高。色谱分析结合使用糖标准品作为对照也是区分糖的常用方法。已有方法包括使用气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)和毛细管电泳(CE)。然而，色谱方法也受到许多限制，这主要是由糖类固有的结构特征所决定的。在色谱进样之前通常需要额外的柱前衍生化步骤，以获得更好的检测效果，或更好的分离效果。衍生化不仅耗时，而且还可能导致分析操作中更大的误差和复杂程度。质谱方法因其灵敏度高、分辨率高、样品用量小而被广泛应用于糖类的结构分析，质谱也可作为“检测器”与色谱联用。

尽管质谱具有显著的优势，但质谱在糖分析领域应用仍然存在两个瓶颈问题：1)糖的高亲水性和高极性导致质谱离子化效率低，继而导致质谱检测灵敏度低；2)糖类由于不同的立体化学、构象差异、单糖组成和连接位点等等存在大量的同分异构体，在一级质谱中表现为具有相同的质荷比(m/z)，因此难以区分这些异构体。针对上述两个瓶颈问题，许多分析化学家已经做了大量的工作，在糖质谱领域取得了很大的进展。例如，Gao的研究小组根据合成的自由基诱导解离试剂Me-FRAGS，在MS分析中通过一步自由基诱导解离可区分七种糖异构体(RayanMurtadaKF,Kaylee Gaspar,XuemingDong,KawtharZeyadAlzarieni,KimberlyCalix,Edgar Manriquez,Rose Mery Bakestani,Hilkka I

JinshanGao.Free-Radical-Mediated Glycan Isomer Differentiation[J].Anal Chem,2020,92(20):13794-13802)。Chiharu等人通过串联质谱结合¹⁸O标记，区分具有不同立体化学和不同构象的1,3-连接的二糖(Chiharu Konda B B,Yu Xia.Differentiation of thestereochemistry and anomeric configuration for 1-3linked disaccharides viatandem mass spectrometry and18O-labeling[J].JAm Soc Mass Spectrom,2012,23(2):347-358)。由此可见，目前低分子糖的质谱分析常常与衍生化、额外的化学反应(例如自由基反应)或标记等其它化学反应一起使用。近年来，离子迁移质谱(ionmobilitymassspectrometry，IM-MS)已经发展为可以分析糖类异构体的商业化仪器。在离子迁移质谱分析中，离子的漂移时间(drift time)与质荷比同时被测定。漂移时间可以用来计算离子在特定漂移气体中的碰撞截面积(CCS)。CCS只与离子的形状有关，这提供了有助于区分糖异构体的离子尺寸和形状的信息。然而，如果同分异构体太小，如单糖或二糖离子，那么它们的CCS的差异也不可能足够大到用来区分它们。目前IM-MS能做到直接区分四糖或者五糖或者更大的寡糖，而对于小分子糖(单糖或二糖)，则无法实现直接分析，必须经过衍生化或者采用其它方法，让分子“变大”。这样异构体的CCS才有足够大的差异用来区分彼此。例如，Gaye团队用含有特定单糖的团簇离子(单糖、配体及金属离子)作为分析物，基于它们碰撞截面积(CCS)的差异，采用离子迁移质谱区分了16种常见的单糖(M M Gaye G N,D EClemmer,N L B Pohl Multidimensional Analysis of 16Glucose Isomers by IonMobility Spectrometry[J].Anal Chem,2016,88(4):2335-2344)。而质谱一旦匹配了离子迁移谱部件，其价格就会非常昂贵，限制了这类方法的使用。Cooks团队利用电喷雾离子化质谱(无需离子迁移部件)以含有特定单糖的团簇离子作为分析物，通过二级质谱分析，定义团簇离子母子离子对中子离子与母离子的强度比为"R值"。基于"R值"他们实现了对甘露糖、葡萄糖、半乳糖和核糖对映体的快速定量分析(D.V.Augusti F C,R.Augusti,W.A.Tao,R.G.Cooks.Quantitative chiral analysis of sugars by electrospray ionizationtandemmass spectrometry using modified amino acids as chiral referencecompounds[J].Anal Chem,2002,74(14):3458-3462)。

虽然Gaye团队运用一个单糖和配体以及过渡金属配合成的簇离子增加了离子的尺寸，使运用离子迁移质谱中离子漂移时间计算的不同离子在特定飘逸气体中的旋转平均碰撞截面(CCS)的差异增大，可用于区分16种常见的单糖。但该方法基于离子迁移质谱，质谱仪一旦装备有离子迁移部件就会非常昂贵、不具有广泛适用性，且他们做不到复杂临床样本直接进样分析，分析的都是单糖纯品。

Cooks团队只能做到对几种单糖的对映体的快速定量分析，无法应用于寡糖分析等更复杂的情况；且用电喷雾离子化方法对复杂基质样品不可以直接进样分析，需要样本前处理，因而无法实现快速分析实际样本。

发明内容

基于上述技术缺陷，本发明的技术目的是提供一种基于纸喷雾质谱快速分析低分子糖结构的方法及其应用。本发明的方法是采用含有特定糖的团簇离子作为分析物，我们定义了"R值"的计算方法，为两个产物离子之间的强度比，并且我们采用更广义的“母子离子对”进行分析(我们使用了两对，而Cooks团队只使用一对)，这使得我们的方法可以应用于更复杂的寡糖分析。更重要的是，我们使用了纸喷雾离子化质谱进行分析，纸喷雾离子化技术具备直接分析复杂样本(无需前处理或仅需简单前处理)的能力，可实现对临床干血浆样品的直接快速分析。

本发明提供一种基于纸喷雾质谱快速分析低分子糖的方法，所述方法是采用纸喷雾离子化质谱对含有特定糖的团簇离子(由糖分子、手性氨基酸配体及过渡金属离子形成)进行检测，然后计算R值作为区分常见低分子糖的判断依据；具体是将糖S与一个金属离子M和手性氨基酸配体L形成的三聚团簇离子作为前体离子，通过碰撞诱导解离每个前体离子会失去一个配体分子或一个糖分子，生成产物离子，所述R值为失去一分子配体的产物离子的强度与失去一分子糖的产物离子的强度之比，即

本发明所述的低分子糖，指的是包括单糖和寡糖在内的分子量较小的糖类，其中单糖包括已知的各类单糖，寡糖包括聚合度为2-8或2-10之间的糖类。

本发明的方法，更具体的说，所述前体离子一种形式为团簇离子A：[M(L)₂(S)–H]⁺，其经过碰撞诱导解离产生两种产物离子：失去一个配体分子的产物离子[M(L)(S)–H]⁺；和失去一个糖分子的产物离子[M(L)₂–H]⁺，则

所述前体离子另一种形式为团簇离子B：[M(L)(S)₂–H]⁺，其经过碰撞诱导解离产生两种产物离子：失去一个配体分子的产物离子[M(S)₂–H]⁺；和失去一个糖分子的产物离子[M(L)(S)–H]⁺，则

本发明的方法，当用于单糖时，单糖形成的团簇离子主要为团簇离子A：[M(L)₂(S)-H]⁺，通过R_A值一般即可区分单糖的种类和构型。当用于寡糖(如二糖)时，二糖形成的团簇离子为团簇离子A：[M(L)₂(S)–H]⁺和团簇离子B：[M(L)(S)₂–H]⁺，在一般情况下通过R_A值也可区分二糖的种类和构型，当R_A值区分不明显时，可结合使用R_A和R_B值区分二糖的种类和构型。其他聚合度的寡糖可由此类推。

本发明的方法，用于单糖时，优选地，所述金属离子M为金属离子Ni²⁺；所述手性氨基酸配体L为配体N-Fmoc-L-Pro。

本发明的方法，用于寡糖中的二糖时，优选地，所述金属离子M为金属离子Cu²⁺；所述手性氨基酸配体L为配体L-Pro。

本发明的方法，其中所述纸喷雾质谱的检测过程是将待测样品直接点样在色谱纸上，干燥后加入手性氨基酸配体和金属离子的混合溶液，反应后用洗脱溶剂和高压进行纸喷雾分析。

优选地，所述纸喷雾分析条件为：高压4.5kV，正离子模式，CID碰撞裂解能设置为0.35V。

本发明开发了一种使用纸喷雾二级质谱快速分析低分子糖的方法，方法取得的技术效果有：

(1)无需衍生化，无需昂贵的离子迁移部件，常规质谱就可以用来分析，也无需标记；质谱分析相较于传统糖结构分析方法，不需要核磁共振(NMR)对样品大小和纯度的高要求，也不需要色谱方法进样之前额外的耗时还可能导致更大误差和分析复杂度的柱前衍生步骤。不需要标记，可以通过串联质谱来区分低分子糖类(单糖和寡糖)，而不需要相对昂贵的离子迁移技术。本技术中使用的团簇离子的离子强度是原糖离子的强度的100倍，大大提升了检测的灵敏度。

(2)本发明对Cooks团队文献(Quantitative Chiral Analysis of Sugars byElectrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry Using Modified Amino Acidsas Chiral Reference Compounds)中R值的定义进行了修改，运用R值即可快速分析低分子糖的种类及结构，快速、经济、有效，并将该方法由仅区分几种单糖扩展到适用于复杂基质中的低分子糖分析。

(3)采用纸喷雾电离技术(一种可以用于复杂样本直接、快速检测的敞开式离子化技术)，可实现对复杂基质样本的直接快速分析。结合MS的高灵敏度和高通量分析能力，本文提供的分析方法在快速检测低分子糖作为临床样本中的生物标记物或未来的其他聚糖分析应用中具有潜在的应用前景。

(4)本方法不仅可以定性分析，也可以实现在低分子糖混合物中的定量分析。

(5)本发明还提供一种本方法的具体应用实例：可用于快速定量干燥血浆样本中葡萄糖与半乳糖的摩尔比，快速辅助诊断“半乳糖血症”，因此也证明了本方法具有广泛的临床应用前景。

附图说明

图1是本发明前体团簇离子的碎裂和R值的定义；

图2是不同单糖和不同二糖的结构式；

图3-1是D-葡萄糖团簇离子的二级质谱图；

图3-2是L-葡萄糖团簇离子的二级质谱图；

图4-1是D-葡萄糖团簇离子的二级质谱图；

图4-2是D-半乳糖团簇离子的二级质谱图；

图4-3是D-甘露糖团簇离子的二级质谱图；

图4-4是D-果糖团簇离子的二级质谱图；

图5-1是D-乳糖团簇离子的二级质谱图；

图5-2是D-蔗糖团簇离子的二级质谱图；

图5-3是D-乳果糖团簇离子的二级质谱图；

图5-4是D-纤维二糖团簇离子的二级质谱图；

图5-5是D-蜜二糖团簇离子的二级质谱图；

图5-6是D-海藻糖团簇离子的二级质谱图；

图6-1是D-麦芽糖和D-松二糖的R_A值；

图6-2是D-麦芽糖和D-松二糖的R_B值；

图7-1是D-Lac[Gal-β(1,4)-Glc]团簇离子的二级质谱图；

图7-2是D-Mel[Gal-α(1,6)-Glc]团簇离子的二级质谱图；

图7-3是D-Mal[Glc-α(1,4)-Glc]团簇离子的二级质谱图；

图7-4是D-Cel[Glc-β(1,4)-Glc]团簇离子的二级质谱图；

图7-5是D-Suc[Glc-α(1,2)-Fru]团簇离子的二级质谱图；

图7-6是D-Tre[Glc-α(1,1)-Glc]团簇离子的二级质谱图；

图7-7是D-Tur[Glc-α(1,3)-Fru]团簇离子的二级质谱图；

图7-8是D-Lact[Gal-β(1,4)-Fru]团簇离子的二级质谱图；

图8-1是Cu^II形成的团簇离子的二级质谱图；

图8-2是Ni^II形成的团簇离子的二级质谱图；

图9-1是NiCl₂形成的Ni^II团簇离子的二级质谱图；

图9-2是Ni(NO₃)₂形成的Ni^II团簇离子的二级质谱图；

图10-1是由L-Pro形成的团簇离子的二级质谱图；

图10-2是由L-Phe形成的团簇离子的二级质谱图；

图10-3是由L-Glu形成的团簇离子的二级质谱图；

图10-4是由L-His形成的团簇离子的二级质谱图；

图11-1是由L-Pro形成的团簇离子的二级质谱图；

图11-2是由N-Fmoc-L-Pro形成的团簇离子的二级质谱图；

图12-1是碰撞能量的研究；

图12-2是实验重现性；

图13-1是浓度为2.0mM的D-葡萄糖的质谱图；

图13-2是浓度为0.2mM的D-葡萄糖团簇离子的二级质谱图；

图13-3是浓度为2.0mM的D-乳糖的质谱图；

图13-4是浓度为0.2mM的D-乳糖团簇离子的二级质谱图；

图14-1是糖和配体(均过量)的摩尔比不影响R值；

图14-2是溶液的稀释程度不改变R值；

图15是干燥血浆中半乳糖与葡萄糖摩尔比与R值的标准曲线。

具体实施方式

下面参考附图来说明本发明的实施例。在本发明的一个附图或一种实施方式中描述的元素和特征可以与一个或更多个其他附图或实施方式中示出的元素和特征相结合。应当注意，为了清楚的目的，附图和说明中省略了与本发明无关的、本领域普通技术人员已知的部件或处理的表示和描述。

实施例1：本发明分析方法的构建

1.试剂与材料

单糖:D-葡萄糖(D-Glc)，L-葡萄糖(L-Glc)，D-半乳糖(D-Gal)、D-甘露糖(D-Man)、D-果糖(D-Fru)

二糖:D-乳糖(D-Lac),D-蔗糖(D-Suc)，D-乳果糖(D-Lact)，D-纤维二糖(D-Cel)，D-蜜二糖(D-Mel)，D-海藻糖(D-Tre)，D-麦芽糖(D-Mal)，D-松二糖(D-Tur)

氨基酸:L-脯氨酸(L-Pro)、L-苯丙氨酸(L-Phe)、L-谷氨酸(L-Glu)、L-组氨酸(L-His),N-(9-芴甲氧羰基)-L-脯氨酸(N-Fmoc-L-Pro)；

无机盐:氯化镍(NiCl₂)，硝酸镍[Ni(NO₃)₂]和氯化铜(CuCl₂)。

超滤管。

2.实验方法

2.1糖样品溶液和洗脱溶剂的制备

将每一种糖分析物溶于甲醇:水＝1:1(v/v)中，最终浓度为0.2mM，制备糖样品溶液。

洗脱溶剂为含0.1％甲酸的甲醇溶液。

2.2质谱条件

纸喷雾电压为4.5kV，正离子模式。CID裂解碰撞能为0.35V。本实施例中使用的是商业化四级杆-线性离子阱质谱仪(Q-Trap 6500,Sciex,USA)

2.3标准曲线的制作

使用经过超滤去除小分子的血浆作为基质，加入5.0mM葡萄糖和一系列不同浓度的半乳糖作为样品，制作标准曲线。半乳糖浓度范围为0.05～5.0mM,使Gal:Glc的摩尔比分别为0.01、0.05、0.1、0.2、0.5和1.0。将样品点样在已裁剪好的底和高分别为7mm的等腰三角形色谱纸上，晾干后再使用。

2.3实验步骤

样品(2微升糖样品溶液；400微升血浆)直接点样在底为7mm，高7mm的等腰三角形色谱纸上，待干燥后形成血浆斑点。在干燥的血浆斑点上加入10微升配体(单糖使用N-Fmoc-L-Pro，二糖使用L-Pro)和金属离子(单糖使用Ni²⁺，二糖使用Cu²⁺)的混合溶液，等待1分钟，使团簇离子充分形成；随后应用洗脱溶剂和高压进行纸喷雾分析——将三角形色谱纸用金属夹夹好，使色谱纸的三角形尖端正对于质谱进样孔，距离约为5mm，接着滴加8微升洗脱溶剂，同时加上4.5kV高压，正离子模式，CID碰撞裂解能设置为0.35V。

3.结果

三聚团簇离子[M(L)₂(S)–H]⁺和/或[M(L)(S)₂–H]⁺为前体离子，其中“S”为特定糖类，“M”为金属离子，“L”为手性氨基酸配体。如图1所示，前体团簇离子A[M(L)₂(S)-H]⁺经过裂解可以产生两种典型的产物离子，产物离子[M(L)(S)-H]⁺表示失去配体，产物离子[M(L)₂–H]⁺表示失去一个糖基；而前体团簇离子B[M(L)(S)₂–H]⁺通过CID产生两个典型的产物离子，即产物离子[M(S)₂–H]⁺表示失去配体和产物离子[M(L)(S)–H]⁺表示失去糖。

本发明的分析方法是采用含有特定糖的团簇离子作为分析物，但我们改变了"R值"的计算方法，将其改为两个产物离子之间的强度比，并且我们采用更广义的“母子离子对”进行分析(我们使用了两对，而Cooks团队只使用一对)，这使得我们的方法可以应用于更复杂的寡糖分析。我们将R值定义为失去一分子配体的产物离子的强度与失去一分子糖的产物离子的强度之比。以R值作为区分常见简单糖类(包括单糖和二糖)的基础，如图1中R值、R_A值、R_B值的计算等式所示。

在确定了上述"R值"的定义后，采用代表性的单糖和二糖来考察所建立方法的适用性。图2示出了不同种类单糖(D-Glc,D-Gal,D-Man,D-Fru)和不同构型单糖(D-GlcL-Glc)、以及具有不同单糖组成、连接位点和α/β构象的二糖的8种异构体的结构式。

单糖形成的簇离子主要为A型前体团簇离子[M(L)₂(S)-H]⁺，R_A值能区分单糖的D-/L-构型。我们以葡萄糖(Glc)为例，图3-1和图3-2为D-Glc和L-Glc的MS/MS CID谱图。其前体离子均为m/z 911([Ni^II(N-Fmoc-L-Pro)₂(Glc)–H]⁺)，前体团簇离子m/z 911可通过CID生成两种典型产物离子m/z 574([Ni^II(N-Fmoc-L-Pro)(Glc)–H]⁺)和m/z 731([Ni^II(N-Fmoc-L-Pro)₂–H]⁺)。R_A值等于m/z 574的强度与m/z 731的强度之比。D-Glc的R_A值为0.769，小于1(m/z 574峰小于m/z 731峰)，L-Glc的R_A值为1.156，大于1(m/z 574峰大于m/z 731峰)。通过计算R_A值，我们可以很容易地区分D-Glc和L-Glc。

为了研究R_A值对单糖种类的鉴别能力，我们使用四种常见单糖(D-Glc,D-Gal,D-Man和D-Fru)进行分析，将它们都固定在D构型中，其MS/MS CID谱图如图4-1～图4-4所示。类似地，R_A值等于m/z 574([Ni^II(N-Fmoc-L-Pro)(单糖)–H]⁺)与m/z 731([Ni^II(N-Fmoc-L-Pro)₂–H]⁺)的强度之比，因此对应于D-Glc、D-Gal、D-Man和D-Fru的R_A值分别约为0.769、1.010、2.226和2.703。不同单糖种类的R_A值相差很大，可以R_A值来区分。

对于一些二糖，它们的R_A值有很大的差异，足以区分它们，如图5-1至图5-6，D-Lac(R_A＝9.681),D-Suc(R_A＝0.701),D-Lact(R_A＝25.574),D-Cel(R_A＝1.753),D-Mel(R_A＝2.925)和D-Tre(R_A＝0.045)，仅凭其R_A值即可区分它们。

对于单用R_A值无法区分的二糖，如D-Mal和D-Tur，它们的R_A值都是～2.5，结合使用R_A值和R_B值我们可以很容易地区分它们。如图6-1至图6-2所示，结合使用R_A值和R_B值鉴别D-Mal和D-Tur。图6-1是D-Mal和D-Tur的R_A值都在2.5左右，不能单独通过R_A值进行鉴别；图6-2是D-Mal和D-Tur具有不同的R_B值，可以结合使用R_A值和R_B值进行鉴别，D-Mal的R_B值约为零(N/A)，这是由于前体团簇离子[Cu^II(L-Pro)(D-Mal)₂–H]⁺经历CID裂解，几乎不产生产物离子[Cu^II(D-Mal)₂–H]⁺，因此产物离子[Cu^II(D-Mal)₂–H]⁺的强度非常低；而D-Tur的R_B值约为3.745。D-Mal和D-Tur的R_B值之间的差异非常大，因此很容易区分。

总的来说，我们可以根据R值区分常见的二糖种类。

进一步地，对于二糖的构型，由于二糖是由两个单糖通过糖苷键连接而成，因此可以在几种情况下讨论二糖异构体的鉴别，如表1所示。

表1：六种不同情况下二糖异构体的鉴别

我们通过对比实验对这六种情况进行了研究，如图7-1至图7-8，结果表明，在前五种情况中，仅根据R_A值就可以很容易地实现二糖的区分。在第六种情况下，三种二糖D-Suc/D-Mel/D-Tre可单独通过R_A值确定，而D-Mal与D-Tur的区分需要结合使用R_A值和R_B值。

综合上述，我们可以根据R值区分常见的单糖和二糖的种类和构型。

实施例2：本发明分析方法技术的优化

1、金属离子的优化

在以往的关于使用簇离子来区分手性化合物的报道中，研究人员通过研究许多过渡金属已经证实，Cu²⁺和Ni²⁺离子表现得更好。因此，本研究对Cu²⁺和Ni²⁺离子进行了优化选择。首先通过固定阴离子来优化阳离子。我们比较了CuCl₂和NiCl₂，发现Ni^II簇离子比Cu^II形成的簇离子更能区分单糖种类(图8-1至图8-2)。然后，我们比较了NiCl₂和Ni(NO₃)₂，研究了不同阴离子镍盐形成的Ni^II簇离子对单糖R_A值的影响(图9-1至图9-2)。实验结果表明，无论是使用NiCl₂还是Ni(NO₃)₂，单糖的二级质谱几乎没有变化，因此阴离子差异对单糖的R_A值影响不大。这表明阴离子对团簇离子的形成几乎没有贡献。最后我们选择用NiCl₂进行单糖实验。

2、手性氨基酸配体的优化

为了选择最佳配体，我们对手性氨基酸进行了优化。以D-Glc和D-Gal为例，使用优化后的NiCl₂，将碰撞能量(CE)设置为0.35V进行CID碎裂。首先，我们比较了不同类型的氨基酸，并对4种氨基酸(L-Pro、L-Phe、L-Glu和L-His)进行了研究。这四种氨基酸分别代表了四种不同结构类型的常见氨基酸，即脂肪氨基酸、芳香氨基酸、杂环氨基酸和杂环亚氨基酸。由这四种氨基酸形成的团簇离子的质谱图如图10-1至图10-4所示，在这四种氨基酸中，L-Pro的表现相对最好。

接下来，我们比较了L-Pro和N-Fmoc-L-Pro，研究保护组对R_A值的影响，见图11-1和图11-2。我们最终选择了N-Fmoc-L-Pro，因为它参与了团簇离子的形成，能够更好地区分单糖种类。

我们用类似的方法对二糖团簇离子中的金属离子和手性氨基酸配体进行了优化，发现Cu²⁺和L-Pro是分析二糖的最佳选择。

3、CID能量和实验重现性的研究

以D-Glc和L-Glc为样品研究。以0.35V为最佳CE，见图12-1。实验重现性好，见图12-2。

实施例3：本发明分析方法检测灵敏度的比较

糖的高亲水性和高极性导致检测灵敏度低是糖质谱检测的瓶颈之一。糖簇比糖本身更容易电离。我们可以观察到，如图13-1至图13-4，比较用D-Glc和D-Gal的团簇离子和糖本身作为分析物的质谱和二级质谱图，可以看出，与直接分析糖离子本身相比，使用团簇离子作为分析物的峰值强度增加了约100倍。

实施例4：本发明分析方法R值稳定性研究

首先，我们研究了不同比例的糖和配体制备溶液对R值的影响，两者都过量。固定氯化镍的浓度，同时以1:1、1:2、2:1、1:3和3:1的摩尔比添加过量的D-Glc和N-Fmoc-L-Pro或D-Gal和N-Fmoc-L-Pro。我们对上述溶液进行了MS/MS分析，并研究了每种条件下团簇离子[Ni^II(N-Fmoc-L-Pro)₂(D-Glc)–H]⁺和[Ni^II(N-Fmoc-L-Pro)₂(D-Gal)–H]⁺的R_A值。实验结果表明，无论糖类和配体过量程度如何，R_A值保持不变。这表明糖和配体与Ni²⁺配位形成的团簇离子具有固定的组成比，这是由Ni²⁺的配位能力决定的。

接下来，我们研究了混合糖团簇离子的R值是否随着溶液不断稀释而变化。我们将D-Glc与D-Gal混合作为糖类混合物的示例。按照形成簇离子[Ni^II(N-Fmoc-L-Pro)₂(saccharide)–H]⁺(糖：配体：金属＝2:2:1)的摩尔比按比例制备溶液。我们测试了D-Glc和D-Gal的摩尔比分别为1:1、1:3和3:1的三种糖类混合物。所有三种糖类混合物的初始浓度均为0.2mM，并分别稀释2倍、5倍和10倍进行ESI-MS/MS分析。实验结果表明，混合糖的R_A值几乎稳定，且几乎不受稀释的影响,见图14-1至图14-2，示出了糖和配体的过量程度(14-1)和溶液的稀释程度(14-2)不改变R值。

实施例5：本发明分析方法临床上的拓展应用

团簇离子R值的稳定性使我们的方法能够发展为潜在的实际应用，如快速临床检测。例如，我们的方法可用于定量血浆中的半乳糖和葡萄糖，以帮助诊断半乳糖血症。半乳糖血症是一种常染色体隐性遗传先天性代谢疾病，由半乳糖-1-磷酸尿苷转移酶缺乏引起，导致半乳糖积累。半乳糖的积累会导致新生儿出现许多症状，如肝病、白内障和败血症，如果不及时治疗会导致死亡。许多国家开发并应用新生儿筛查，使用多种方法检测半乳糖或其衍生产品在血液或尿液中的积累。

临床上，当新生儿血液中的半乳糖浓度大于1.1mM时，表明可能存在半乳糖血症。此外，我们已经知道正常新生儿血糖范围为2.6-7.0mM。Gal/Glc摩尔比与R_A值的标准曲线(均为自然对数)涵盖了从健康到疾病的广泛范围，具有可接受的线性(校正系数R²＝0.9972)，见图15。

图15是干燥血浆中半乳糖与葡萄糖摩尔比与R值的标准曲线。

我们在背景基质中加入不同比例的葡萄糖和半乳糖，分别模拟健康新生儿和半乳糖血症新生儿的血浆样本。对于未来的临床检测，我们相信干全血斑点可以直接使用。然而，在本发明中，使用干血浆斑点代替干全血斑点，以实现葡萄糖和半乳糖的精确混合，从而制备相应的模拟样品。通过计算R_A值，我们可以大致确定Gal/Glc的摩尔比是否在健康或疾病范围内。对于健康和疾病之间的模糊范围，需要更多的信息来做出判断。这种不确定性在很大程度上是由健康人的血糖是一个范围而不是一个固定值这一事实决定的。我们的方法对于快速测定典型健康或疾病样本非常有用。

综上所述，本技术能实现对低分子糖的快速定性定量分析，纸喷雾电离方法使此技术能直接应用于复杂基质样品的直接快速检测，如辅助“半乳糖血症”的检测，具有广泛的应用前景。

虽然已经详细说明了本发明及其优点，但是应当理解在不超出由所附的权利要求所限定的本发明的精神和范围的情况下可以进行各种改变、替代和变换。而且，本申请的范围不仅限于说明书所描述的过程、设备、手段、方法和步骤的具体实施例。本领域内的普通技术人员从本发明的公开内容将容易理解，根据本发明可以使用执行与在此所述的相应实施例基本相同的功能或者获得与其基本相同的结果的、现有和将来要被开发的过程、设备、手段、方法或者步骤。因此，所附的权利要求旨在它们的范围内包括这样的过程、设备、手段、方法或者步骤。

Claims

1.一种基于纸喷雾质谱快速分析低分子糖的方法，其特征在于，所述方法是采用纸喷雾离子化质谱对含有特定糖的团簇离子进行检测，所述团簇离子由糖分子、手性氨基酸配体及过渡金属离子形成，然后计算R值作为区分常见低分子糖的判断依据；具体是将糖S与一个金属离子M和手性氨基酸配体L形成的三聚团簇离子作为前体离子，通过碰撞诱导解离每个前体离子会失去一个配体分子或一个糖分子，生成产物离子，所述R值为失去一分子配体的产物离子的强度与失去一分子糖的产物离子的强度之比，即

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述低分子糖包括单糖和寡糖。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述前体离子一种形式为团簇离子A：[M(L)₂(S)–H]⁺，其经过碰撞诱导解离产生两种产物离子：失去一个配体分子的产物离子[M(L)(S)–H]⁺，和失去一个糖分子的产物离子[M(L)₂–H]⁺，则

所述前体离子另一种形式为团簇离子B：[M(L)(S)₂–H]⁺，其经过碰撞诱导解离产生两种产物离子：失去一个配体分子的产物离子[M(S)₂–H]⁺，和失去一个糖分子的产物离子[M(L)(S)–H]⁺，则

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，单糖形成的团簇离子主要为团簇离子A：[M(L)₂(S)-H]⁺，通过R_A值来区分单糖的种类和构型。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，寡糖中的二糖形成的团簇离子为团簇离子A：[M(L)₂(S)–H]⁺和团簇离子B：[M(L)(S)₂–H]⁺，通过R_A值或R_A值结合R_B值区分二糖的种类和构型。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述金属离子M为金属离子Ni²⁺；所述手性氨基酸配体L为N-Fmoc-L-Pro。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述金属离子M为金属离子Cu²⁺；所述手性氨基酸配体L为L-Pro。

8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，所述纸喷雾离子化质谱的检测过程是将待测样品直接点样在色谱纸上，干燥后加入手性氨基酸配体和金属离子的混合溶液，反应后用洗脱溶剂和高压进行纸喷雾分析。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述纸喷雾分析条件为：高压4.5kV，正离子模式，CID碰撞裂解能设置为0.35V。

10.权利要求1-9任一项所述的方法在快速分析干血浆样本中的葡萄糖与半乳糖的比值中的应用。