CN113827192A - 无线微型荧光显微成像装置及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医学成像技术领域，涉及一种微型的无线荧光显微镜及成像方法。本发明总重量2.7克，总功耗约为0.7W，在高集成度的条件下实现了低功耗的无线发射功能和远程控制功能，以及多个设备同时工作互不干扰的特性。本发明的成像装置通过5.8GHz的射频信号将采集到的荧光显微图像传送到接收端并使用硬盘录像机保存并实时播放。本发明的无线控制功能可以在实验过程中远程控制显微镜的增益值，激发光LED的亮度以及控制显微镜的开关，从而实现了根据需要实施调控图像参数，以及待机功能，在不需要成像的时间段关闭显微镜进入待机状态以减少功耗。
Description
技术领域
本发明涉及无线微型荧光显微成像装置及其应用，属于生物监测设备领域。
背景技术
荧光显微镜(Fluorescence microscope)是以特定波长的光源照射被检物体，使之发出荧光，然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置。在生物领域，对自由活动的动物体的脑细胞和血管的成像是相关领域科学研究的重要手段。荧光显微镜可被用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等，为探索神经环路结构和功能提供了极大的帮助。但传统的荧光显微镜的总重量大，占空间多，造价高，这些特性在诸多方面也限制了科学探索的前进。例如在观察记录实验动物脑部细胞活动时，由于传统荧光显微镜的体型较大，所以不得不将实验动物麻醉或者束缚起来，以保证成像的稳定性。但对清醒的，自由活动的实验动物脑部血流或者神经元活动观察实验就很难完成。因此，开发适合放置在自由活动的实验动物头部的便携式微型荧光显微镜是学者们的迫切需求。虽然已报道了某些微型荧光显微镜，但是大部分是有线连接的方案。有线连接的方案采用将显微镜和上位机用导线连接的方式，导致动物的自由活动受到较大限制，一些复杂的行为(例如小鼠钻洞行为)会遇到阻碍，难以实现完全的自由活动，导致实验结果与自然状况存在偏差。另外，由于导线容易出现缠绕问题，也很难实现做多只小鼠的行为学(如多只小鼠的社交行为学)实验；而无线连接方案则是通过将行为学数据存储在动物背负的储存卡中来实现的。该方案不允许科研人员在实验过程中实时观察实验数据，而只能在实验完成以后将SD卡取出读取数据，导致无法对实验结果进行有效的实时监测。
发明内容
为了改善上述技术问题，本发明提供一种无线荧光成像装置，包括荧光成像显微镜、无线控制单元、无线视频传输单元、无线视频接收单元和视频储存单元，其中，所述无线控制单元包括接收控制端指令的元件和控制荧光成像显微镜的元件，所述无线控制单元与所述无线视频传输单元的频段不相同。
根据本发明的实施方案，所述无线控制单元包含2.4GHz射频芯片(如NRF24LE1)，该芯片用于接收上位机控制端(如计算机)的控制指令，以实现无线控制功能。
根据本发明的实施方案，所述无线控制单元包含一个带有2.4GHz射频芯片(如NRF24LE1)的开发板，用于接收控制端(如计算机)的控制指令并通过射频信号发送出去。
根据本发明的实施方案，另一个2.4GHz射频芯片(如NRF24LE1)设置于显微镜的电路上，并接收控制指令以实现无线控制功能。
根据本发明的实施方案，所述无线控制所要实现的功能包括但不限于选自下列的功能：控制荧光成像激发光的LED亮度、控制荧光成像的CMOS增益值以及远程控制显微镜的开关。
根据本发明的实施方案，所述无线视频传输单元包含5.8GHz射频芯片，例如RTC6705。优选地，所述5.8GHz射频芯片具有2个以上的射频频段，优选12个以上的射频频段，更优选24个射频频段。
根据本发明的实施方案，所述无线视频传输单元采用两个以上的不同频段，以使这些频段在传输过程中互不干扰，实现多个设备同时传输图像。
根据本发明的实施方案，所述无线视频传输单元包含5.8GHz图传模块EWRF 708R。
根据本发明的实施方案，所述视频储存单元可以为硬盘录像机，例如海康威视的硬盘录像机7804HQH-K1。
根据本发明的实施方案，所述荧光成像显微镜的外壳材料可以选自聚酯材料，如聚甲醛树脂(POM)；所述荧光成像显微镜的成像芯片可以选自OV7960，从而在对光的灵敏度较高的情况下，输出模拟视频信号。
根据本发明的实施方案，所述微型荧光显微镜优选包括显微镜照明器，以及反射镜、微型物镜、滤光等若干独立光学元器件以及面阵光电探测器；所述光学元器件通过机械外壳固定在一起。显微镜照明器可使用单色LED，也可以使用光纤耦合外部激光。配置不同波长的光源及滤光片组，可以实现基于不同荧光蛋白的荧光成像。所述微型物镜由梯度折射率透镜构成，具体选择与成像需求有关。所述面阵光电探测器，位于所述显微镜的成像平面上，用于数据采集并将数据通过无线或者有线的方式传递数据处理模块。
根据本发明的实施方案，所述无线荧光成像装置的电路板包含柔性区域，以使电路板位于柔性区域两侧的部分可以弯折，从而位于不同的平面。优选地，弯折后的电路板可以为L型、n型、V型、U型或其他结构。由此，电路运行产生的热量可以从弯折后电路板的空腔中流过，改善显微镜的散热，并缩小电路板的体积。
根据本发明的实施方案，所述无线荧光成像装置的外壳包含散热孔。
根据本发明的实施方案，所述无线荧光成像装置根据射频芯片RTC6705的芯片手册，使用34引脚，断开35引脚，实现低功耗模式运行。
本发明还提供一种监测系统，包括所述无线荧光成像装置和行为学相机。优选地，所述行为学相机获得的图像或视频数据传输至所述视频储存单元。
本发明还提供所述无线荧光成像装置用于监测动物的应用。
本发明还提供一种监测动物行为的方法，包括使用所述无线荧光成像装置监测动物。
根据本发明的实施方案，所述动物可以是人以及除人之外的动物如小鼠、大鼠、兔等。
根据本发明的实施方案，所述监测动物行为的方法还包括对一个或更多个动物进行视觉刺激测试、光刺激测试、钻洞测试等中的一种或多种。
根据本发明的实施方案，所述监测动物行为的方法包括：当观察到小鼠的视线朝向显示器的时候，控制电脑程序同时显示棋盘格的视觉刺激，视觉刺激持续2秒后消失，观察小鼠看到棋盘格以后视觉皮层的变化情况。
根据本发明的实施方案，所述监测动物行为的方法在旷场中进行。
优选地，所述旷场的两个面是透明的，可以在紧贴旷场透明面外侧的位置设置两个显示器。观察小鼠左眼的朝向，当观察到小鼠的视线朝向显示器的时候，控制电脑程序同时显示棋盘格的视觉刺激，视觉刺激持续2秒后消失，观察小鼠看到棋盘格以后视觉皮层的变化情况。
根据本发明的实施方案，所述监测动物行为的方法包括图像控制方法，其中所述图像控制方法包括如下步骤：
(1)根据实时接收到的图像，设置成像用光源(如LED)的初始值；
(2)计算初始成像时的图像的均值作为自动控制亮度的参考；
(3)计算获得的每一张图像的均值，并计算后一张图像减去前一张图像之间的均值差值；
(4)调节光源亮度，使其亮度等于初始值与上述均值差值的和。
优选地，所述图像控制方法中的动物为经注射荧光染料的动物。
根据本发明的实施方案当所述动物为小鼠，特别是对小鼠大脑皮层血管成像时，LED初始值一般为60-80。
根据本发明的实施方案，所述监测动物行为的方法包括能源控制方法，其中所述能源控制方法包括如下步骤：
(1)当动物之间产生社交行为时，使所述无线荧光成像装置启动并成像；
(2)当动物之间未产生社交行为，或社交行为结束时，使所述无线荧光成像装置关闭或休眠。
根据本发明的实施方案，所述监测动物行为的方法还包括判断动物社交行为的方法，包括如下步骤：
(1)实时计算运动轨迹的切向量，作为动物的运动方向；
(2)提取动物的特征点，识别出动物的头部；
(3)当两个以上的动物头部接触时，或当两个动物之间的距离减小且运动方向的夹角>135°时，计为动物之间产生社交行为；
(4)当动物行为不符合(3)中的条件时，计为动物之间未产生社交行为或社交行为结束。
根据本发明的实施方案，所述监测动物行为的方法还包括控制光路的方法，包括使光路经过二向色镜的反射后进入荧光成像的CMOS传感器的感光区域。
根据本发明的实施方案，所述监测动物行为的方法还包括使用液态透镜和软件调焦方式。
根据本发明的实施方案，使用两种具有不同激发波长的染料，可以同时研究两种不同的神经元，这对于研究大脑神经元之间的关联具有重要意义。通过针对所用的染料的激发波长，来定制LED以及相应的滤光片。优选地，这两个不同波长的LED每隔一秒交替开关，分别激发染料产生荧光，通过CMOS采集到荧光图像。
根据本发明的实施方案，所述应用和方法为用于疾病的诊断或治疗目的，或者为用于疾病的诊断或治疗目的。
有益效果
本发明的无线微型荧光显微成像装置能够实现显微镜图像的实时无线传输，解决因连接导线而出现的对动物自由活动的限制，避免因此导致的研究结果偏差。本发明的无线微型荧光显微成像装置能够实现多通道的无线传输，可以轻松实现多只小鼠同时进行行为学实验。并且，本发明的无线微型荧光显微成像装置使得实验人员能够在实验过程中实时监测实验数据和成像效果，并使得实时调整显微镜的参数从而调整图像质量成为可能。
附图说明
图1为本发明无线微型荧光显微成像装置的示意图。
图2为本发明荧光成像显微镜的示意图。
图3为本发明无线微型荧光显微成像装置与现有有线成像装置的图像质量的实时对比结果。
图4为本发明电路模块设计，中间留有一个柔性区域可以弯折
图5为本发明在做单只小鼠的视觉刺激的实验图。
图6为本发明在实施例2过程中观察到的神经元图。
图7为为神经元钙信号的瞬间变化图。
图8为本发明实施例3中两只小鼠在做光刺激的实验图。
图9为本发明实施例3中第一只小鼠的视觉皮层血管结果图。
图10为本发明实施例3中第二只小鼠的视觉皮层血管结果图。
图11为本发明实施例3中其中一只小鼠的视觉皮层血管宽度变化分析结果图
图12为本发明实施例4中小鼠钻洞实验效果的展示图。
图13为本发明实施例5中实验过程中调整参数与不调整参数图像对比结果。
图14为本发明实施例5中实时调整参数的控制算法流程图。
图15为本发明实施例6中自动控制显微镜开关的控制流程。
图16为本发明实施例6中识别小鼠是否产生社交行为的算法流程。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
实施例1：无线微型荧光显微成像装置
如图1所示，本实施例提供一种无线微型荧光显微成像装置，包括荧光成像显微镜、无线控制单元、无线视频传输单元、无线视频接收单元和视频储存单元，其中，所述无线控制单元包括接收控制端指令的元件和控制荧光成像显微镜的元件。
所述微型荧光显微镜优选包括显微镜照明器，以及反射镜、微型物镜、滤光等若干独立光学元器件以及面阵光电探测器；所述光学元器件通过机械外壳固定在一起。显微镜照明器可使用单色LED，也可以使用光纤耦合外部激光。配置不同波长的光源及滤光片组，可以实现基于不同荧光蛋白的荧光成像。所述微型物镜由梯度折射率透镜构成。所述面阵光电探测器，位于所述显微镜的成像平面上，用于数据采集并将数据通过无线或者有线的方式传递数据处理模块。
所述荧光成像显微镜的外壳材料选自聚甲醛树脂(POM)；所述荧光成像显微镜的成像芯片选自OV7960。该芯片具有较高的对光的灵敏度，即使荧光信号很弱也可以接收到信号。另外，该芯片输出的是模拟视频信号，无需进行处理即可通过射频芯片发送出去。
所述无线控制单元使用的是2.4GHz射频芯片NRF24LE1，但不仅限于此芯片。使用2.4GHz的原因是为了避免对视频信号的5.8GHz频段产生干扰。其中，一个带有NRF24LE1芯片的开发板用于接收控制端(计算机)的控制指令并通过射频信号发送出去，另一个NRF24LE1芯片设置于显微镜的电路上，并接收控制指令以实现无线控制功能。所述无线控制功能包括：控制荧光成像的激发光的LED亮度、控制荧光成像的CMOS增益值和远程控制显微镜的开关。
所述无线视频传输单元包含5.8GHz射频芯片RTC6705，但不仅限于此芯片。RTC6705具有24个射频频段，具体如下：
本实施例中由上述频段中选择出多个频段，以使这些频段在传输过程中可以互不干扰，实现多个设备同时传输图像。
本实施例中，电路板设计成可以弯折的结构。如图4所示，电路板中间留有约6毫米的柔性区域，以使弯折后的两部分电路板保持距离，使得电路运行产生的热量可以从中流过，改善显微镜的散热，并缩小电路板的体积。
本实施例中，无线微型荧光显微成像装置的外壳上预留出空气流通的散热孔，以供热量散出。
优选地，本实施例中，根据射频芯片RTC6705的芯片手册，使用34引脚，断开35引脚，实现低功耗模式运行。
本实施例的无线微型荧光显微成像装置的总重量只有2.7g，正常工作时功耗为0.7W，实现了降低小鼠进行成像时重量对小鼠依从性和运动功能影响的需求。
所述无线视频传输单元采用5.8GHz图传模块EWRF 708R。
所述视频储存单元为海康威视的硬盘录像机7804HQH-K1。
实施例2：单只小鼠的视觉刺激实验
使用实施例1中的无线微型荧光显微成像装置进行单只小鼠的视觉刺激实验。
微型显微镜固定于小鼠头部的方式：所有动物实验均在动物中心进行。野生型C57BL/6小鼠(雄性，8-12周龄)购自Vital River实验室(中国北京)，并维持12/12小时反向暗光循环。所有实验均在光循环期间进行。手术前，用三溴乙醇(240mg/kg，Sigma)麻醉小鼠，并在右半球的初级视觉皮层上进行开颅手术(前囟门坐标：前后，-2.8mm；中间，2.5mm；背腹侧，0.2毫米)。开颅手术后，将直径1.8毫米的GRIN透镜(爱特蒙特光学)放置在皮质表面，而不会损坏组织。GRIN镜片和头骨之间的间隙用Kwik-Sil(世界精密仪器)覆盖以保护皮质。使用氰基丙烯酸酯粘合剂和牙科丙烯酸将金属底板安装在颅骨上(微型显微镜通过螺丝固定在金属底板上)。手术后，动物恢复1周，期间每天腹腔注射头孢曲松钠(200mg/kg)和地塞米松(5mg/kg)以预防炎症和水肿。手术后一周，每只动物都装有一个虚拟显微镜，进行一周的训练。
用亚克力板制作了一个35cm*35cm的旷场，旷场的其中两个面是透明的，可以在紧贴旷场外侧的地方放两个显示器。在实验过程中实验人员观察小鼠左眼的朝向，因为手术观察的视觉皮层是位于大脑右半球，对应的是左眼看到的视觉刺激。当观察到小鼠的视线朝向显示器的时候，控制电脑程序同时显示棋盘格的视觉刺激，视觉刺激持续2秒后消失，观察小鼠看到棋盘格以后视觉皮层的变化情况。由于本实验观察的是神经元的反应，当小鼠左眼能够接收到显示器给出的视觉刺激后，视觉皮层区域几乎同时会产生反应，间隔时间在200毫秒以内。
实验设置如图5所示，观察到的小鼠神经元反应如图6所示。图7为神经元钙信号的瞬间变化图。红色虚线表示给出刺激的时间段。可以看到在没有给出刺激的时候，神经元基本没有反应，而当接收到刺激后，可以看到神经元产生了很明显的反应。
实施例3：多只小鼠的光刺激实验
使用实施例1中的无线微型荧光显微成像装置进行多只小鼠的光刺激实验。
参照实施例2的方法，将实施例1中的无线微型荧光显微成像装置固定于两只小鼠的头部。
使用黑色亚克力做的50cm*50cm的旷场，并贴上黑色消光绒减少内壁的反光，在旷场底部安装一圈LED灯带作为光刺激。由于不方便控制两只小鼠在自由状态的视线朝向，所以选择通过控制LED灯带的亮灭来作为光刺激。实验过程中LED灯带点亮2秒，熄灭18秒，依次循环，每个循环时间为20秒，共循环20次，同时观察两只小鼠视觉皮层血管宽度的变化趋势。
实验装置如图8所示，两只小鼠的血管图像如图9，图10所示。图11为其中一根血管的线扫描图，可以看出在给出刺激的时候血管宽度有明显增加，而在刺激前后，血管宽度都明显降低。
实施例4：小鼠钻洞实验
使用实施例1中的无线微型荧光显微成像装置进行小鼠钻洞实验。
小鼠钻洞实验是有线成像装置无法实现的功能。本实施例中，使用黑色亚克力和透明亚克力做了一个两个边长度为20cm的L形盒子，当作小鼠需要钻的洞，洞的顶部使用透明的亚克力，方便观察到小鼠在洞内部的行为，同时在盒子的两个壁上开两个洞放两个摄像头近距离观察小鼠在洞内部的活动。本实施例中捕捉到的图像如图12所示。
实施例5：改进的控制算法
由于给小鼠通过尾静脉注射荧光染料后会遇到染料在经过长时间成像后荧光信号变弱的问题，故本实施例采用改进的控制算法来改善此类问题。
如图13所示，time(时间)为0或30分钟的三幅图中，由于未采用本实施例的控制算法，血管的荧光信号经过半小时及一小时后会出现明显下降，图像的灰度均值会有明显的降低，会使得图像整体偏暗，图像细节部分会模糊。通过实时调整成像的参数，实现将不符合要求的图像调节至实验刚开始时的图像信噪比，使得图像清晰度在长时间维持在稳定的水平，算法流程如图14所示，包括如下步骤：
(1)根据实时接收到的图像，设置成像用光源(如LED)的初始值，其中对小鼠大脑皮层血管成像时，LED初始值设置为60-80；
(2)计算初始成像时的图像的均值作为自动控制亮度的参考；
(3)计算获得的每一张图像的均值，并计算后一张图像减去前一张图像之间的均值差值；
(4)调节光源亮度，使其亮度等于初始值与上述均值差值的和。
由于本实施例实现了远程实时控制参数的功能，故可以无线实时获得质量更高的图像。
实施例6：改进的节能方法
本实施例中，利用小鼠行为识别追踪的算法来实时监督行为学相机中小鼠的行为，同时和远程控制开关的功能相结合。在需要研究小鼠与社交行为有关的皮层，例如前额叶皮层的神经元与小鼠社交行为之间的关系时，仅需在小鼠发生接触时进行成像，而小鼠之间未发生接触行为时的图像数据并非研究关注的信息，因此这段时间可以关闭显微镜节约能耗。
利用idtracker.ai的开源软件工具从视频中提取所有运动物体的算法，可以同时追踪小鼠个体的运动(参见图16)。在此基础上，结合判断小鼠是否发生社交行为的算法来控制开始成像的时间，整体的控制流程如图15所示。
例如，在实施例2的视觉刺激相关实验中，可以将给予小鼠的视觉刺激与显微镜的开关控制相结合。在给出小鼠视觉刺激(例如LED光刺激或者是显示器上持续的棋盘格图片刺激)的时间点时开启显微镜，未给出视觉刺激时则关闭显微镜，从而延长电池的使用时间。
实施例7：改进的光路设计
本实施例中可使用液态透镜，利用软件控制调焦，来替换掉现有技术中通过滑动的机械结构来调焦的方式，从而减少手动造成的机械误差，对于实验的准备阶段也更加方便。
在优选的实施方案中，使用两种具有不同激发波长的染料，可以同时研究两种不同的神经元，这对于研究大脑神经元之间的关联具有重要意义。通过针对所用的染料的激发波长，来定制LED以及相应的滤光片。这两个波长的LED每隔一秒交替开关，分别激发染料产生荧光，通过CMOS采集到荧光图像。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种无线荧光成像装置，包括荧光成像显微镜、无线控制单元、无线视频传输单元、无线视频接收单元和视频储存单元；
其中，所述无线控制单元包括接收控制端指令的元件和控制荧光成像显微镜的元件，所述无线控制单元与所述无线视频传输单元的频段不相同。
2.根据权利要求1所述的无线荧光成像装置，其中：
所述荧光成像显微镜的外壳材料可以选自聚酯材料，如聚甲醛树脂(POM)；
所述荧光成像显微镜的成像芯片选自OV7960。
3.根据权利要求1或2所述的无线荧光成像装置，其中：
所述无线控制单元包含一个带有2.4GHz射频芯片(如NRF24LE1)的开发板，用于接收控制端(如计算机)的控制指令并通过射频信号发送出去；
另一个2.4GHz射频芯片(如NRF24LE1)设置于显微镜的电路上，并接收控制指令以实现无线控制功能。
4.根据权利要求1-3任一项所述的无线荧光成像装置，其中：
无线控制所要实现的功能包括但不限于选自下列的功能：控制荧光成像激发光的LED亮度、控制荧光成像的CMOS增益值以及远程控制显微镜的开关。
5.根据权利要求1-4任一项所述的无线荧光成像装置，其中：
所述无线视频传输单元包含5.8GHz射频芯片，例如RTC6705；
优选地，所述5.8GHz射频芯片具有2个以上的射频频段，优选12个以上的射频频段，更优选24个射频频段；
所述无线视频传输单元采用两个以上的不同频段，以使这些频段在传输过程中互不干扰，实现多个设备同时传输图像。
6.根据权利要求1-5任一项所述的无线荧光成像装置，其中所述无线视频传输单元包含5.8GHz图传模块EWRF 708R。
7.根据权利要求1-6任一项所述的无线荧光成像装置，其中所述视频储存单元为硬盘录像机。
8.一种监测系统，包括根据权利要求1-6任一项所述的无线荧光成像装置和行为学相机；
优选地，所述行为学相机获得的图像或视频数据传输至所述视频储存单元。
9.权利要求1-7任一项所述的无线荧光成像装置或权利要求8所述的监测系统用于监测动物的应用。
10.一种监测动物行为的方法，包括使用权利要求1-7任一项所述的无线荧光成像装置或权利要求8所述的监测系统监测动物。
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