CN113827554B - 一种载药水凝胶的制备方法及其应用 - Google Patents

一种载药水凝胶的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明揭示了一种载药水凝胶的制备方法，包括如下步骤：S100、制备苯硼酸官能化聚乙烯亚胺PBA‑PEI；S200、制备氧化葡聚糖OD；S300、将所述PBA‑PEI配制成水溶液，并加入适量多西环素与二甲双胍以使得形成B‑N配位；S400、将所述OD配制成水溶液；S500、将S300的水溶液和S400的水溶液共混，制得ROS响应性PBA‑PEI/OD载药水凝胶。本发明同时负载二甲双胍与多西环素，可提升多西环素与二甲双胍的载药率，同时实现药物的ROS响应性释放，实现了两种药物的协同治疗效应，并可同时发挥抗菌、抗炎和促牙周骨组织修复性再生的多重功效，为未来伴糖尿病牙周炎临床治疗提供了新的有效手段。

Description

一种载药水凝胶的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于载药水凝胶领域，特别涉及一种载药水凝胶的制备方法及其在牙周炎的应用。
背景技术
慢性牙周炎是口腔医学领域最常见的疾病，同时是全球最常见的慢性疾病之一。慢性牙周炎是由菌斑引起的感染性疾病，主要表现为牙齿支持组织不可逆的免疫炎症性破坏，随着疾病进展，往往会导致牙齿松动、脱落，受损的咀嚼功能会严重影响患者的身心健康。牙周炎还和包括阿尔兹海默症、类风湿性关节炎、糖尿病、动脉粥样硬化等许多全身系统性疾病相关。其中糖尿病是一种以胰岛素分泌不足或胰岛素功能障碍引起的代谢紊乱性的疾病，以高血糖为主要标志，全球糖尿病流行形势严峻。
牙周炎已成为糖尿病的第六大并发症，可能是糖尿病代谢失调的危险因素。已有大量流行病、试验性或临床研究证实：糖尿病人的牙周炎比非糖尿病人严重，两者之间互为危险因素，互为因果，恶性循环，使疾病加重。糖尿病患者的高血糖状态会导致活性氧的大量产生以及多种促炎细胞因子的释放。体内活性氧(ROS)和抗氧化体系间稳态的破坏会导致氧化应激，在伴糖尿病牙周炎的发生发展中发挥着关键作用。
负载抗生素类药物的牙周局部药物输送系统，可以避免系统用药的副作用，同时提升活性药物的局部浓度，是牙周炎临床治疗的常见手段。
可注射水凝胶，相较于其他剂型(膜片、纤维、纳米颗粒等)易于制备、成本较低、生物安全性良好，可以轻松注射进入形状不规则的牙周袋内，实现均匀分布，因此是较为理想的牙周局部药物输送系统。然而，常规水凝胶中的药物负载简单依靠的是单纯物理相互作用，药物释放呈“爆释”，如何根据牙周微环境设计理想的牙周局部药物输送系统，实现药物控释，是本领域需要解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明揭示了一种载药水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
S100、制备苯硼酸官能化聚乙烯亚胺PBA-PEI：
S200、制备氧化葡聚糖OD：
S300、将所述PBA-PEI配制成水溶液，并加入适量多西环素与二甲双胍以使得形成B-N配位；
S400、将所述OD配制成水溶液；
S500、将S300的水溶液和S400的水溶液共混，制得ROS响应性PBA-PEI/OD载药水凝胶。
优选的，
所述步骤S100包括如下步骤：
1)利用1M盐酸将1.000g、0.04mmol聚乙烯亚胺PEI的pH调节至5.0备用；
2)称取0.579g、3.49mmol对羧基苯硼酸溶解于8mL二甲基亚砜DMSO中，先加入2mL去离子水，室温下搅拌30min至放热完全后，加入0.669g、3.49mmol的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和0.402g、3.49mmol的N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，继续搅拌2小时；
3)将所得混合物加入PEI溶液中，室温搅拌24小时，将混合液加入透析袋MW 3500中，透析3天，每12小时更换一次水；
4)将液体收集冷冻后，利用冻干机冻干，所得黄色产物即为PBA-PEI；
其中，所得产物PBA-PEI的核磁共振氢谱具有如下特征：
δ2.9，3.1和7.8ppm处的特征峰分别对应苯硼酸官能化的聚乙烯亚胺上的关键位点，苯硼酸成功接于聚乙酰亚胺上，构建了苯硼酸官能化的聚乙烯亚胺。
优选的，
所述步骤S200包括如下步骤：
1)称取10g(0.0618mol)葡聚糖，37℃溶解于50mL去离子水中；
2)配制50mL 26.4％(w/v)的高碘酸钠溶液，避光环境下，缓慢滴加进葡聚糖溶液中，持续搅拌；
3)避光、室温条件下持续搅拌1小时后，加入4.53mL丙二醇终止反应；
4)将溶液转移进入透析袋中，透析7天，每12小时换水1次；
5)将液体收集冷冻后，利用冻干机冻干，所得白色产物即为氧化葡聚糖OD；，合成的产物的核磁共振氢谱具有如下特征：
烷基氢谱呈单峰分布：δ4.72～4.89；而糖环上其它氢谱则以多重峰的形式出现：δ3.31-3.82；醛基特征峰为δ9.54-9.69，葡聚糖的羟基成功被氧化为醛基，氧化葡聚糖顺利合成，其中，醛基和氧化葡聚糖上附近的羟基可以相互反应，形成半缩醛基，表现为5.7-4.1ppm的多个多重峰。
优选的，
所述步骤S300中：
PBA-PEI配制成2％-20％的水溶液。
优选的，
所述步骤S400中：
OD配制成5％-30％的水溶液。
优选的，
所述步骤S500中：
10％PBA-PEI水溶液和20％OD水溶液以6∶4进行混合。
优选的，
称取适量多西环素与二甲双胍加入600μL 10％PBA-PEI水溶液中，静置30min待B-N配位形成，再加入400μL 20％OD水溶液，振荡混匀，成胶，以此构建ROS响应性PBA-PEI/OD载药水凝胶。
优选的，
所述载药水凝胶的载药率最高可达4％。
此外，本发明还揭示了一种载药水凝胶，其通过上述的方法制得。
最后，本发明还揭示了所述的载药水凝胶在伴糖尿病牙周炎的应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明的一个实施例所得水凝胶在伴糖尿病牙周炎动物模型中实现牙周组织修复性再生的示意图；
图2为本发明的一个实施例中PBA-PEI的核磁共振氢谱；
图3为本发明的一个实施例中OD的核磁共振氢谱；
图4为本发明的一个实施例中10％PBA-PEI水溶液与20％OD水溶液以不同体积比例进行共混，所得凝胶的储能模量值；
图5A至5B为本发明的一个实施例中核磁共振硼谱结果及载药率差异的有关示意图；
图6A至6F为本发明的一个实施例中水凝胶形貌和可注射特性的有关示意图；
图7A至7D为本发明的一个实施例中二甲双胍与多西环素的紫外可见光谱图、测试水凝胶的药物释放过程中所得样品的紫外可见光谱图和药物释放曲线的有关示意图；
图8A至8D为本发明的一个实施例中检测凝胶与牙龈组织粘接强度及其测试的有关示意图；
图9为本发明的一个实施例中各组水凝胶的细胞相容性的有关示意图；
图10为本发明的一个实施例中各组水凝胶的溶血率的有关示意图；
图11为本发明的一个实施例中各组水凝胶的抗菌情况的有关示意图；
图12A至12G为本发明的一个实施例中检测水凝胶治疗伴糖尿病牙周炎大鼠的治疗效果的Micro-CT检测有关示意图；
图13A至13F为本发明的一个实施例中检测水凝胶治疗伴糖尿病牙周炎大鼠的治疗效果的组织学检测的有关示意图；
图14A至14H为本发明的一个实施例中检测水凝胶治疗伴糖尿病牙周炎大鼠的治疗效果的牙龈组织炎症因子和成骨相关基因的表达状况的有关示意图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图1至图14H，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。
此外，若出现术语“第一”、“第二”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例中的特征可以相互结合。
发明人发现，现有的牙周局部药物输送系统，负载的主要是单一药物，且仅针对慢性牙周炎患者，缺乏对于伴糖尿病牙周炎的靶向性；且，现有的牙周局部药物输送系统均为抗生素类药物，仅能起到抗菌效果，缺乏促进牙周骨再生的特性。此外，ROS响应性水凝胶在心肌梗塞、癌症治疗领域有相关研究，但对牙周炎，尤其是伴糖尿病牙周炎的治疗上尚无报道。伴糖尿病的牙周炎的治疗是领域的难题。
在一个实施例中，本发明提供了一种载药水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
S100、制备苯硼酸官能化聚乙烯亚胺PBA-PEI：
S200、制备氧化葡聚糖OD：
S300、将所述PBA-PEI配制成水溶液，并加入适量多西环素与二甲双胍以使得形成B-N配位；
S400、将所述OD配制成水溶液；
S500、将S300的水溶液和S400的水溶液共混，制得ROS响应性PBA-PEI/OD载药水凝胶。
能够理解，由于上述制备方法最终所得的载药水凝胶负载了多西环素和二甲双胍两种药物，利用这两种携带氨基结构的药物，与苯硼酸官能化的聚乙烯亚胺进行B-N配位即硼-氮配位，可以在实现ROS响应性药物释放，两种药物可同时发挥抑菌抗炎和促进牙周骨组织修复的作用，从而产生协同效应，这使得所述载药水凝胶有利于牙周炎特别是伴糖尿病牙周炎的治疗。
结合图1，其示意了：(A)多西环素化学结构，(B)二甲双胍化学结构，(C)氧化葡聚糖化学结构图，(D)苯硼酸官能化的聚乙烯亚胺结构图，(E)水凝胶的制备过程及其ROS响应性药物释放特性示意图，(F)应用负载二甲双胍与多西环素的ROS-响应性水凝胶，从而可实现抗菌、抗炎及促骨修复效果，在伴糖尿病牙周炎动物模型中实现牙周组织修复性再生。
换言之，本发明的制备方法，关键在于得到了这样的水凝胶：利用苯硼酸官能化的聚乙烯亚胺与氧化葡聚糖构建的具有ROS响应性的可注射水凝胶。该水凝胶同时负载二甲双胍与多西环素，可提升多西环素与二甲双胍的载药率，同时实现药物的ROS响应性释放。且，后文中印证了：在SD大鼠伴糖尿病牙周炎动物模型中，实现了两种药物的协同治疗效应，可同时发挥抗菌、抗炎和促牙周骨组织修复性再生的多重功效，为未来伴糖尿病牙周炎临床治疗提供了新的有效手段。
在一个实施例中，
所述步骤S100包括如下步骤：
1)利用1M盐酸将1.000g、0.04mmol聚乙烯亚胺PEI的pH调节至5.0备用；
2)称取0.579g、3.49mmol对羧基苯硼酸溶解于8mL二甲基亚砜DMSO中，先加入2mL去离子水，室温下搅拌30min至放热完全后，加入0.669g、3.49mmol的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和0.402g、3.49mmol的N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，继续搅拌2小时；
3)将所得混合物加入PEI溶液中，室温搅拌24小时，将混合液加入透析袋MW 3500中，透析3天，每12小时更换一次水；
4)将液体收集冷冻后，利用冻干机冻干，所得黄色产物即为PBA-PEI。
在一个实施例中，
所述步骤S200包括如下步骤：
1)称取10g(0.0618mol)葡聚糖，37℃溶解于50mL去离子水中；
2)配制50mL 26.4％(w/v)的高碘酸钠溶液，避光环境下，缓慢滴加进葡聚糖溶液中，持续搅拌；
3)避光、室温条件下持续搅拌1小时后，加入4.53mL丙二醇终止反应；
4)将溶液转移进入透析袋中，透析7天，每12小时换水1次；
5)将液体收集冷冻后，利用冻干机冻干，得到合成的产物。
在一个实施例中，
所述步骤S300中：
PBA-PEI配制成2％-20％的水溶液。
优选的，
所述步骤S400中：
OD配制成5％-30％的水溶液。
优选的，
所述步骤S500中：
10％PBA-PEI水溶液和20％OD水溶液以6∶4进行混合。
在一个实施例中，
称取10mg多西环素和10mg二甲双胍，加入600μL 10％PBA-PEI水溶液中，静置30min待B-N配位形成，再加入400μL 20％OD水溶液，振荡混匀，成胶，以此构建ROS响应性PBA-PEI/OD载药水凝胶。
在一个实施例中，
所述载药水凝胶的载药率可达4％。
在一个实施例中，本发明还揭示了一种载药水凝胶，其通过上述的方法制得。
在一个实施例中，本发明还揭示了所述的载药水凝胶在伴糖尿病牙周炎的治疗中的应用。
更详细的，本发明还通过如下实施例详细说明了发明构思：
1.苯硼酸官能化聚乙烯亚胺(PBA-PEI)的制备：
1)利用1M盐酸将1.000g(0.04mmol)聚乙烯亚胺(PEI)的pH调节至5.0备用；
2)称取0.579g对羧基苯硼酸(3.49mmol)溶解于8mL二甲基亚砜(DMSO)中，进入2mL去离子水，室温下搅拌30min至放热完全后，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)(0.669g，3.49mmol)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)(0.402g，3.49mmol)，继续搅拌2小时；
3)将所得混合物加入PEI溶液中，室温搅拌24小时，将混合液加入透析袋(MW3500)中，透析3天，每12h更换一次水；
4)将液体收集冷冻后，利用冻干机冻干，所得黄色产物即为PBA-PEI，利用核磁共振氢谱对其结构进行表征，如图2所示的PBA-PEI的核磁共振氢谱：
其中，δ2.9，3.1和7.8ppm处(即图2中a、b、c处)的特征峰分别对应苯硼酸官能化的聚乙烯亚胺上的关键位点，苯硼酸成功接于聚乙酰亚胺上，构建了苯硼酸官能化的聚乙烯亚胺。
2.氧化葡聚糖(OD)的制备：
1)称取10g(0.0618mol)葡聚糖，37℃溶解于50mL去离子水中；
2)配制50mL 26.4％(w/v)的高碘酸钠溶液，避光环境下，缓慢滴加进葡聚糖溶液中，持续搅拌；
3)避光、室温条件下持续搅拌1小时后，加入4.53mL丙二醇终止反应；
4)将溶液转移进入透析袋中，透析7天，每12小时换水1次；
5)合成的产物利用核磁共振氢谱进行表征，如图3所示OD的核磁共振氢谱：
烷基氢谱呈单峰分布：δ4.72～4.89；而糖环上其它氢谱则以多重峰的形式出现：δ3.31-3.82；醛基特征峰为δ9.54-9.69，葡聚糖的羟基成功被氧化为醛基，氧化葡聚糖顺利合成，其中，醛基和氧化葡聚糖上附近的羟基可以相互反应，形成半缩醛基，表现为5.7-4.1ppm的多个多重峰。
3.ROS响应性PBA-PEI/OD载药水凝胶的制备
1)将PBA-PEI配制成2％-20％的水溶液；
2)将OD配制成5％-30％的水溶液；
3)将PBA-PEI和OD以不同比例进行共混，观察混合液成胶情况，可见将10％PBA-PEI和20％OD水溶液以6∶4进行混合时，快速形成水凝胶的同时，凝胶流变力学性能最佳(如图4所示)；
示例性的，有如下具体实施，我们发现：
对于10％PBA-PEI水溶液和20％OD水溶液以5∶5，6∶4，7∶3，8∶2进行混合后，可在30分钟内成胶(备注：倒置试管，样品60s内不会沿管壁流动)；综合凝胶强度、可注射性评价，10％PBA-PEI水溶液和20％OD水溶液以6∶4混合组，性状最为理想；
对于2％PBA-PEI水溶液和30％OD水溶液以5∶5，6∶4，7∶3，8∶2，9∶1的比例混合，可在30分钟内成胶(备注：倒置试管，样品60s内不会沿管壁流动)；综合凝胶强度、可注射性评价，10％PBA-PEI水溶液和20％OD水溶液以9∶1混合组，性状最为理想；
对于20％PBA-PEI水溶液和5％OD水溶液以1∶9，2∶8，3∶7，4∶6，5∶5的比例混合，可在30分钟内成胶(备注：倒置试管，样品60s内不会沿管壁流动)，综合凝胶强度、可注射性评价，10％PBA-PEI水溶液和20％OD水溶液以2∶8混合组，性状最为理想。
4)将适量(例如0.1667％-6.67％的)多西环素与二甲双胍加入600μL 10％PBA-PEI水溶液中，静置30min待B-N配位形成(硼谱结果如图5A-5B所示，硼原子的峰从30ppm至3ppm，提示B-N配位的形成)，加入400μL 20％OD水溶液，振荡混匀，30s内成胶，成功构建ROS响应性PBA-PEI/OD载药水凝胶，载药率可从2％提升至4％；
示例性的，称取10mg多西环素和10mg二甲双胍，加入600μL10％PBA-PEI水溶液中，静置30min待B-N配位形成，再加入400μL 20％OD水溶液，振荡混匀，成胶，以此构建负载1％多西环素和1％二甲双胍的ROS响应性PBA-PEI/OD载药水凝胶，为后续研究所用配方。
更加优选的，有如下具体实施，我们发现：
(a)称取1mg多西环素加入600μL 10％PBA-PEI水溶液中，静置30min待B-N配位形成，再加入400μL 20％OD水溶液，振荡混匀，成胶，以此构建负载0.1多西环素的ROS响应性PBA-PEI/OD载药水凝胶。
(b)称取40mg多西环素加入600μL 10％PBA-PEI水溶液中，静置30min待B-N配位形成，再加入400μL 20％OD水溶液，振荡混匀，成胶，以此构建负载4％多西环素的ROS响应性PBA-PEI/OD载药水凝胶。
(c)称取1mg二甲双胍加入600μL 10％PBA-PEI水溶液中，静置30min待B-N配位形成，再加入400μL 20％OD水溶液，振荡混匀，成胶，以此构建负载0.1％二甲双胍的ROS响应性PBA-PEI/OD载药水凝胶。
(d)称取100mg二甲双胍加入600μL 10％PBA-PEI水溶液中，静置30min待B-N配位形成，再加入400μL 20％OD水溶液，振荡混匀，成胶，以此构建负载10％二甲双胍的ROS响应性PBA-PEI/OD载药水凝胶。
(e)称取1mg多西环素和1mg二甲双胍，加入600μL 10％PBA-PEI水溶液中，静置30min待B-N配位形成，再加入400μL 20％OD水溶液，振荡混匀，成胶，以此构建负载0.1％多西环素和0.1％二甲双胍的ROS响应性PBA-PEI/OD载药水凝胶。
(f)称取40mg多西环素和40mg二甲双胍，加入600μL 10％PBA-PEI水溶液中，静置30min待B-N配位形成，再加入400μL 20％OD水溶液，振荡混匀，成胶，以此构建负载4％多西环素和4％二甲双胍的ROS响应性PBA-PEI/OD载药水凝胶。
(g)称取10mg多西环素和10mg二甲双胍，加入600μL 10％PBA-PEI水溶液中，静置30min待B-N配位形成，再加入400μL 20％OD水溶液，振荡混匀，成胶，以此构建负载1％多西环素和1％二甲双胍的ROS响应性PBA-PEI/OD载药水凝胶，1％二甲双胍为相关研究中选取的浓度，0.03-10％的负载多西环素凝胶均可在牙周炎治疗中实现抗菌效果，因此选取负载1％多西环素和1％二甲双胍的ROS响应性PBA-PEI/OD载药水凝胶为优选所用配方。
进一步参见图5A至5B，图5A为PBA与多西环素、二甲双胍发生B-N配位的核磁共振硼谱结果；图5B为PEI/OD水凝胶和PBA-PEI/OD水凝胶的载药率差异(未进行苯硼酸官能化的PEI，制备的水凝胶仅能负载2％的多西环素与2％的二甲双胍，而PBA-PEI制备的水凝胶可以同时负载4％的多西环素和4％二甲双胍，无药物析出)。
进一步参见图6A至6F，图6A为PBA-PEI/OD水凝胶载药前后的成胶形貌，载药前凝胶成淡黄透明状，载药后凝胶呈明黄透明状；图6B为PBA-PEI/OD水凝胶载药前后的流变力学黏度测试，随着剪切率的提高，黏度降低，说明凝胶具备剪切变稀特性，具备可注射性；图6C利用罗丹明染料对载药凝胶进行染色后，装载入注射器中，进行注射，说明凝胶具备可注射特性；图6D为PBA-PEI/OD水凝胶载药前后的储能模量未见明显改变；图6E为PBA-PEI/OD水凝胶载药前后在不同频率下的流变力学测试，储能模量与损耗模量均未见明显改变；图6F为PBA-PEI/OD水凝胶载药前后的微观形貌，载药前后各组水凝胶均呈现水凝胶典型的多孔状形貌。
4.PBA-PEI/OD载药水凝胶的ROS响应性药物释放
1)将400μL制备好的水凝胶注入50mL离心管中，加入30mL的人工唾液(pH＝6.8)，加入过氧化氢溶液，使得液体中的过氧化氢含量分别为0mM，1mM，10mM，100mM；
2)封口膜封口后，将离心管置于37℃摇床中，转速设置为100rpm；
3)在相应时间点，取出离心管，利用移液枪吸出3mL上清液待测，并重新加入3mL人工唾液；
4)利用不同浓度的多西环素和二甲双胍进行紫外可见光检测，绘制标准曲线；
5)依照标准曲线，计算多西环素和二甲双胍的药物释放量，绘制药物释放曲线，如图7A至7D所示。
图7A为多西环素和二甲双胍的紫外可见光光谱结果(多西环素的特征峰在276nm和350nm，二甲双胍特征峰在236nm)；图7B为取样上清液的紫外可见光光谱结果(特征峰位置与多西环素和二甲双胍一致)；图7C为多西环素的药物释放曲线(ROS可加速药物释放，说明载药水凝胶具有ROS响应性药物释放特性)；图7D为二甲双胍的药物释放曲线(ROS可加速药物释放，说明载药水凝胶具有ROS响应性药物释放特性，二甲双胍药物释放速度较多西环素慢，可先发挥抗菌作用，而后持续发挥促成骨效应)。
5.PBA-PEI/OD载药水凝胶的粘接性能
1)从市场上购买新鲜猪颌骨，分离牙龈，将牙龈组织切成1cm*3cm的矩形长条；
2)将水凝胶注射在牙龈表面，将两块牙龈组织搭接起来，使粘接面积约1cm*1cm，静置15分钟；
3)利用搭接剪切法，测量水凝胶与牙龈间的粘接强度，拉力机传感器为100N，拉伸速度设置为1mm/min，参见图8A至8D所示。
图8A为猪下颌骨及分离的牙龈组织；图8B为搭接剪切测试流程示意图；图8C为粘接强度测试结果(水凝胶与牙龈组织粘接强度约为4kPa，粘接性能良好，载药前后未见明显影响)；图8D则为水凝胶网络与牙龈组织粘接机制的示意图。
6.PBA-PEI/OD载药水凝胶的细胞相容性
1)将无菌处理后的单纯PBA-PEI/OD水凝胶，分别负载多西环素和二甲双胍的PBA-PEI/OD水凝胶，以及同时负载多西环素和二甲双胍的PBA-PEI/OD水凝胶，以10mg/mL浸入添加1％抗生素和10％胎牛血清的DMEM高糖培养基中；
2)在37℃条件下浸泡24小时，取凝胶浸提液进行水凝胶的细胞相容性测试；
3)小鼠成纤维细胞L929，以5000个细胞/100μL/孔，种于96孔板，细胞培养箱中培养12小时，待细胞贴附在96孔板上；
4)移除培养基，加入凝胶浸提液，继续培养24小时和72小时；
5)在规定时间，移除培养基，加入预先混合均匀的90μL DMEM和10μL MTT(5mg/mL)，继续培养4小时；
6)移除培养基，加入100μL二甲基亚砜，充分溶解孔底的深蓝色甲瓒晶体；
7)酶标仪检测570nm吸光度，通过样品孔与对照孔的吸光度比值，计算细胞活性，结果如图9所示。图9示意了各组间PBA-PEI/OD水凝胶的细胞活性结果(各组细胞活性良好，说明各组凝胶细胞相容性良好)。
7.PBA-PEI/OD载药水凝胶的血液相容性
1)昆明小鼠心脏穿刺取血，将血液收集于10mL真空采血管(EDTA抗凝管)，在采血管上标记全血的高度；
2)4℃条件下，以1500rpm离心5分钟，移除上层血清；
3)加入150mM生理盐水补齐，使页面维持原始高度，轻轻吹打，使红细胞重悬；
4)4℃条件下，以1500rpm离心5分钟，移除上清，加入150mM生理盐水补齐，使页面维持原始高度，轻轻吹打，使红细胞重悬；
5)重复步骤4)2次；
6)吸取2mL红细胞悬液，加入48mL 0.01M PBS溶液，形成1.11*108个/mL的红细胞混合液；
7)将40mg不同组的水凝胶分别加入4mL红细胞混合液(10mg/mL)，37℃下孵育1小时，1％TritonX-100为阳性对照组，PBS溶液作为阴性对照组；
8)以1500rpm离心5分钟，取100μL上清液加入96孔板，酶标仪测量540nm的吸光度；
9)溶血率％＝(实验组吸光度-对照组吸光度)/阳性对照组吸光度*100％，结果如图10所示。
图10示意了各组PBA-PEI/OD水凝胶的溶血率结果(各组间均未见明显溶血情况的出现)。
8.BA-PEI/OD载药水凝胶的抗菌性
1)将无菌处理后的单纯PBA-PEI/OD水凝胶，分别负载多西环素和二甲双胍的PBA-PEI/OD水凝胶，以及同时负载多西环素和二甲双胍的PBA-PEI/OD水凝胶，以200mg/mL浸入PBS溶液中，37℃孵育24小时，获得水凝胶浸提液；
2)将109CFU/mL的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌细菌悬液，分别涂布于10cm直径的加入Luria-Bertani琼脂固体培养基的培养皿中；
3)将109CFU/mL的牙龈卟啉单胞菌(ATCC33277)细菌悬液，涂布于10cm直径的加入牙龈卟啉单胞菌固体培养基的培养皿中；
4)将10mm直径的无菌滤纸圆片分别浸于不同组的凝胶浸提液中，PBS作为阴性对照组，放置于培养皿表面；
5)涂布大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的培养皿在37℃孵育24小时，涂布牙龈卟啉单胞菌的培养皿在37℃，厌氧环境中，孵育72小时；
6)利用游标卡尺测量抑菌环的直径大小，判断凝胶的抗菌效果，结果如图11所示。
图11示意了各组PBA-PEI/OD水凝胶的抗菌结果(负载多西环素组与同时负载多西环素与二甲双胍组，可见明显的抑菌环的出现，说明负载多西环素的水凝胶具备抗菌效果，且同时负载二甲双胍，不影响多西环素抗菌效果的发挥)。
9.PBA-PEI/OD载药水凝胶治疗伴糖尿病牙周炎的药效学结果
9.1实验分组及伴糖尿病牙周炎大鼠模型的构建
1)购置48只8周龄的SD大鼠，将实验动物随机平均分为6组：1.健康组：不做任何处理；2.伴糖尿病牙周炎组；3.单纯水凝胶治疗组；4.负载多西环素的水凝胶治疗组(水凝胶+多西环素组)；5.负载二甲双胍的水凝胶治疗组(水凝胶+二甲双胍组)；6.同时负载二甲双胍+多西环素的水凝胶治疗组(水凝胶+多西环素+二甲双胍组)；
2)适应性养育1周后，对大鼠禁食12小时，称重后，于腹腔注射链脲佐菌素(STZ)溶液(60mg/kg)，对照组注射相应量的无菌生理盐水；
3)1周后测量血糖，空腹血糖值＞16.65mmol/L，说明糖尿病模型构建成功；
4)除健康组之外，将正畸结扎丝捆扎在其他各组大鼠双侧上颌第二磨牙(M2)牙颈部，4周后伴糖尿病牙周炎模型构建成功。
9.2样本处理
1)去除结扎丝，利用胰岛素注射器，在大鼠双侧第二磨牙龈沟内进行水凝胶注射给药，每三天给药1次，共计给药10次；
2)处死大鼠，随机选取两只分离双侧上颌第二磨牙的牙龈，提取牙龈组织的RNA和蛋白质，立即保存于-80℃，待测；
3)其余上颌骨置于4％多聚甲醛溶液中，待测；
9.3Micro-CT检测
将所取上颌骨利用Micro-CT(Y.Cheetah，YXLON，德国)在90kVp、55.6μA条件下扫描，并用VG Studio MAX 3.0.2(Volume Graphics，德国)软件进行三维重建与数据测量，观察上颌骨颊、腭侧及近远中向截面上牙槽骨吸收和再生性修复状况，参见图12A至12G所示。
图12A示意了牙周炎模型构建方法；图12B为Micro-CT扫描结果(各组上颌骨的三维重建与矢状面剖面结果图)；图12C为釉牙骨质界-牙槽嵴顶距离(CEJ-ABC)；图12D为骨量/组织量(BV/TV)；图12E骨小梁数量(Tb.N)；图12F为骨小梁厚度(Tb.Th)；图12G为骨小梁间隔(Tb.Sp)。
其中，如图12C可见，伴糖尿病牙周炎组CEJ-ABC明显增加，说明伴糖尿病牙周炎模型构建成功，健康组，伴糖尿病牙周炎组，水凝胶+多西环素组，水凝胶+二甲双胍组以及水凝胶+多西环素+二甲双胍组的釉牙骨质界-牙槽嵴顶的距离分别是0.42±0.06，0.91±0.07，0.88±0.06，0.65±0.08，0.55±0.07，and 0.46±0.05mm，说明负载双药组治疗效果最为理想。
同时，如图12D至12F可见，相较于其他实验组，水凝胶+多西环素+二甲双胍组在骨量/组织量％，骨小梁数量，骨小梁厚度三指标上，同样取得了最为理想的结果。对照组的骨量/组织量％，骨小梁数量，骨小梁厚度的结果分别为：35.9％，2.69/mm和0.16mm；伴糖尿病牙周炎组分别为19.1％，1.56/mm和0.11mm，相较健康组明显降低，说明牙槽骨吸收明显，牙周炎模型构建成功；单纯水凝胶治疗组的三指标分别为20.6％，1.50/mm和0.12mm，相较于伴糖尿病牙周炎组未见明显改善；水凝胶+多西环素组，结果分别为24.6％，1.84/mm和0.14mm；水凝胶+二甲双胍组，三指标结果则为28.5％，1.84/mm，和0.14mm，说明多西环素和二甲双胍对于伴糖尿病牙周炎的牙槽骨炎症性吸收状况，均有一定的治疗作用；同时负载多西环素+二甲双胍，BV/TV％，Tb.N和Tb.Th值为33.9％，2.26/mm和0.16mm，实现了最为理想的治疗效果，与健康组结果未见统计学差异。
如图12G，健康组大鼠骨小梁间隔(Tb.Sp)为0.224±0.03mm，伴糖尿病牙周炎组和单纯水凝胶治疗组，Tb.Sp则分别增加至0.47±0.06mm和0.47±0.04mm，说明牙周炎模型成功构建，单纯水凝胶并无治疗效应；负载二甲双胍水凝胶治疗组和负载多西环素水凝胶治疗组，Tb.Sp结果分别为0.32±0.03mm和0.35±0.01mm，说明单纯负载二甲双胍或多西环素有一定治疗效果，但治疗效果并不理想；水凝胶+多西环素+二甲双胍组的骨小梁间隔最低，结果为0.29±0.00mm，说明同时负载多西环素与二甲双胍，实现了最为理想的治疗效果，二甲双胍和多西环素在伴糖尿病牙周炎大鼠模型的治疗过程中，可以发挥协同效应，实现最为理想的牙槽骨修复性再生。
9.4组织学检测
1)将取下的新鲜组织置于4％多聚甲醛固定24h后，在37℃环境下，将组织置于20％的EDTA中，进行为期4周脱钙处理，石蜡包埋；
2)石蜡块沿第二颗牙的长轴在近远中方向上连续切成厚度为4μm的切片，按试剂盒说明书进行HE染色及TRAP染色；
3)使用基质金属蛋白酶-9(MMP-9)抗体试剂盒说明书进行免疫组织化学染色；
4)在正置荧光显微镜DMi8(Leica公司，德国)下观察拍照；
5)根据炎症细胞覆盖区域的面积大小评价炎症指数：0＝阴性，1＝覆盖小于30％区域，2＝30-60％区域，3＝＞60％区域；根据单位面积TRAP+细胞数目评价破骨细胞数量：骨组织表面呈红染的多核细胞数目计数/观察区域面积；根据MMP-9免疫组化染色强度，进行MMP-9免疫反应性评价：0＝阴性，1＝轻微，2＝中度，3＝重度；请病理科医师对每组4张切片染色进行评分，并进行统计学分析。结果如图13A至13F所示。
图13A为大鼠上颌第二磨牙HE染色结果；图13B为MMP-9免疫组织化学染色结果；图13C为TRAP染色结果；图13D为炎症指数评分；图13E为MMP-9免疫组化染色强度；图13F为单位面积TRAP+细胞计数；
如图13A，在伴糖尿病牙周炎和单纯水凝胶组，局部区域炎症细胞数量明显增加，说明牙周组织区域发生持续炎症反应，伴糖尿病牙周炎模型构建成功；水凝胶+多西环素，水凝胶+二甲双胍和水凝胶+多西环素+二甲双胍组，炎症细胞浸润状况明显减轻，炎症状况得到不同程度缓解。
如图13B，基质金属蛋白酶-9(MMP-9)是中性粒细胞产生的一类明胶酶，MMP-9的过度生成与结缔组织丧失、明胶降解和IV型胶原的降解高度相关。MMP-8的表达水平可以反应牙周疾病的严重程度、进展状况和预后。如图12B所示，在伴糖尿病牙周炎和单纯水凝胶治疗组，牙周炎模型的成功构建使得MMP-9阳性细胞明显较健康组更多，而应用负载多西环素和二甲双胍的水凝胶进行治疗后，MMP-9阳性细胞数量明显降低。
抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色用于评价破骨细胞的数量，如图13C所示，健康组仅能观察到少量的TRAP阳性细胞，而伴糖尿病牙周炎和单纯水凝胶组，破骨细胞数量明显增加，同时，水凝胶+二甲双胍和水凝胶+多西环素+二甲双胍组破骨细胞数量明显降低。这可能是由于二甲双胍本身具有利于骨代谢的作用，可以刺激成骨细胞，促进骨重建，通过激活AMPK、激活调节核因子-κB配体的受体，促进成骨相关基因和碱性磷酸酶的表达。负载二甲双胍后的水凝胶显示出了理想的抑制破骨细胞活性的效应，进一步说明在牙周局部少量应用二甲双胍，对于伴糖尿病牙周炎的治疗具备一定的治疗效应。
组织炎症评分结果如图13D所示，健康组为0.67±0.52，提示炎症状况轻微，伴糖尿病牙周炎和单纯水凝胶组则分别为2.75±0.50和2.25±0.50；而水凝胶+多西环素+二甲双胍组炎症评分最低，为1.00±0.63，与健康组无统计学差异。同样在图13E中，MMP-9的染色强度表现出类似的趋势，水凝胶+多西环素+二甲双胍组与健康组无显著性差异。而单位面积破骨细胞的数量，如图13F，各组的结果分别为：健康组(8.02±3.41)，伴糖尿病牙周炎组(34.45±4.32mm)，单纯水凝胶组(29.22±4.65)，水凝胶+多西环素组(22.10±2.98mm)，水凝胶+二甲双胍组(15.44±4.12mm)，水凝胶+多西环素+二甲双胍组(10.69±3.56mm)，在各实验组中，同时负载二甲双胍和多西环素组实现了最理想的治疗效果。
9.5牙龈组织炎症因子和成骨相关基因的表达状况
尽管伴糖尿病牙周炎的具体发病机制尚不明确，但炎症在该疾病的发生发展中发挥着重要的角色。持续的高糖状况和牙周炎症会形成恶性驯化，高糖状况使得牙周局部炎症状况水平家具，同时加剧的炎症状况优惠进一步提升牙周局部致病菌的致病性、免疫炎症反应异常，最终导致血糖控制不佳，加剧高糖状况。相比单纯的慢性牙周炎，伴糖尿病牙周炎状况下，牙周组织会产生更多的炎症因子，其中包括白介素-1β(IL-1β)，肿瘤坏死因子α(TNF-α)，白介素-17(IL-17)和白介素-6(IL-6)。
发明人还研究利用免疫酶联检测法测定各组治疗区域牙龈组织的炎症因子表达情况，同时应用实时定量聚合酶链式反应(RT-PCR)评价治疗区域牙龈组织成骨相关基因的表达状况，结果如图14A至14H所示，其中：
如图14A至14C所示，伴糖尿病牙周炎组治疗位点大鼠牙龈组织的IL-1β，TNF-α，IL-17A和IL-6水平分别是健康组的4.4，4.0，5.5和4.9倍。其中IL-1β在健康组、伴糖尿病牙周炎组、单纯水凝胶组、水凝胶+多西环素组、水凝胶+二甲双胍组、水凝胶+多西环素+二甲双胍组的表达水平分别为88.2、391.1、376.9、121.1、149.9、102.8pg/mg。TNF-α在各组的表达水平分别为5.8，23.3，22.9，6.1，9.7和5.5pg/mg，IL-17A在各组的表达水平则分别为3.6，19.5，15.1，6.8，12.2，and 3.9pg/mg。同时负载多西环素与二甲双胍组，IL-17A和TNF-α的表达水平与健康组无统计学差异。
IL-6是与牙周炎发生发展高度相关的代表性细胞因子，在骨重塑中发挥重要作用。如图14D，伴糖尿病牙周炎组大鼠治疗位点的牙龈组织，IL-6的表达水平是对照组的4.9倍，实验各组大鼠治疗位点牙龈组织的IL-6表达水平分别是：74.4，367.6，167.1，97.2，123.8和85.8pg/mL。应用同时负载多西环素和二甲双胍的ROS响应性可注射水凝胶治疗慢性牙周炎，可以显著降低治疗区域牙龈组织促炎因子的表达水平，改善局部炎症状况，实现最为理想的治疗效果。
与此同时，如图14E至14H，利用牙龈局部区域的提取的组织RNA进行实时定量PCR检测，评价成骨相关基因的表达水平，可见在伴糖尿病牙周炎状况，成骨相关因子碱性磷酸酶(ALP)、Runt相关转录因子2(Runx-2)、骨细胞分泌蛋白(OCN)，I型胶原(COL-1)的mRNA表达水平分别是健康对照组的0.23，0.29，0.15，和0.11倍，单纯水凝胶治疗组则分别对应健康对照组的0.19，0.37，0.16和0.16倍。应用载药水凝胶治疗后，可以提升成骨相关基因的表达水平，但这一现象在同时负载多西环素和二甲双胍组效果最为明显，ALP，Runx-2，OCN和COL-1的mRNA表达水平分别提升至健康对照组的3.98，4.66，2.95和2.48倍。
综上所述，本发明具有如下特点：
1)通过在水凝胶网络中引入苯硼酸结构，利用B-N配位作用，在席夫碱构成的水凝胶网络中，实现了药物二甲双胍与多西环素的定量负载，可两倍提升载药量；
2)药物通过自由扩散和ROS刺激两种形式持续缓慢释放；
3)可同时实现抗炎抑菌、促牙周骨组织修复的双重治疗目标；
4)验证了牙周局部应用二甲双胍和多西环素的牙周炎治疗药效学结果，为伴糖尿病牙周炎患者的治疗提供了新的手段。
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (3)

1.一种载药水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
S100、制备苯硼酸官能化聚乙烯亚胺PBA-PEI：
；
S200、制备氧化葡聚糖OD：
；
S300、将所述PBA-PEI配制成水溶液，并加入适量多西环素与二甲双胍以使得形成B-N配位；
S400、将所述OD配制成水溶液；
S500、将S300的水溶液和S400的水溶液共混，制得ROS响应性PBA-PEI/OD载药水凝胶；
其中，所述步骤S100包括如下步骤：
1) 利用1 M盐酸将1.000 g、0.04 mmol聚乙烯亚胺PEI的pH调节至5.0备用；
2) 称取0.579 g、3.49 mmol对羧基苯硼酸溶解于8 mL二甲基亚砜DMSO中，先加入2 mL去离子水，室温下搅拌30 min至放热完全后，加入0.669 g、3.49 mmol的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和0.402 g、3.49 mmol的N-羟基丁二酰亚胺（NHS），继续搅拌2小时；
3) 将所得混合物加入PEI溶液中，室温搅拌24小时，将混合液加入透析袋MW 3500中，透析3天，每12 小时更换一次水；
4) 将液体收集冷冻后，利用冻干机冻干，所得黄色产物即为PBA-PEI；
其中，所述步骤S200包括如下步骤：
1)称取10 g、0.0618 mol葡聚糖，37℃溶解于50 mL去离子水中；
2)配制50 mL 26.4% w/v的高碘酸钠溶液，避光环境下，缓慢滴加进葡聚糖溶液中，持续搅拌；
3)避光、室温条件下持续搅拌1小时后，加入4.53 mL丙二醇终止反应；
4)将溶液转移进入透析袋中，透析7天，每12小时换水1次；
5)将液体收集冷冻后，利用冻干机冻干，所得白色产物即为氧化葡聚糖OD；
其中，所述步骤S300中：
PBA-PEI配制成2%-20%的水溶液；
其中，所述步骤S400中：
OD配制成5%-30%的水溶液；
其中，所述步骤S500中：
10%PBA-PEI水溶液和20%OD水溶液以6:4进行混合。
2.如权利要求1所述的方法，其中，
称取适量多西环素与二甲双胍加入600 μL 10% PBA-PEI水溶液中，静置30 min待B-N配位形成，再加入400μL 20% OD水溶液，振荡混匀，成胶，以此构建 ROS响应性PBA-PEI/OD载药水凝胶。
3.一种载药水凝胶，其通过权利要求1至2中任一所述的方法制得。
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