CN113834804B

CN113834804B - 一种柔性表面增强拉曼基底的构筑方法和应用

Info

Publication number: CN113834804B
Application number: CN202111112318.5A
Authority: CN
Inventors: 肖卫华; 于海涛; 吕谦; 韩鲁佳
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2021-09-23
Filing date: 2021-09-23
Publication date: 2023-01-24
Anticipated expiration: 2041-09-23
Also published as: CN113834804A

Abstract

本发明公开了属于表面增强拉曼检测技术领域的一种柔性表面增强拉曼基底的构筑方法和应用。所述柔性基底以二醋酸纤维素和金纳米颗粒为原材料，将金纳米颗粒过滤截留在制备好的二醋酸纤维素薄膜上，之后使用滴加测试或者过滤富集测试的方法对对氨基苯硫酚和福美双农药进行了定性定量分析。采用本发明的方法对福美双等农残进行检测，具有无损、快速、实时和灵敏度高等优点，因此，本发明为快速测定低浓度农药提供了一种有效方法，具有实际应用价值。

Description

一种柔性表面增强拉曼基底的构筑方法和应用

技术领域

本发明属于表面增强拉曼检测技术领域，尤其涉及一种柔性表面增强拉曼基底的构筑方法和应用。

背景技术

根据《中华人民共和国农药管理条例》，农药是指用于预防、消灭或者控制危害农业、林业的病、虫、草和其他有害生物以及有目的地调节植物、昆虫生长的化学合成或者来源于生物、其他天然物质的一种物质或者几种物质的混合物及其制剂。其是确保粮食供应、改善人类生活的重要生产资料和战略物资。《自然-地球科学》最近的调查显示，全球64％用于农业和粮食作物的土地面临农药污染的风险，其中中国、日本、马来西亚和菲律宾的风险最高。近年来，一批高效低毒的生物农药出现，现在人们已经找到了一些具有专一性的农药来替代传统的高毒性农药。福美双(thiram)是一种广谱保护性低毒杀菌剂，对多种病原真菌具有活性，常用于种子处理、土壤处理或喷雾杀菌。虽然其抗菌谱广，应用广泛，但有较高的蓄积性。长期以来，我国使用福美双来防治果蔬与粮食作物的病害，因此，开发福美双的检测方法十分必要。

常用的农药残留检测方法包含提取、测试和数据分析三个步骤。成熟的提取方法主要包括液相-液相萃取、固相萃取、QuEChERS法和凝胶色谱法等，之后采用液相质谱(LC-MS)和气相质谱(GC-MS)等方法对农药分子进行定量检测。针对农药残留的检测方法，我国已推行了一系列的标准，对市面上大部分的农药类型的检测方法进行了规定。但是，这些检测方法前处理步骤较多，需要对待测物进行破坏，后续检测时间长且对于检测者的实验操作要求较高。

基于拉曼光谱学分析的检测方法由于其无损、快速的优势逐渐得到重视，其指纹性识别目标分子的优势使得特异性识别一种或一类农药成为了可能。拉曼光谱(Ramanspectra)，是一种散射光谱。拉曼光谱分析法是对入射光频率不同的散射光谱进行分析以得到分子振动、转动方面信息，并应用于分子结构研究的一种分析方法。拉曼光谱技术具有样品无需前处理、操作简便、时间短、灵敏度高等优点，能获得样品的物理化学及深层结构信息，另外，拉曼光谱对水等极性物质不敏感，因此，其针对水体中农药的检测具有良好的应用前景。但是，由于拉曼光谱测量的是分子的散射信号，其信号强度较低。由文献调研可知，农药的安全残留量标准常常较低，常常达到ppm甚至ppb水平，大部分的农药分子使用拉曼光谱无法达到所需要的检测限。

表面增强拉曼光谱(SERS)能够测量痕量分子的化学指纹信息，并通过等离子体激元诱导的磁共振等方法增强光谱的散射信号以获得较好的灵敏度和较低的检测限。因此，其在农药残留检测方面的应用具有巨大潜力。

现有专利CN 111535022A将纤维素改性后，在金盐溶液和还原剂溶液中循环浸渍制备柔性SERS基底，其主要利用静电吸附作用原位还原得到金纳米颗粒，颗粒均匀分散，但“热点”密度较低，从而检测限有限制。专利CN 110220881 A利用光固化树脂材料卷对卷紫外固化得到具有阵列的凹槽，然后使用蒸发镀膜技术在凹槽中镀上一层金纳米颗粒薄层制备柔性SERS基底，但是其制备凹槽这一操作需要使用化学刻蚀等精密的实验操作，其技术操作复杂且成本较高，适合于生物检测等领域。

对于纳米级金银颗粒和纳米级粗糙度的金属表面的构筑是制备SERS基底最为简单的方法，但其信号的均匀度、稳定性和可控性无法保证，难以向定量检测的方向发展。固态SERS基底的优势很多，但是由于常用材料玻璃和硅片的非柔性，使得其在样品前处理上依然需要大量的实验操作和时间。柔性SERS基底规避了样品前处理步骤，采用擦拭取样、过滤富集和吸附取样等方式，大大减少了样品前处理时间，提高了检测效率。但是，由于柔性SERS基底的制备方法研究还未成熟，很多方法难以保证测试检测限和测试的均匀性、可重复性。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提出了一种柔性表面增强拉曼基底的构筑方法，包括以下步骤：

1)采用柠檬酸钠还原氯金酸的方法制备金纳米胶体；

2)以二醋酸纤维素为溶质，N,N-二甲基乙酰胺为溶剂，均匀溶解配制铸膜液，刮涂成0.4mm的厚度，干燥后以水作为反溶剂造孔，得到基底膜；

3)使用基底膜过滤金纳米胶体，通过匹配金纳米颗粒的尺寸和基底膜的膜孔径，使得金纳米颗粒截留在基底膜材料表面，得到柔性表面增强拉曼基底；基底膜的膜孔径大小的选择保证将金纳米颗粒截留在基底膜材料表面的同时，又能实现水分子的完全透过。

金纳米胶体中金纳米颗粒的尺寸为40-74nm；基底膜的膜孔径为15-30nm。

所述柔性表面增强拉曼基底夹持风干保存或将柔性表面增强拉曼基底非截留金纳米颗粒面浮于水中保存。

所述步骤3)中抽滤过滤液的体积为100-300mL。通过改变过滤液用量调整表面金层的厚度，由于二醋酸纤维素本身存在拉曼背景峰，因此调控的金层厚度越大，二醋酸纤维素的背景峰越弱。

风干保存的柔性表面增强拉曼基底的最低检出限为10^-6g/mL；水中保存的柔性表面增强拉曼基底的最低检出限为10^-8g/mL。

金纳米胶体制备的方法为：配制25mmol/L的氯金酸水溶液和1wt％的二水合柠檬酸钠水溶液，将100mL去离子水加热至沸腾，依次加入1mL氯金酸水溶液和0.4-1mL二水合柠檬酸钠溶液，持续搅拌至溶液由淡黄色变化为黑色，最后变为棕红色；继续搅拌冷却至室温。

所述铸膜液的浓度为6-10wt％。

所述构筑方法得到的柔性表面增强拉曼基底。

所述柔性表面增强拉曼基底用于表面增强拉曼光谱测定水环境中的对氨基苯硫酚和福美双农药。

所述柔性表面增强拉曼基底在表面增强拉曼光谱测定过程中的使用方法，风干保存的柔性表面增强拉曼基底的测试方法为：在柔性表面增强拉曼基底的金纳米颗粒截留区域，滴加10-50μL待测药液，再次风干后测试拉曼信号；

水中保存的柔性表面增强拉曼基底的测试方法为：使用柔性表面增强拉曼基底过滤1-10mL待测药液，富集后再次风干测试拉曼信号。水中储存时，膜材料由于水的表面张力会浮在水表面。另外，其表面金层是疏水的，滴加药液时液滴不会散开，因此风干后，在液滴处会有分子吸附在金颗粒“热点”处，从而能够测试到信号。

所述待测药液的浓为10^-8-10^-5g/mL。

本发明的有益效果在于：

1、本发明构筑方法仅需调控基底膜的膜孔径大小，在保证将金纳米颗粒截留在基底膜材料表面的同时，又能实现水分子的完全透过；无需将基底膜进行复杂的改性过程，即能发挥金纳米颗粒拉曼信号的增强作用。

2、本发明使用二醋酸纤维素作为基底材料，其是一种商业上十分重要的纤维素衍生物，主要原料为木浆和棉浆等，因此，其具有较低的成本和较好的环境友好性。

3、本发明使用金纳米颗粒作为拉曼信号的增强材料，相比于银纳米颗粒，其在空气中更难以氧化，储存性能较好；相比于铜纳米颗粒和其他金属氧化物，其等离子体激元共振现象更为明显，表现为被激光激发后，颗粒周围的电磁场强度更强，因此，其拉曼信号强度也会更强。

4、本发明涉及的二醋酸纤维素制备柔性表面增强拉曼基底，不仅能发挥基底的负载支撑作用，在检测过程中，又能对待测药液进行过滤富集测试，进一步降低了最低检测限的测量标准，拓宽了在水体农药残留检测的测定范围。

5、本发明可操作性强，简单易行，测试时间短，且重复性好，相对标准偏差值(RSD)均小于20％，能够对水中对氨基苯硫酚和福美双农药分子进行定性定量检测，试验结果也能稳定呈现。

附图说明

图1实施例1制备的柔性表面增强拉曼基底的形貌表征；

图2实施例3制备的柔性表面增强拉曼基底的形貌表征；

图3在实施例1柔性表面增强拉曼基底上的过滤富集测试对氨基苯硫酚和福美双农药的SERS光谱图；

图4对氨基苯硫酚两个特征峰在实施例1水中保存的柔性表面增强拉曼基底上过滤富集测试的线性范围；

图5福美双农药特征峰在实施例1水中保存的柔性表面增强拉曼基底上过滤富集测试的线性范围。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细说明：

本发明构筑方法得到的一种用于测定农业水体中农药福美双和对氨基苯硫酚的柔性表面增强拉曼基底，配套本发明柔性表面增强拉曼基底在表面增强拉曼光谱测定过程中的使用方法能够大大减少测试时间，同时实现对水中福美双和对氨基苯硫酚的定性定量检测。

柔性表面增强拉曼基底的构筑方法包括下述步骤：

1)金纳米胶体制备：配制25mmol/L的氯金酸水溶液和1wt％的二水合柠檬酸钠水溶液，之后将100mL去离子水加热至沸腾，依次加入1mL氯金酸水溶液和二水合柠檬酸钠溶液，持续搅拌至溶液由淡黄色变化为黑色，最后变为棕红色；继续搅拌冷却至室温；

在0.4-1mL范围内改变二水合柠檬酸钠溶液的加入量，得到不同尺寸的金纳米颗粒；

2)用粉末状的二醋酸纤维素作为溶质，N,N-二甲基乙酰胺作为溶剂，配制浓度为6-10wt％的铸膜液，充分搅拌直至粉末状样品全部溶解在溶剂中，将铸膜液静置足够长的时间直至气泡脱除；将铸膜液用刮刀在平整的玻璃板上，厚度为0.4mm；常温下在通风橱中风干，泼去离子水作为反溶剂，通过溶剂交换造孔得到基底膜，溶剂交换时间控制在半小时之内；

3)将步骤2)基底膜作为滤膜，将步骤1)制备的金纳米胶体作为过滤液，在抽滤装置中抽滤，使得金纳米颗粒截留在基底膜材料表面，得到柔性表面增强拉曼基底；调整金纳米胶体的用量为100-300mL范围，得到不同厚度金层的SERS基底。而实验过程中，通过考察5mL-300mL的范围，100mL是基底膜材料背景峰消失的分界点，因此，选择100-300mL作为范围值。100mL以上的过滤体积其基底膜材料的背景峰就几乎不存在了，基于成本考量，选取100mL进行试验即可。

柔性表面增强拉曼基底夹持风干保存或将柔性表面增强拉曼基底非截留金纳米颗粒面浮于水中保存。

测试过程

将上述构筑方法得到的风干保存和水中保存的柔性表面增强拉曼基底分别记作A基底和B基底；将二者裁剪成合适尺寸的若干相同基底，记作A1基底、A2基底、A3基底、…An基底和B1基底、B2基底、B3基底、…Bn基底。

标准曲线的绘制：分别配制对氨基苯硫酚和福美双农药的标准溶液，然后用水分别稀释成浓度范围为10^-8-10^-5g/mL对应的系列梯度浓度溶液。

使用A基底，测定氨基苯硫酚系列梯度浓度溶液的拉曼信号，绘制标准曲线A-氨基苯硫酚；

使用B基底，测定氨基苯硫酚系列梯度浓度溶液的拉曼信号，绘制标准曲线B-氨基苯硫酚；

使用A基底，测定福美双系列梯度浓度溶液的拉曼信号，绘制标准曲线A-福美双；

使用B基底，测定福美双系列梯度浓度溶液的拉曼信号，绘制标准曲线B-福美双；

A基底的测试方法为：在风干保持的基底上滴加药液10-50μL，风干后测试拉曼信号；

B基底的测试方法为：在水中保存的基底过滤1-10mL药液，进行富集后，风干测试拉曼信号。

测试结果

结果显示对氨基苯硫酚的检测限最低能达到10^-8g/mL；福美双农药的检测限最低能达到10^-8g/mL；

实施例1：

用于测定农业水体中农药的柔性表面增强拉曼基底的构筑，包括以下步骤：

1)金纳米胶体颗粒的制备：柠檬酸盐还原法

配制25mmol/L的氯金酸水溶液和1wt％的二水合柠檬酸钠水溶液，之后将100mL去离子水加热至沸腾，依次加入1mL氯金酸水溶液和0.4mL的二水合柠檬酸钠溶液，持续搅拌至溶液由淡黄色变化为黑色，最后变为棕红色，继续搅拌冷却至室温；

2)用粉末状的二醋酸纤维素作为溶质，N,N-二甲基乙酰胺作为溶剂，配制浓度为7wt％的铸膜液，充分搅拌直至粉末状样品全部溶解在溶剂中，将铸膜液静置足够长的时间直至气泡脱除。

用刮刀在平整的玻璃板上刮取厚度为0.4mm的膜，常温下在通风橱中风干，泼去离子水作为反溶剂，溶剂交换时间控制在半小时之内，得到基底膜。

3)将步骤2)制备的基底膜作为滤膜，步骤2)制备的纳米胶体100mL作为过滤液，在抽滤装置中抽滤，使得金纳米颗粒截留在膜材料表面，得到柔性表面增强拉曼基底。

分别将过滤截留后的膜材料夹持风干保存和水中保存。

配制对氨基苯硫酚浓度为10^-4g/mL的甲醇溶液，然后用水稀释至浓度10^-8-10^-5g/mL。

在风干保存后基底上滴加药液30μL测试拉曼信号；选择使用在水中保存的基底过滤5mL药液富集后，风干测试拉曼信号。

拉曼光谱的测量采用共聚焦拉曼显微光谱仪(SENTERRA II,Bruker,德国)进行，测量条件:激光光源波长为785nm，激光能量为10mW，积分时间为1s，物镜放大倍率为10×，光谱测试范围为50-3655cm^-1。单次测试光谱16条，取平均值作为1次测试结果，测试3次取平均光谱作为样品的光谱数据。样品光谱截取400-2000cm^-1部分，然后进行基线校正和平滑处理，再对样品特征峰处的光谱强度做定性定量分析。

如图4和图5的结果显示，夹持风干保存基底的对氨基苯硫酚的检测限能达到10^- ⁶g/mL，线性范围为10^-6-10^-5g/mL水中保存基底的对氨基苯硫酚的检测限能达到10^-8g/mL，线性范围为10^-8-10^-7g/mL。

实施例2：

使用实施例1所述方法构筑柔性表面增强拉曼基底并分别保存。

配制福美双农药浓度为10^-4g/mL的甲醇溶液，然后用水稀释至浓度10^-8-10^-5g/mL，在风干保存后基底上滴加药液30μL测试拉曼信号；选择使用在水中保存的基底过滤5mL药液富集后，风干测试拉曼信号。

结果显示夹持风干保存基底的福美双农药的检测限能达到10^-6g/mL，线性范围为10^-6-10^-5g/mL；福美双农药的检测限能达到10^-8g/mL，线性范围为10^-8-8×10^-8g/mL。

实施例3：

用于测定农业水体中农药的表面增强拉曼基底构筑，包括以下步骤：

1)金纳米胶体颗粒的制备：柠檬酸盐还原法

配制25mmol/L的氯金酸水溶液和1wt％的二水合柠檬酸钠水溶液，之后将100mL去离子水加热至沸腾，依次加入1mL氯金酸水溶液和1mL的二水合柠檬酸钠溶液，持续搅拌至溶液由淡黄色变化为黑色，最后变为棕红色。继续搅拌冷却至室温。

用刮刀在平整的玻璃板上刮取厚度为0.4mm的膜，常温下在通风橱中风干一定时间后，泼去离子水作为反溶剂，溶剂交换时间控制在半小时之内，得到基底膜。

3)将步骤2)制备的基底膜作为滤膜，将步骤1)中制备的金纳米胶体100mL作为过滤液，在抽滤装置中抽滤，使得金纳米颗粒截留在膜材料表面，得到柔性表面增强拉曼基底。

分别将柔性表面增强拉曼基底夹持风干保持和水中保存。

配制对氨基苯硫酚浓度为10^-4g/mL的甲醇溶液，然后用水稀释至浓度10^-8-10^-5g/mL，在风干保存基底上滴加药液30μL测试拉曼信号；同时选择使用在水中保存的基底过滤5mL药液富集后，风干测试拉曼信号。

结果显示对氨基苯硫酚的检测限能达到10^-8g/mL，线性范围为10^-8-10^-7g/mL。

实施例4：

使用实施例3所述方法构筑柔性表面增强拉曼基底并分别保存。

配制福美双农药浓度为10^-4g/mL的甲醇溶液，然后用水稀释至浓度10^-8-10^-5g/mL，在风干保存后基底上滴加药液30μL测试拉曼信号；同时选择使用在水中保存的基底过滤5mL药液富集后，风干测试拉曼信号。

结果显示福美双农药的检测限能达到10^-7g/mL，线性范围为10^-7-10^-6g/mL。

试验结果

表1实施例中柔性表面增强拉曼基底不同测试方法的RSD值

本试验结果显示：

(1)如图1、图2的形貌表征可知，本发明制备的表面增强拉曼基底将具有等离子体激元共振效应的金纳米颗粒完整的截留在二醋酸纤维素膜表面，且具有良好的紧密排列结构和粗糙度，适用于进行表面增强拉曼光谱测试。不同大小的金纳米颗粒均能够被截留，形成致密的金纳米颗粒薄层；

(2)图3是基于图1SERS基底的对氨基苯硫酚和福美双农药的表面增强拉曼光谱，图中对氨基苯硫酚的1080cm^-1和1588cm^-1两个谱峰信号较强，对这些谱峰进行归属，其中1080cm^-1处的谱峰特征峰对应于C-S键的伸缩振动，1588cm^-1处的谱峰特征峰对应于C-C键的伸缩振动；图中福美双的1380cm^-1谱峰信号较强，对这些谱峰进行归属，其在1380cm^-1处的谱峰特征峰对应于CH₃基团的非对称摇摆振动；

(3)由表1数据可知，本发明涉及的两种测试方法，即滴加测试和过滤富集测试均有良好的测试均匀性，其相对标准偏差值(RSD)均小于20％。进一步分析测试数据可知，在滴加测试的方法中，其对于两种测试药品(对氨基苯硫酚和福美双农药)的检测限均能够达到10^-6g/mL，线性范围为10^-6-10^-5g/mL；而在过滤富集测试的方法中，其对于两种测试药品(对氨基苯硫酚和福美双农药)的检测限能够达到10^-8g/mL，线性范围为10^-8-10^-7g/mL；

综上所述，本发明构筑了一种基于二醋酸纤维素和金纳米颗粒的表面增强拉曼柔性基底，属于表面增强拉曼检测领域。首先，通过传统的柠檬酸盐还原法制备得到不同尺寸的金纳米颗粒，以二醋酸纤维素作为溶质，N,N-二甲基乙酰胺作为溶剂，配制不同浓度的铸膜液，采用刮膜法刮得膜材料，然后将金纳米颗粒过滤在膜材料上制得表面增强拉曼柔性基底，基底表面均匀的密排金纳米颗粒结构使得测试拥有良好的增强效果和测试均匀性，由此，确定了对氨基苯硫酚和农药福美双的检测限以及测试线性范围。本发明测试方法包含滴加测试和富集过滤测试，其测试操作简单，检测速度较快，测试精度和稳定性均较好，能够实现水体中对氨基苯硫酚和福美双农药的原位检测。

Claims

1.一种柔性表面增强拉曼基底的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）采用柠檬酸钠还原氯金酸的方法制备金纳米胶体；金纳米胶体中金纳米颗粒的尺寸为40-74 nm；

2）用粉末状的二醋酸纤维素作为溶质，N ,N-二甲基乙酰胺作为溶剂，配制浓度为6-10wt％的铸膜液，充分搅拌直至粉末状样品全部溶解在溶剂中，将铸膜液静置足够长的时间直至气泡脱除；将铸膜液用刮刀在平整的玻璃板上刮取厚度为0 .4mm的膜；常温下在通风橱中风干，泼去离子水作为反溶剂，通过溶剂交换造孔得到基底膜，溶剂交换时间控制在半小时之内；所述基底膜的膜孔径为15-30 nm；

3）使用基底膜过滤步骤1）制备的金纳米胶体，通过匹配金纳米颗粒的尺寸和基底膜的膜孔径，使得金纳米颗粒截留在基底膜材料表面，得到柔性表面增强拉曼基底；基底膜的膜孔径大小的选择保证将金纳米颗粒截留在基底膜材料表面的同时，又能实现水分子的完全透过；其中，金纳米胶体的体积为100-300 mL；

所述柔性表面增强拉曼基底夹持风干保存或将柔性表面增强拉曼基底非截留金纳米颗粒面浮于水中保存；风干保存的柔性表面增强拉曼基底的最低检出限为10^-6g/mL；水中保存的柔性表面增强拉曼基底的最低检出限为10^-8g/mL。

2.根据权利要求1所述的一种柔性表面增强拉曼基底的制备方法，其特征在于，金纳米胶体制备的方法为：配制25 mmol/L的氯金酸水溶液和1 wt%的二水合柠檬酸钠水溶液，将100 mL去离子水加热至沸腾，依次加入1 mL氯金酸水溶液和0.4-1 mL二水合柠檬酸钠水溶液，持续搅拌至溶液由淡黄色变化为黑色，最后变为棕红色；继续搅拌冷却至室温。

3.权利要求1或2所述的制备方法制备得到的柔性表面增强拉曼基底。

4.权利要求3所述的柔性表面增强拉曼基底在表面增强拉曼光谱测定水环境中的对氨基苯硫酚或福美双农药中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，其应用方法如下：

风干保存的柔性表面增强拉曼基底的测试方法为：在柔性表面增强拉曼基底的金纳米颗粒截留区域，滴加10-50 µL待测药液，再次风干后测试拉曼信号；或者，

水中保存的柔性表面增强拉曼基底的测试方法为：使用柔性表面增强拉曼基底过滤1-10 mL待测药液，富集后风干测试拉曼信号。