CN104603617A - 使用定点衍生化和lc/ms/ms工作流程分析一组脑腱黄瘤病生物 - Google Patents

使用定点衍生化和lc/ms/ms工作流程分析一组脑腱黄瘤病生物 Download PDF

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Abstract

本发明提供用于分析人血浆、血清或全血中的酮固醇生物标记物(例如胆汁酸前体)的方法、标记试剂、标记试剂组和标记技术。此方法被用于筛查新生儿的脑腱黄瘤病CTX。此外还揭示了用于标记、分析和量化酮固醇生物标记物的方法，以及同样使用质谱法的方法。

Description

使用定点衍生化和LC/MS/MS工作流程分析一组脑腱黄瘤病生物
相关申请
本申请要求了2012年5月18日提交的美国临时申请第61/649,044号的优先权，所述申请的全部内容以引用的方式并入本文中。
政府许可权利
本发明可能已经部分地在政府支持下，在NCRR和NIH的NCATS授予的OCTRI基金编号5KL2 RR024141-04下完成。政府可以拥有本发明的某些权利。
技术领域
本文所述的教示涉及使用标记试剂分析酮固醇胆汁酸前体的方法和试剂盒。
背景技术
新生儿筛查程序可以通过遗传病症的早起检测和治疗有效地拯救生命以及防止严重的病态(例如智力迟钝)。因此，筛查新生儿应该扩大到包括额外失调症，特别是具有治疗选择的失调症。
其中新生儿筛查程序可能特别有用的遗传病症包括那些涉及固醇路径改变的遗传病症。这些病症可以导致过早的死亡和发病且包括病症例如脑腱黄瘤病(CTX)、Smith-Lemli-Opitz综合症、家族性高胆固醇血症和先天性肾上腺增生。CTX在最近的一份美国大学医学遗传学报告中已经被确定为普遍新生儿筛查的候选疾病。然而，为了有效，CTX的筛查和/或诊断方法必须具有足够的灵敏性和选择性。
CTX是由CYP27A基因(CYP27A基因也被称为固醇27-羟化酶基因)的突变所引起的一种罕见遗传性固醇病症。CYP27A基因与在产生胆汁酸过程中具有重要性的P450酶有关。当CYP27A活性被抑制或阻断时，胆汁酸前体将在各种组织中积累。CTX经常在幼年时期呈现，且伴随着由酮固醇胆汁酸前体和其衍生物的积累所引起的症状缓慢增加。CTX经常直到成年期才被确诊，而此时已经造成显著损害。CTX的生化表型显示在图12中。
先前曾经考虑过筛查27-羟化酶缺陷的生物标记物。然而，CTX的生物标记物是酮固醇生物标记物化合物，且因为这些生物标记物在临床和生物样品(例如血浆)中的含量通常很低，所以这种筛查提出了挑战。另外，所述生物标记物可能以甚至更低的含量存在于未受影响的个体中，从而使得难以获得参照。当使用反相(RP)色谱法时，高疏水性酮类固醇给色谱分析带来了挑战。通过质量分析来检测和量化酮固醇生物标记物类固醇同样特别有挑战性，因为此类化合物的电离效率不良、电离图案复杂、同重元素化合物干扰质量测量以及样品介质中的低样品浓度。
可利用标准色谱技术(例如GC-MS方法)进行化学衍生后的分析。参见例如Song,J.等人,Journal of Chromatography B.,791卷,1-2期,(127-135)2003，其内容以引用的方式并入本文中。还可以利用使用荧光检测和某些免疫分析(包括放射免疫分析(RIA))的方法，但这些方法通常不提供多组分分析。使用RIA的主要问题是缺少特异性和需要对每种类固醇进行不同分析。
用来分析在CTX和肠道疾病中积累的酮固醇(例如5α-胆固-3-酮和其它胆汁酸前体)的一种现有分析方法已被描述在(例如)美国专利案第8,158,435号；Andrea E.DeBarber等人：Clinica Chimica Acta,411(2010)43-48；Akira Honda等人：The Journalof Biological Chemistry 276,37(2001)34579-34585；和M.Camilleri等人Neurogastroenterol Motil(2009)21,734-e43技术说明中，所述文献以引用的方式并入本文中。GC-FID或GC-MS被用于CTX的生化筛查，所述筛查使用Girard P衍生化和ESI-MSMS检测。然而，基于GC的方法的限制包括长分析时间(>30min)和复杂的样品制备。
以上与检测和量化样品中的酮固醇生物标记物化合物有关的挑战在希望快速筛查和/或分析大量生物样品中的特定受关注化合物或一组酮固醇胆汁酸前体时被放大。
另外，传统方法可能耗费人力且缺少测量正常未受影响患者的血清或全血样品所必需的灵敏性，特别是对通常只能获得少量样品的新生儿筛查来说。因此，希望拥有用于分析受影响人类样品和正常人类样品中的CTX生物标记物水平的简单和特定方法。
因此，仍然需要适用于确认和量化CTX的具灵敏性且选择性的筛查测试。此测试优选对量化酮固醇和可用作CTX标记物的其它分析物具有灵敏性和特异性。
发明内容
根据本教示的一些广泛方面，公开了用于检测和量化人类样品(例如受影响或正常的人类样品)中的CTX和IBS(肠易激综合症)生物标记物的方法。在许多实施例中，这些方法使用本文所公开的季氨氧基(QAO)试剂，以提高受关注分析物(例如CTX生物标记物)的电离效率，从而经由质谱法检测实现所需LLOQ，即使对于低体积(例如小于约5微升(μL)的样品体积，如小于10μL的样品体积，例如在约3至约5μL的范围内)样品来说。酮固醇胆汁酸前体是CTX和IBS生物标记物的实例。
在各个实施例中，本文所公开的同位素富集型季氨氧基试剂可以用于通过与洁净标准物的简单反应来制造每种受关注分析物的内标物。在一些实施例中，可以通过用本文所公开的季氨氧基试剂的同位素变体标记已知浓度的多种生物标记物分析物(即，用QAO试剂的不同同位素变体标记每种生物标记物)来制造一组生物标记物的内标物。可以将这些内标物添加到测试样品中以允许受关注生物标记物的绝对量化。
在各个实施例中，根据本教示的方法可以用于酮固醇生物标记物的高灵敏性和特异性分析，这允许从各种样品(包括具有低体积和复杂生物基质的样品)中检测酮类固醇胆汁酸前体。
在一些实施例中，公开了一种诊断或筛查27-羟化酶缺陷的方法，其包括用QAO试剂(例如以上所公开的QAO试剂)处理人类样品以标记样品中的一种或多种酮固醇胆汁酸前体，以及对经处理的样品进行LC-MS分析以检测和量化标记前体。
在某些情况下，上述方法可以进一步包括通过用本文所公开的不同同位素标记QAO试剂标记已知浓度的不同酮固醇胆汁酸前体制备一种或多种内标物。在一些实施例中，这些内标物可以用来同时量化一组生物标记物，例如使用LC-MS。例如，在一些实施例中，使用这些内标物允许在LC-MS光谱仪的单次操作中检测和量化一组生物标记物。
在一些实施例中，用于标记供质量分析用的酮固醇胆汁酸前体的季氨氧基(QAO)试剂包括式(I)标记试剂：
Y-(CH2)n-O-NH2(I)
其中n是2、3、4、5或6且Y是：
其中每个R4独立地为H或是支链或直链C1-C18烷基，
m是1与20之间的整数，且
X是阴离子；
或其盐或水合物。
在一些实施例中，标记试剂是：
在一些实施例中，样品是生物基质，例如血液、血清、血浆、尿液或唾液。作为新生儿筛查的一部分的血液样品分析是在本教示的范围内。例如，在一些实施例中，本教示的方法可以用于分析体积为10μL或更少、或5μL或更少的干血粉、血清或血浆样品，或者分析从新生儿筛查卡打孔物获得的干血粉、血清或血浆样品。
在一些实施例中，分析1、2、3或4种酮固醇胆汁酸前体，例如7α-胆固烯-3-酮(7αC4)、5α-胆固烷-3-酮、4-胆固烯-3-酮、7α,l2α-二羟基-4-胆固烯-3-酮、7α-羟基-5β-胆固烷-3-酮和7α,12α-二羟基-5β-胆固烷-3-酮(7α,12α-C4)中的一个或多个。
此外，本发明提供在极低浓度下的质量定量且因此可以用于在(例如)不具有显著高浓度的这些化合物的群体中测量酮固醇胆汁酸前体的浓度。
在一些实施例中，可以提供酮类固醇分析试剂盒以允许高度灵敏地(低pg/mL浓度)定量复杂生物基质中的酮类固醇。
在一些实施例中，本文所述的方法可以测量相对浓度、绝对浓度或两者，且可以应用于一种或多种样品中的一种或多种酮固醇胆汁酸前体。本方法可以使用同位素富集内标物(IS)或同重元素标记试剂以及质量示差标记试剂，这取决于用于检测酮类固醇的化合物的同位素取代和标记策略的选择。
在一些实施例中，本教示提供了一种量化酮类固醇和含有酮或醛官能团的分析物的方法。在一些实施例中，所述方法可以包括化学衍生法和液相色谱法/串联质谱法(LC/MSMS)工作流程。所述方法可以包括使用永久带电的氨氧基试剂，其可以显著提高酮类固醇的检测极限。
将显而易见的所述实施例的这些和其它特征被阐明和描述在本文中。
附图说明
下文参照(例如)以下图式提供各个实施例的详细描述。本领域的技术人员应该理解以下描述的图式仅用于举例说明。这些图式无意以任何方式限制申请人的教示的范围。
图1是显示样品制备、衍生化和衍生化分析物的LC/MS/MS分析的方法流程图。
图2A和2B是显示样品制备、衍生化和衍生化分析物的LC/MS/MS分析的两种方法的流程图。在图2A和2B中各自使用7αC4作为实例。
图3提供使用这种方法获得的7α-胆固烯-3-酮(在DCS血清中为1-400ng/mL)的典型浓度曲线。
图4A-4D提供针对来自代表性正常(图4A)和CTX(图4B)患者血浆以及空白DCS血清(图4C)和DCS血清中的1.3ng/mL样品(图4D)的干燥样品点所产生的QAO标记7α-胆固烯-3-酮的MRM数据。
图5A-5D提供针对来自代表性正常(图5A)和CTX(图5B)患者血浆以及空白DCS血清(图5C)和DCS血清中的1.3ng/mL样品(图5D)的干燥样品点所产生的QAO标记4-胆固烯-3-酮的MRM数据。
图6A-6D提供针对来自代表性正常(图6A)和CTX(图6B)患者血浆以及空白DCS血清(图6C)和DCS血清中的1.3ng/mL样品(图6D)的干燥样品点所产生的QAO标记5α-胆固烷-3-酮的MRM数据。
图7显示针对三种不同QAO标记酮固醇的QAO衍生化方法性能。
图8是使用d77αC4作为IS(方形)以及氘化试剂作为IS(菱形)的浓度曲线。
图9是显示使用d77αC4作为IS(右)和氘化试剂作为IS(左)分析正常和CTX样品的图表。
图10是使用方法3获得的DCS血清中7αC4的浓度曲线。
图11A-11F是空白DCS血清(存在一些内生7αC4)2.5ng/mL std和正常未受影响个体的典型样品的代表性色谱图，其中图11A是DCS中空白7αC4的色谱图。图11B是7αC4的内标物。图11C是2.5ng/mL 7αC4的色谱图。图11D是7αC4的内标物。图11E是7αC4的典型样品的色谱图。图11F是7αC4的内标物。
图12是CYP27A缺陷的生化表型。
图13A是未在管柱上衍生化的50pg 7αC4的扫描图。图13B是在管柱上衍生化的80fg 7αC4的扫描图。信号增强了400倍。
图14是QAO标记7αC4的产物离子光谱，其在m/z 515.7[M]+、m/z 456.5[M-59]+、m/z 438.6[M-59-18]+和m/z 152.3[QAO基团碎片]+下具有强度。
图15A-15C提供针对掺加血浆校准物中的QAO标记7αC4的监测，其中图15A提供在515.7>152.3下具有m/z跃迁的5.0ng/mL DSC血浆。图15B提供DCS血浆空白，且图DC提供2.5ng/mL下的DCS血浆。
图16A-16C提供针对代表性未受影响样品的血浆中QAO标记7a C4的监测，其中图16A提供在518.7>152.3下具有m/z跃迁的7αC4-d7衍生物(上部迹线)和在515.7>152.3下具有m/z跃迁的7αC4-d0衍生物(下部迹线)。图16B和图16C提供了稀释25倍的CTX样品。
图17提供使用QAO试剂和酮基-d0标记型7αC4-d7内标物获得的7αC4定量方法验证数据的表格。
图18提供使用QAO试剂和酮基-d3标记型7αC4-d0内标物获得的7αC4定量方法验证数据的表格。
图19提供使用与d3内标物作比较的d7计算得到的7αC4浓度的表格。
图20A-20C提供针对代表性未受影响样品的血浆中QAO标记7α12αC4的监测，其中图20A提供在534.77>152.3下具有m/z跃迁的7α12αC4-衍生物(上部迹线)和在531.7>152.3下具有m/z跃迁的7α12αC4-d0衍生物(下部迹线)。图20B和图20C提供了稀释25倍的CTX样品。
图21提供使用QAO试剂和酮基-d3标记型7α21αC4内标物获得的7α12αC4定量方法验证数据的表格。
图22提供使用7αC4和7α12αC4作为CTX的诊断标记物的表格，其中d3标记内标物的血浆浓度。
图23A-23C提供针对成人DBS中的QAO标记7α12αC4的监测。图23A显示代表性未受影响样品，其中7α12αC4-d3衍生物在534.7>152.3下具有m/z跃迁(上部迹线)，且7α12αC4-d0衍生物在531.7>152.3下具有m/z跃迁(在此样品中未观察到下部迹线)。图23B和23C提供具有d0(上部迹线)和d3(下部迹线)的CTX样品。
图24A-24C提供针对新生儿DBS中的QAO标记7α12αC4的监测。图24A显示代表性未受影响样品，其中7α12αC4-d3衍生物在534.7>152.3下具有m/z跃迁(上部迹线)，且7α12αC4-d0衍生物在531.7>152.3下具有m/z跃迁(下部迹线)。图24B和24C提供具有d0(上部迹线)和d3(下部迹线)的CTX样品。
应当了解的是，所述图式仅为例示性且对图式的所有参考只是为了说明，而无意以任何方式限制下文所述的实施例的范围。为了方便起见，也可以在所有图式中重复参考数字(具有或不具有位移)以指示类似组件或特征。
具体实施方式
应该理解为了清楚起见，以下论述将说明本教示的实施例的各个方面，但在方便或适当的地方省略了某些具体细节。例如，在替代实施例中可以稍微节略对相同或类似特征的论述。为了简单起见，对众所周知的想法或概念也可以不作任何详细论述。技术人员将认识到某些实施例在每次实施时可以不需要某些具体描述的细节，所述细节在本文中的阐述只是为了提供对实施例的彻底理解。类似地，应当明白在不脱离本公开的范围的情况下，所述实施例可以根据常识稍作改变或变化。以下实施例的详细描述不应该被视为以任何方式限制本教示的范围。
本发明描述了一种检测和量化人类样品(例如人血浆、血清或全血)中的酮固醇生物标记物(例如胆汁酸前体)的方法。在一些实施例中，公开了一种诊断或筛查27-羟化酶(CYP27A1)缺陷，例如发现于脑腱黄瘤病(CTX)和肠易激综合症(IBS)失调症中的CYP27A1缺陷的方法。在各个实施例中，提供了一种同步分析CTX和肠易激综合症疾病的酮固醇生物标记物的快速简单的解决方法，因而使得常规筛查这些失调症以及与CYP27A1缺陷有关的其它失调症和/或病症成为可能。这可以是有用的，例如用于筛查新生儿的CTX。
在受关注的生物标记物中有7α-胆固烯-3-酮(7αC4)、5α-胆固烷-3-酮、4-胆固烯-3-酮、7α,l2α-二羟基-4-胆固烯-3-酮(7α12αC4)和由于27-羟化酶(CYP27A1)缺陷而积累的其它酮固醇胆汁酸前体。
建立每种受关注酮固醇生物标记物的内标物的简单廉价方法是有用的且有时是关键的。本文所述的QAO试剂大体上改善这些酮固醇胆汁酸前体的电离效率，且提供比未使用QAO试剂时明显更低的LLOQ。此方法允许使用低至3-5pL的样品体积进行分析。
本文中所述的实施例包括用于新生儿筛查的诊断或筛查方法。然而，本文所述的方法同样可用于其它群体和筛查/诊断，例如幼儿和成人。
在一些实施例中，同位素富集型季氨氧基试剂可以通过与洁净标准物的简单反应而用于制造每种受关注分析物的IS。可以通过用季氨氧基试剂的同位素变体标记已知浓度的分析物建立一组生物标记物的特定浓度的内标物。然后可将其掺加到测试样品中并用作内标物。
本文所述的用作质谱技术中的分析物的酮固醇生物标记物被发现于各种生物基质例如生理流体样品、细胞或组织裂解物样品、蛋白质样品、细胞培养物样品、发酵培养基样品、农产品样品、动物产品样品、动物饲料样品、供人类食用的食品或饮料样品、其组合等以及实质上任何其中存在酮固醇生物标记物功能的样品中。生物基质的实例包括生理流体，例如血液、血清、血浆、汗液、眼泪、尿液、腹膜夜、淋巴、阴道分泌物、精子、脊髓液、腹水、唾液、痰、乳房渗出液和其组合。在一些实施例中，样品来自干血点(DBS)。在一些实施例中，DBS样品是来自新生儿筛查的DBS。
本教示被应用于由于27-羟化酶(CYP27A1)缺陷而积累的酮固醇胆汁酸前体。酮固醇胆汁酸前体包括(例如)7α-胆固烯-3-酮(7αC4)、5α-胆固烷-3-酮、4-胆固烯-3-酮和7α,l2α-二羟基-4-胆固烯-3-酮。
本教示还被应用于筛查和/或诊断CTX的方法。尤其可用于诊断和/或筛查CTX的胆汁酸前体包括7α-胆固烯-3-酮(7αC4)、5α-胆固烷-3-酮、4-胆固烯-3-酮和7α,l2α-二羟基-4-胆固烯-3-酮。
在一些实施例中，提供了一种使用QAO试剂使包括一种或多种胆汁酸前体的分析物衍生化，电离标记分析物和通过质量分析检测所述标记分析物的特征离子碎片以及量化浓度的方法。在一些实施例中，胆汁酸前体包括7αC4且大于50ng/mL的浓度指示CTX。在其它实施例中，大于75ng/mL、大于100ng/mL、大于150ng/mL、大于200ng/mL、大于250ng/mL或大于300ng/mL的7αC4浓度指示CTX。在其它实施例中，用于确定样品是否指示27-羟化酶缺陷的胆汁酸前体浓度可以通过使用表格(例如图9中提供的针对使用7αC4筛查CTX的表格)来确定。
本教示还被应用于筛查和/或诊断Δ4-3-氧代类固醇-5B还原酶缺陷的方法。尤其可用于诊断和/或筛查Δ4-3-氧代类固醇-5B还原酶缺陷的胆汁酸前体包括7α-胆固烯-3-酮和7α,l2α-二羟基-4-胆固烯-3-酮。
本教示还被应用于筛查和/或诊断肠易激综合症(IBS)的方法。
本教示还被应用于筛查和/或诊断胆汁酸吸收不良的方法。尤其可用于胆汁酸吸收不良的胆汁酸前体包括7α-羟基-4-胆固烯-3-酮。
在一些实施例中，量化单一酮固醇胆汁酸前体。在一些实施例中，量化两种或更多种酮固醇胆汁酸前体。在一些实施例中，在单个分析中量化由于27-羟化酶(CYP27A1)缺陷而积累的一组三种或更多种酮固醇胆汁酸前体。
在其它实施例中，在一个小组中量化四种或更多种酮固醇胆汁酸前体。在一些实施例中，量化7α-胆固烯-3-酮(7αC4)和7α,l2α-二羟基-4-胆固烯-3-酮中的至少一个。在一些实施例中，量化7α-胆固烯-3-酮(7αC4)、5α-胆固烷-3-酮、4-胆固烯-3-酮、和7α,l2α-二羟基-4-胆固烯-3-酮中的每一个。在一些实施例中，分析7α-胆固烯-3-酮(7αC4)、5α-胆固烷-3-酮、4-胆固烯-3-酮、7α,l2α-二羟基-4-胆固烯-3-酮、7α-羟基-5β-胆固烷-3-酮和7α,12α-二羟基-5β-胆固烷-3-酮中的每一个。在一些实施例中，量化7α-胆固烯-3-酮(7αC4)、5α-胆固烷-3-酮、4-胆固烯-3-酮、7α,l2α-二羟基-4-胆固烯-3-酮、7α-羟基-5β-胆固烷-3-酮和7α,12α-二羟基-5β-胆固烷-3-酮中的每一个。
可以通过各种方法富集样品。富集方法取决于样品的类型，例如血液(新鲜或干燥)、血浆、血清、尿液或唾液。例示性富集方法包括蛋白质沉淀、液液萃取、固液萃取和超滤作用。可以使用其它富集方法或者两种或更多种富集方法的组合。
标记试剂
因此，本文提供了一种酮固醇胆汁酸前体的质量分析方法，所述方法使用特定标记试剂并选择用于分析的特征离子碎片。
在一些实施例中，提供了用于生物样品中酮固醇胆汁酸前体的相对定量、绝对定量或两者的标记试剂和标记试剂组，其包括具有通式(I)的胺氧化物标记试剂：
Y-(CH2)n-O-NH2    (I)
其中n是2、3、4、5或6且Y具有以下结构：
每个R4独立地为H或是支链或直链C1-C18烷基，
m是在1与20之间的整数，且
X是阴离子；
或其盐或水合物。
在一些实施例中，n是2至4，且在其它实施例中，n是3。在一些实施例中，Y是-N(CH3)3 (+)。在一些实施例中，m是在1与12之间的整数或在1与5之间的整数。在一些实施例中，每个R4独立地为H或是支链或直链C1-C12烷基，或者每个R4独立地为H或是支链或直链C1-C6烷基。在一些实施例中，每个R4是相同的。
在一些实施例中，式(I)化合物是盐。在一些实施例中，所述盐是CF3COO-、CF3CF2COO-、CF3CF2CF2COO-或CF3SO3COO-。在一些实施例中，所述盐是全氟羧酸盐。
在一些实施例中，式I标记试剂是：
或其盐或水合物。在一些实施例中，式(II)化合物是盐。在一些实施例中，所述盐是CF3COO-、CF3CF2COO-、CF3CF2CF2COO-或CF3S03COO-。在一些实施例中，所述盐是全氟羧酸盐。
在各个方面中，本教示提供标记分析物，其中所述分析物可以包括至少一个酮基和式(I)标记试剂和/或(II)标记试剂。在各个方面中，本教示提供了标记分析物，其中所述分析物可以包括至少一个醛基和本文所述的QAO标记。
在各个实施例中，使用式(I)和/或(II)标记试剂标记内标物(IS)。这些同位素标记内标物可以特别有用，因为许多酮类固醇和其它醛化合物的同位素标记内标物无法从市场上获得。另外，可用标准物经常十分昂贵且形式受限。
在一些实施例中，酮类固醇胆汁酸前体-QAO加合物的特征离子碎片包括：
其中每个是单键或双键，且每个或不存在，或表示一个或多个键。当分析物是7α-胆固烯-3-酮(7αC4)时，特征离子碎片在一些实施例中可以包括质量为152.0的碎片离子。当分析物是5α-胆固烷-3-酮时，特征离子碎片在一些实施例中可以包括质量为443.0的碎片离子。当分析物是4-胆固烯-3-酮时，特征离子碎片在一些实施例中可以包括质量为161.2的碎片离子。
主要特征离子碎片可以是(例如)中性丢失碎片或包含分析物和标记试剂或其部分的结构碎片的中性丢失。在一些实施例中，存在一种以上的主要特征离子碎片。在一些实施例中，存在2、3、4或5种主要特征离子碎片。
罕见酮固醇(例如是酮固醇胆汁酸前体的酮固醇)的同位素富集型内标物(IS)或是无法从市场上获得，或是制造费用昂贵。例如，虽然可以获得7αC4的稳定同位素标记内标物，但是5α-胆固烷-3-酮、4-胆固烯-3-酮或7α,l2α-二羟基-4-胆固烯-3-酮中的任何一个都没有市售的标记IS。
因此，在一些实施例中，“重”(同位素富集)QAO试剂可以提供这些酮固醇的内标物。在一些实施例中，如果要分析两种或更多种酮固醇胆汁酸前体，这些内标物会特别有利。因此，可以使用标记试剂的同位素富集型类似物且可以生成用于定量的内标物。例如，可以使用碳的重原子同位素(12C、13C和14C)、氮的重原子同位素(14N和15N)、氧的重原子同位素(16O和18O)、硫的重原子同位素(32S、33S和34S)和/或氢的重原子同位素(氢、氘和氚)制备内标物。美国专利申请公开第US 2005/068446A1号公开了同位素富集型化合物的合成方法；美国专利申请公开第US 2008/0014642A1号公开了质量分析的工作流程和策略，所述公开均以全文引用的方式并入本文中。
同位素富集型化合物可以包括例如：
所述方法可以包括使用MRM工作流程以定量分析酮类固醇。试剂可以经同位素编码，用于个别酮类化合物或一组酮类化合物的定量分析。在涉及酮类固醇分布的研究中，可以在低碰撞能量下实现MS/MS裂解，以主要从氨氧基衍生化产物产生中性丢失特征离子。MRM跃迁可以是Q1中的大部分衍生化类固醇和Q3中的大部分中性丢失碎片。本教示在一些实施例中提供了一种经由衍生化(改善灵敏性)和Q3碎片的定向选择(改善特异性)明显降低背景噪声的方法。
在一些实施例中，提供了类固醇(例如7αC4)的一组同位素标记内标物。这个组可以包括两种或更多种加合物，其包括被本文所述的季胺氧化物(QAO)试剂标记的已知浓度的酮类固醇，其中两种或更多种加合物中的每个具有不同的同位素富集型类似物。
在一些方面中，本教示包括使用质量示差标签(包括质量示差标记组)的试剂和方法，其中所述组中的一个或多个标记含有一种或多种重原子同位素。还可以通过制备具有不同总质量和不同主要报告基团或质量平衡基团的标记来提供一组质量示差标记，但不是一组质量示差标签中的每个成员都需要富集同位素。本试剂和方法允许使用质量示差标记和母离子-子离子跃迁监测(PDITM)分析一种或多种样品中的酮固醇生物标记物分析物。本教示可以用于利用质量示差标记试剂和质谱法定性和定量分析这些分析物。质量示差标签包括(但不限于)非同重元素同位素编码试剂。本教示进一步包括用于酮固醇生物标记物化合物在使用或不使用同位素富集型标准化合物情况下的绝对定量的试剂和方法。
在一些实施例中，提供了具有通式(I)和/或(II)的质量示差标记组。在各个实施例中，提供了呈非盐和/或非水合形式的具有通式(I)的同重元素标记组。在各个实施例中，呈非盐和/或非水合形式的标记的质量相差小于约0.05AMU。所提供的标记组可以包括两种或更多种具有通式(I)或(II)的化合物，其中标记组中的一种或多种化合物含有一种或多种重原子同位素。在各个实施例中，重原子同位素各自独立地为13C、15N、18O、33S或34S。
式(I)或(II)化合物可以以各种盐和水合物形式来提供，包括(但不限于)单TFA盐、单HCl盐、双HCl盐或双TFA盐或其水合物。关于式(I)的变化被公开在美国专利公开第2011/0003395号和第WO2005/068446号中，所述公开均明确地以引用方式并入且通常被称为试剂。
根据各个实施例，同位素可以用作平衡基团或平衡部分，例如，氢、碳、氮、氧、硫、氯、溴等的同位素。例示性平衡基团或部分还可以包括描述在(例如)美国专利申请公开第US 2004/0219685A1号(2004年11月4日公开)、第US 2004/0219686A1号(2004年11月4日公开)、第US 2004/0220412A1号(2004年11月4日公开)和第US2010/0112708A1号(2010年5月6日公开)中的平衡基团或部分，这些公开均以全文引用的方式并入本文中。
在各个实施例中，标记组中的一种或多种化合物是同位素富集型，其具有两个或更多个重原子、三个或更多个重原子和/或四个或更多个重原子。在各个实施例中，一组具有式(I)的标记是通过合并重原子同位素而形成。在一些实施例中，同位素是以至少80％的同位素纯度、至少93％的同位素纯度和/或至少96％的同位素纯度存在。
或者或除质量平衡标签以外，可以使用同重元素标签。当使用同位素富集型同重元素标签时，同重元素标记组可以包括一个或多个重原子同位素。一组同重元素标记可以具有相同或明确限定范围的总质量，但可以具有具不同可测质量的主要报告离子或带电分析物。一组同重元素试剂允许使用质谱法定性和定量分析酮固醇生物标记物分析物化合物。例如，同位素富集型同重元素标签和母离子-子离子跃迁监测(PDITM)可以用于检测和量化样品中的一种或多种酮固醇胆汁酸前体，例如特定的酮类固醇或酮类固醇群组。
在包括同重元素标记组的实施例中，连接基部分可以被称为平衡基团。例如，在一些实施例中，将一组四个同重元素标记添加到一组一种或多种分析物中并组合在一起形成组合样品，其接受MS/MS分析以使标记的酮固醇胆汁酸前体裂解并产生4种具有不同质量的报告离子或带电分析物。所述标记可以通过报告基团或质量平衡基团或其部分或者仅质量平衡基团或其部分的重原子取代的适当组合而成为同重元素型。
以下是根据本教示的各个实施例的一组例示性季氨氧基质量示差试剂：
以下是根据本教示的各个实施例的一组例示性季氨氧基同重元素试剂：
分析
本教示可以提供用于分析一种或多种样品中的一种或多种酮固醇胆汁酸前体的试剂和方法，其使用质量示差标记、同重元素标记或两者以及母离子-子离子跃迁监测(PDITM)。本教示可以提供用于测定一种或多种样品中的一种或多种分析物(例如酮固醇胆汁酸前体)的相对浓度、绝对浓度或两者的方法，并提供可以用于以多重方式测定一种样品中的多种分析物、多种样品中的一种或多种分析物或其组合的相对浓度、绝对浓度或两者的方法，其使用质量示差标记试剂、同重元素标记试剂或两者以及质谱法。
本文所述的各种方法中的一些可以通过图1的流程图加以解释。具体地说，可以选择样品(其可以部分是生物基质例如血液、血清或血浆)并利用本文所公开的一种或多种QAO标记试剂通过氨氧基化学使其衍生化，接着混合标记分析物和QAO标记标准物。混合物可以通过例如LC(例如通过HPLC)进行色谱分离，然后通过MRM进行质量分析。如果使用同位素富集试剂作为内标物，则其优选在衍生化步骤之后添加。
所述方法还可以包括在衍生化步骤前利用液液萃取、固液萃取或使用疏水性溶剂的蛋白质沉淀萃取分析物的步骤，或者使分析物在衍生化步骤之前接受色谱分离的步骤。
可以小心选择在MRM中测量的特征碎片离子以包括具有附接标记试剂或其部分的结构碎片。例如，当标记试剂包含三甲胺时，特征碎片离子可以包括已丢失基团N(CH3)3以及分析物主链的至少一部分的离子。在一些实施例中，所选择的用于形成特征碎片离子的碰撞能量是低碰撞能量，以产生单个主要特征碎片离子。
在一些实施例中，所选择的碰撞碎片能量是在10-130eV的范围内。例如，可以使用30或35eV。
在一些实施例中，分析是在最低时间的样品制备后进行。例如，从干血点开始的样品制备小于30分钟，或小于20分钟，或小于10分钟。在一些实施例中，分析是在制备期间不进行GC分离步骤的情况下进行。
若干方面提供了通过利用酮类固醇的衍生化学(使用永久带电的氨氧基试剂(季氨氧基))和可以包括试剂和衍生化合物主链的定向裂解来降低或消除背景噪声。使用易电离/可电离分子进行衍生化可以在(例如)ESI/MS/MS中产生更好的电离效率，这可以提高检测受关注分析物的灵敏性。当小心选择碎片离子(Q3特征离子)以包括具有附接衍生化试剂(或所述试剂的部分)的结构碎片时，灵敏性和选择性都可以增强。具有相同Q1/Q3跃迁的化合物可以被检测到并产生BKG噪声干扰的机率极低。
通过正确选择包括易电离标记试剂的至少部分的特征离子碎片，可以在明显更低的背景噪声和改善的检测极限下完成质量分析(与未添加标记试剂下进行的酮固醇胆汁酸前体的MRM分析相比)。还可以看到相比于在非衍生化情况下进行检测的增强因子。例如，在一些实施例中，非衍生化样品在管柱上的检测极限在约20至100pg/mL之间，而衍生化样品在管柱上的检测极限小于约0.08pg/mL。因此，由于利用QAO衍生化而导致的增强是至少200倍，或至少400倍，或1000倍以上，或2000倍以上。
本文所提供的方法的线性度和动态范围可以特别良好。例如，在一些实施例中，线性度在DSC中大于0.990。在一些实施例中，线性度在DSC中大于0.995。
在一些实施例中，特征离子碎片是含有分析物主链的一部分且还含有标记试剂的一部分的中性丢失碎片。在一些实施例中，特征离子碎片是具有442.6、93.3、164.2、152.1、440.8、456.8、152.3和/或179.9的m/z的一个或多个碎片。在这些实施例和其它实施例中，特征离子碎片可以是同位素富集(例如13C富集)碎片。
定量可以通过衍生自一种或多种分析物和标准物的信号的相对或绝对测量而实现。正电荷可以转移到作为待质谱法检测的碎片离子的分析物中。
本文所述的其它各种方法可以通过图2A、图2B和图2C的流程图加以解释。具体地说，选择包含酮固醇胆汁酸前体(在这些图中被例示为7αC4)且可以部分是生物基质(例如血液、血清或血浆)的样品。任选地将7αC4内标物(例如同位素富集型7αC4)添加到样品中。7αC4可以任选地通过(例如)液/液萃取或固/液萃取来萃取。样品和任选的内标物是利用QAO标记试剂通过氨氧基化学而衍生化。在图2A中所述的方法中，使加合物和已经富集同位素的7αC4内标物衍生化。然后，利用QAO试剂，通过混合和培育样品使样品衍生化。在图2B中所述的方法中，加合物是与已经富集同位素的7αC4标准物组合的标记加合物。样品首先利用QAO试剂通过混合和培育样品而衍生化。然后使其与已经富集同位素的标准7αC4前体-QAO加合物组合。
对于图2A和图2B中所述的方法来说，混合物通过例如LC(例如通过HPLC)接受色谱分离，然后通过MRM接受质量分析，其中分析一种或多种酮固醇胆汁酸前体的MRM跃迁。定量是通过衍生自一种或多种分析物的信号和一种或多种标准物的信号的相对或绝对测量而实现。在图2A中，7αC4浓度是基于浓度曲线而测定的。正电荷转移到作为待通过质谱法检测的碎片离子的分析物中。
定量可以通过将增加量的已知分析物浓度掺加到无内生物基质中以建立校准曲线而实现。样品的未知浓度是从浓度曲线的线性回归算得。浓度曲线的直线图包括校准物和内标物的浓度比对校准物和IS的面积比。或者，可以使用已知量的掺加内标物，通过一点校准法实现相对定量。对于是同重元素异构体的样品来说，可以在其质量分析之前使用色谱分离来分离样品，因为这些化合物可以具有相同的质量图案。因为生物样品中的同重元素酮类固醇可以具有类似的Q1/Q3MRM跃迁，因此同重元素酮类固醇可以与分析物共享相同的裂解图案，从而表现为干扰。在这种情况下，同重元素酮类固醇优选从分析物中色谱分离。
标记试剂的一个额外优点是：在一些实施例中，在MSMS裂解后，衍生化分析物产生具有衍生化分析物上的电荷的碎片离子(Q3特征离子)，使得其可接受MS3分析。
衍生化分析物可以增强质谱分析的灵敏性和选择性。例如，本所主张的方法可以用于检测生物基质中的酮固醇胆汁酸前体，其灵敏性是非衍生化样品的200到2000倍。在一些实施例中，MS/MS灵敏性增强了20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍或甚至2000倍或更多，这取决于化合物。例如，在一些实施例中，非衍生化样品在管柱上的检测极限在约20至100pg/mL之间，而衍生化样品在管柱上的检测极限小于约0.08pg/mL。在一些实施例中，衍生化之后的检测极限可以低至<1pg/mL(参见图7)。
在各个实施例中，将标记添加到标准样品中以标记样品中的一种或多种标准化合物的步骤包括一步反应，其中氨氧基与分析物标准物的酮基或醛基形成肟。
在各个方面中，本教示提供了标记酮分析物以形成标记分析物化合物的方法。在各个实施例中，所述方法包括使具有通式(I)或(II)的标记化合物与含酮化合物反应。确切地说，化合物7α-胆固烯-3-酮(7αC4)、5α-胆固烷-3-酮、4-胆固烯-3-酮和7α,l2α-二羟基-4-胆固烯-3-酮是利用式I标记试剂衍生化，且特别在室温下在5％乙酸/MeOH中标记60分钟或更长时间。
参考以下实例、图式和表格，显示了使用标记试剂标记酮固醇胆汁酸前体的一个实例。在这些反应中，氨氧基部分与类固醇上的酮或醛反应，在标记化合物上形成肟基，从而生成标记分析物。
如文中所述，提供了测定两种或更多种样品中的一种或多种酮固醇胆汁酸前体的浓度的方法，所述方法为：将不同标记添加到每个样品中，组合经差别标记的样品，以及使用PDITM测定样品中的一种或多种酮固醇胆汁酸前体化合物的浓度。样品之一可以包括标准样品，例如对照样品、参照样品、具有已知浓度化合物的样品等。所述方法因此可以用于分析多种样品中的多种化合物。
在各个实施例中，测定一种或多种标记酮固醇胆汁酸前体的浓度的步骤包括测定一种或多种标记酮固醇胆汁酸前体的绝对浓度，测定一种或多种标记酮或标记分析物化合物的相对浓度，或其组合。
某些方法包括标记两种或更多种受关注样品中的一种或多种酮固醇胆汁酸前体的步骤，所述步骤是将一组标签中的不同标签添加到每个受关注样品中以形成一组标记酮固醇胆汁酸前体。这组标签中的每个标签可以包括本文所述的标记试剂或其部分。一种或多种标记酮固醇胆汁酸前体可以针对从中获得每种分析物或包含每种分析物的样品有差别地被标记。将标记添加到酮固醇胆汁酸前体中的步骤可以包括一步反应，其中标记的第一部分由式(I)或(II)组成。
可以组合每个样品的一部分以产生组合样品并通过母离子-子离子跃迁监测和测量一个或多个透射离子的离子信号分析其一部分。透射母离子m/z范围可以包括标记分析物化合物的m/z值，且透射子离子m/z范围包括对应于标记分析物化合物的标签的报告离子的m/z值或是电离分析物本身。然后，可以至少基于相应透射报告离子或分析物离子的离子信号测量值与标准化合物的一个或多个离子信号测量值的比较来测定一种或多种标记分析物化合物的浓度。离子信号可以基于(例如)离子峰强度(平均值、平均数、最大值等)、离子峰面积或其组合。两种或更多种受关注样品中的一个或多个可以为包含一种或多种标准化合物的标准样品。
在一些实施例中，酮固醇胆汁酸前体的浓度是通过将相应标记酮固醇胆汁酸前体-报告离子跃迁信号的离子信号测量值与下列中一个或多个进行比较而测得：
(i)针对标准化合物-报告离子或分析物离子跃迁的浓度曲线；或
(ii)具有标记酮固醇胆汁酸前体的组合样品中的标准化合物的标准化合物-报告离子跃迁信号。
在一些实施例中，使用“母离子-子离子跃迁监测”或“PDITM”作为分析方法和工作流程状态。PDITM指的是一种技术，其中特定地选择第一质量分离器(经常被称为“MS”或质谱法的第一维度)的透射质荷比(m/z)范围以将分子离子(经常被称为“母离子”或“前体离子”)传送到离子裂解器(例如碰撞室、光解区等)中以产生碎片离子(经常被称为“子离子”)，且选择第二质量分离器(经常被称为“MS/MS”或质谱法的第二维度)的透射m/z范围以将一个或多个子离子传送到测量子离子信号的检测器中。当通过将检测器“锁定”在预期子离子质量上以专注于检测光谱中的子离子时，此技术具有独特优势。受监测的母离子和子离子质量的组合可以被称为受监测的“母离子-子离子跃迁”。针对特定受监测母离子-子离子组合的检测器中的子离子信号可以被称为“母离子-子离子跃迁信号”。
例如，母离子-子离子跃迁监测的一个实施例是多反应监测(MRM)(也称作选择性反应监测)。在MRM的各个实施例中，监测特定母离子-子离子跃迁包括使用第一质量分离器(例如锁定在受关注的母离子m/z上的第一四极杆)传送受关注母离子和使用第二质量分离器(例如锁定在受关注的子离子m/z上的第二四极杆)传送一个或多个受关注子离子。在各个实施例中，可以通过使用第一质量分离器(例如锁定在受关注的母离子m/z上的四极杆)传送母离子和在包括一个或多个受关注子离子的m/z值的m/z范围内扫描第二质量分离器进行PDITM。
例如，可以使用串联质谱仪(MS/MS)仪器或更一般地说多维质谱仪仪器进行PDITM(例如MRM)。适宜质量分析仪系统的实例包括(但不限于)包括三重四极杆、四极杆-线性离子阱、四极杆TOF和TOF-TOF中的一个或多个的系统。
因此，PDITM可以在包括第一质量分离器以及离子裂解器和第二质量分离器的质量分析仪系统上进行。选择PDITM扫描的透射母离子m/z范围(由第一质量分离器选择)以包括一种或多种标记分析物化合物的m/z值，且选择PDITM扫描的透射子离子m/z范围(由第二质量分离器选择)以包括对应于透射标记分析物化合物的标签的一个或多个报告离子的m/z值。
在一些实施例中，利用三重四极杆MS平台进行标记分析物的母离子-子离子跃迁监测(PDITM)。美国专利申请公开第US 2006/0183238A1号描述了关于PDITM和其使用的更多细节，所述公开以全文引用的方式并入本文中。在一些实施例中，氨氧基MS标记试剂在MSMS期间经历中性丢失并留下属于带电分析物种类的报告离子。在一些实施例中，氨氧基MS标记试剂在MSMS期间形成报告离子(标签碎片)。
因此，在各个实施例中，使用本教示的标记分析一种或多种样品中的一种或多种酮固醇胆汁酸前体包括以下步骤：(a)用来自一组式(II)标记的不同标记各自标记一种或多种酮固醇胆汁酸前体化合物，以提供标记酮固醇胆汁酸前体化合物，所述标记前体化合物各自具有质量平衡或报告离子部分；(b)组合每种标记分析物化合物的至少一部分以产生组合样品；(c)使组合样品的至少一部分接受母离子-子离子跃迁监测；(d)测量一个或多个透射分析物离子或报告离子的离子信号；和(e)至少基于相应前体离子或报告离子的离子信号测量值与标准化合物的一个或多个离子信号测量值的比较，测定一种或多种标记酮固醇胆汁酸前体的浓度。因此，在各个实施例中，可以以多重方式测定一种或多种样品中的多种酮固醇胆汁酸前体化合物的浓度，例如，通过组合两种或更多种标记分析物化合物以产生组合样品并对组合样品进行PDITM，并监测两种或更多种标记前体化合物的分析物离子或报告离子。
对组合样品的至少一部分进行PDITM的步骤包括：将组合样品的一部分装载到色谱柱(例如，LC管柱、气相色谱法(GC)管柱或其组合)上，对来自色谱柱的洗脱液的至少一部分进行母离子-子离子跃迁监测，并测量一个或多个透射报告离子的离子信号。
可以以许多方式提供在测定一种或多种标记酮固醇胆汁酸前体化合物的浓度的步骤中所使用的标准化合物的一个或多个离子信号测量值。在各个实施例中，用标签标记一种或多种非同位素富集型标准化合物，且组合一种或多种标记标准化合物的至少一部分与每种标记前体化合物的至少一部分以产生组合样品；然后对这个组合样品的至少一部分进行PDITM并测量一个或多个透射报告离子的离子信号。
将来自标签组的标签添加到一种或多种标准样品中，以提供一种或多种标记标准样品，每种标准样品包含被所述标签标记的一种或多种非同位素富集型标准化合物，添加到一种或多种标准样品中的标签不同于添加到受关注样品中的标签。组合一种或多种标记标准样品的至少一部分与每个受关注样品的至少一部分以产生组合样品；然后对这个组合样品的至少一部分进行PDITM并测量一个或多个透射报告离子的离子信号。
对应于组合样品中的一种或多种标记标准化合物中的一或多者的一个或多个报告离子或分析物离子的离子信号测量值然后可以用于测定一种或多种标记酮固醇胆汁酸前体化合物的浓度且可以用于通过绘制标准化合物的数个值来产生浓度曲线。因此，在一些实施例中，测定标记分析物化合物的浓度至少是基于相应报告离子或分析物离子的离子信号测量值与对应于组合样品中的一种或多种标记标准化合物中的一或多者的一个或多个报告离子或分析物离子的离子信号测量值的比较。使这个组合样品的至少一部分接受PDITM的步骤可以包括例如：直接引入质量分析仪系统中；首先将这个组合样品的至少一部分装载到色谱柱上，然后对来自色谱柱的洗脱液的至少一部分进行PDITM并测量一个或多个透射报告离子的离子信号。
如本文中所公开，对标准化合物的PDITM可以在质量分析仪系统上进行，所述系统包括第一质量分离器以及离子裂解器和第二质量分离器。可以选择PDITM扫描的透射母离子m/z范围(由第一质量分离器选择)以包括一种或多种标记标准化合物的m/z值，且可以选择PDITM扫描的透射子离子m/z范围(由第二质量分离器选择)以包括对应于透射标准化合物的一个或多个报告离子或分析物离子的m/z值。
测定一种或多种标记分析物化合物的浓度可以基于以下二者：(i)相应报告离子或分析物离子的离子信号测量值与对应于一种或多种标准化合物的一个或多个浓度曲线的一个或多个报告离子或分析物离子的离子信号测量值的比较；和(ii)相应报告离子的离子信号测量值与对应于与标记酮固醇胆汁酸前体组合的一种或多种标记标准化合物的一个或多个报告离子的离子信号测量值的比较。可以提供具有第一浓度的非同位素富集型标准化合物，用来自标签组的标签标记，与每个标记样品的至少一部分组合以产生组合样品，然后可以如本文所述进一步分析这个组合样品。
在本教示的各个实施例中，可以通过下列步骤产生标准化合物的浓度曲线：(a)提供具有第一浓度的同位素富集型或非同位素富集型标准酮固醇胆汁酸前体；(b)用来自一组标记的标记物标记标准化合物，其中被标记的酮固醇胆汁酸前体标准化合物具有报告离子部分；(c)将标记标准化合物的至少一部分装载到色谱柱上；(d)对来自色谱柱的洗脱液的至少一部分进行母离子-子离子跃迁监测；(e)测量透射分析物离子或报告离子的离子信号；(f)针对一种或多种不同标准化合物浓度重复步骤(a)-(e)；和(g)至少基于在一种或多种标准化合物浓度下的透射分析物离子或报告离子的离子信号测量值产生针对标准化合物的浓度曲线。
在各个实施例中，本公开提供了测定一种或多种样品中的一种或多种酮固醇胆汁酸前体的浓度的方法。所述方法包括用来自一组式(I)标签的不同标签标记一种或多种酮固醇胆汁酸前体的步骤，其中Y基团(可以是季氮)包括报告离子部分。所述方法还包括以下步骤：组合每种标记前体化合物的至少一部分以产生组合样品并对组合样品的至少一部分进行母离子-子离子跃迁监测(其中透射母离子m/z范围包括标记分析物化合物的m/z值，且透射子离子m/z范围包括对应于标记分析物化合物的标签的报告离子的m/z值)和测量一个或多个透射报告离子的离子信号；然后，至少基于相应报告离子的离子信号测量值与标准化合物的一个或多个离子信号测量值的比较来测定一种或多种标记分析物化合物的浓度。离子信号可以基于(例如)离子峰强度(平均值、平均数、最大值等)、离子峰面积或其组合。
PDITM可以在本领域中已知的任何合适的质量分析仪上进行，质量分析仪系统包括第一质量分离器以及离子裂解器和第二质量分离器。选择PDITM扫描的透射母离子m/z范围(由第一质量分离器选择)以包括一种或多种标记分析物化合物的m/z值，且选择PDITM扫描的透射子离子m/z范围(由第二质量分离器选择)以包括对应于透射标记分析物化合物的标签的一个或多个报告离子的m/z值。
在一些实施例中，用选自一组质量示差标签的一个或多个标签标记一种或多种酮固醇胆汁酸前体样品，以使得在相同的实验测量中：(i)可以比较和/或量化不同样品(例如对照、处理组)中的多种含酮固醇胆汁酸前体的化合物；(ii)可以对相同样品中的相同酮固醇胆汁酸前体化合物进行多次浓度测量；以及(iii)可以用基线样品作对照来评估临床样品的不同分离物。
对组合样品的至少一部分进行PDITM的步骤包括将组合样品直接引入质量分析仪系统中，例如通过使用电喷雾电离(ESI)离子源引入含在适宜溶液中的组合样品。
对应于组合样品中的一种或多种标记标准化合物的一个或多个报告离子的离子信号测量值确定了一种或多种标记分析物化合物的浓度。测定标记分析物化合物的浓度至少是基于相应碎片离子的离子信号测量值与对应于组合样品中的一种或多种标记标准化合物的一个或多个碎片离子的离子信号测量值的比较。使这个组合样品的至少一部分接受PDITM的步骤可以包括例如：直接引入质量分析仪系统中；首先将这个组合样品的至少一部分装载到色谱柱上，然后对来自色谱柱的洗脱液的至少一部分进行PDITM并测量一个或多个透射报告离子或分析物离子的离子信号；或其组合。
在一些实施例中，测定一种或多种标记酮固醇胆汁酸前体化合物的浓度包括比较相应分析物离子或报告离子的离子信号测量值与对应于一种或多种标准化合物的一个或多个浓度曲线的一个或多个报告离子的离子信号测量值。提供了具有第一浓度的非同位素富集型标准化合物，并用来自一组标签的标签标记。对标记标准化合物的一部分进行母离子-子离子跃迁监测(其中透射母离子m/z范围包括标记标准化合物的m/z值，且透射子离子m/z范围包括对应于标记标准化合物的标签的报告离子或分析物离子的m/z值)，并测量报告离子或分析物离子的离子信号。针对不同于第一浓度的至少又一种标准化合物浓度重复进行标记步骤以及PDITM和测量透射报告离子或分析物离子的离子信号的步骤，以产生针对标准化合物的浓度曲线。
样品的衍生化可以是一步反应，其中QAO试剂包括氨氧基MS标签部分以及如通式(I)中所示的标记部分；或者可以是多步反应，其中加合物是通过使含氧代试剂与酮固醇胆汁酸前体反应以及随后与与氨氧基MS标签组合而形成。这些方法被描述在美国专利申请第61/588,902号中，所述申请以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，可以提供两步标记反应，所述反应提供多路复用能力。例如，在一些实施例中，可以用不同QAO试剂标记不同的酮固醇胆汁酸前体。在其它实施例中，可以用单一QAO试剂标记不同的酮固醇胆汁酸前体，且所得加合物可以与不同氨氧基标签反应。
所述方法可以进一步包括提供包括已知酮固醇胆汁酸前体的标准物，用QAO试剂处理标准物的已知酮固醇胆汁酸前体以形成标准加合物。在各个实施例中，可以用QAO试剂经由根据本教示的一步或两步标记反应处理标准物以形成标准加合物。标准加合物然后可以与通过用QAO试剂标记酮固醇胆汁酸前体所形成的加合物混合以形成混合物。随后可以使用质谱法(例如使用LC/MSMS光谱法)分析混合物。在一些实施例中，可以获得酮固醇胆汁酸前体的相对浓度。在其它实施例中，可以通过使用已知浓度的标准物获得酮固醇胆汁酸前体的绝对定量。
根据各个实施例，一种或多种酮固醇胆汁酸前体的相对定量方法可以包括标记一种或多种酮固醇胆汁酸前体，然后使用质谱法进行分析。根据某些实施例，可以量化一种或多种酮固醇胆汁酸前体和/或其代谢物。根据一些实施例，氨氧基标记剂可以包括一组同重元素标签。根据一些实施例，在第一步骤中，可以用QAO试剂标记标准物中的至少一种酮固醇胆汁酸前体以形成标准加合物。在第二步骤中，可以用来自一组同重元素标签的第一同重元素标签标记标准加合物。测试样品可以与QAO试剂反应以标记测试样品中的一种或多种酮固醇胆汁酸前体(如果有的话)。接着可以用来自同一组同重元素标签的第二同重元素标签(不同于第一同重元素标签)标记测试样品中的标记酮固醇胆汁酸前体。然后可以组合标记标准物与标记测试样品且所得混合物可以在反相管柱上进行液相色谱法(LC)分离。标记酮固醇胆汁酸前体可以具有不同的保留时间且可以在不同的时间从管柱洗脱。洗脱峰可以包括包含标记分析物的峰和包含标记标准物的峰。随后可以利用质谱法分析来自管柱的洗脱液。
应该了解的是，酮固醇胆汁酸前体的绝对定量(其中标准物具有已知浓度的酮固醇胆汁酸前体)可以如上文针对相对定量所述的相同方式进行。另外，虽然上文提到了酮固醇胆汁酸前体和/或酮固醇胆汁酸前体的代谢物，但应该理解可以使用任何酮固醇胆汁酸前体。
根据各个实施例，可以用不同QAO试剂处理包括多种不同酮固醇胆汁酸前体的样品，以用所述试剂中的不同试剂标记两种或更多种酮固醇胆汁酸前体中的每个。接着可以使用质谱法(例如LC/MSMS)分析标记样品，以量化标记酮固醇胆汁酸前体。在一些实施例中，这种样品分析可以在光谱仪的单次操作中进行。如上所述，在一些实施例中，酮固醇胆汁酸前体可以是类固醇或类固醇样分析物。
根据各个实施例，包含一种或多种化合物的样品可以在分析之前通过各种方法进行富集。富集方法可以取决于样品类型，例如血液(新鲜或干燥)、血浆、血清等。例示性富集方法可以包括(但不限于)蛋白质沉淀、液液萃取、固液萃取和超滤作用。可以使用其它富集方法，或两种或更多种富集方法的组合。
在一些实施例中，酮固醇胆汁酸前体的分析可以包括产生报告离子(例如经由质谱仪中的高能碰撞)以及利用报告离子的强度或峰面积进行定量。例如，上述QAO试剂可以在高能碰撞(MSMS)期间经历中性丢失，留下带电分析物种类作为报告离子，且然后可以对报告离子进行MS3分析。在一些实施例中，QAO试剂可以在高能碰撞后产生标签碎片，且然后可以对标签碎片进行MS3分析。
根据各个实施例，多种质谱法(MS)标记剂可以用于标记一种或多种酮固醇胆汁酸前体和/或根据本教示所形成的其加合物。根据一些实施例，氨氧基标记剂可以很好地裂解，从而提供强烈的报告离子。根据一些实施例，氨氧基标记剂可以包括针对质谱法特别设计的标记剂，且根据一些实施例，氨氧基标记剂是针对多反应监测(MRM)分析而特别设计的。在一些实施例中，氨氧基标记剂可以用于标记通过标记酮固醇胆汁酸前体而产生的加合物。在其中使用标准加合物以量化酮固醇胆汁酸前体的一些实施例中，可以使用氨氧基标记剂标记标准加合物。在各个实施例中，标准加合物可以用于酮固醇胆汁酸前体的相对定量。在一些实施例中，当标准加合物的浓度为已知时，标准加合物可以用于酮固醇胆汁酸前体的绝对定量。在一些实施例中，可以使用各种氨氧基MS标记剂标记各种分析物。例如，氨氧基MS标记剂可以是不同同重元素标签或不同质量示差标签。例如，用于标记标准加合物的氨氧基MS标记剂可以包括来自一组同重元素标签的第一同重元素，而用于标记来自样品的加合物的氨氧基MS标记剂可以包括来自同一组同重元素标签的第二同重元素标签，但其不同于第一同重元素标签。
同重元素标签允许多路复用且提供每个样品具有高产量和更低分析成本的酮固醇胆汁酸前体的多重分析方法。因为所有酮固醇胆汁酸前体中都具有一个共同官能团，所以在各个实施例中，每种分析物只需要一种标签。在一些实施例中，使用PDITM增加了特异性且降低了错误风险。所述试剂设计使其成为FlashQuantTM应用的良好工具且允许进行MS3，这有助于确定分析物的特性。
根据各个实施例，来自一组同重元素试剂的第一同重元素标签可以与可包括已知酮固醇胆汁酸前体(例如具有已知浓度)的标准物接触。所述接触可以在有利于第一同重元素标签与标准物之间的反应的条件下进行。与第一同重元素标签来自同一组同重元素试剂的第二同重元素标签可以与包括未知浓度的酮固醇胆汁酸前体的样品接触。如下文进一步所述，可以将标准物和样品的标记分析物混合在一起并进行分析以测定样品中分析物的浓度。分析可以包括分离混合物以形成分离分析物和分析所述分离分析物。可以使用的分离方法包括气相色谱法、液相色谱法、其它色谱法、电泳法、电渗法、质量示差分离法等。在一个例示性实施例中，使用液相色谱法分离混合物中的各种分析物并由此形成分离分析物。
在一些实施例中，色谱分离可以在反相管柱上进行，且可以对从管柱洗脱的峰进行后续分析。在一些实施例中，后续分析可以包括质谱法，或者更具体地说，母离子-子离子跃迁监测(PDITM)。通过比较来自PDITM的结果，可以测定样品中酮固醇胆汁酸前体的浓度，下文对此作了更详细的描述。关于PDITM和其使用的更多细节可参见公开申请US 2006/0183238A1，所述申请以全文引用的方式并入本文中。
根据一些实施例，可以使用质量示差标记剂代替同重元素标记试剂，例如如上文所述的质量示差剂对。根据各个实施例，氨氧基MS标记剂可以用于多重分析中的相对和绝对定量。根据一些实施例，氨氧基MS标记剂可以用于二重、三重、四重和其它多重分析。
在一些实施例中，使QAO试剂与样品在等摩尔浓度的氧代基团下组合。在一些实施例中，添加过量的(例如，约10％、约20％、约两倍过量或约四倍过量)QAO试剂。在一些实施例中，使用小于等摩尔浓度的QAO，例如，QAO浓度可以是氧代基团的摩尔浓度的约25％、约50％或约75％。在一些实施例中，QAO试剂与在样品溶液中的浓度在1μg/mL-100mg/mL之间或在100μg/mL-10mg/mL之间的样品组合。
可以根据本教示的各个实施例使用的不同液相色谱法和质谱法、系统和软件包括在2009年5月31日申请的美国临时专利申请第61/182,748号和2006年8月17日公开的美国专利申请第US 2006/0183238A1号中所描述的液相色谱法和质谱法、系统和软件。这些参考文献均以引用的方式并入本文中。
根据本教示的其它实施例，提供了一种试剂盒，其包括QAO试剂，例如上文所述的QAO试剂。在其它实施例中，提供了一种试剂盒，其包括QAO试剂和一种或多种氨氧基MS标记剂。氨氧基MS标记剂可以包括来自上述第一和/或第二类别或组的氨氧基MS标记剂的化合物。在一些实施例中，所述试剂盒可以包括标准物，其包括已知酮固醇胆汁酸前体。
根据本教示的各个实施例，提供了一种试剂盒，其可以包括QAO试剂和氨氧基MS标记剂中的一个或多个。在一些实施例中，试剂盒可以包括标准物，其包含已知浓度的含酮类固醇分析物。
在一些实施例中，试剂盒可以包括至少一种标准物，其包括已知浓度的已知酮固醇胆汁酸前体。根据一些实施例，氨氧基MS标记剂可以是来自一组同重元素标签的同重元素标签，且在一些实施例中，试剂盒可以包括来自一组同重元素标签的多种不同的同重元素标签。根据一些实施例，氨氧基MS标记剂可以是来自一组质量示差标签的质量示差标签，且在一些实施例中，试剂盒可以包括来自一组质量示差标签的多种不同的质量示差标签。根据一些实施例，试剂盒可以包括QAO试剂、氨氧基MS标记剂、包含已知酮固醇胆汁酸前体和/或已知浓度的已知酮固醇胆汁酸前体的标准物，且可以进一步包括标记说明书。
在一些实施例中，可以提供一种试剂盒，其包括本文所述的一种或多种氨氧基试剂，例如包括一种或多种永久带电的式(I)或(II)氨氧基化合物。
在一些实施例中，所述方法可以包括使用MRM工作流程以定量分析酮类固醇。所述试剂可以经同位素编码，用于定量分析个别酮类化合物或一组酮类化合物。对于分布研究来说，在低碰撞能量下进行MS/MS裂解可以产生一种主要特征离子。特征离子可以源自氨氧基衍生化产物的中性丢失。MRM跃迁可以为Q1中的大部分衍生化类固醇和Q3中的大部分中性丢失碎片。对于低浓度定量来说，在高碰撞能量下的MS/MS裂解(包括标记试剂和分子主链的部分)可以提供一种经由衍生化(改善灵敏性)和Q3碎片的定向选择(改善特异性)明显降低背景噪声的方法。
根据各个实施例，本教示提供了一种降低或消除背景噪声的方法，所述方法不产生与生物样品的多步清洗和色谱分离有关的问题。在一些实施例中，所述方法通过利用酮类固醇的衍生化学(使用永久带电的氨氧基试剂(QAO))和包括试剂和衍生化类固醇主链的定向裂解来消除背景噪声。使用易电离/可电离分子进行衍生化可在ESI MS/MS中产生更好的电离效率，这会增加对分析物的灵敏性。当选择碎片离子(Q3特征离子)以包括具有附接衍生化试剂或所述试剂的一部分的结构碎片时，灵敏性和选择性都可以增强。具有完全相同的Q1/Q3跃迁的化合物可以被检测到并产生背景噪声干扰的机率极低。出现类似Q1/Q3MRM跃迁的唯一可能性将是生物样品中存在同重元素酮类固醇。同重元素酮类固醇将需要与分析物共享相同的裂解图案，从而表现为干扰。在这种罕见的情况下，同重元素酮类固醇可以从分析物中色谱分离。
根据各个实施例，所述试剂设计的一个额外优点是：在进行MS/MS裂解时，试剂产生碎片离子，它是具有衍生化分析物上的电荷的Q3特征离子，这使其可接受MS3分析。在一些实施例中，所述方法可以在具有酮或醛官能团的分子种类上实现，所述官能团的检测可以得益于衍生化，以通过MS/MS进行超高灵敏度分析。
在一些实施例中，在检测酮固醇胆汁酸前体后，酮固醇胆汁酸前体的相对浓度是通过与标准化合物进行比较或通过使用标准浓度曲线测得。在一些实施例中，测定至少一种分析物的绝对浓度。在一些实施例中，使用校准物，其包括被至少一个重原子标记的标准物。在一些实施例中，校准物是具有至少两个氘原子的化合物。
本教示提供了酮类固醇和包含酮官能团的分子种类的高灵敏性和特异性分析。本教示由于(例如)小心删除特征离子以包括标记试剂的部分和分子主链的部分而在MS/MS中提供更高信噪比和极低背景噪声。
质量分析仪
在本教示中可以使用多种质量分析仪系统进行PDITM。适宜的质量分析仪系统包括两个质量分离器，以及配置在两个质量分离器之间的离子飞行路径中的离子裂解器。合适的质量分离器的实例包括(但不限于)四极杆、RF多极杆、离子阱、飞行时间(TOF)、以及与定时离子选择器联合的TOF。合适的离子裂解器包括(但不限于)根据以下原理操作的离子裂解器：碰撞诱导解离(CID，也称作碰撞辅助解离(CAD))、光诱导解离(PID)、表面诱导解离(SID)、源后衰减、与电子束相互作用(例如电子诱导解离(EID)、电子捕获解离(ECD))、与热辐射相互作用(例如热/黑体红外辐射解离(BIRD))、源后衰减或其组合。
适用于质量分析仪的质谱法系统的实例包括(但不限于)包括下列中的一个或多个的质谱法系统：三重四极杆、四极杆-线性离子阱(例如4000Q LC/MS/MS系统、Q LC/MS/MS系统)、四极杆TOF(例如LC/MS/MS系统)和TOF-TOF。
在各个实施例中，质量分析仪系统包括MALDI离子源。在各个实施例中，使组合样品的至少一部分与MALDI基质材料混合并使用具有MALDI电离源的质量分析仪进行母离子-子离子跃迁监测。在各个实施例中，将组合样品的至少一部分装载到色谱柱上，使洗脱液的至少一部分与MALDI基质材料混合，并使用具有MALDI电离源的质量分析仪进行母离子-子离子跃迁监测。
质谱仪系统可以包括三重四极杆质谱仪，用来选择母离子和检测其碎片子离子。在这个实施例中，第一四极杆选择母离子。将第二四极杆维持在足够高的压力和电压下，使得发生多重低能碰撞，从而使一些母离子裂解。选择第三四极杆以将选定子离子传送到检测器。在各个实施例中，三重四极杆质谱仪可以包括配置在离子源与三重四极杆之间的离子阱。离子阱可以被设定为收集离子(例如，所有离子、具有特定m/z范围的离子等)，且在全时后通过使端电极产生脉冲以允许选定离子离开离子阱，将选定离子传送到第一四极杆。所需的填充时间可以基于例如下列因素来决定：离子数量、离子阱内的电荷密度、不同特征肽的洗脱之间的时间、工作周期、激发态种类或多电荷离子的衰减率或其组合。
三重四极杆质谱仪中的一个或多个四极杆可以被配置成线性离子阱(例如通过添加端电极以在四极杆内提供大体上细长的圆柱形诱捕体积)。在各个实施例中，第一四极杆选择母离子。将第二四极杆维持在足够高的碰撞气体压力和电压下，使得发生多重低能碰撞，从而使一些母离子裂解。选择第三四极杆以捕获碎片离子且在填充时间后通过使端电极产生脉冲以允许选定子离子离开离子阱，将选定子离子传送到检测器。所需的填充时间可以基于例如下列因素来决定：碎片离子数量、离子阱内的电荷密度、不同特征肽的洗脱之间的时间、工作周期、激发态种类或多电荷离子的衰减率或其组合。
质谱仪系统可以包括两个四极杆质量分离器和一个TOF质谱仪，用来选择母离子和检测其碎片子离子。在各个实施例中，第一四极杆选择母离子。将第二四极杆维持在足够高的压力和电压下，使得发生多重低能碰撞，从而使一些离子裂解，且TOF质谱仪选择用于检测的子离子，例如通过在涵盖受关注子离子的质量范围内和所产生的提取离子色谱图中监测离子，通过使出现在选定子离子的时间窗口外的离子偏离检测器，通过将检测器定时选通到选定子离子的到达时间窗口，或其组合。
质谱仪系统可以包括两个TOF质量分析仪和一个离子裂解器(例如，CID或SID)。在各个实施例中，第一TOF选择用于引入离子裂解器中的母离子(例如通过使出现在选定母离子的时间窗口外的离子偏离裂解器)，且第二TOF质谱仪选择用于检测的子离子，例如通过在涵盖受关注子离子的质量范围内和所产生的提取离子色谱图中监测离子，通过使出现在选定子离子的时间窗口外的离子偏离检测器，通过将检测器定时选通到选定子离子的到达时间窗口，或其组合。TOF分析仪可以是线性或反射分析仪。
质谱仪系统可以包括串联MS-MS仪器，其包括：用于选择受关注母离子的具有定时离子选择器的第一无场漂移区，用于产生子离子的裂解室(或离子裂解器)，以及用于传送选定子离子以供检测的质量分离器。在各个实施例中，定时离子选择器包括脉冲离子偏转器。在各个实施例中，离子偏转器可以用作脉冲离子偏转器。质量分离器可以包括离子反射器。在各个实施例中，裂解室是被设计成导致离子裂解和延迟提取的碰撞室。在各个实施例中，裂解室还可以用作延迟提取离子源，以通过飞行时间质谱法分析碎片离子。
在一些实施例中，可以利用电离作用产生结构特异性碎片离子和Q3MRM离子。标记试剂可以完全或部分包含在结构特异性碎片离子中。所述方法可以提供针对Q3MRM离子的灵敏性和特异性。在一些实施例中，可以利用电离作用产生主要中性丢失碎片离子，其可以被选择进Q3中，且然后裂解产生结构特异性离子。这些碎片离子然后可以用于在称作MS3的程序中进行确认和量化。
试剂盒
在一些实施例中，本教示包括用于分析酮固醇胆汁酸前体的试剂盒。试剂盒包括一种或多种标记(包含一组两种或更多种同位素富集型标准物和一种或多种试剂)、容器、酶、缓冲剂和/或使用说明书。本教示的试剂盒包括一组或多组支持物，每个支持物包括通过可裂解连接子可裂解地连接到支持物的不同同重元素标记化合物。可裂解连接的实例包括(但不限于)化学或光解可裂解连接子。支持物可以与不同样品反应，从而用与各别支持物联合的同重元素标签标记样品的分析物。分析不同样品中的酮固醇胆汁酸前体可以与不同支持物接触且因此被不同报告子/连接子组合标记。
根据各个实施例，试剂盒可以包括多种不同的氨氧基标记试剂，例如，如本文所述的一组标记试剂。试剂盒可以经配置以分析多种不同的酮固醇胆汁酸前体(例如，多种不同的酮固醇)，且标记可以包括用多种不同的各别标记试剂分别标记，例如，对每种不同酮固醇胆汁酸前体使用不同试剂。根据本教示的各个实施例，提供了一种试剂盒，其包括用于标记一种或多种酮固醇胆汁酸前体的一种或多种氨氧基MS标记试剂。氨氧基MS标记试剂可以包括具有如本文所述的结构之一的化合物。
试剂盒可以包括标准物，其包括一种或多种已知酮固醇胆汁酸前体。标准物可以包括已知浓度的已知化合物。在一些实施例中，试剂盒中的氨氧基MS标记试剂可以包括来自一组同重元素标签的一种或多种同重元素标签。在一些实施例中，试剂盒可以包括来自一组同重元素标签的多种不同的同重元素标签。在一些实施例中，试剂盒中的氨氧基MS标记试剂可以包括来自一组永久带电的氨氧基试剂的一种或多种永久带电的氨氧基试剂。在一些实施例中，试剂盒可以包括来自一组永久带电的氨氧基试剂标签的多种不同的永久带电的氨氧基试剂标签。
试剂盒还可以包括用于标记酮固醇胆汁酸前体的说明书，例如，纸质说明书或在例如光盘上格式化成电子文件形式的说明书。说明书可以用于进行分析。在一些实施例中，试剂盒可以包括单个容器中的均质分析，只需要将样品添加到所述容器中。试剂盒的其它组件可以包括缓冲剂、其它试剂、一种或多种标准物、混合容器、一个或多个液相色谱法管柱等。
在一些实施例中，提供了一种酮类固醇分析试剂盒，其允许高灵敏性定量复杂生物基质中的酮类固醇，例如，在低pg/m浓度的范围内进行检测。
定义
如文中所使用，术语“诊断”指的是试图确定或确认个体是否患有特定疾病或病症的过程。术语“诊断”指的不是100％确定具体疾病存在与否，乃至特定过程或结果更加可能出现的能力。相反地，技术人员将了解术语“诊断”指的是个体中存在某些疾病的可能性增加。如本文所使用，诊断还包括初步诊断的方法，其可以通过使用本领域中已知的其它方法进行诊断来确认。另外，考虑到了本文所述的方法可以用于监测病症进展和/或用于治疗病症的疗法的功效。
术语“筛查”指的是针对特定疾病或临床病症且采用目标的分析。
如文中所使用，“水合物形式”指的是化合物或混合物的任何水化状态或化合物的一种以上水化状态。例如，本文所论述的标记试剂可以是半水合物、一水合物、二水合物等。此外，本文所述的标记试剂的样品可以包括一水合物、二水合物和半水合物形式。
短语“同重元素标记”、“同重元素标签”和“同重元素标记试剂”可以互换使用。短语“同重元素标记组”、“同重元素标签组”和“同重元素标记试剂组”可以互换使用且指的是(例如)试剂或化学基团，其中所述组的成员(个别“同重元素标记”、“同重元素标签”或“同重元素标记试剂”)具有相同质量，但其中所述组的每个成员在经受离子裂解(例如通过碰撞诱导解离(CID)、光诱导解离(PID)等)时可以产生不同子离子信号。一组同重元素标签可以包括式(I)或(II)化合物或其盐或水合物形式。可以用来区别组成员的同重元素标签的子离子可以是同重元素标签的报告离子或带电分析物。一组同重元素标签可以用于标记酮固醇胆汁酸前体并产生无法用色谱法区别但在CID后产生特征离子的标记化合物。一组质量标记的个别成员的质量可以相同或不同。当个别同位素取代相同时，质量可以相同。针对并入组中特定标记中的重元素或轻元素所选择的个别原子的差异也可以基于同位素富集型取代基的特定原子量而产生质量差异。
如文中所使用，“同位素富集”意指化合物(例如标记试剂)已经通过合成富集了一种或多种重原子同位素(例如包括(但不限于)氘、13C、15N、18O、37Cl或81Br的稳定同位素)。因为同位素富集的效率不是100％，所以可以存在富集态较低的化合物杂质且这些杂质将具有较低质量。同样地，由于过度富集(非期望富集)且由于天然同位素丰度变化，可以存在更大质量的杂质。
短语“质量示差标记”、“质量示差标签”和“质量示差标记试剂”在本文中可以互换使用。短语“质量示差标记组”、“质量示差标签组”可以互换使用，且指的是(例如)一组试剂或化学基团，其中所述组的成员(即，个别“质量示差标记”或“质量示差标签”)具有大体上类似的结构和化学性质，但由于组成员之间的重同位素富集的差异而具有不同质量。所述质量示差标签组的每个成员在经受离子裂解时可以产生不同的子离子信号。离子裂解可以通过例如与惰性气体碰撞(例如，碰撞诱导解离(CID)、碰撞活化解离(CAD)等)、通过与光子相互作用导致解离(例如光诱导解离(PID))、通过与表面碰撞(例如表面诱导解离(SID))、通过与电子束相互作用导致解离(例如电子诱导解离(EID)、电子捕获解离(ECD))、热/黑体红外辐射解离(BIRD)、源后衰减或其组合来实现。可以用来区别组成员的质量示差标签或标记的子离子可以被称为质量示差标签或标记的报告离子。
如文中所使用，“天然同位素丰度”指的是基于同位素在自然界的天然陆地普遍性，发现于化合物中的一种或多种同位素的水平(或分布)。例如，从活植物物质获得的天然化合物通常将包含约0.6％的13C。
如文中所使用，术语“主要”(例如“一种主要特征离子碎片”)意指在裂解过程中产生的至少大于50％的离子是特征离子。在一些实施例中，在裂解过程中产生的至少60％、70％、80％、90％的离子是特征离子。类似地，术语主要为(例如“主要为中性丢失裂解”)意指在裂解过程中产生的至少大于50％的离子是中性丢失碎片。在一些实施例中，在裂解过程中产生的至少60％、70％、80％、90％的离子是中性丢失碎片。
如文中所使用，术语“盐形式”包括化合物的盐或化合物的盐的混合物。另外，化合物的两性离子形式也包含在术语“盐形式”中。具有胺或其它碱性基的化合物的盐可以通过(例如)与合适的有机或无机酸(例如氯化氢、溴化氢、乙酸、高氯酸等)反应而获得。具有季铵基的化合物还可以包含抗衡阴离子，例如氯离子、溴离子、碘离子、乙酸根、高氯酸根等。具有羧酸或其它酸性官能团的化合物的盐可以通过使所述化合物与合适的碱(例如，氢氧化物碱)反应而制得。因此，酸性官能团的盐可以具有抗衡阳离子，例如钠、钾、镁、钙等。
如文中所使用，术语“未受影响”或未受影响的个体、患者或样品指的是没患有与27-羟化酶缺陷有关的病症的个体、患者或样品。这些个体、患者或样品可以用于比较样品和/或对照。
虽然以上描述提供了各个实施例的实例和具体细节，但应该理解允许在不脱离所述实施例的范围的情况下对所述实施例的一些特征和/或功能进行修改。以上描述意图说明本文的教示，所述教示的范围只受附加权利要求的语言限制。
实例
可以根据下列实例进一步理解申请人教示的方面，所述实例不应该被视为以任何方式限制申请人教示的范围。
实例1-酮类固醇的萃取-方法1
下列程序描述使用同位素富集型IS从干血粉、血清或血浆点样品中萃取酮固醇。
获取包含3μL干燥血清、血浆或全血点的样品(3.17mm打孔物)。添加含在MeOH+5％乙酸中的50μL(250μg)QAO试剂。另外将10μL同位素富集内标物(IS)(112pg)添加到样品中。然后，涡旋混合样品并在环境温度下培育60分钟。
注入5μL样品用于LC-ESI-MS/MS分析。使用RP C8管柱(Phenomenex Luna50～4.6mm，5pm，40℃)进行LC-MS/MS，并使用以正模式操作的ESI源进行API4000TM LC/MS/MS。LC-MS/MS梯度法(8min)使用水/乙腈/0.1％甲酸移动相。
衍生化酮固醇的定量是通过产生同位素富集型IS而实现。
对7α-胆固烯-3-酮、5α-胆固烷-3-酮和4-胆固烯-3-酮中的每个来说，发现使用上述方法的萃取回收率是>90％。
用于浓度曲线的校准物：对于每个校准物来说，将包含所需量的std和内标物的3pL MeOH溶液掺加到3.17mm滤纸打孔物上并让其干燥。将DCS(双重木炭吸附)血清(3μL)掺加到每个打孔圆盘上并使其在环境温度下干燥。如上所述使用含在MeOH+5％乙酸中的50μL(250μg)试剂萃取校准物。
图3提供了使用此方法获得的7αC4(在DCS血清中为1-400ng/mL)的典型浓度曲线。
图4A-4D、图5A-5D和图6A-6D显示这些被QAO标记的生物标记物以单峰形式共洗脱。
表1提供用于分析5α胆固烷-3-酮、4-胆固烯-3-酮和7α胆固烷-3-酮的MS/MS条件。
表1
化合物 MRM DP EP CE CXP
5α胆固烷-3-酮 501.7->442.6NL 80 11 37 12
501.7->93.3弱碎片 80 11 87 12
4-胆固烯-3-酮 499.8->164.2 60 10 64 12
499.8->152.1 60 10 64 12
499.8->440.8(NL) 60 10 30 12
7α胆固烷-3-酮 515.7->456.8(NL) 85 12 38 14
515.7->152.3 85 12 70 14
515.7->179.9 85 12 65 14
图7提供了三种不同QAO标记酮固醇的QAO衍生化方法性能。给出了检测极限、增强因子、线性度、动态范围、CV和精确度。衍生化之后的增强因子在275与2500之间，这显示了实质性改善。
实例2-酮类固醇的萃取-方法2
下列步骤描述使用同位素富集试剂从干血粉、血清或血浆点样品萃取酮固醇。
获取包含3μL干燥血清、血浆或全血点的样品(3.17mm打孔物)。添加含在MeOH+5％乙酸中的50μL(250μg)QAO试剂。涡旋此混合物并在环境温度下培育60分钟。接着，添加10μL经同位素富集型QAO试剂衍生化的酮固醇分析物作为IS(～112pg)。
注入此样品用于LC-ESI-MS/MS分析(5μL样品)。使用RP C8管柱(PhenomenexLuna 50x4.6mm，5μm，40℃)进行LC-MS/MS，并使用以正模式操作的ESI源进行API 4000TM LC/MS/MS。使用具有水/乙腈/0.1％甲酸移动相的LC-MS/MS梯度法(8min)。
衍生化酮固醇的定量是通过产生同位素富集型IS而实现。对每种浓度进行校准。对于每个校准物来说，将包含所需量的标准物的3μL MeOH溶液与IS一起掺加到3.17mm滤纸打孔物上并让其干燥。将3μL DCS(双重木炭吸附)血清掺加到每个打孔圆盘上并使其在环境温度下干燥。如上所述使用含在MeOH+5％乙酸中的50μL(250μg)试剂萃取校准物。在LC/MS/MS之前，掺加已经用同位素富集试剂衍生化的10μL已知浓度(112pg)的酮固醇分析物。
所进行的如图6浓度曲线中所示的浓度测定十分接近实际样品，表明了使用氘化试剂作为IS的可行性。在图8中，在LC/MS/MS之前掺加试剂。
实例3-酮类固醇的萃取-方法3
使用以下方法分析没有呈干燥形式的3至10μL样品。
获取包含5μL血清、血浆或全血点的样品(3.17mm打孔物)。添加含在MeOH+5％乙酸中的75μL(2.8mglml)QAO试剂。添加10μL同位素富集内标物(7aC4-d7，10pg/μL MeOH溶液)。涡旋混合此样品30秒并在环境温度下培育60-120分钟。
注入10μL用于LC-ESI-MS/MS分析。使用RP CS管柱(Phenomenex Luna 50x4.6mm，5pm，40℃)进行LC-MS/MS，并使用以正模式操作的ESI源进行QTRAP 5500LC/MS/MS。使用具有水/乙腈/0.l％甲酸移动相的LC-MS/MS梯度法(6min)。
每个标准物是用掺加了渐增浓度的酮固醇分析物7αC4和IS 7αC4-d7(10μL MeOH溶液)的5μL DCS血清制成。如上所述使用含在MeOH+5％乙酸中的75μL(2.8mg/ml)试剂萃取校准物。使用方法3获得的7αC4(在DCS血清中的浓度在0与250nm/mL之间)的典型浓度曲线被显示在图10中。
图11提供了其中存在一些内生7αC4的DSC血清的典型样品的色谱。
实例4-酮类固醇的萃取和分析
采用在实例4的分析中所使用的定量工作流程。明确地说，将血浆样品(5μL)与含在MeOH+5％乙酸中的50μL QAO试剂以及10μL内标物(112pg)组合。涡旋混合此混合物并在室温下培育1至2小时。添加40μL MeOH+5％乙酸。使用QTRAO5500TM将5μL样品注入LC-MS/MS分析中。
此方法的灵敏性增强提供在图13中，其比较了50pg非衍生化7αC4与80fg QAO衍生化7αC4的扫描，其中信号增强了400倍。使用此工作流程分析的酮类固醇被描述在图14至24的至少一些中。
实例5-7αC4的萃取和分析
采用用于分析7αC4的定量工作流程。明确地说，将血浆样品(5μL)与含在MeOH+5％乙酸中的80μL(210μg)QAO试剂组合，并添加含在MeOH中的10μL同位素富集型(d7)内标物。涡旋混合此混合物并在室温下培育1至2小时。添加含在MeOH:H2O中的20μL IS-d3。使用QTRAO 5500TM注入5μL样品用于LC-ESI-MS/MS分析。分析耗时6分钟。使用此工作流程分析的7αC4被描述在图14至24的至少一些中。
本申请中所引用的所有文献和类似材料，包括(但不限于)专利、专利申请、文章、书籍、专著和网页，不管这些文献和类似材料的格式如何，均明确地以全文引用的方式并入本文中以供所有目的使用。在一个或多个所并入的文献和类似材料不同于本申请或与本申请矛盾的情况下，包括(但不限于)定义术语、术语用法、所述技术或诸如此类，本申请优先。
本文中所使用的段落标题仅用于组织目的且不应该被视为以任何方式限制所描述的标的物。
虽然结合了各个实施例来描述申请人的教示，但申请人的教示无意局限于这些实施例。相反地，正如本领域技术人员所能理解的，申请人的教示涵盖各种替代、修改和等效物。
本教示不应该被解读为局限于所述顺序或元素，除非规定如此。应该理解的是，可以在不脱离本教示的范围的情况下对形式和细节作出各种改变。例如，任何公开的方法步骤可以与任何其它公开的步骤组合，以提供分析含环化合物的方法根据本教示的各个实施例。因此，主张了在本教示的范围和精神内的所有实施例和其等效物。

Claims (20)

1.一种诊断或筛查27-羟化酶CYP27A1缺陷的方法，其包括：
用式(I)的标记试剂或其盐或水合物使包含一种或多种酮固醇胆汁酸前体的分析物衍生化，以形成标记分析物：
Y-(CH2)n-O-NH2   (I)
其中n是2、3、4、5或6，且Y是：
每个R4独立地为H或支链或直链C1-C18烷基，
m是1与20之间的整数，且
X是阴离子；
电离所述标记分析物；
通过质量分析检测所述标记分析物的特征离子碎片；以及
比较所述特征离子碎片与标准物的特征离子碎片的强度。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述27-羟化酶CYP27A1缺陷是由脑腱黄瘤病CTX所引起。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述27-羟化酶CYP27A1缺陷是由Δ4-3-氧代类固醇-5B还原酶缺陷所引起。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种酮固醇胆汁酸前体包括下列各项中的一个或多个：
7α-胆固烯-3-酮；
5α-胆固烷-3-酮；
4-胆固烯-3-酮；
7α,l2α-二羟基-4-胆固烯-3-酮；
7α-羟基-5β-胆固烷-3-酮；以及
7α,12α-二羟基-5β-胆固烷-3-酮。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述一种或多种酮固醇胆汁酸前体包括7α-胆固烯-3-酮、5α-胆固烷-3-酮、4-胆固烯-3-酮和7α,l2α-二羟基-4-胆固烯-3-酮中的至少两个。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述衍生化包括使包括7α-胆固烯-3-酮和7α,l2α-二羟基-4-胆固烯-3-酮的一组分析物衍生化。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述分析物组包括7α-胆固烯-3-酮、5α-胆固烷-3-酮、4-胆固烯-3-酮和7α,l2α-二羟基-4-胆固烯-3-酮。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述标记试剂具有以下结构：
或其盐或水合物。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述分析物是从生物基质获得。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述生物基质包括鲜血、干血粉、血清或血浆。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述生物基质的体积为10μL或更少。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述特征离子碎片为中性丢失碎片，其包括所述分析物和所述标记试剂或其部分的结构碎片。
13.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括以下步骤：用式(I)的标记试剂使一种或多种标准化合物衍生化以形成标记标准物，其中所述标记标准物经同位素富集，以及电离所述标记分析物和所述标记标准物二者。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述标准化合物包括7α-胆固烯-3-酮和7α,l2α-二羟基-4-胆固烯-3-酮。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述检测是在单次质量分析操作中进行。
16.根据权利要求13所述的方法，其进一步包括测量所述标记分析物相对于同位素标记标准物的相对浓度。
17.根据权利要求1所述的方法，其中电离所述标记分析物的所述步骤是利用约10至约130eV范围内的碰撞能量进行。
18.一种用于分析酮固醇胆汁酸前体的试剂盒，其包括：
一组酮固醇胆汁酸前体标准物；
一组质量标记，其包括两种或更多种式(I)化合物：
Y-(CH2)n-O-NH2   (I)
其中n是2、3、4、5或6且Y是：
每个R4独立地为H或支链或直链C1-C18烷基，
m是1与20之间的整数，且
X是阴离子；
或其盐或水合物，
以及缓冲剂、试剂、分离柱和用于进行分析的说明书中的一个或多个。
19.根据权利要求18所述的试剂盒，其中所述组的酮固醇胆汁酸前体标准物包括下列各项中的两个或更多个：
7α-胆固烯-3-酮(7αC4)；
5α-胆固烷-3-酮；
4-胆固烯-3-酮；
7α,l2α-二羟基-4-胆固烯-3-酮；
7α-羟基-5β-胆固烷-3-酮；以及
7α,12α-二羟基-5β-胆固烷-3-酮。
20.根据权利要求18所述的试剂盒，其中所述组的酮固醇胆汁酸前体包括7α-胆固烯-3-酮和7α,l2α-二羟基-4-胆固烯-3-酮。
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