CN113827368A - 一种活体采集猪体内1、2、4、8细胞期胚胎的收集方法 - Google Patents
一种活体采集猪体内1、2、4、8细胞期胚胎的收集方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种活体采集猪体内1、2、4、8细胞期胚胎的收集方法，该方法主要包括以下流程：母猪发情鉴定、人工输精、手术冲胚、挑胚及体外胚胎培养等步骤。本发明方法提出了一种活体收集猪体内1‑细胞、2‑细胞、4‑细胞、8‑细胞期胚胎的收集方法及专用设备，该方法能从供体母猪输卵管内获得不同发育阶段的胚胎，供胚胎发育、基因原核注射、嵌合体动物制备等研究，有效解决了体外授精胚胎质量差、移植受孕率低的问题，从而提高转基因或基因编辑猪的生产效率。
Description
技术领域
本发明涉及猪胚胎移植技术领域，具体为一种活体采集猪体内1、2、4、8细胞期胚胎的收集方法。
背景技术
猪胚胎移植试验成功最早于1951年由Kvashickii报道，到20世纪60年代，已经基本建立了外科手术方法采集和移植胚胎的技术。70年代以后，北美和欧洲开始将胚胎移植技术应用于向闭锁猪群引进外血和国际间的引种。80年代转基因动物技术的出现，促进了胚胎移植技术的应用和发展。良好的胚胎采集技术，能从供体母猪生殖道内获得最大限度数量的胚胎，供转基因的操作；而高效的胚胎移植技术，能保障受体母猪获得较高的受胎率和较多的产仔数，从而提高转基因猪的生产效率。任何一种方法制备的转基因胚胎，其最后的一个环节都是要通过胚胎移植技术，才能生产出转基因猪。有些用很复杂的过程制备出转基因的胚胎，也许前期的工作做的很好，只是由于胚胎移植技术不过关，而未能得到、或低效率的得到转基因猪，这是很得不偿失的。胚胎的采集和移植是制备转基因猪的关键基础技术。
发明内容
本申请围绕解决活体、高效收集猪体内1、2、4、8细胞期胚胎的技术问题，进行了相关创造性发明：1、冲卵管的自制；2、冲卵时间的把控；3、冲卵过程中的关键技术。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种活体采集猪体内1、2、4、8细胞期胚胎的收集方法，该方法利用时间与空间的不同来判定胚胎所处于的发育阶段以及体内的大概位置，主要包括以下几个方面：
一、收集1-细胞期胚胎，最佳时间在人工授精后18-24小时；
二、收集2-细胞期胚胎，最佳时间在人工授精后26-32小时；
三、收集4-细胞期胚胎，最佳时间在人工授精后34-40小时；
四、收集8-细胞期胚胎，最佳时间在人工授精后42-48小时。
该方法主要包括以下流程：
(一)胚胎采集前的各项准备工作
1、器材的准备
(1)冲卵装置
(2)集卵装置
(3)胚胎转移装置
(4)集卵皿(表面皿)
(5)手术器材
2、冲卵液和培养液的配制
(1)冲卵液
(2)培养液
(二)手术室的准备工作
1、采集的时间
2、供体猪的麻醉和保定
3、手术部位及消毒
4、手术方法
5、胚胎采集
(1)输卵管采胚
其主要步骤为：
S1：将集卵装置一端由输卵管伞部的喇叭口插入约1-2cm深，用大拇指和食指固定吸盘，然后用注射器连接吸洗盘接口，将空气抽出直到输卵管伞紧紧固定在吸盘上为止，另一端接表面皿；
S2：将冲卵装置的储液罐装满冲卵液，盖紧盖子，将有穿刺针的一端在宫管结合部，针头朝输卵管方向插入(此时针头不连接充气装置)，打开微型充气泵开关，调节阀门选择合适的冲卵液冲击力度，调好后再在连接针头开始冲卵。冲卵时注意表面皿保持平衡，液体满了需更换新的表面皿；
S3：再将另一侧输卵管引出切口之外，用同样的方法冲胚。
(2)子宫角采胚
其主要步骤为：
S1：根据冲卵时间的不同，或近或远，在距宫管接合部30-70cm的子宫角背面没有血管的部位用眼科剪剪个小孔，插入子宫角集卵装置，开口向宫管结合部方向，另一端开口接表面皿或平皿；
S2：用冲卵装置从宫管结合部向子宫角注入30-50ml冲卵液；
S3：冲卵液流经子宫角，将胚胎带入接卵的表面皿或平皿:；
S4：鉴于子宫角过长，也可以采取分段冲卵的方法；
S5：再将另一侧子宫角引出切口之外，用同样的方法冲胚。
6、拣卵
7、供体母猪的术后处理
优选的，对于胚胎采集前的各项准备工作中的胚胎转移装置准备，其制作步骤如下：
a、点燃酒精喷灯，将外径4mm左右的玻璃管置于酒精喷灯的火焰上方；
b、不断转动玻璃管，使玻璃管受热均匀，灼烧4-5秒钟左右；
c、待灼烧玻璃管发红，轻轻用力拉长玻璃管，长度为8-9cm；
d、待拉长的玻璃管冷却之后，用沙轮将中间折断成两根玻璃吸管；
e、将玻璃吸管与长20-30cm的硅胶管连接，注意连结紧密，防止漏气。
优选的，对于手术室的准备中的供体猪的麻醉和保定，其主要包括以下几个方面：
(1)供体猪上腭牵拉，限制活动，按20-30mg/kg(每公斤体重毫克)戊巴比妥钠(2.5％)或水合氯醛硫酸镁注射液(水合氯醛8％，硫酸镁5％)150-200ml耳静脉注射，进行全身麻醉；
(2)由于个体之间对麻醉药的敏感性不同，所以在注射时要随时观察猪的神态，注射的速度要慢，防止过量，一般在眼睑刚刚失去反应，蹄部刺激无明显反射时即可；
(3)麻醉到位后仰放在手术保定架上，四肢固定；
(4)为防止手术过程中猪的挣扎、弹动，要用绳索将四肢和头部捆绑牢靠；
(5)为使腹腔内脏向前倾斜，方便手术，手术台要前低(头低)后高(尾高)；
(6)手术过程根据需要肌肉或静脉滴注适量的盐酸氯胺酮。
优选的，对于手术室的准备中的手术部位及消毒，其主要步骤为：
S1：用肥皂水和毛刷洗刷术部，水洗后用毛巾擦干净；
S2：手术部位一般选择在倒数第2、3个乳头之间，先用电剪或毛剪在术部剪毛，应剪净毛茬，用清水洗净术部，擦干，然后涂以2-4％的碘酒，再用70％-75％的酒精棉脱碘；
S3：消毒程序是：碘酊棉球→酒精棉球，由内向外；
S4：盖创巾于术部，使预定的切口暴露在创巾开口的中部。
优选的，对于手术室的准备中的手术方法，其主要步骤为：
S1：沿腹中线，尽量避开血管，切开皮肤5-8cm，钝性分离脂肪和肌肉层，使腹膜露出后，用钝头剪刀剪开腹膜；
S2：术者将食指及中指由切口伸人腹腔，在与骨盆腔交界的前后位置触摸子宫或子宫角，摸到后用二指夹持，牵引至创口的表面；
S3：循一侧子宫角导出输卵管及卵巢，观察卵巢表面排卵点和卵泡发育。
优选的，对于手术室的准备中的拣卵，其主要步骤为：
S1：将接卵的表面皿置于实体显微镜下，用低倍镜的大视野在冲卵液中找到胚胎；
S2：猪胚胎直径为150μm左右，肉眼观察只有针尖大小，为一球形体，在镜下呈圆形，其外层是透明带；
S3：移卵管先吸入少许PBS再吸人卵，依次在第二个表面皿内重复冲洗，然后把全部卵集中到一个表面皿，一只供体的卵放在一个皿内，操作室温为20-25℃。
优选的，对于手术室的准备中的供体母猪的术后处理，其主要包括以下几个方面：
S1：供体采胚完毕后，用37℃灭菌生理盐水湿润子宫，冲去凝血块，将器官复位；
S2：腹膜、肌肉缝合后，涂抹磺胺等消炎防腐药；
S3：皮肤缝合后，在伤口周围涂碘酒，肌注青、链霉素。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明方法提出了一种活体采集猪体内1、2、4、8细胞期胚胎的收集方法，该方法能从供体母猪生殖道内获得最大限度数量的胚胎，供转基因的操作，能保障受体母猪获得较高的受胎率和较多的产仔数，从而提高转基因猪的生产效率，有效解决了传统的猪胚胎移植技术不过关，未能得到、或低效率的得到转基因猪的问题。
附图说明
图1为本发明中用于输卵管冲卵的冲卵装置结构示意图；
图2为本发明中猪用集卵装置的结构示意图；
图3为本发明中胚胎转移装置的示意图；
图4为胚胎采集的时间与胚胎发育阶段统计表。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
请参阅图1-4，本发明提供一种技术方案：一种活体采集猪体内1、2、4、8细胞期胚胎的收集方法，该方法利用时间与空间的不同来判定胚胎所处于的发育阶段以及体内的大概位置，主要包括以下几个方面：
一、收集1-细胞期胚胎，最佳时间在人工授精后18-24小时；
二、收集2-细胞期胚胎，最佳时间在人工授精后26-32小时；
三、收集4-细胞期胚胎，最佳时间在人工授精后34-40小时；
四、收集8-细胞期胚胎，最佳时间在人工授精后42-48小时。
该方法主要包括以下流程：
(一)胚胎采集前的各项准备工作
1、器材的准备
(1)冲卵装置：本发明研制的用于输卵管冲卵的冲卵装置如图1所示，由于该冲卵装置的连接部件为输液器改造而来的软管，向输卵管插入针头时，克服了针头与注射器直接连接的局限，操作自如，能将针头确实插入输卵管的内腔。在冲卵过程中，即使操作者稍有抖动或猪稍有骚动，由于软管的缓冲作用，也不会出现针头划破、划穿或脱出输卵管的现象，从而大大提高冲卵的成功率。另外特别设置了冲卵液贮存罐可以更好的控制冲卵液的使用，微型充气泵代替了手动推拉注射器的繁琐操作更省时省力。
(2)集卵装置：本发明研制的集卵管如图2所示，用于输卵管冲卵的集卵装置为长130mm、壁厚0.8mm、内径3mm的两根玻璃管，连接部分由万向连接头连接；与输卵管连接部分设有喇叭状吸盘便于固定输卵管伞；用于子宫角冲卵的集卵装置，外径10mm、长130mm的玻璃管；两种玻璃管均在酒精喷灯上中间弯成120°角，两端烧制、研磨平滑；
由于该集卵装置中间连接是弯曲的，集卵皿可摆放的位置增大，局限性小，即使有时接卵不慎或猪稍有骚动，集卵皿可随之移动，不会造成冲卵液流到集卵皿之外、或集卵皿内的冲卵液倒撒的现象。
(3)胚胎转移装置：胚胎转移装置是从一个容器中收集卵或胚胎、并向另一个容器中转移的工具(如冲卵后在解剖镜下从表面皿中收集卵并向培养皿中转移)，也是移植胚胎的工具，胚胎转移装置先由外径4mm左右的玻璃管拉制成吸管(如图3所示)，然后与去针头的头皮针软管连接，在依次装上输液器的出液端跟吸头拼接而成(如图4所示)。
其制作步骤如下：
a、点燃酒精喷灯，将外径4mm左右的玻璃管置于酒精喷灯的火焰上方；
b、不断转动玻璃管，使玻璃管受热均匀，灼烧4秒钟左右；
c、待灼烧玻璃管发红，轻轻用力拉长玻璃管，长度为8cm；
d、待拉长的玻璃管冷却之后，用沙轮将中间折断成两根玻璃吸管；
e、将玻璃吸管与长20cm的硅胶管连接，注意连结紧密，防止漏气。
(4)集卵皿(表面皿)：准备直径为8cm的表面皿，做为冲卵时接收冲卵液用。每个供体猪需备2个皿，写好编号，放入培养箱待用。
(5)手术器材：将手术所需要的器材(手术刀、手术剪、止血钳、持针钳、巾钳、缝合针、缝合线、创巾、沙布、表面皿、拣卵管、冲卵管等)高压灭菌，手术前将金属器械浸泡在0.1％新洁尔灭液中备用。
2、冲卵液和培养液的配制
(1)冲卵液：在试剂公司购置成品PBS或DPBS粉剂，按其说明书用双蒸水配制。
(2)培养液：短暂培养可以用冲卵液，但需加入10％的小牛血清，用0.22μm的滤膜过滤灭菌，然后分装保存，待用。
(二)手术室的准备工作
每次手术之前，手术室需用福尔马林熏蒸消毒，通气之后，再用紫外灯照射30min。
1、采集的时间
根据采胚部位的不同，可分为输卵管采胚和子宫角采胚。樊俊华等人(1995)观察了母猪早期胚胎在生殖道内的分布情况，对7-8月龄湖北白猪发情后配种，以最后一次配种结束的时间为0，分别于24、48……192h手术于输卵管或子宫角内采集胚胎，然后镜检，其结果如图4；
从图4可见，如果从输卵管采胚，应在最后一次配种的18小时后进行，根据不同母猪静立反射表现，在不同时间段内收集相应时期的胚胎，如果时间延后，则胚胎进入子宫，采集胚胎的难度将大大增加。
如果收集1-细胞期胚胎，最佳时间在人工授精后18-24小时；收集2-细胞期胚胎，最佳时间在人工授精后26-32小时；收集4-细胞期胚胎，最佳时间在人工授精后34-40小时；收集8-细胞期胚胎，最佳时间在人工授精后42-48小时。
2、供体猪的麻醉和保定
其主要包括以下几个方面：
(1)供体猪上腭牵拉，限制活动，按20mg/kg(每公斤体重毫克)戊巴比妥钠(2.5％)或水合氯醛硫酸镁注射液(水合氯醛8％，硫酸镁5％)150ml耳静脉注射，进行全身麻醉；
(2)由于个体之间对麻醉药的敏感性不同，所以在注射时要随时观察猪的神态，注射的速度要慢，防止过量，一般在眼睑刚刚失去反应，蹄部刺激无明显反射时即可；
(3)麻醉到位后仰放在手术保定架上，四肢固定；
(4)为防止手术过程中猪的挣扎、弹动，要用绳索将四肢和头部捆绑牢靠；
(5)为使腹腔内脏向前倾斜，方便手术，手术台要前低(头低)后高(尾高)；
(6)手术过程根据需要肌肉或静脉滴注适量的盐酸氯胺酮。
3、手术部位及消毒
其主要步骤为：
S1：用肥皂水和毛刷洗刷术部，水洗后用毛巾擦干净；
S2：手术部位一般选择在倒数第2、3个乳头之间，先用电剪或毛剪在术部剪毛，应剪净毛茬，用清水洗净术部，擦干，然后涂以2％的碘酒，再用70％的酒精棉脱碘；
S3：消毒程序是：碘酊棉球→酒精棉球，由内向外；
S4：盖创巾于术部，使预定的切口暴露在创巾开口的中部。
4、手术方法
其主要步骤为：
S1：沿腹中线，尽量避开血管，切开皮肤5cm，钝性分离脂肪和肌肉层，使腹膜露出后，用钝头剪刀剪开腹膜；
S2：术者将食指及中指由切口伸人腹腔，在与骨盆腔交界的前后位置触摸子宫或子宫角，摸到后用二指夹持，牵引至创口的表面；
S3：循一侧子宫角导出输卵管及卵巢，观察卵巢表面排卵点和卵泡发育。
5、胚胎采集
(1)输卵管采胚
其主要步骤为：
S1：将集卵管一端由输卵管伞部的喇叭口插入约1cm深，用大拇指和食指固定，另一端接表面皿；
S2：用注射器吸取37℃的冲卵液15ml，在宫管结合部将冲卵装置的针头朝输卵管方向插入，推注射器，冲卵液由宫管结合部流入输卵管，经输卵管流至表面皿；
S3：再将另一侧输卵管引出切口之外，用同样的方法冲胚。
(2)子宫角采胚
其主要步骤为：
S1：根据冲卵时间的不同，或近或远，在距宫管接合部30cm的子宫角背面没有血管的部位用眼科剪剪个小孔，插入子宫角集卵管，开口向宫管结合部方向，另一端开口接表面皿或平皿；
S2：用注射器从宫管结合部向子宫角注入30ml冲卵液；
S3：冲卵液流经子宫角，将胚胎带入接卵的表面皿或平皿:；
S4：鉴于子宫角过长，也可以采取分段冲卵的方法；
S5：再将另一侧子宫角引出切口之外，用同样的方法冲胚。
6、拣卵
其主要步骤为：
S1：将接卵的表面皿置于实体显微镜下，用低倍镜的大视野在冲卵液中找到胚胎；
S2：猪胚胎直径为150μm左右，肉眼观察只有针尖大小，为一球形体，在镜下呈圆形，其外层是透明带；
S3：移卵管先吸入少许PBS再吸人卵，依次在第二个表面皿内重复冲洗，然后把全部卵集中到一个表面皿，一只供体的卵放在一个皿内，操作室温为20℃。
7、供体母猪的术后处理
其主要包括以下几个方面：
S1：供体采胚完毕后，用37℃灭菌生理盐水湿润子宫，冲去凝血块，将器官复位；
S2：腹膜、肌肉缝合后，涂抹磺胺等消炎防腐药；
S3：皮肤缝合后，在伤口周围涂碘酒，肌注青、链霉素。
实施例2：
请参阅图1-4，本发明提供一种技术方案：一种活体采集猪体内1、2、4、8细胞期胚胎的收集方法，该方法利用时间与空间的不同来判定胚胎所处于的发育阶段以及体内的大概位置，主要包括以下几个方面：
一、收集1-细胞期胚胎，最佳时间在人工授精后18-24小时；
二、收集2-细胞期胚胎，最佳时间在人工授精后26-32小时；
三、收集4-细胞期胚胎，最佳时间在人工授精后34-40小时；
四、收集8-细胞期胚胎，最佳时间在人工授精后42-48小时。
该方法主要包括以下流程：
(一)胚胎采集前的各项准备工作
1、器材的准备
(1)冲卵装置：本发明研制的用于输卵管冲卵的冲卵装置如图1所示，由于该冲卵装置的连接部件为输液器改造而来的软管，向输卵管插入针头时，克服了针头与充气、充液装置直接连接的局限，操作自如，能将针头确实插入输卵管的内腔。在冲卵过程中，即使操作者稍有抖动或猪稍有骚动，由于软管的缓冲作用，也不会出现针头划破、划穿或脱出输卵管的现象，从而大大提高冲卵的成功率。另外特别设置了冲卵液贮存罐可以更好的控制冲卵液的使用，微型充气泵代替了手动推拉注射器的繁琐操作更省时省力。
(2)集卵装置：本发明研制的集卵管如图2所示，用于输卵管冲卵的集卵装置为长130mm、壁厚0.8mm、内径3mm的两根玻璃管，连接部分由万向连接头连接；与输卵管连接部分设有喇叭状洗盘吸盘便于固定输卵管伞，由于该集卵装置中间连接是万向的，集卵皿可摆放的位置增大，局限性小，即使有时接卵不慎或猪稍有骚动，集卵皿可随之移动，不会造成冲卵液流到集卵皿之外、或集卵皿内的冲卵液倒撒的现象。
(3)胚胎转移装置：胚胎转移装置是从一个容器中收集卵或胚胎、并向另一个容器中转移的工具(如冲卵后在解剖镜下从表面皿中收集卵并向培养皿中转移)，也是移植胚胎的工具，移卵装置先由外径4mm左右的玻璃管拉制成吸管(如图3所示)，然后与去针头的头皮针软管连接，在依次装上输液器的出液端跟吸头拼接而成(如图4所示)。
其制作步骤如下：
a、点燃酒精喷灯，将外径4mm左右的玻璃管置于酒精喷灯的火焰上方；
b、不断转动玻璃管，使玻璃管受热均匀，灼烧4.5秒钟左右；
c、待灼烧玻璃管发红，轻轻用力拉长玻璃管，长度为8.5cm；
d、待拉长的玻璃管冷却之后，用沙轮将中间折断成两根玻璃吸管；
e、将玻璃吸管与长25cm的硅胶管连接，注意连结紧密，防止漏气。
(4)集卵皿(表面皿)：准备直径为9cm的表面皿，做为冲卵时接收冲卵液用。每个供体猪需备3个皿，写好编号，放入培养箱待用。
(5)手术器材：将手术所需要的器材(手术刀、手术剪、止血钳、持针钳、巾钳、缝合针、缝合线、创巾、沙布、表面皿、拣卵管、冲卵管等)高压灭菌，手术前将金属器械浸泡在0.1％新洁尔灭液中备用。
2、冲卵液和培养液的配制
(1)冲卵液：在试剂公司购置成品PBS或DPBS粉剂，按其说明书用双蒸水配制。
(2)培养液：短暂培养可以用冲卵液，但需加入10％的小牛血清，用0.22μm的滤膜过滤灭菌，然后分装保存，待用。
(二)手术室的准备工作
每次手术之前，手术室需用福尔马林熏蒸消毒，通气之后，再用紫外灯照射30min。
1、采集的时间
根据采胚部位的不同，可分为输卵管采胚和子宫角采胚。研究发现了母猪早期胚胎在生殖道内的分布情况，对7-8月龄大白猪发情后配种，以最后一次配种结束的时间为0，分别于不同时间段收集胚胎，然后镜检，其结果如图4；
从图4可见，收集1-细胞期胚胎，最佳时间在人工授精后18-24小时；收集2-细胞期胚胎，最佳时间在人工授精后26-32小时；收集4-细胞期胚胎，最佳时间在人工授精后34-40小时；收集8-细胞期胚胎，最佳时间在人工授精后42-48小时。
2、供体猪的麻醉和保定
其主要包括以下几个方面：
(1)供体猪上腭牵拉，限制活动，按25mg/kg(每公斤体重毫克)戊巴比妥钠(2.5％)或水合氯醛硫酸镁注射液(水合氯醛8％，硫酸镁5％)175ml耳静脉注射，进行全身麻醉；
(2)由于个体之间对麻醉药的敏感性不同，所以在注射时要随时观察猪的神态，注射的速度要慢，防止过量，一般在眼睑刚刚失去反应，蹄部刺激无明显反射时即可；
(3)麻醉到位后仰放在手术保定架上，四肢固定；
(4)为防止手术过程中猪的挣扎、弹动，要用绳索将四肢和头部捆绑牢靠；
(5)为使腹腔内脏向前倾斜，方便手术，手术台要前低(头低)后高(尾高)；
(6)手术过程根据需要肌肉或静脉滴注适量的盐酸氯胺酮。
3、手术部位及消毒
其主要步骤为：
S1：用肥皂水和毛刷洗刷术部，水洗后用毛巾擦干净；
S2：手术部位一般选择在倒数第2、3个乳头之间，先用电剪或毛剪在术部剪毛，应剪净毛茬，用清水洗净术部，擦干，然后涂以3％的碘酒，再用72％的酒精棉脱碘；
S3：消毒程序是：碘酊棉球→酒精棉球，由内向外；
S4：盖创巾于术部，使预定的切口暴露在创巾开口的中部。
4、手术方法
其主要步骤为：
S1：沿腹中线，尽量避开血管，切开皮肤7cm，钝性分离脂肪和肌肉层，使腹膜露出后，用钝头剪刀剪开腹膜；
S2：术者将食指及中指由切口伸人腹腔，在与骨盆腔交界的前后位置触摸子宫或子宫角，摸到后用二指夹持，牵引至创口的表面；
S3：循一侧子宫角导出输卵管及卵巢，观察卵巢表面排卵点和卵泡发育。
5、胚胎采集
(1)输卵管采胚
其主要步骤为：
S1：将集卵装置一端由输卵管伞部的喇叭口插入约1-2cm深，用大拇指和食指固定吸盘，然后用注射器连接洗盘吸盘接口，将空气抽出直到输卵管伞紧紧固定在吸盘上为止，另一端接表面皿；
S2：将冲卵装置的储液罐装满冲卵液，盖紧盖子，将有穿刺针的一端在宫管结合部，针头朝输卵管方向插入(此时针头不连接充气装置)，打开微型充气泵开关，调节阀门选择合适的冲卵液冲击力度，调好后在链接连接针头开始冲卵。冲卵时注意表面皿保持平衡，液体满了需更换新的表面皿；
S3：再将另一侧输卵管引出切口之外，用同样的方法冲胚。
(2)子宫角采胚
其主要步骤为：
S1：根据冲卵时间的不同，或近或远，在距宫管接合部30-70cm的子宫角背面没有血管的部位用眼科剪剪个小孔，插入子宫角集卵装置，开口向宫管结合部方向，另一端开口接表面皿或平皿；
S2：用冲卵装置从宫管结合部向子宫角注入30-50ml冲卵液；
S3：冲卵液流经子宫角，将胚胎带入接卵的表面皿或平皿:；
S4：鉴于子宫角过长，也可以采取分段冲卵的方法；
S5：再将另一侧子宫角引出切口之外，用同样的方法冲胚。
6、拣卵
其主要步骤为：
S1：将接卵的表面皿置于实体显微镜下，用低倍镜的大视野在冲卵液中找到胚胎；
S2：猪胚胎直径为150μm左右，肉眼观察只有针尖大小，为一球形体，在镜下呈圆形，其外层是透明带；
S3：胚胎转移装置先吸入少许PBS再吸人卵，依次在第二个表面皿内重复冲洗，然后把全部卵集中到一个表面皿，一只供体的卵放在一个皿内，操作室温为25℃。
7、供体母猪的术后处理
其主要包括以下几个方面：
S1：供体采胚完毕后，用37℃灭菌生理盐水湿润子宫，冲去凝血块，将器官复位；
S2：腹膜、肌肉缝合后，涂抹磺胺等消炎防腐药；
S3：皮肤缝合后，在伤口周围涂碘酒，肌注青、链霉素。
实施例3：
请参阅图1-4，本发明提供一种技术方案：一种活体采集猪体内1、2、4、8细胞期胚胎的收集方法，该方法利用时间与空间的不同来判定胚胎所处于的发育阶段以及体内的大概位置，主要包括以下几个方面：
一、收集1-细胞期胚胎，最佳时间在人工授精后18-24小时；
二、收集2-细胞期胚胎，最佳时间在人工授精后26-32小时；
三、收集4-细胞期胚胎，最佳时间在人工授精后34-40小时；
四、收集8-细胞期胚胎，最佳时间在人工授精后42-48小时。
该方法主要包括以下流程：
(一)胚胎采集前的各项准备工作
1、器材的准备
(1)冲卵装置：本发明研制的用于输卵管冲卵的冲卵器如图1所示，由于该冲卵器为胶质软管，向输卵管插入针头时，克服了针头与注射器直接连接的局限，操作自如，能将针头确实插入输卵管的内腔。在冲卵过程中，即使操作者稍有抖动或猪稍有骚动，由于软管的缓冲作用，也不会出现针头划破、划穿或脱出输卵管的现象，从而大大提高冲卵的成功率。
(2)集卵装置：本发明研制的集卵装置如图2所示，用于输卵管冲卵的集卵管为长140mm、壁厚1.1mm、内径4mm的玻璃管；用于子宫角冲卵的集卵管，外径10mm、长140mm的玻璃管；两种玻璃管均在酒精喷灯上中间弯成140°角，两端烧制、研磨平滑；
由于该集卵装置中间是弯曲的，集卵皿可摆放的位置增大，局限性小，即使有时接卵不慎或猪稍有骚动，集卵皿可随之移动，不会造成冲卵液流到集卵皿之外、或集卵皿内的冲卵液倒撒的现象。
(3)胚胎转移装置：胚胎转移装置是从一个容器中收集卵或胚胎、并向另一个容器中转移的工具(如冲卵后在解剖镜下从表面皿中收集卵并向培养皿中转移)，也是移植胚胎的工具，胚胎转移装置先由外径4mm左右的玻璃管拉制成吸管(如图3所示)，然后与去针头的头皮针软管连接，在依次装上输液器的出液端跟吸头拼接而成(如图4所示)。
其制作步骤如下：
a、点燃酒精喷灯，将外径4mm左右的玻璃管置于酒精喷灯的火焰上方；
b、不断转动玻璃管，使玻璃管受热均匀，灼烧5秒钟左右；
c、待灼烧玻璃管发红，轻轻用力拉长玻璃管，长度为9cm；
d、待拉长的玻璃管冷却之后，用沙轮将中间折断成两根玻璃吸管；
e、将玻璃吸管与长30cm的硅胶管连接，注意连结紧密，防止漏气。
(4)集卵皿(表面皿)：准备直径为10cm的表面皿，做为冲卵时接收冲卵液用。每个供体猪需备4个皿，写好编号，放入培养箱待用。
(5)手术器材：将手术所需要的器材(手术刀、手术剪、止血钳、持针钳、巾钳、缝合针、缝合线、创巾、沙布、表面皿、拣卵管、冲卵管等)高压灭菌，手术前将金属器械浸泡在0.1％新洁尔灭液中备用。
2、冲卵液和培养液的配制
(1)冲卵液：在试剂公司购置成品PBS或DPBS粉剂，按其说明书用双蒸水配制。
(2)培养液：短暂培养可以用冲卵液，但需加入10％的小牛血清，用0.22μm的滤膜过滤灭菌，然后分装保存，待用。
(二)手术室的准备工作
每次手术之前，手术室需用福尔马林熏蒸消毒，通气之后，再用紫外灯照射30min。
1、采集的时间
收集1-细胞期胚胎，最佳时间在人工授精后18-24小时；收集2-细胞期胚胎，最佳时间在人工授精后26-32小时；收集4-细胞期胚胎，最佳时间在人工授精后34-40小时；收集8-细胞期胚胎，最佳时间在人工授精后42-48小时。分别于不同时间段进行外科手术，采集胚胎，然后镜检，其结果如图4；
从图4可见，如果从输卵管采胚，应在最后一次配种的48小时内进行；如果从子宫角采胚，则应在最后一次配种的48小时以后直至胚胎着床前进行，同时应注意不同发育时间胚胎在子宫角所处的部位，以有的放矢。48小时以后的时间越长，胚胎在子宫角的分布越分散，采集胚胎的难度也就越大。
2、供体猪的麻醉和保定
其主要包括以下几个方面：
(1)供体猪上腭牵拉，限制活动，按30mg/kg(每公斤体重毫克)戊巴比妥钠(2.5％)或水合氯醛硫酸镁注射液(水合氯醛8％，硫酸镁5％)200ml耳静脉注射，进行全身麻醉；
(2)由于个体之间对麻醉药的敏感性不同，所以在注射时要随时观察猪的神态，注射的速度要慢，防止过量，一般在眼睑刚刚失去反应，蹄部刺激无明显反射时即可；
(3)麻醉到位后仰放在手术保定架上，四肢固定；
(4)为防止手术过程中猪的挣扎、弹动，要用绳索将四肢和头部捆绑牢靠；
(5)为使腹腔内脏向前倾斜，方便手术，手术台要前低(头低)后高(尾高)；
(6)手术过程根据需要肌肉或静脉滴注适量的盐酸氯胺酮。
3、手术部位及消毒
其主要步骤为：
S1：用肥皂水和毛刷洗刷术部，水洗后用毛巾擦干净；
S2：手术部位一般选择在倒数第2、3个乳头之间，先用电剪或毛剪在术部剪毛，应剪净毛茬，用清水洗净术部，擦干，然后涂以4％的碘酒，再用75％的酒精棉脱碘；
S3：消毒程序是：碘酊棉球→酒精棉球，由内向外；
S4：盖创巾于术部，使预定的切口暴露在创巾开口的中部。
4、手术方法
其主要步骤为：
S1：沿腹中线，尽量避开血管，切开皮肤8cm，钝性分离脂肪和肌肉层，使腹膜露出后，用钝头剪刀剪开腹膜；
S2：术者将食指及中指由切口伸人腹腔，在与骨盆腔交界的前后位置触摸子宫或子宫角，摸到后用二指夹持，牵引至创口的表面；
S3：循一侧子宫角导出输卵管及卵巢，观察卵巢表面排卵点和卵泡发育。
5、胚胎采集
(1)输卵管采胚
其主要步骤为：
S1：将集卵装置一端由输卵管伞部的喇叭口插入约1-2cm深，用大拇指和食指固定吸盘，然后用注射器链接连接洗盘吸盘接口，将空气抽出直到输卵管伞紧紧固定在吸盘上为止，另一端接表面皿；
S2：将冲卵装置的储液罐装满冲卵液，盖紧盖子，将有穿刺针的一端在宫管结合部，针头朝输卵管方向插入(此时针头不连接充气装置)，打开微型充气泵开关，调节阀门选择合适的冲卵液冲击力度，调好后在链接连接针头开始冲卵。冲卵时注意表面皿保持平衡，液体满了需更换新的表面皿；
S3：再将另一侧输卵管引出切口之外，用同样的方法冲胚。
(2)子宫角采胚
其主要步骤为：
S1：根据冲卵时间的不同，或近或远，在距宫管接合部30-70cm的子宫角背面没有血管的部位用眼科剪剪个小孔，插入子宫角集卵装置，开口向宫管结合部方向，另一端开口接表面皿或平皿；
S2：用冲卵装置从宫管结合部向子宫角注入30-50ml冲卵液；
S3：冲卵液流经子宫角，将胚胎带入接卵的表面皿或平皿:；
S4：鉴于子宫角过长，也可以采取分段冲卵的方法；
S5：再将另一侧子宫角引出切口之外，用同样的方法冲胚。
6、拣卵
其主要步骤为：
S1：将接卵的表面皿置于实体显微镜下，用低倍镜的大视野在冲卵液中找到胚胎；
S2：猪胚胎直径为150μm左右，肉眼观察只有针尖大小，为一球形体，在镜下呈圆形，其外层是透明带；
S3：胚胎转移装置先吸入少许PBS再吸人卵，依次在第二个表面皿内重复冲洗，然后把全部卵集中到一个表面皿，一只供体的卵放在一个皿内，操作室温为25℃。
7、供体母猪的术后处理
其主要包括以下几个方面：
S1：供体采胚完毕后，用37℃灭菌生理盐水湿润子宫，冲去凝血块，将器官复位；
S2：腹膜、肌肉缝合后，涂抹磺胺等消炎防腐药；
S3：皮肤缝合后，在伤口周围涂碘酒，肌注青、链霉素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (7)
1.一种活体采集猪体内1、2、4、8细胞期胚胎的收集方法，其特征在于：该方法利用时间与空间的不同来判定胚胎所处于的发育阶段以及体内的大概位置，主要包括以下几个方面：
一、收集1-细胞期胚胎，最佳时间在人工授精后18-24小时；
二、收集2-细胞期胚胎，最佳时间在人工授精后26-32小时；
三、收集4-细胞期胚胎，最佳时间在人工授精后34-40小时；
四、收集8-细胞期胚胎，最佳时间在人工授精后42-48小时；
该方法主要包括以下流程：
(一)胚胎采集前的各项准备工作
1、器材的准备
(1)冲卵装置
(2)集卵装置
(3)胚胎转移装置
(4)集卵皿(表面皿)
(5)手术器材
2、冲卵液和培养液的配制
(1)冲卵液
(2)培养液
(二)手术室的准备工作
1、采集的时间
2、供体猪的麻醉和保定
3、手术部位及消毒
4、手术方法
5、胚胎采集
(1)输卵管采胚
其主要步骤为：
S1：将集卵装置一端由输卵管伞部的喇叭口插入约1-2cm深，用大拇指和食指固定吸盘，然后用注射器连接吸洗盘接口，将空气抽出直到输卵管伞紧紧固定在吸盘上为止，另一端接表面皿；
S2：将冲卵装置的储液罐装满冲卵液，盖紧盖子，将有穿刺针的一端在宫管结合部，针头朝输卵管方向插入(此时针头不连接充气装置)，打开微型充气泵开关，调节阀门选择合适的冲卵液冲击力度，调好后再在连接针头开始冲卵，冲卵时注意表面皿保持平衡，液体满了需更换新的表面皿；
S3：再将另一侧输卵管引出切口之外，用同样的方法冲胚；
(2)子宫角采胚
其主要步骤为：
S1：根据冲卵时间的不同，或近或远，在距宫管接合部30-70cm的子宫角背面没有血管的部位用眼科剪剪个小孔，插入子宫角冲卵装置，开口向宫管结合部方向，另一端开口接表面皿或平皿；
S2：用冲卵装置从宫管结合部向子宫角注入30-50ml冲卵液；
S3：冲卵液流经子宫角，将胚胎带入接卵的表面皿或平皿；
S4：鉴于子宫角过长，也可以采取分段冲卵的方法；
S5：再将另一侧子宫角引出切口之外，用同样的方法冲胚；
S6：拣卵；
S7：供体母猪的术后处理。
2.根据权利要求1所述的一种活体采集猪体内1、2、4、8细胞期胚胎的收集方法，其特征在于：对于胚胎采集前的各项准备工作中的胚胎转移装置准备，其制作步骤如下：
a、点燃酒精喷灯，将外径4mm左右的玻璃管置于酒精喷灯的火焰上方；
b、不断转动玻璃管，使玻璃管受热均匀，灼烧4-5秒钟左右；
c、待灼烧玻璃管发红，轻轻用力拉长玻璃管，长度为8-9cm；
d、待拉长的玻璃管冷却之后，用沙轮将中间折断成两根玻璃吸管；
e、将玻璃吸管与长20-30cm的硅胶管连接，注意连结紧密，防止漏气，然后将头皮针硅胶管另一端与输液器的前端相连，剪掉多余的输液器，取一吸头插入另一端，胚胎转移装置制作完成。
3.根据权利要求1所述的一种活体采集猪体内1、2、4、8细胞期胚胎的收集方法，其特征在于：对于手术室的准备中的供体猪的麻醉和保定，其主要包括以下几个方面：
(1)供体猪上腭牵拉，限制活动，按20-30mg/kg(每公斤体重毫克)戊巴比妥钠(2.5％)或水合氯醛硫酸镁注射液(水合氯醛8％，硫酸镁5％)150-200ml耳静脉注射，进行全身麻醉；
(2)由于个体之间对麻醉药的敏感性不同，所以在注射时要随时观察猪的神态，注射的速度要慢，防止过量，一般在眼睑刚刚失去反应，蹄部刺激无明显反射时即可；
(3)麻醉到位后仰放在手术保定架上，四肢固定；
(4)为防止手术过程中猪的挣扎、弹动，要用绳索将四肢和头部捆绑牢靠；
(5)为使腹腔内脏向前倾斜，方便手术，手术台要前低(头低)后高(尾高)；
(6)手术过程根据需要肌肉或静脉滴注适量的盐酸氯胺酮。
4.根据权利要求1所述的一种活体采集猪体内1、2、4、8细胞期胚胎的收集方法，其特征在于：对于手术室的准备中的手术部位及消毒，其主要步骤为：
S1：用肥皂水和毛刷洗刷术部，水洗后用毛巾擦干净；
S2：手术部位一般选择在倒数第2、3个乳头之间，先用电剪或毛剪在术部剪毛，应剪净毛茬，用清水洗净术部，擦干，然后涂以2-4％的碘酒，再用70％-75％的酒精棉脱碘；
S3：消毒程序是：碘酊棉球→酒精棉球，由内向外；
S4：盖创巾于术部，使预定的切口暴露在创巾开口的中部。
5.根据权利要求1所述的一种活体采集猪体内1、2、4、8细胞期胚胎的收集方法，其特征在于：对于手术室的准备中的手术方法，其主要步骤为：
S1：沿腹中线，尽量避开血管，切开皮肤5-8cm，钝性分离脂肪和肌肉层，使腹膜露出后，用钝头剪刀剪开腹膜；
S2：术者将食指及中指由切口伸人腹腔，在与骨盆腔交界的前后位置触摸子宫或子宫角，摸到后用二指夹持，牵引至创口的表面；
S3：循一侧子宫角导出输卵管及卵巢，观察卵巢表面排卵点和卵泡发育。
6.根据权利要求1所述的一种活体采集猪体内1、2、4、8细胞期胚胎的收集方法，其特征在于：对于手术室的准备中的拣卵，其主要步骤为：
S1：将接卵的表面皿置于实体显微镜下，用低倍镜的大视野在冲卵液中找到胚胎；
S2：猪胚胎直径为150μm左右，肉眼观察只有针尖大小，为一球形体，在镜下呈圆形，其外层是透明带；
S3：移卵管先吸入少许PBS再吸人卵，依次在第二个表面皿内重复冲洗，然后把全部卵集中到一个表面皿，一只供体的卵放在一个皿内，操作室温为20-25℃。
7.根据权利要求1所述的一种活体采集猪体内1、2、4、8细胞期胚胎的收集方法，其特征在于：对于手术室的准备中的供体母猪的术后处理，其主要包括以下几个方面：
S1：供体采胚完毕后，用37℃灭菌生理盐水湿润子宫，冲去凝血块，将器官复位；
S2：腹膜、肌肉缝合后，涂抹磺胺等消炎防腐药；
S3：皮肤缝合后，在伤口周围涂碘酒，肌注青、链霉素。
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| CN208454969U (zh) * | 2018-06-12 | 2019-02-01 | 江苏集萃药康生物科技有限公司 | 新型胚胎操作口吸管 |
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