CN113813268A - 包含Bcl-2抑制剂或Bcl-2/Bcl-xL抑制剂的组合产品及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种包含Bcl‑2抑制剂或Bcl‑2/Bcl‑xL抑制剂和另外的药剂的组合产品，所述组合产品提供了在预防和/或治疗疾病(例如，癌症、自身免疫性疾病和炎性疾病)的用途。

Description

包含Bcl-2抑制剂或Bcl-2/Bcl-xL抑制剂的组合产品及其 用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种含有Bcl-2抑制剂或Bcl-2/Bcl-xL抑制剂的组合产品及其在预防和/或治疗疾病 (例如，癌症、自身免疫性疾病和炎性疾病)中的用途。

背景技术

细胞凋亡(程序性细胞死亡)是机体清除异常或不需要的细胞的自然途径，若其受到影响则可能导致各种疾病如癌症的发生。

抗细胞凋亡的Bcl-2蛋白与许多疾病相关。Bcl-2家族蛋白是线粒体介导细胞凋亡途径中的关键调控因子。逃避细胞凋亡是人类癌症的特征之一，并且是临床上耐药的常见原因。

布鲁顿氨酸激酶(Bruton’s tyrosine kinase,BTK)属于 Tec家族的成员。它由独特的N-端结构域即PH(pleckstrin homology)结构域、TH(Tec homology)同源区、SH3(Srchomology 3)结构域、SH2(Src homology 2)结构域和催化结构域，也称SH 1/TK(Srchomology1/Tyrosine kinase)结构域或者激酶结构域组成(Akinleye et al:Ibrutiniband novel BTK inhibitors in clinical development,Journal of Hematology&Oncology 2013,6:59)。在B淋巴细胞正常发育过程中，BTK基因不同蛋白区域的正确表达在B细胞的功能及多种转导途径中具有关键性作用。

BTK功能下游有多种受体，包括生长因子、B细胞抗原、趋化因子和先天免疫受体，从而启动一个多元化范围内的细胞过程，如细胞增殖、存活、分化、运动、血管生成、细胞因子生产、抗原表达等。因此BTK在许多造血细胞信号传输途径中起重要作用，同时在B细胞激活、发育、存活和信号传导中也至关重要(Kurosaki,Molecular mechanisms in B cellantigen receptor signaling.Curr OP Imm,1997,9(3):309-18)。

BTK在自身免疫性疾病中的作用的证据已经由BTK-缺失型小鼠和BTK-充足型小鼠模型试验提供(Kil LP,et al:Bruton’s tyrosine kinase mediated signalingenhances leukemogenesis in a mouse model for chronic lymphocytic leukemia.AmJ Blood Res 2013,3(1):71–83.)。在慢性淋巴细胞白血病(CLL)小鼠模型中，BTK-缺失型小鼠完全废止慢性淋巴细胞白血病，BTK过度表达会加速白血病发病，增加死亡率。

随着分子生物学的研究进展，分子靶向治疗已成为医药研究(特别是肿瘤研究)的热点，大部分肿瘤的生物学行为并非由单一信号传导通路所支配，而是多个信号传导通路共同起作用。因此，现有技术中存在针对不同靶蛋白和/或不同信号转导通路的联合用药的方案和产品存在需求，所述联合用药的方案和产品能够减少单药剂量、降低单药毒副作用和/或以协同作用的方式起作用，实现预防和/或治疗疾病的目的。

发明内容

为了满足现有技术中的需求，本发明提供了一种含有Bcl-2 抑制剂或Bcl-2/Bcl-xL抑制剂的组合产品及其在治疗和/或预防疾病(例如，癌症、自身免疫性疾病和炎性疾病)中的用途。

具体地，在本发明的第一方面涉及一种组合产品，所述组合产品包含Bcl-2抑制剂或Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和另外的药剂。

在一些实施方式中，所述另外的药剂选自BTK抑制剂、 HDAC抑制剂、MDM2抑制剂、JAK抑制剂、抗代谢药和酶中的一种或多种。

具体地，在本发明的另一方面涉及一种在所需的受试者中治疗疾病(例如癌症、自身免疫性疾病和炎性疾病)的方法，包括对所述受试者给予含有治疗有效量的Bcl-2抑制剂或Bcl- 2/Bcl-xL抑制剂的组合产品，其中所述受试者对BTK抑制剂不响应或者耐药。在某些实施方式中，所述受试者对依鲁替尼不响应或者耐药。

在一些实施方式中，所述Bcl-2抑制剂选自下述化合物或其药学上可接受的盐或其溶剂化物：

在一些实施方式中，所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂选自下述化合物或其药学上可接受的盐或其溶剂化物：

在一些实施方式中，所述BTK抑制剂选自：依鲁替尼 (Ibrutinib)、ICP-022、阿卡替尼(Acalabrutinib(ACP- 196))、泽布替尼(BGB3111)、ONO/GS-4059、Spebrutinib (CC-292或AVL-292)、CNX-774、Olmutinib(HM61713， BI1482694)、M7583、HM71224、PCI-32765外消旋体(PCI- 32765Racemate)、GDC-0853、ONO-4059、赞鲁替尼 (Zanubrutinib)、RN486、PCI-32765、CGI-1746、QL47、 LFM-A13、(±)-赞鲁替尼((±)-Zanubrutinib)、SNS-062、BMS-935177、BMS-986195、PCI29732、Btk抑制剂2、 Evobrutinib、依鲁替尼-生物素(Ibrutinib-biotin)、BMX-IN- 1、GDC-0834和CB1763。

在一些实施方式中，所述HDAC抑制剂选自西达本胺 (chidamide)。

在一些实施方式中，所述MDM2抑制剂选自APG-115。

在一些实施方式中，所述JAK抑制剂选自托法替尼 (tofacitinib)。

在一些实施方式中，所述抗代谢药选自吉西他滨 (gemcitabine)。

在一些实施方式中，所述酶选自门冬酰胺酶 (asparaginase)。

在一些实施方式中，所述组合产品呈药物组合物的形式。

在一些实施方式中，所述Bcl-2抑制剂和另外的药剂各自呈单独的制剂形式，或其中所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和另外的药剂各自呈单独的制剂形式。

在一些实施方式中，所述Bcl-2抑制剂和另外的药剂同时或先后施用，或其中所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和另外的药剂同时或先后施用。

在一些实施方式中，所述组合产品还包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

在一些实施方式中，所述组合产品呈片剂、胶囊剂、颗粒剂、糖浆剂、粉剂、锭剂、药囊、扁囊剂、酏剂、混悬剂、乳剂、溶液、糖浆剂、气雾剂、软膏剂、乳膏剂或注射剂的形式。

在本发明的第二方面涉及含有Bcl-2抑制剂和另外的药剂，或Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和另外的药剂的组合产品在制备用于预防和/或治疗疾病的药物中的用途，所述疾病选自癌症、自身免疫性疾病和炎性疾病。在一些实施方式中，所述另外的药剂选自BTK抑制剂、HDAC抑制剂、MDM2抑制剂、JAK抑制剂、抗代谢药和酶中的一种或多种。

在本发明的第三方面涉及一种用于预防和/或治疗疾病组合产品，所述组合产品包含Bcl-2抑制剂，或Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和另外的药剂，且所述疾病选自癌症、自身免疫性疾病和炎性疾病。在一些实施方式中，所述另外的药剂选自BTK抑制剂、 HDAC抑制剂、MDM2抑制剂、JAK抑制剂、抗代谢药和酶中的一种或多种。

在本发明的第四方面涉及一种预防和/或治疗疾病的方法，包括对有此需要的受试者施用含有预防和/或治疗有效量的Bcl- 2抑制剂和另外的药剂，或Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和另外的药剂的组合产品，其中所述疾病选自癌症、自身免疫性疾病和炎性疾病。在一些实施方式中，所述另外的药剂选自BTK抑制剂、 HDAC抑制剂、MDM2抑制剂、JAK抑制剂、抗代谢药和酶中的一种或多种。

在一些实施方式中，所述癌症是恶性血液病。

优选地，所述恶性血液病选自急性髓细胞性白血病 (AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)/小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、边缘区淋巴瘤 (MZL)、慢性骨髓性白血病(CML)、套细胞淋巴瘤(MCL)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(WM)、多发性骨髓瘤(MM)、T幼淋巴细胞白血病(T-PLL)、小细胞肺癌 (SCLC)和NK/T细胞淋巴瘤。更优选地，所述恶性血液病是弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)和 NK/T细胞淋巴瘤。

在一些实施方式中，所述的预防和/或治疗疾病的方法，其中将在组合产品中的所述Bcl-2抑制剂、Bcl-2/Bcl-xL抑制剂或其药学上可接受的盐或溶剂化物以约0.0025-1500mg/日的量给药。

在一些实施方式中，所述的预防和/或治疗疾病的方法，其中将在组合产品中的所述另外的药剂或其药学上可接受的盐或溶剂化物以约0.0025-1000mg/日的量给药。

附图说明

图1显示在WST实验中依鲁替尼、阿卡替尼或泽布替尼单药以及化合物72分别于依鲁替尼、阿卡替尼或泽布替尼联合用药对下述恶性肿瘤细胞中的增殖的抑制作用：DOHH-2(滤泡性淋巴瘤(FL))(图1A，图1B)、OCI-LY8(弥漫性大 B细胞淋巴瘤(DLBCL))(图1C)和Z-138(套细胞淋巴瘤 (MCL))(图1D、图1E和图1F)。

图2显示化合物6与阿卡替尼联合用药在CLL患者来源的原代细胞中增强凋亡作用。

图3显示化合物6联合阿卡替尼在人源ALL细胞中具有协同的抗增殖作用。

图4显示化合物6联合阿卡替尼在DLBCL OCI-LY19小鼠异种移植瘤模型中对肿瘤体积的影响(图4A)以及化合物6联合阿卡替尼在DLBCL OCI-LY19小鼠异种移植瘤模型中对体重的影响(图4B)。

图5显示化合物72联合依鲁替尼在人FL DOHH-2小鼠异种移植瘤模型中对肿瘤体积的影响(图5A)以及化合物72联合依鲁替尼在人FL DOHH-2小鼠异种移植瘤模型中对体重的影响 (图5B)。

图6显示化合物72联合依鲁替尼或阿卡替尼在人FL DOHH2 小鼠异种移植瘤模型中对肿瘤体积的影响(图6A)以及化合物 72联合依鲁替尼或阿卡替尼在人FL DOHH2小鼠异种移植瘤模型中对体重的影响(图6B)。

图7显示化合物72联合依鲁替尼或阿卡替尼在人MCL Z138 小鼠异种移植瘤模型中对肿瘤体积的影响(图7A)以及化合物 72联合依鲁替尼或阿卡替尼在人MCL Z138小鼠异种移植瘤模型中对体重的影响(图7B)。

图8显示化合物72及其代谢(化合物88)物诱导 NK/TCL细胞SNK-6中的凋亡。

图9显示化合物72诱导NK/TCL细胞SNK-6的 CASPASE-3和PARP-1裂解(图9A)；IP检测化合物72抑制 BCL-XL与BAK或BAX的结合(图9B)。

图10化合物72或其代谢物(化合物88)分别与西达本胺、APG-115、吉西他滨、门冬酰胺酶和托法替尼的联合用药对NK/TCL细胞SNK-6的影响。

图11化合物72及其代谢物(化合物88)或ABT-263在人 NK/TCL细胞SNK-6异种移植瘤模型中对肿瘤体积的影响(图 11A)和对体重的影响(图11B)。

图12化合物72与西达本胺或APG-115联合用药在 NK/TCL细胞SNK-6异种移植瘤模型中对肿瘤体积的影响(图 12A)和对体重的影响(图12B)以及化合物72与西达本胺或APG-115联合用药在NK/TCL细胞SNK-6异种移植瘤模型中的抗肿瘤作用(图12C)。

发明详述

定义

在本文中使用的术语“BTK抑制剂”是指抑制BTK酶活性的物质、或降解BTK酶的物质、或降低BTK酶水平的基因工具。

在本文中使用的术语“耐药”在本申请中是指对治疗剂(例如BTK抑制剂)产生抗性或者不响应。例如，即使接受治疗剂的治疗，肿瘤细胞的数量仍然增加。

在本文中使用的术语“药学上可接受的盐”是指游离酸或游离碱的盐，通常通过将游离碱与合适的有机或无机酸反应或者通过将酸与合适的有机或无机碱反应而进行制备。该术语可以用于本发明中的任何化合物。代表性的盐包括：乙酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、硫酸氢盐、酒石酸氢盐、硼酸盐、溴化物、依地酸钙盐、樟脑磺酸盐、碳酸盐、氯化物、克拉维酸盐、柠檬酸盐、二盐酸盐、依地酸盐、乙二磺酸盐、丙酸酯月桂硫酸盐(estolate)、乙磺酸盐(esylate)、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡萄糖酸盐、谷氨酸盐、甘苯砷酸盐(glycollylarsanilate)、己基间苯二酚酸盐(hexylresorcinate)、哈胺盐 (hydrabamine)、氢溴酸盐、盐酸盐、羟萘酸盐、碘化物、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、月桂酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲溴酸盐、甲硝酸盐、甲硫酸盐、马来酸单钾盐、粘酸盐(Mucate)、萘磺酸盐、硝酸盐、N-甲葡萄糖胺盐、草酸盐、巴莫酸盐(双羟萘酸盐)、棕榈酸盐、泛酸盐、磷酸盐/二磷酸盐、聚半乳糖醛酸盐、钾盐、水杨酸盐、钠盐、硬脂酸盐、次乙酸盐、琥珀酸盐、丹宁酸盐、酒石酸盐、茶氯酸盐、对甲苯磺酸盐、三乙基碘盐(triethiodide)、三甲胺盐和戊酸盐。当酸性取代基存在时，例如-COOH，可以形成铵盐、吗啉盐、钠盐、钾盐、钡盐、钙盐等以供剂型使用。当碱性基团存在时(例如在柠檬苦素类化合物或1，1-二甲基双胍中)，例如氨基或碱性杂芳基如吡啶基，可形成酸性盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐、三氟乙酸盐、三氯乙酸盐、乙酸盐、草酸盐、马来酸盐、丙酮酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、富马酸盐、扁桃酸盐、苯甲酸盐、肉桂酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苦味酸盐等。

在本文使用的术语“预防”是指当用于疾病或病症(例如癌症)时，与未施用化合物或药物(例如，本申请要求保护的组合产品)的受试者相比，所述化合物或药物能降低受试者体内的医学病症症状的频率或推迟其发病。

在本文中使用的术语“治疗”是指减轻、缓解或改善疾病或病症的症状，改善潜在的代谢引起的的症状，抑制疾病或症状，例如阻止疾病或病症的房展、缓解疾病或病症、引起疾病或病症的消退、缓解疾病或病症引起的病况、或阻止疾病或病症的症状。

在本文中使用的术语“癌症”是指由异常的不受控制的细胞生长引起的新生物或肿瘤。非限制性的例子包括那些在发明详述中所描述的示例性癌症。术语“癌症”包括同时涉及恶化前癌细胞和恶性癌细胞的疾病。

在本文中使用的术语“溶剂化物”是本发明所涉及的化合物与溶剂分子的组合、物理结合、和/或溶剂合，例如二溶剂化物、单溶剂化物、半溶剂化物。本发明涉及的化合物可以以与例如水、甲醇、乙醇等药学上可接受溶剂形成溶剂化形式，其不显著影响化合物的药理学活性或毒性且这样可以作为药理学等价物起作用。

在本文中使用的术语“受试者”是指包括人类(例如，患者)和动物(例如，小鼠、大鼠、犬、猫、兔、鸡或猴等)。当受试者是人类患者时(通常体重按60kg来计算)时，除非另有说明，本发明所述的剂量可采用与实验动物的转换因子(例如，人用剂量＝小鼠剂量/12.3)进行换算得到(请参考Kin Tam.“Estimating the“First in human”dose-a revisit withparticular emphasis on oncology drugs,ADMET&DMPK 1(4)(2013)63-75)。本领域的普通技术人员能够根据一般常识，根据受试者的具体体重、疾病的种类和严重程度以及其它因素对所述剂量进行合理调整，这些调整的技术方案均落入本发明要求保护的技术方案的范围之内。

在本文中使用的术语“有效量”或“预防和/或治疗有效量”是指施用的药物或化合物的足够量(例如，剂量)，其将在一定程度上减轻被治疗的疾病或病症的一种或多种症状。结果可以是缩小和/或减轻病症或疾病原因或任意其它期望的生物系统的改变。例如，用于治疗用途的“有效量”是提供以使疾病或病症的临床症状显著减轻、而不产生过度的毒副作用的化合物或药物(例如，本申请要求保护的组合产品)的量。

在本文中使用的术语“剂量”是指每千克(kg)受试者体重的活性物质的重量(例如，毫克(mg))。

在本文中使用的术语“IC₅₀”是指在测量这样的效应的试验中获得最大效应的50％抑制，例如BCL-2或BTK的抑制的特定测试化合物或药物的量、浓度或剂量。

在本文中使用的术语“室温”是指25℃±1℃。同时，若没有具体指明实验温度，均为室温。

在本文中使用的术语“约”是指该术语所修饰的数值的±10％，更优选为±5％，最优选为±2％，因此本领域的普通技术人员能够清楚地根据所修饰的数值确定术语“约”的范围。

在本文中使用的术语“选自…”包括该术语中所限定的要素的一种或多种。例如，“选自要素A、要素B和要素C”可以包括“选自要素A、要素B和要素C中的一种”和“选自要素A、要素B和要素C中的多种”。

在本文中使用的术语“依鲁替尼”是具有下述结构的化合物：

在本文中使用的术语“阿卡替尼((Acalabrutinib(ACP- 196)))”是具有下述结构的化合物：

在本文中使用的术语“泽布替尼(BGB3111)”是具有下述结构的化合物：

在本文中使用的术语“APG-115”是具有下述结构的化合物：

在本发明的第一方面涉及一种组合产品，所述组合产品包含Bcl-2抑制剂和另外的药剂，或由它们组成。在本发明的第一方面涉及一种组合产品，所述组合产品包含Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和另外的药剂，或由它们组成。在一些实施方式中，所述另外的药剂选自BTK抑制剂、HDAC抑制剂、MDM2抑制剂、JAK抑制剂、抗代谢药和酶中的一种或多种。

在本发明的另一方面涉及一种在所需的受试者中治疗疾病 (例如癌症、自身免疫性疾病和炎性疾病)的方法，包括对所述受试者给予包含治疗有效量的Bcl-2抑制剂或Bcl-2/Bcl-xL抑制剂的组合产品，其中所述受试者对BTK抑制剂不响应或者耐药。在某些实施方式中，所述受试者对依鲁替尼 (Ibrutinib)、ICP-022、阿卡替尼(Acalabrutinib)、泽布替尼(BGB3111)、ONO/GS-4059、Spebrutinib(CC-292或 AVL-292)、CNX-774、Olmutinib(HM61713，BI1482694)、 M7583、HM71224、PCI-32765外消旋体(PCI-32765 Racemate)、GDC-0853、ONO-4059、赞鲁替尼 (Zanubrutinib)、RN486、PCI-32765、CGI-1746、QL47、 LFM-A13、(±)-赞鲁替尼((±)-Zanubrutinib)、SNS-062、 BMS-935177、BMS-986195、PCI29732、Btk抑制剂2、 Evobrutinib、依鲁替尼-生物素(Ibrutinib-biotin)、BMX-IN- 1、GDC-0834和CB1763不响应或者耐药。在某些实施方式中，所述受试者对依鲁替尼不响应或者耐药。

在一些实施方式中，所述Bcl-2抑制剂选自下述化合物或其药学上可接受的盐或其溶剂化物：

(有时简称为“化合物6”)。

在一些实施方式中，所述Bcl-2抑制剂选自下述化合物或其药学上可接受的盐或其溶剂化物：

(有时简称为“化合物3”)。

在一些实施方式中，所述Bcl-2抑制剂选自下述化合物或其药学上可接受的盐或其溶剂化物：

(有时简称为“化合物13”)。

在一些实施方式中，所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂为(R)-2-(1-(3- (4-(N-(4-(4-(3-(2-(4-氯苯基)-1-异丙基-5-甲基-4-(甲基磺酰基)- 1H-吡咯-3-基)-5-氟苯基)哌嗪-1-基)苯基)氨磺酰基)-2-(三氟甲基磺酰基)苯基氨基)-4-(苯基硫代)丁基)哌啶-4-羰基氧基)乙基膦酸 (有时简称为“化合物72”)或其药学上可接受的盐或溶剂化物，如下述结构式表示：

化合物72以高亲和力与Bcl-2，Bcl-xL，Bcl-w蛋白选择性结合，其IC50分别为1.6nM、4.4nM、9.3nM。化合物72能与 Mcl-1微弱结合。化合物72通过化学结构修饰在血液循环中有效地降低了第一代BCL-2抑制剂的血小板毒性缺陷，但是又能够在组织里获得特异酶的激活来有效地杀死肿瘤细胞。其血小板毒性减少了10-30倍，但是活性是第一代BCL-2抑制剂的10倍左右。化合物88是化合物72的活性代谢产物。化合物72是第二代新靶点BCL-2蛋白抑制剂。

本发明的Bcl-2/Bcl-xL抑制剂还可以优选为(R)-1-(3-(4-(N- (4-(4-(3-(2-(4-氯苯基)-1-异丙基-5-甲基-4-(甲基磺酰基)-1H-吡咯- 3-基)-5-氟苯基)哌嗪-1-基)苯基)-氨磺酰基)-2-(三氟甲基磺酰基) 苯氨基)-4-(苯基硫基)丁基)哌啶-4-甲酸(有时简称为“化合物 88”)或其药学上可接受的盐，如下述结构式表示：

可以根据WO2014/113413A1中描述的方法来合成本发明药物组合物中的上述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂。

在一些实施方式中，所述BTK抑制剂选自：依鲁替尼 (Ibrutinib)、ICP-022、阿卡替尼(Acalabrutinib(ACP- 196))、泽布替尼(BGB3111)、ONO/GS-4059、Spebrutinib (CC-292或AVL-292)、CNX-774、Olmutinib(HM61713， BI1482694)、M7583、HM71224、PCI-32765外消旋体(PCI- 32765Racemate)、GDC-0853、ONO-4059、赞鲁替尼 (Zanubrutinib)、RN486、PCI-32765、CGI-1746、QL47、 LFM-A13、(±)-赞鲁替尼((±)-Zanubrutinib)、SNS-062、BMS-935177、BMS-986195、PCI29732、Btk抑制剂2、 Evobrutinib、依鲁替尼-生物素(Ibrutinib-biotin)、BMX-IN- 1、GDC-0834和CB1763。进一步地，所述BTK抑制剂选自：依鲁替尼(Ibrutinib)、阿卡替尼(Acalabrutinib(ACP- 196))和泽布替尼(BGB3111)。

在一些实施方式中，所述HDAC抑制剂选自西达本胺。

在一些实施方式中，所述MDM2抑制剂选自APG-115。

在一些实施方式中，所述JAK抑制剂选自托法替尼。

在一些实施方式中，所述抗代谢药选自吉西他滨。

在一些实施方式中，所述酶选自门冬酰胺酶。

在一些实施方式中，所述组合产品呈药物组合物的形式。

在一些实施方式中，所述Bcl-2抑制剂和所述另外的药剂各自呈单独的制剂形式，或所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和所述另外的药剂各自呈单独的制剂形式。

在一些实施方式中，所述Bcl-2抑制剂和所述另外的药剂同时或先后施用，或其中所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和所述另外的药剂同时或先后施用。

在一些实施方式中，所述Bcl-2抑制剂或Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和所述另外的药剂先后施用的时间间隔可为约1分钟、约5 分钟、约10分钟、约15分钟、约30分钟、约45分钟、约1 小时、约2小时、约4小时、约6小时、约12小时、约24小时、约48小时、约72小时、约96小时、约1周、约2周、约 3周、约4周、约5周、约6周、约8周、或约12周。

在一些实施方式中，可以根据需要，将所述呈药物组合物的形式(优选地，各自呈单独的剂量单元形式)的含有所述 Bcl-2抑制剂或Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和所述另外的药剂的本发明的组合产品，每天施用包括但不限于：1次、2次、3次、4 次、5次或6次。

在一些实施方式中，可以根据需要，将所述呈药物组合物的形式(优选地，剂量单元形式)的含有所述Bcl-2抑制剂或 Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和所述另外的药剂的本发明的组合产品，每天施用包括但不限于：1次、2次、3次、4次、5次或6次。

在一些实施方式中，所述组合产品可以通过下述方式施用：口服、口腔、吸入喷雾、舌下、直肠、透皮、阴道粘膜、透黏膜、局部给药，鼻或肠道给药；注射给药，如肌肉注射、皮下注射、髓内注射，以及鞘内、脑部直接给药、原位给药、皮下、腹腔内、静脉注射、关节内滑膜、胸骨内、肝内、病灶内，颅内、腹腔、鼻腔、或眼内注射或其他药物递送方式。

在一些实施方式中，所述Bcl-2抑制剂或其药学上可接受的盐或溶剂化物以约0.0025-1500mg/日的量给药。优选地，所述 Bcl-2抑制剂的每日给药量是1mg、5mg、10mg、20mg、 30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、 150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg、 460mg、470mg、480mg、487mg、490mg、500mg、550mg、 600mg、650mg、700mg、750mg、800mg、850mg、900mg、 950mg、1000mg，以及所述各量之间的范围，例如，1mg-1000mg、30mg-900mg、30mg-800mg、30mg-900mg、30mg- 800mg、30mg-700mg、30mg-600mg、30mg-500mg、30mg- 490mg、30mg-487mg等，且所述另外的药剂或其药学上可接受的盐或溶剂化物以约0.0025-1000mg/日的量给药。

在某些实施方式中，所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂可以以约 0.005-约500mg/日、优选约0.05-约365mg/日、优选约0.05-约317mg/日、优选约0.05-约250mg/日、更优选约0.5-约100mg/ 日的量给药。在某些实施方式中，所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂以约10mg/周至约1000mg/周、约10mg/周至约900mg/周、约 10mg/周至约800mg/周、约10mg/周至约700mg/周、约10 mg/周至约640mg/周、约10mg/周至约600mg/周、约10mg/ 周至约500mg/周、约10mg/周至约400mg/周、约10mg/周至约300mg/周、约10mg/周至约200mg/周、或约20mg/周至约100mg/周的量，例如约10、15、20、25、30、35、40、50、 55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、 250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、 800、850、900、950、1000mg/周的量给药，且所述另外的药剂或其药学上可接受的盐或溶剂化物以约0.0025-1000mg/日的量给药。在某些实施方式中，所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂以每剂量约0.005、0.05、0.5、5、10、20、30、40、50、100、150、 200、250、300、350、400、450或500毫克的量给药。在某些实施方式中，所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂以每周一次、每周两次、每周三次、每周四次、每周五次、每周六次、每周七次的频率给药。

优选地，所述另外的药剂的每日给药量是10mg、20mg、 30mg、40mg、50mg、61mg、70mg、73mg、80mg、90mg、 97.6mg、100mg、122mg、150mg、200mg、250mg、300mg、 350mg、400mg、450mg、460mg、470mg、480mg、487mg、 490mg、500mg，550mg、600mg、650mg、700mg、750mg、800mg、850mg、900mg、950mg、1000mg，以及所述各量之间的范围，例如，10mg-1000mg、20mg-950mg、30mg- 900mg、50mg-650mg、61mg-600mg、70mg-450mg、73mg- 400mg、73mg-550mg、73mg-522mg、97.6mg-600mg、97.6mg- 600mg、97.6mg-700mg、97.6mg-800mg、97.6mg-950mg、122mg-500mg、122mg-600mg、122mg-700mg、122mg- 800mg、97.6mg-900mg、73mg-1000mg等。

在一些实施方式中，所述组合产品还包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

在一些实施方式中，所述组合产品呈片剂、胶囊剂、颗粒剂、糖浆剂、粉剂、锭剂、药囊、扁囊剂、酏剂、混悬剂、乳剂、溶液、糖浆剂、气雾剂、软膏剂、乳膏剂或注射剂的形式。

在本发明的第二方面涉及包含Bcl-2抑制剂和另外的药剂，或Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和另外的药剂的组合产品在制备用于预防和/或治疗疾病的药物中的用途，所述疾病选自癌症、自身免疫性疾病和炎性疾病。在一些实施方式中，所述疾病对BTK抑制剂不响应或者耐药。在一些实施方式中，所述疾病对依鲁替尼(Ibrutinib)、ICP-022、阿卡替尼(Acalabrutinib)、泽布替尼(BGB3111)、ONO/GS-4059、Spebrutinib(CC-292或 AVL-292)、CNX-774、Olmutinib(HM61713，BI1482694)、 M7583、HM71224、PCI-32765外消旋体(PCI-32765 Racemate)、GDC-0853、ONO-4059、赞鲁替尼 (Zanubrutinib)、RN486、PCI-32765、CGI-1746、QL47、 LFM-A13、(±)-赞鲁替尼((±)-Zanubrutinib)、SNS-062、 BMS-935177、BMS-986195、PCI29732、Btk抑制剂2、 Evobrutinib、依鲁替尼-生物素(Ibrutinib-biotin)、BMX-IN- 1、GDC-0834和CB1763不响应或者耐药。在某些实施方式中，所述疾病对依鲁替尼不响应或者耐药。

在一些实施方式中，所述Bcl-2抑制剂是化合物6或其药学上可接受的盐或溶剂化物。

在一些实施方式中，所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂是化合物72 或化合物88或其药学上可接受的盐或溶剂化物。

在一些实施方式中，所述另外的药剂选自BTK抑制剂、 HDAC抑制剂、MDM2抑制剂、JAK抑制剂、抗代谢药和酶中的一种或多种。

在一些实施方式中，所述BTK抑制剂选自：依鲁替尼 (Ibrutinib)、ICP-022、阿卡替尼(Acalabrutinib)、泽布替尼(BGB3111)、ONO/GS-4059、Spebrutinib(CC-292或AVL-292)、CNX-774、Olmutinib(HM61713，BI1482694)、 M7583、HM71224、PCI-32765外消旋体(PCI-32765 Racemate)、GDC-0853、ONO-4059、赞鲁替尼 (Zanubrutinib)、RN486、PCI-32765、CGI-1746、QL47、 LFM-A13、(±)-赞鲁替尼((±)-Zanubrutinib)、SNS-062、 BMS-935177、BMS-986195、PCI29732、Btk抑制剂2、 Evobrutinib、依鲁替尼-生物素(Ibrutinib-biotin)、BMX-IN- 1、GDC-0834和CB1763。优选地，所述BTK抑制剂选自：依鲁替尼(Ibrutinib)、阿卡替尼(Acalabrutinib)和泽布替尼 (BGB3111)。

在一些实施方式中，所述HDAC抑制剂选自西达本胺。

在一些实施方式中，所述MDM2抑制剂选自APG-115。

在一些实施方式中，所述JAK抑制剂选自托法替尼。

在一些实施方式中，所述抗代谢药选自吉西他滨。

在一些实施方式中，所述酶选自门冬酰胺酶。

在一些实施方式中，所述药物呈药物组合物的形式。

在一些实施方式中，所述Bcl-2抑制剂和所述另外的药剂各自呈单独的制剂形式，或者所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和所述另外的药剂各自呈单独的制剂形式。

在一些实施方式中，所述Bcl-2抑制剂和所述另外的药剂同时或先后施用，或者所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和所述另外的药剂同时或先后施用。

在一些实施方式中，所述Bcl-2抑制剂或Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和所述另外的药剂先后施用的时间间隔可为约1分钟、约5 分钟、约10分钟、约15分钟、约30分钟、约45分钟、约1 小时、约2小时、约4小时、约6小时、约12小时、约24小时、约48小时、约72小时、约96小时、约1周、约2周、约 3周、约4周、约5周、约6周、约8周、或约12周。

在一些实施方式中，可以根据需要，将所述呈药物组合物的形式(优选地，各自呈单独的剂量单元形式)的含有所述 Bcl-2抑制剂或Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和所述另外的药剂的本发明的药物，每天施用包括但不限于：1次、2次、3次、4次、5次或6次。

在一些实施方式中，可以根据需要，将所述呈药物组合物的形式(优选地，剂量单元形式)的含有所述Bcl-2抑制剂或 Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和所述另外的药剂的本发明的药物，每天施用包括但不限于：1次、2次、3次、4次、5次或6次。

在一些实施方式中，所述药物可以通过下述方式施用：口服、口腔、吸入喷雾、舌下、直肠、透皮、阴道粘膜、透黏膜、局部给药，鼻或肠道给药；注射给药，如肌肉注射、皮下注射、髓内注射，以及鞘内、脑部直接给药、原位给药、皮下、腹腔内、静脉注射、关节内滑膜、胸骨内、肝内、病灶内，颅内、腹腔、鼻腔、或眼内注射或其他药物递送方式。

在一些实施方式中，所述Bcl-2抑制剂或Bcl-2/Bcl-xL抑制剂或其药学上可接受的盐或溶剂化物以及所述另外的药剂或其药学上可接受的盐或溶剂化物的每日给药量如在上述发明详述中的本发明第一方面所述。

在一些实施方式中，所述疾病是癌症。在一些实施方式中，所述癌症对BTK抑制剂不响应或者耐药。在一些实施方式中，所述癌症对依鲁替尼(Ibrutinib)、ICP-022、阿卡替尼 (Acalabrutinib)、泽布替尼(BGB3111)、ONO/GS-4059、Spebrutinib(CC-292或AVL-292)、CNX-774、Olmutinib (HM61713，BI1482694)、M7583、HM71224、PCI-32765外消旋体(PCI-32765Racemate)、GDC-0853、ONO-4059、赞鲁替尼(Zanubrutinib)、RN486、PCI-32765、CGI-1746、 QL47、LFM-A13、(±)-赞鲁替尼((±)-Zanubrutinib)、SNS- 062、BMS-935177、BMS-986195、PCI29732、Btk抑制剂2、 Evobrutinib、依鲁替尼-生物素(Ibrutinib-biotin)、BMX-IN- 1、GDC-0834和CB1763不响应或者耐药。在某些实施方式中，所述癌症对依鲁替尼不响应或者耐药。

进一步地，在本发明中所述的癌症包括但不限于选自下述的癌症：肾上腺癌、淋巴上皮瘤、腺样细胞癌、淋巴瘤、听神经瘤、急性淋巴细胞白血病、肢端黑色素瘤、急性髓系白血病、肢端汗腺瘤、慢性淋巴细胞白血病、急性嗜酸粒细胞白血病、肝癌、急性红细胞白血病、小细胞肺癌、急性淋巴细胞白血病、非小细胞肺癌、急性巨核细胞白血病、MALT淋巴瘤、急性单核细胞白血病、恶性纤维组织细胞瘤、急性早幼粒细胞白血病、恶性外周神经鞘瘤、腺癌、恶性海马肿瘤、腺样囊性癌、套细胞淋巴瘤、腺瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、腺瘤样牙源性肿瘤、肥大细胞白血病、腺鳞癌、纵隔生殖细胞肿瘤、脂肪组织肿瘤、乳腺髓样癌、肾上腺皮质癌、甲状腺髓样癌、成人 T细胞白血病/淋巴瘤、成神经管细胞瘤、侵袭性NK细胞白血病、黑色素瘤、艾滋病相关淋巴瘤、脑膜瘤、肺泡横纹肌肉瘤、默克尔细胞癌、肺泡软组织肉瘤、间皮瘤、成釉细胞瘤、转移性尿路上皮癌、间变性大细胞淋巴瘤、混合苗勒氏肿瘤、甲状腺未分化癌、粘液性肿瘤、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、血管平滑肌脂肪瘤、肌肉组织肿瘤、血管肉瘤、蕈样真菌病、星形细胞瘤、粘液样脂肪肉瘤、非典型畸形性横纹肌样瘤、粘液瘤、B细胞慢性淋巴细胞白血病、粘液肉瘤、B细胞幼淋巴细胞白血病、鼻咽癌、B细胞淋巴瘤、神经鞘瘤、基底细胞癌、神经母细胞瘤、胆道癌、神经纤维瘤、膀胱癌、神经瘤、胚细胞瘤、结节性黑色素瘤、骨癌、眼癌、布伦纳瘤、少突细胞瘤、褐色肿瘤、少突神经胶质瘤、伯基特氏淋巴瘤、嗜酸细胞瘤乳腺癌、鞘膜脑膜瘤、脑癌、视神经肿瘤癌、口腔癌原位癌、骨肉瘤、癌肉瘤、卵巢癌、软骨肿瘤、肺上沟瘤、水泥瘤、乳头状甲状腺癌、骨髓瘤、副神经节瘤、软骨瘤、松果体母细胞瘤、脊索瘤、松果细胞瘤、绒毛膜癌、垂体瘤、脉络丛乳头状瘤、垂体腺瘤、肾透明细胞肉瘤、垂体瘤、颅咽管瘤、浆细胞瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、多胚胎瘤、宫颈癌、前驱体T淋巴母细胞淋巴瘤、结直肠癌、原发性中枢神经系统淋巴瘤、德戈斯病、原发性积液淋巴瘤、增生性小圆细胞瘤、原发性腹膜癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、前列腺癌、胚胎发育不良的神经上皮肿瘤、胰腺癌、无性细胞瘤、咽癌、胚胎癌、腹膜假粘液瘤、内分泌腺肿瘤、肾细胞癌、内胚窦瘤、肾髓样癌、肠病相关的T细胞淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、食道癌、横纹肌瘤、胎中胎、横纹肌肉瘤、纤维瘤、Richter’s征转化、纤维肉瘤、直肠癌、滤泡性淋巴瘤、肉瘤、滤泡性甲状腺癌、神经鞘瘤病、神经节细胞瘤、精原细胞瘤、胃肠癌、支持细胞瘤、生殖细胞肿瘤、性索-性腺间质瘤、妊娠绒毛膜癌、印戒细胞癌、巨细胞成纤维细胞瘤、皮肤癌、骨巨细胞瘤、小蓝圆细胞瘤、胶质瘤、小细胞癌、多形性胶质母细胞瘤、软组织肉瘤、胶质瘤、生长抑素瘤、胶质瘤病、煤烟疣、胰高血糖素瘤、脊柱肿瘤、性腺母细胞瘤、脾边缘区淋巴瘤、颗粒细胞瘤、鳞状细胞癌、雌激素瘤、滑膜肉瘤、胆囊癌、Sezary疾病、胃癌、小肠癌、毛细胞白血病、鳞状细胞癌、血管母细胞瘤、胃癌、头颈癌、T细胞淋巴瘤、血管外皮细胞瘤、睾丸癌、血液系统恶性肿瘤、肉瘤肝母细胞瘤、甲状腺癌、肝脾T 细胞淋巴瘤、移行细胞癌、霍奇金淋巴瘤、喉癌、非霍奇金淋巴瘤、脐尿管癌、浸润性小叶癌、泌尿生殖系统癌、肠癌、尿路上皮癌、肾癌、葡萄膜黑色素瘤、喉癌、子宫癌、恶性雀斑样痣、疣状癌、致死性中线癌、视觉通路胶质瘤、白血病、外阴癌、睾丸间质细胞瘤、阴道癌、脂肪肉瘤、瓦尔登斯特伦的巨球蛋白血症(Waldenstrom macroglobulinemia，WM)、肺癌、腺淋巴瘤、淋巴管瘤、肾母细胞瘤和淋巴管肉瘤。

优选地，所述癌症选自：急性单核细胞白血病、急性髓性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病混合谱系白血病、NUT中线癌、多发性骨髓瘤、小细胞肺癌、神经母细胞瘤、伯基特淋巴瘤、宫颈癌、食管癌、卵巢癌、结直肠癌症、前列腺癌和乳腺癌。

优选地，所述癌症是恶性血液病。

更优选地，所述恶性血液病选自：急性髓细胞性白血病 (AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)/小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、边缘区淋巴瘤 (MZL)、慢性骨髓性白血病(CML)、套细胞淋巴瘤 (MCL)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(WM)、多发性骨髓瘤(MM)、T幼淋巴细胞白血病(T-PLL)、小细胞肺癌 (SCLC)和NK/T细胞淋巴瘤。更优选地，所述恶性血液病选自弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤(FL) 和NK/T细胞淋巴瘤。

优选地，所述癌症是B细胞增生性疾病。更优选地，所述 B细胞增生性疾病选自：弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、慢性淋巴细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、B细胞前淋巴细胞性白血病、淋巴浆细胞淋巴瘤/瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(

macroglobulinemia)、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞性骨髓瘤、浆细胞瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、淋巴结边缘区B细胞淋巴瘤、外套细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkittlymphoma)/白血病和淋巴瘤样肉芽肿病。

在一些实施方式中，所述疾病是自身免疫疾病。在一些实施方式中，所述自身免疫疾病对BTK抑制剂不响应或者耐药。在某些实施方式中，所述受试者对依鲁替尼(Ibrutinib)、 ICP-022、阿卡替尼(Acalabrutinib)、泽布替尼 (BGB3111)、ONO/GS-4059、Spebrutinib(CC-292或AVL- 292)、CNX-774、Olmutinib(HM61713，BI1482694)、 M7583、HM71224、PCI-32765外消旋体(PCI-32765 Racemate)、GDC-0853、ONO-4059、赞鲁替尼(Zanubrutinib)、RN486、PCI-32765、CGI-1746、QL47、 LFM-A13、(±)-赞鲁替尼((±)-Zanubrutinib)、SNS-062、 BMS-935177、BMS-986195、PCI29732、Btk抑制剂2、Evobrutinib、依鲁替尼-生物素(Ibrutinib-biotin)、BMX-IN- 1、GDC-0834和CB1763不响应或者耐药。在某些实施方式中，所述自身免疫疾病对依鲁替尼不响应或者耐药。

进一步地，在本发明中所述的自身免疫疾病包括但不限于选自下述的自身免疫疾病：炎性肠病、关节炎、狼疮、类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、骨关节炎、斯蒂尔病(Still’s disease)、青少年关节炎、糖尿病、重症肌无力症、桥本甲状腺炎(Hashimoto′sthyroiditis)、奥德甲状腺炎 (Ord′s thyroiditis)、格雷夫斯病(Graves′disease)、类风湿性关节炎综合征(

syndrome)、多发性硬化症、传染性神经元炎(Guillain-Barrésyndrome)、急性播散性脑脊髓炎、阿狄森病(Addison′s disease)、视性眼阵挛-肌阵挛综合征、强直性脊椎炎、抗磷脂抗体综合征、再生障碍性贫血、自身免疫性肝炎、乳糜泻(coeliac disease)、古德帕斯彻综合征 (Goodpasture′s syndrome)、特发性血小板减少性紫癜、视神经炎、硬皮病、原发性胆汁性肝硬化、莱特尔综合征(Reiter′s syndrome)、高安动脉炎(Takayasu′s arteritis)、颞动脉炎、温型自身免疫性溶血性贫血、韦格纳肉芽肿病 (Wegener′sgranulomatosis)、银屑病、全身脱毛、贝赫切特病、慢性疲劳、家族性自主神经功能异常、子宫内膜异位、间质性膀胱炎、神经肌强直和外阴痛。

在一些实施方式中，所述疾病是炎性疾病。在一些实施方式中，所述炎性疾病对BTK抑制剂不响应或者耐药。在某些实施方式中，所述受试者对依鲁替尼(Ibrutinib)、ICP-022、阿卡替尼(Acalabrutinib)、泽布替尼(BGB3111)、ONO/GS- 4059、Spebrutinib(CC-292或AVL-292)、CNX-774、Olmutinib(HM61713，BI1482694)、M7583、HM71224、PCI- 32765外消旋体(PCI-32765Racemate)、GDC-0853、ONO- 4059、赞鲁替尼(Zanubrutinib)、RN486、PCI-32765、CGI- 1746、QL47、LFM-A13、(±)-赞鲁替尼((±)- Zanubrutinib)、SNS-062、BMS-935177、BMS-986195、 PCI29732、Btk抑制剂2、Evobrutinib、依鲁替尼-生物素(Ibrutinib-biotin)、BMX-IN-1、GDC-0834和CB1763不响应或者耐药。在某些实施方式中，所述炎性疾病对依鲁替尼不响应或者耐药。

进一步地，在本发明中所述的炎性疾病包括但不限于选自下述的炎性疾病：哮喘、阑尾炎、睑炎、细支气管炎、支气管炎、粘液囊炎、宫颈炎、胆管炎、胆囊炎、结肠炎、结膜炎、膀胱炎、泪腺炎、皮炎、皮肌炎、脑炎、心内膜炎、子宫内膜炎、肠炎、小肠结肠炎、上髁炎、附睾炎、筋膜炎、纤维织炎、胃炎、胃肠炎、肝炎、化脓性汗腺炎、喉炎、乳腺炎、脑膜炎、脊髓炎心肌炎、肌炎、肾炎、卵巢炎、睾丸炎、骨炎、耳炎、胰腺炎、腮腺炎、心包炎、腹膜炎、咽炎、胸膜炎、静脉炎、局限性肺炎(pneumonitis)、肺炎(pneumonia)、直肠炎、前列腺炎、肾盂肾炎、鼻炎、输卵管炎、鼻窦炎、口腔炎、滑膜炎、腱炎、扁桃腺炎、葡萄膜炎、阴道炎、血管炎或外阴炎。

在本发明的第三方面涉及一种用于预防和/或治疗疾病的组合产品，所述组合产品包含Bcl-2抑制剂或Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和所述另外的药剂，所述疾病选自癌症、自身免疫性疾病和炎性疾病。进一步地，所述癌症、自身免疫性疾病和炎性疾病包括但不限于如在上述发明详述中本发明的第二方面所述的那些癌症、自身免疫性疾病和炎性疾病。进一步地，所述疾病对 BTK抑制剂(例如依鲁替尼)不响应或者耐药。

在一些实施方式中，所述Bcl-2抑制剂是化合物6或其药学上可接受的盐或溶剂化物。

在一些实施方式中，所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂是化合物72 或化合物88或其药学上可接受的盐或溶剂化物。

在一些实施方式中，所述另外的药剂选自BTK抑制剂、 HDAC抑制剂、MDM2抑制剂、JAK抑制剂、抗代谢药和酶中的一种或多种。在一些实施方式中，所述BTK抑制剂选自：依鲁替尼(Ibrutinib)、ICP-022、阿卡替尼 (Acalabrutinib)、泽布替尼(BGB3111)、ONO/GS-4059、 Spebrutinib(CC-292或AVL-292)、CNX-774、Olmutinib (HM61713，BI1482694)、M7583、HM71224、PCI-32765外消旋体(PCI-32765Racemate)、GDC-0853、ONO-4059、赞鲁替尼(Zanubrutinib)、RN486、PCI-32765、CGI-1746、 QL47、LFM-A13、(±)-赞鲁替尼((±)-Zanubrutinib)、SNS- 062、BMS-935177、BMS-986195、PCI29732、Btk抑制剂2、Evobrutinib、依鲁替尼-生物素(Ibrutinib-biotin)、BMX-IN- 1、GDC-0834和CB1763。优选地，所述BTK抑制剂选自：依鲁替尼(Ibrutinib)、阿卡替尼(Acalabrutinib)和泽布替尼(BGB3111)。

在一些实施方式中，所述HDAC抑制剂选自西达本胺。

在一些实施方式中，所述MDM2抑制剂选自APG-115。

在一些实施方式中，所述JAK抑制剂选自托法替尼。

在一些实施方式中，所述抗代谢药选自吉西他滨。

在一些实施方式中，所述酶选自门冬酰胺酶。

在一些实施方式中，所述组合产品呈药物组合物的形式。

在一些实施方式中，所述Bcl-2抑制剂和所述另外的药剂各自呈单独的制剂形式，或者所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和所述另外的药剂各自呈单独的制剂形式。

在一些实施方式中，所述Bcl-2抑制剂和所述另外的药剂同时或先后施用，或者所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和所述另外的药剂同时或先后施用。

在一些实施方式中，所述Bcl-2抑制剂或Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和所述另外的药剂先后施用的时间间隔可为约1分钟、约5 分钟、约10分钟、约15分钟、约30分钟、约45分钟、约1 小时、约2小时、约4小时、约6小时、约12小时、约24小时、约48小时、约72小时、约96小时、约1周、约2周、约 3周、约4周、约5周、约6周、约8周、或约12周。

在一些实施方式中，可以根据需要，将所述呈药物组合物的形式(优选地，各自呈单独的剂量单元形式)的含有所述 Bcl-2抑制剂或Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和所述另外的药剂的本发明的组合产品，每天施用包括但不限于：1次、2次、3次、4 次、5次或6次。

在一些实施方式中，可以根据需要，将所述呈药物组合物的形式(优选地，剂量单元形式)的含有所述Bcl-2抑制剂或 Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和所述另外的药剂的本发明的组合产品，每天施用包括但不限于：1次、2次、3次、4次、5次或6次。

在一些实施方式中，所述组合产品可以通过下述方式施用：口服、口腔、吸入喷雾、舌下、直肠、透皮、阴道粘膜、透黏膜、局部给药，鼻或肠道给药；注射给药，如肌肉注射、皮下注射、髓内注射，以及鞘内、脑部直接给药、原位给药、皮下、腹腔内、静脉注射、关节内滑膜、胸骨内、肝内、病灶内，颅内、腹腔、鼻腔、或眼内注射或其他药物递送方式。

在一些实施方式中，所述Bcl-2抑制剂或Bcl-2/Bcl-xL抑制剂或其药学上可接受的盐或溶剂化物以及所述另外的药剂或其药学上可接受的盐或溶剂化物的每日给药量如在上述发明详述中的本发明第一方面所述。

在本发明的第四方面涉及一种预防和/或治疗疾病的方法，包括对有此需要的受试者施用包含预防和/或治疗有效量的Bcl- 2抑制剂和所述另外的药剂，或Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和所述另外的药剂的组合产品，所述疾病选自癌症、自身免疫性疾病和炎性疾病。进一步地，所述癌症、自身免疫性疾病和炎性疾病包括但不限于如在上述发明详述中本发明的第二方面所述的那些癌症、自身免疫性疾病和炎性疾病。进一步地，所述疾病对 BTK抑制剂(例如依鲁替尼)不响应或者耐药。

在一些实施方式中，所述Bcl-2抑制剂是化合物6或其药学上可接受的盐或溶剂化物。

在一些实施方式中，所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂是化合物72 或化合物88或其药学上可接受的盐或溶剂化物。

在一些实施方式中，所述另外的药剂选自BTK抑制剂、 HDAC抑制剂、MDM2抑制剂、JAK抑制剂、抗代谢药和酶中的一种或多种。

在一些实施方式中，所述BTK抑制剂选自：依鲁替尼 (Ibrutinib)、ICP-022、阿卡替尼(Acalabrutinib)、泽布替尼(BGB3111)、ONO/GS-4059、Spebrutinib(CC-292或 AVL-292)、CNX-774、Olmutinib(HM61713，BI1482694)、 M7583、HM71224、PCI-32765外消旋体(PCI-32765 Racemate)、GDC-0853、ONO-4059、赞鲁替尼 (Zanubrutinib)、RN486、PCI-32765、CGI-1746、QL47、LFM-A13、(±)-赞鲁替尼((±)-Zanubrutinib)、SNS-062、 BMS-935177、BMS-986195、PCI29732、Btk抑制剂2、 Evobrutinib、依鲁替尼-生物素(Ibrutinib-biotin)、BMX-IN- 1、GDC-0834和CB1763。优选地，所述BTK抑制剂选自：依鲁替尼(Ibrutinib)、阿卡替尼(Acalabrutinib)和泽布替尼 (BGB3111)。

在一些实施方式中，所述HDAC抑制剂选自西达本胺。

在一些实施方式中，所述MDM2抑制剂选自APG-115。

在一些实施方式中，所述JAK抑制剂选自托法替尼。

在一些实施方式中，所述抗代谢药选自吉西他滨。

在一些实施方式中，所述酶选自门冬酰胺酶。

在一些实施方式中，所述Bcl-2抑制剂和所述另外的药剂呈药物组合物的形式，或所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和所述另外的药剂呈药物组合物的形式。

在一些实施方式中，所述Bcl-2抑制剂和所述另外的药剂各自呈单独的制剂形式，或所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和所述另外的药剂各自呈单独的制剂形式。

在一些实施方式中，所述Bcl-2抑制剂和所述另外的药剂同时或先后施用，或其中所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和所述另外的药剂同时或先后施用。

在一些实施方式中，所述Bcl-2抑制剂或Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和所述另外的药剂先后施用的时间间隔可为约1分钟、约5 分钟、约10分钟、约15分钟、约30分钟、约45分钟、约1 小时、约2小时、约4小时、约6小时、约12小时、约24小时、约48小时、约72小时、约96小时、约1周、约2周、约 3周、约4周、约5周、约6周、约8周、或约12周。

在一些实施方式中，可以根据需要，将所述呈药物组合物的形式(优选地，各自呈单独的剂量单元形式)的所述Bcl-2 抑制剂或Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和所述另外的药剂，每天施用包括但不限于：1次、2次、3次、4次、5次或6次。

在一些实施方式中，可以根据需要，将所述呈药物组合物的形式(优选地，剂量单元形式)的所述Bcl-2抑制剂或Bcl- 2/Bcl-xL抑制剂和所述另外的药剂，每天施用包括但不限于：1 次、2次、3次、4次、5次或6次。

在一些实施方式中，所述Bcl-2抑制剂或Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和所述另外的药剂可以通过下述方式施用：口服、口腔、吸入喷雾、舌下、直肠、透皮、阴道粘膜、透黏膜、局部给药，鼻或肠道给药；注射给药，如肌肉注射、皮下注射、髓内注射，以及鞘内、脑部直接给药、原位给药、皮下、腹腔内、静脉注射、关节内滑膜、胸骨内、肝内、病灶内，颅内、腹腔、鼻腔、或眼内注射或其他药物递送方式。

在一些实施方式中，所述Bcl-2抑制剂每天的施用量是 0.017mg/kg、0.083mg/kg、0.17mg/kg、0.33mg/kg、0.5mg/kg、 0.67mg/kg、0.83mg/kg、1mg/kg、1.16mg/kg、1.33mg/kg、1.5mg/kg、1.67mg/kg、2.5mg/kg、3.33mg/kg、4.17mg/kg、 5mg/kg、5.83mg/kg、6.67mg/kg、7.5mg/kg、7.67mg/kg、 7.83mg/kg、8mg/kg、8.12mg/kg、8.16mg/kg、8.33mg/kg、 9.17mg/kg、10mg/kg、10.83mg/kg、11.66mg/kg、12.5mg/kg、 13.33mg/kg、14.17mg/kg、15mg/kg、15.83mg/kg、16.67mg，以及所述各施用量之间的范围，例如，0.017mg-16.67mg/kg、0.083mg-16.67mg/kg、0.17mg-16.67mg/kg、0.33mg- 16.67mg/kg、0.5mg-15mg/kg、0.5mg-13.33mg/kg、0.5mg- 11.67mg/kg、0.5mg-10mg/kg、0.5mg-8.33mg/kg、0.5mg- 8.16mg/kg、0.5mg-8.12mg/kg等，且所述另外的药剂每天的施用量是0.17mg/kg、0.33mg/kg、0.5mg/kg、0.67mg/kg、 0.83mg/kg、1mg/kg、1.02mg/kg、1.17mg/kg、1.22mg/kg、 1.33mg/kg、1.5mg/kg、1.62mg/kg、1.67mg/kg、2.03mg/kg、2.5mg/kg、3.33mg/kg、4.17mg/kg、5mg/kg、5.83mg/kg、 6.67mg/kg、7.5mg/kg、7.67mg/kg、7.83mg/kg、8mg/kg、 8.17mg/kg、8.33mg/kg，以及所述各量之间的范围，例如， 0.17mg-8.33mg/kg、0.33mg-7.5mg/kg、0.5mg-6.67mg/kg、0.83mg-5.83mg/kg、1mg-5mg/kg、1.02mg-5mg/kg、1.16mg- 4.17mg/kg、1.22mg-3.33mg/kg、1.22mg-2.5mg/kg、1.22mg- 2.03mg/kg、1.62mg-8.33mg/kg、1.62mg-8mg/kg、1.62mg7.5mg/kg、1.62mg-5mg/kg、1.62mg-2.5mg/kg、1.22mg- 1.62mg/kg等。在某些实施方式中，所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂以约10mg/周至约1000mg/周、约10mg/周至约900mg/周、约10mg/周至约800mg/周、约10mg/周至约700mg/周、约10 mg/周至约640mg/周、约10mg/周至约600mg/周、约10mg/ 周至约500mg/周、约10mg/周至约400mg/周、约10mg/周至约300mg/周、约10mg/周至约200mg/周、或约20mg/周至约 100mg/周的量，例如约10、15、20、25、30、35、40、50、 55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、 250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、 800、850、900、950、1000mg/周的量给药。

最后，WO 2018/027097以其整体并为了所有目的通过引用并入本文。

具体实施方式

下面通过具体的实施例、对照例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例、对照例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

实施例1.本发明所使用的实验材料及其来源

(1)实验试剂及其一般配制

依鲁替尼购自Selleck(中国，Cat.S2680)或Aikonchem (中国南京，Cat.2645743)。对于体内研究，依鲁替尼(Selleck)在5％DMSO(Sigma，Cat.D8418)和95％(20％H-β-CD)中配制；对于体外研究，将依鲁替尼溶解于 DMSO中至10mM储备溶液，并在无血清培养基中稀释至指定浓度。

阿卡替尼购自Selleck(中国，Cat.S8116)或Aikonchem (中国南京，Cat.AK2017-11533-001)。对于体内研究，阿卡替尼(Selleck)在5％DMSO(Sigma，Cat.D8418)和95％(20％H-β-CD)中配制；对于体外研究，将阿卡替尼均溶解于 DMSO中至10mM储备溶液，并在无血清培养基中稀释至指定浓度。

泽布替尼购自Aikonchem(中国南京，Cat.2645743)。对于体外研究，将泽布替尼溶解于DMSO中至10mM储备溶液，并在无血清培养基中稀释至指定浓度。

化合物6(R16JA450041-A5s)由Ascentage Pharma(江苏亚盛)合成。将化合物6在10％乙醇(Sinopharma，中国上海，Cat.10009257)，30％聚乙二醇400和60％Phosal 50PG(Lipoid GmbH，德国，Cat.368315-31700201006)中配制用于体内研究。将体外使用的化合物6溶于DMSO至10mM储备溶液，并用无血清培养基稀释至指定浓度。

化合物72(P化合物72-DP-201410B或C13091003- J18001W)由Ascentage Pharma(江苏亚盛)合成。将化合物 72在于预冷的研钵中，将研钵置于冰上以维持低温，加入 10％PEG-400Sigma，St.Louis，MO，Cat.91893-1L-F)研磨至均匀，加入5％Cremophor EL(Sigma，Cat.C5135-500G) 继续研磨至药物在溶液中完全均匀，在溶液中滴加0.1M NaOH(国药集团化学试剂有限公司，Cat.10019718)至溶液澄清，用0.1M HCl(国药集团化学试剂有限公司，Cat. 1011018)调整pH至6-8，用PBS(GENOME，中国杭州，Cat.GNM14190)定容，充分混匀后转移至配药瓶中置于冰上，使用前用0.22μm滤膜过滤，并在1小时内使用。

本发明使用的抗体购自福麦斯(BD，中国)：CD5流式抗体(PE)(Cat.555353)，CD19流式抗体(PE-Cy7)(Cat. 560728)。

APG-115由Ascentage Pharma(江苏亚盛)合成，对于体外研究，将APG-115溶解于DMSO(Sigma，Cat.D8418)中至10mM储备溶液，并在无血清培养基中稀释至指定浓度。

西达本胺购自江苏艾康生物医药研发有限公司(中国，Cat. 1616493-44-7)，对于体外研究，将西达本胺溶解于DMSO (Sigma，Cat.D8418)中至10mM储备溶液，并在无血清培养基中稀释至指定浓度。

托法替尼购自江苏艾康生物医药研发有限公司(中国，Cat. 540737-29-9)，对于体外研究，将托法替尼溶解于DMSO (Sigma，Cat.D8418)中至10mM储备溶液，并在无血清培养基中稀释至指定浓度。

吉西他滨购自大连美仑生物技术有限公司(中国，Cat. 95058-81-4)，对于体外研究，将吉西他滨溶解于DMSO (Sigma，Cat.D8418)中至10mM储备溶液，并在无血清培养基中稀释至指定浓度。

门冬酰胺酶购自上海爱必信生物科技有限公司(中国， Cat.9015-68-3)，对于体外研究，将门冬酰胺酶溶解于PBS (生工生物工程(上海)股份有限公司，Cat.SD8117)中至2000U/ml储备溶液，并在无血清培养基中稀释至指定浓度。

(2)细胞系

人急性淋巴细胞白血病(ALL)Molt-4细胞购自南京科佰，细胞在补充有10％胎牛血清(GIBCO，澳大利亚，Cat. 10099-141)和1％青霉素/链霉素(GENOME，中国杭州，Cat.GNM15140)的RPMI 1640培养基(GIBCO，中国，Cat. C11875500BT)中培养。

人B细胞淋巴瘤细胞系DOHH-2购自南京科佰。人弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系OCI-LY19购自南京科佰，OCI-LY8获自Dajun Yang博士(中山大学癌症中心)。通过STR(短串联重复)分析测试和鉴定所有细胞系。DOHH-2和OCI-LY8 细胞在补充有10％胎牛血清(GIBCO，澳大利亚，Cat.10099- 141)和1％青霉素/链霉素(GENOME，中国杭州，Cat. GNM15140)的RPMI1640培养基(GIBCO，中国，Cat. C11875500BT)中培养。OCI-LY19细胞在含有20％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的alpha-MEM(GIBCO，China，Cat. C12571500BT)培养基中培养。Z-138细胞在含有20％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的IMDM(GIBCO，China，Cat. 12200036)培养基中培养。在37℃在含有5％CO₂和95％空气的加湿培养箱中培养细胞并保持。

原代慢性淋巴细胞白血病(CLL)病人癌细胞来自于与苏州大学医学院的合作项目，根据《赫尔辛基宣言》，通过了苏州大学医学院机构审查委员会审查和批准。在获得患者的知情同意后，采集了符合CLL诊断标准的外周血。采集的血液样本通过Ficoll Paque密度梯度离心法分离得到外周血单个核细胞，并冻存在含10％的DMSO的胎牛血清中，液氮保存。

Molt-4细胞(购自南京科佰)在补充有10％胎牛血清 (GIBCO，澳大利亚，Cat.10099-141)和1％青霉素/链霉素 (GENOME，中国杭州，Cat.GNM15140)的RPMI 1640培养基(GIBCO，中国，Cat.C11875500BT)中培养。

Z138购自ATCC在补充有10％马血清(GIBCO，澳大利亚，Cat.16050130)和1％青霉素/链霉素(GENOME，中国杭州，Cat.GNM15140)的IMEM培养基(GIBCO，中国， Cat.12200036)中培养。

NK/TCL(NK/T细胞淋巴瘤)细胞系SNK-1、SNK-6和 SNT-8均由上海交通大学医学院附属新华医院赠送。

实施例2.本发明所使用的一般实验方法

(1)体外细胞抗增殖实验

(1.1)WST实验

通过基于水溶性四唑盐(WST)的CCK-8(Cell Counting Kit-8,细胞计数试剂盒-8)实验检测抗增殖作用(购自上海李记医药科技有限公司)(请参考Ishiyama M,TominagaH,Shiga M et al.,A combined assay of cell viability and in vitro cytotoxicitywith a highly water-soluble tetrazolium salt,neutral red and crystalviolet.Biol.Pharm.Bull 19(11)1518-1520(1996), Vol.19,No.11和Tominaga H,Ishiyama M,Ohseto F et al.,A water-soluble tetrazolium salt useful forcolorimetric cell viability assay.Anal.Commun.,1999,36,47-50)。细胞接种于 96孔板中，并以不同浓度受试物处理72小时。通过使用9个不同浓度BTK抑制剂(例如，依鲁替尼，其中在10^-2至10²中间按3被梯度选取9个浓度)与3个不同浓度的化合物6(具体请参见图1)作用72小时，测试化合物6与该药物的联合作用。每个测试剂量做3复孔。

通常，选择受试物9个系列剂量，100μl/孔加到96孔板。对于联合实验，2个受试物的终体积为100μl/孔。每个测试剂量做3复孔。在同一培养板上选3-6孔加入100μl稀释液作为对照组，另设3-6孔作为空白对照。除空白对照孔外，每孔加入100μl细胞悬液(含有合适细胞数，以确保需要检测时细胞对照组的细胞刚好铺满孔底面)到相同96孔板。培养板于37℃，CO2培养箱中培养72小时。培养结束时，对于贴壁细胞，除去待测孔内旧液，加入100μl/孔CCK-8检测液(含 10％CCK-8，5％FBS的相应培养基)。对于悬浮细胞，直接加入20μl/孔CCK-8原液。培养板继续37℃，CO2培养箱中孵育2-4小时。

酶标仪(SpectraMax Plus 384，Molecular Devices， LLC.，US)A450nm检测OD值。使用3复孔平均OD值，通过下列公式计算细胞存活率百分比：

(O.D.测试孔–O.D.空白对照孔)/(O.D.细胞对照孔- O.D.空白对照孔)×100。

使用Graphpad Prism 6.0软件的非线性回归数据分析方法计算IC₅₀。

对于联合用药的实验，通过单药对照的3复孔平均OD值归一化处理后计算细胞存活率。通过进行联合曲线与单药曲线的IC50比较，结合观察联合用药组曲线是否左移来确定2个化合物的协同作用。同时，通过CalcuSyn软件(BIOSOFT， UK)计算组合指数(CI)值。通常，CI<0.9表示协同组合作用。CI<0.1标记为5+，表示非常强的协同组合作用，CI在0.1 和0.3之间标记为4+，表示强协同组合作用，CI在0.3和0.7 之间标记为3+，表示中等协同组合作用。

(1.2)CTG实验

通过基于ATP定量的CTG(

Luminescent Cell ViabilityAssay)实验方法检测抗增殖作用。96孔培养板中，加入9个系列浓度的受试物，接种细胞后作用72小时。联合实验中，分别使用9个系列剂量的2种受试物一一对应，接种细胞后作用72小时。每个测试剂量做3复孔。在同一培养板上设置稀释液对照组和空白对照。培养板于37℃，CO2培养箱中培养。培养结束时，每个测试孔加入已经平衡至室温的CTG 试剂(CellTiter-Lumi^TM发光法细胞活力检测试剂盒，碧云天, #C0068L)，使用酶标仪(Molecular Devices,SpectraMax i3x)进行化学发光检测。计算细胞存活率％＝(O.D.测试孔– O.D.空白对照孔)/(O.D.细胞对照孔-O.D.空白对照孔) ×100。使用GraphpadPrism 9.1.0软件(GraphPad Software Inc.，San Diego，CA)的非线性回归数据分析方法计算 IC50。联合用药使用Calcusyn 2.11软件(Biosoft,Dr.TC Zhou) 计算CI(combination index)值，CI>1为拮抗作用，CI＝1为相加作用，CI<1为协同作用。

(2)细胞凋亡检测

细胞经受试物作用24小时后，收集细胞，并用预冷的PBS 清洗一次。根据AnnexinⅤ-Alexa Fluor 647/PI细胞凋亡检测试剂盒(翊圣，#40304ES20)的说明，加入100μl 1×Binding buffer重悬细胞，加入5μl AnnexinⅤ-Alexa Fluor 647，混匀，加入10μl碘化丙啶(PI)，混匀，室温避光孵育10-20分钟，加入400μl PBS混匀，随后置于冰浴中。流式细胞仪(CytoFLEX,BECKMAN)检测细胞凋亡。

(3)免疫印迹(Western blotting)实验

细胞经受试物作用后，在设定的时间点收集细胞，并用预冷的PBS清洗一次。使用含有1％PMSF(碧云天， #ST506)、1％磷酸酶抑制剂(翊圣，#20109-A，#20109-B) 及1％蛋白酶抑制剂(翊圣，#20124ES03)的RIPA裂解液 (碧云天，#P0013B)裂解细胞沉淀。经BCA蛋白浓度检测试剂盒(碧云天，#P0011)检测蛋白浓度。用8-12％SDS-PAGE (Acry/Bis 30％Solution(37.5:1)，生工，#B546018)分离肿瘤裂解物(20-50μg)。将分离的蛋白质转移到PVDF膜(GE， #10600023)。PVDF膜使用1-4％BSA(GENVIEW， #FA016)缓冲液室温封闭30分钟至1小时后，使用含1-4％ BSA的1×TBST(TBS，生工，#B548105)稀释的一抗 (PARP，CST，#9532；CASPASE-3，CST，#9665；β- ACTIN，CST，#4970)4℃摇床上孵育过夜。1×TBST洗膜3次。使用辣根过氧化物酶标记的二抗(Goat Anti Rabbit，联科，#GAR0072；Goat AntiMouse，联科，#GAM0072)室温孵育膜1小时。1×TBST洗膜3次。使用ECL化学发光超敏显色试剂盒(YEASEN，#36208ES76)和化学发光成像系统 (c300，Azure)进行信号生成和检测。

(4)免疫共沉淀检测(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)

细胞经受试物作用后，在24h后离心收集细胞，并用预冷的PBS清洗一次。使用含有1％PMSF、1％磷酸酶抑制剂及 1％蛋白酶抑制剂的IP及western裂解液(碧云天,#P0013)裂解细胞沉淀。经BCA蛋白浓度检测试剂盒检测蛋白浓度。将细胞裂解液蛋白浓度统一调整到2.5ug/ul，从对照组取出Input，其余按1:100的比例向细胞裂解液中加入抗体(BCL-XL，CST， #2764)，4℃旋转过夜。用IP及western裂解液清洗Beads (碧云天,#P2009)后加入抗体和细胞裂解液的混合物，4℃旋转4h，旋转结束后清洗Beads。配置好1xLoading Buffer(碧云天，货号：P0015)，等体积加入Beads中，Input中按比例加入5xLoading Buffer，100℃煮5min后高速离心，取上清。采用8-12％SDS-PAGE分离蛋白(20-50μg)，将分离的蛋白转移到PVDF膜。常规Western blotting方法检测目标蛋白，一抗为BAX(CST，#5023)和BAK(CST，#12105)。

(5)体内药效学实验评估方法

通过细胞接种法建立人肿瘤免疫缺陷小鼠皮下异种移植瘤模型：收集对数生长期的肿瘤细胞，计数后重悬于1×PBS，调整细胞悬液浓度至2.5-5×10⁷/mL。用1mL注射器(4号针头) 在免疫缺陷小鼠右侧背部皮下接种肿瘤细胞，5-10×10⁶/0.2mL/ 鼠。所有动物实验操作严格遵守吉玛基因股份有限公司和苏州亚盛药业有限公司实验动物使用和管理规范。相关参数的计算参考中国CFDA《细胞毒类抗肿瘤药物非临床研究技术指导原则》。实验用动物来源如下表所示：

表1实验用动物来源

实验期间每周测定两次动物体重和肿瘤大小。定期观察肿瘤生长情况，待肿瘤生长至平均体积100-200mm³时根据肿瘤大小和小鼠体重随机分组给药。每天观察动物的状态以及有无死亡等情况发生。常规监测包括了肿瘤生长及给药对动物正常行为的影响，具体内容有实验动物的活动性、摄食和饮水情况、体重增加或降低情况、眼睛、被毛及其它异常情况。实验过程中观察到的死亡和临床症状均记录在原始数据中。整个给药、小鼠体重及肿瘤体积的测量操作均在超净工作台中进行。根据实验方案要求，末次给药结束后，收集血浆和肿瘤组织，称重并拍照记录。血浆和肿瘤样本-80℃冻存备用。

肿瘤体积(Tumor volume，TV)的计算公式为： TV＝a×b²/2。其中a、b分别代表肿瘤测量长和宽。相对肿瘤体积(relative tumor volume，RTV)计算公式为：RTV＝V_t/V₁。其中V₁为分组给药时的肿瘤体积，V_t为给药后某天测量时的肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T/C (％)，计算公式分别为：相对肿瘤增殖率T/C(％)＝ (T_RTV/C_RTV)×100％，T_RTV为治疗组RTV，C_RTV为溶媒对照组RTV；肿瘤缓解率(％)为治疗后荷瘤小鼠出现SD(疾病稳定)、PR(肿瘤部分消退)及CR(肿瘤完全消退)的数目除以本组小鼠总数×100％。

动物体重变化(Change of body weight，％)＝(测量体重 -分组时体重)/分组时体重×100％。

疗效评价标准：根据中国CFDA《细胞毒类抗肿瘤药物非临床研究技术指导原则》(2006年11月)，T/C(％)值≤

40％并经统计学分析p<0.05为有效。若小鼠的体重下降超过 20％或药物相关的死亡数超过20％，则认为该药物剂量具有严重毒性。

协同性分析采用以下公式：协同因子＝((A/C)× (B/C))/(AB/C)；A＝A药单药组的RTV值；B＝B药单药组的 RTV值；C＝溶媒对照组的RTV值，AB＝AB联合用药组的 RTV值(Clarke R.Issues in experimental design and endpoint analysis in the study ofexperimental cytotoxic agents in vivo in breast cancer and other models[J].Breast Cancer Research& Treatment,1997,46(2-3):255-278)。若协同因子>1，则具有协同作用；若协同因子＝1，则具有相加作用；若协同因子<1，则具有拮抗作用。

(6)肿瘤异种移植模型实验

NCG小鼠，4-6周龄，雌性，体重16-18±20％g，由江苏集萃药康生物科技股份有限公司(生产许可证号：SCXK (苏)2018-0008，动物合格证号：202105885，202107138)提供。NCG免疫缺陷小鼠右侧背部皮下注射SNK-6肿瘤细胞 3×10⁶/只(30％Matrigel；Corning,#354234)建立异种移植瘤模型。当肿瘤达到合适的大小(100-200mm³)，根据动物肿瘤体积按随机区组法进行随机分组，每组5只，并于分组当日开始给药。实验期间每周测定两次动物体重和肿瘤大小。每日观察记录临床症状。实验动物饲养在上海市计划生育科学研究所实验动物经营部SPF级别实验室(使用许可证号：SYXK(沪) 2018-0026)。涉及动物管理和使用的试验方案均通过上海市计划生育科学研究所实验动物经营部实验动物管理和使用委员会 (Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC)的审核和批准。肿瘤体积、动物重量变化、疗效评价标准以及协同性分析参考本实施例第(5)项。

实施例3.Bcl-2抑制剂(化合物3、6和13)的制备

(1)2-((1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((6-(4-氯苯基)螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)哌嗪-1-基)-N-((3-硝基-4-(((四氢- 2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)苯基)磺酰)苯甲酰胺的合成(化合物 3)

2-((1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((6-(4-氯苯基)螺 [3.5]壬-6-烯-的混合物7-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酸(1.75g， 3mmol)，3-硝基-4-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)苯磺酰胺 (1.43g，4.5)在室温下使EDCI(1.15g，6mmol)和4-(N，N-二甲基氨基)吡啶(550mg，4.5mmol)和二氯甲烷(40ml)反应过夜，然后加入水。用二氯甲烷萃取水层。将合并的有机层用盐水洗涤，浓缩并通过硅胶柱纯化，得到2-((1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((6-(4-氯苯基)螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)哌嗪-1-基)-N- ((3-硝基-4-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)苯基)磺酰)苯甲酰胺 (1.7g，64.4％)，为黄色固体。

¹H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ8.70(d,J＝2.3Hz,1H),8.01 (d,J＝2.7Hz,1H),7.87(d,J＝9.2,2.3Hz,1H),7.66(d,J＝8.9 Hz,1H),7.55(d,J＝2.7Hz,1H),7.47(d,J＝3.4Hz,1H),7.38(d, J＝8.4Hz,2H),7.10(d,J＝8.4Hz,2H),6.97(d,J＝9.2Hz,1H), 6.77(dd,J＝8.9,2.4Hz,1H),6.44(d,J＝3.4Hz,1H),6.34(d,J＝ 2.4Hz,1H),4.02–3.94(m,3H),3.66(s,3H),3.49–3.38(m,2H), 3.41–3.25(m,7H),2.42(s,3H),2.26(s,3H),2.00–1.67(m,4H), 1.45–1.38(m,2H)。

(2)(R)-N-((4-(((1,4-二

烷-2-基)甲基)氨基)-3-硝基苯基) 磺酰)-2-((1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((6-(4-氯苯基) 螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰胺的合成(化合物 13)

采用类似于合成化合物3所述的方法制备标题化合物。

¹H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ8.66(d,J＝2.4Hz,1H),7.99 (d,J＝2.4Hz,1H),7.84(dd,J＝9.2,2.4Hz,1H),7.64(d,J＝8.9 Hz,1H),7.51(d,J＝2.4Hz,2H),7.45(d,J＝3.3Hz,1H),7.37(d, J＝8.4Hz,2H),7.10(d,J＝8.4Hz,2H),6.94(d,J＝9.2Hz,1H), 6.76(dd,J＝8.9,2.3Hz,1H),6.40(d,J＝3.3Hz,1H),6.36(d,J＝ 2.3Hz,1H),3.87(dd,J＝11.8,4.2Hz,3H),3.83–3.70(m,3H), 3.67(s,2H),3.62(dd,J＝11.7,2.9Hz,1H),3.51–3.41(m,2H), 3.40–3.35(m,1H),3.29(dq,J＝3.2,1.6Hz,1H),2.41(s,2H), 2.26(s,2H),2.00–1.77(m,6H).

同样地，类似于合成化合物13所述的方法制备

具体参考WO2018/027097。

实施例4.Bcl-2/Bcl-xL抑制剂(化合物72和88)的制备

化合物72：(R)-2-(1-(3-(4-(N-(4-(4-(3-(2-(4-氯苯基)-1-异丙基-5-甲基-4-(甲基磺酰基)-1H-吡咯-3-基)-5-氟苯基)哌嗪-1-基)苯基)氨磺酰基)-2-(三氟甲基磺酰基)苯基氨基)-4-(苯基硫代)丁基) 哌啶-4-羰基氧基)乙基膦酸。化合物72合成的方法可参照 WO2014/113413A1说明书的记载，由如下途径制备：

¹H NMR(300MHz,CD3OD):δ7.93(d,J＝1.9Hz,1H), 7.72(dd,J＝9.2,1.8Hz,1H),7.30-7.12(m,12H),6.83- 6.42(m,5H),4.46-4.33(m,3H),3.96(s,1H),3.54- 2.93(m,16H),2.82(s,3H),2.72(s,3H),2.71-2.55(m,1H),2.24- 1.65(m,8H),1.41(d,J＝7.1Hz,6H)。MS(ESI):m/z 1268.58(M+H)⁺.

化合物88：(R)-1-(3-(4-(N-(4-(4-(3-(2-(4-氯苯基)-1-异丙基- 5-甲基-4-(甲基磺酰基)-1H-吡咯-3-基)-5-氟苯基)哌嗪-1-基)苯基)-氨磺酰基)-2-(三氟甲基磺酰基)苯氨基)-4-(苯基硫基)丁基)哌啶-4-甲酸。化合物88的合成的方法可参照WO2014/113413A1 说明书的记载，由如下途径制备：

¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.84(s,1H),7.82(s, 1H),7.65(d,J＝8.7Hz,1H),7.38(d,J＝8.5Hz,2H),7.32– 7.14(m,7H),7.11–6.81(m,6H),6.63–6.47(m,2H),6.43–6.30(m,1H),4.33(p,J＝7.1Hz,1H),4.07(s,1H),3.32-3.22 (m,4H),3.19–3.03(m,9H),2.89(s,4H),2.67(s,4H),2.31- 1.55(m,8H),1.35(d,J＝7.0Hz,6H).

实施例5.化合物72分别于依鲁替尼、阿卡替尼或泽布替尼的联合用药对不同恶性肿瘤细胞的影响

(1)实验目的

化合物72是新型的、静脉注射的BCL-2/BCL-xL双靶点抑制剂。在本实验中，评估了化合物72与依鲁替尼、阿卡替尼或泽布替尼的联合用药治疗是否可以进一步增强单药在这些血液恶性肿瘤细胞系中的抗增殖活性。

(2)实验材料及其来源

如实施例1所述。

(3)实验方法

如实施例2第(1)部分所述。在WST实验中，测定依鲁替尼、阿卡替尼或泽布替尼单药以及化合物72分别与依鲁替尼、阿卡替尼或泽布替尼联合用药在下述恶性肿瘤细胞中的细胞存活率(％)：OCI-LY8(弥漫性大B细胞淋巴瘤 (DLBCL))、DOHH-2(滤泡性淋巴瘤(FL))和Z-138 (套细胞淋巴瘤(MCL))。

(4)实验结果

如图1所示，在多种血液学恶性肿瘤细胞中，化合物72与 BTK抑制剂依鲁替尼、阿卡替尼或泽布替尼的联合用药，对血液恶性肿瘤细胞系中的抗增殖活性具有增强作用。

在实验中，在用指定浓度的化合物72、依鲁替尼、阿卡替尼、泽布替尼或两种药物的联合用药处理后72小时，通过 WST测定评估FL(图1A，1B)、DLBCL(图1C)和 MCL(图1D、图1E和图1F)细胞的增殖作用。显示了细胞存活率的剂量-效应曲线。通过CalcuSyn(BIOSOFT)计算在指定浓度下用化合物72与依鲁替尼、阿卡替尼或泽布替尼的联合用药治疗的CI值。CI<0.9表示两种单药的协同效应。药物剂量矩阵表示相对于溶媒对照组，被处理的细胞的生长抑制百分比。

具体地，来自人FL DOHH-2(图7A，7B)和DLBCL OCI-LY8(图1C)和MCL(图1D，图1E和图1F)细胞的细胞存活率测定显示，与单药相比，化合物72与BTK抑制剂依鲁替尼、阿卡替尼和泽布替尼联合用药的剂量效应曲线向左移动，表明有增强的抗肿瘤增殖作用。

如所示地，针对不同剂量的联合用药，计算化合物72和 BTK抑制剂的组合指数(CI)，CI<0.9认为有协同性(图下方表格)。在DOHH-2细胞系中，化合物72(0.6uM)和依鲁替尼(0.037uM)开始有协同作用(CI<0.9)；化合物72 (0.2uM)和泽布替尼(0.037uM)开始有协同作用 (CI<0.9)。在OCI-LY8细胞系中，化合物72与阿卡替尼联合用药的剂量效应曲线向左移动，表明有增强的抗肿瘤增殖作用。在Z138细胞系中，化合物72(0.03uM)和依鲁替尼(0.411uM)开始有协同作用(CI<0.9)；化合物72 (0.03uM)和阿卡替尼(3.70uM)开始有协同作用 (CI<0.9)；化合物72(0.15uM)和泽布替尼(3.70uM)开始有协同作用(CI<0.9)。

(5)小结

由此可见，体外实验中，当化合物72与靶向治疗药物 (即BTK抑制剂)联合使用时，化合物72在血液学恶性肿瘤的体外抗增殖活性得到进一步增强，且通过联合给药曲线与单药曲线的IC50进行比较，观察到联合用药组曲线左移，联合用药组的IC50值比各自单药的IC50值均小，且在大多数联合用药组中CI<0.9。因此，化合物72与依鲁替尼、阿卡替尼或泽布替尼联用具有协同作用。

实施例6.阿卡替尼与化合物6联合用药对慢性淋巴细胞白血病(CLL)或急性淋巴细胞白血病(ALL)的影响

1.阿卡替尼或化合物6单药以及阿卡替尼与化合物6联合用药对CLL的影响

(1)实验材料及其来源

如实施例1所述。

(2)实验方法

细胞存活率检测实验前，检测患者外周血癌细胞表面标志物以确认其为B-CLL细胞。取一部分癌细胞(0.5x106细胞/测定)离心并分别重悬在无抗体的染色缓冲液中(阴性对照组)、含1.25μL抗CD19和/或者抗CD5抗体的染色缓冲液中。冰上避光孵育30分钟后，离心并重悬于400μL的PBS 中。在Attune NxT流式细胞仪(Thermo Fisher Scientific)上检测，癌细胞中CD19+CD5+(或者CD19+)的细胞约占总细胞数的90％及以上用于后续实验。

使用Annexin V-PI(碘化丙啶)染色试剂盒检测细胞凋亡。简单地说，在处理后24或48小时收集细胞，用表面标记物 (CD5和CD19表示CLL)、Annexin-V和PI在室温中染色30分钟，使用Attune NxT流式细胞仪根据制造商的说明进行分析。通过分析各实验条件下20,000个细胞的凋亡数据。

(3)实验结果

如图2所示，3.3nM化合物6单药处理CLL原代细胞， 10μM阿卡替尼单药处理或者两药联合处理CLL原代细胞24 小时后，即使在10μM阿卡替尼单药处理组仍仅导致不到10％细胞凋亡；3.3nM化合物6单独处理组可导致26％左右的细胞凋亡。当3.3nM化合物6与阿卡替尼联合时，细胞凋亡百分比约为40％左右。

(4)小结

阿卡替尼与化合物6联合用药对CLL原代细胞的处理与各单药处理相比对具有增强的凋亡作用。这表明，阿卡替尼与化合物6用药可能使临床上慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者获益。

2.阿卡替尼或化合物6单药以及阿卡替尼与化合物6联合用药对ALL的影响

(1)实验材料及其来源

如实施例1所述。

(2)实验方法

如实施例2第(1)部分所述。

(3)实验结果

如图3所示，在WST实验中来自人ALL MOLT-4(细胞的细胞存活率测定显示，与单药相比，化合物6与阿卡替尼联合用药的剂量效应曲线向左移动，且在较高浓度的化合物6(3μM)和阿卡替尼(11.111μM)下开始表现出协同作用(CI< 0.9)。

(4)小结

阿卡替尼与化合物6联合用药可能使临床上急性淋巴细胞白血病(ALL)患者获益。

实施例7.阿卡替尼与化合物6联合用药对对人源OCI- LY19细胞系DLBCL小鼠异种移植瘤模型的影响

(1)实验方法

实验方法如实施例2第(5)部分所述。本实验在来源于人 OCI-LY19细胞系的DLBCL异种移植模型(请参见Donnou S, Galand C,Touitou V et al.,Murine Models of B-Cell Lymphomas:Promising Tools for Designing Cancer Therapies. Advances inHematology,Volume 2012,Article ID 701704,13 pages和Benet Pera,Tiffany Tang,Rossella Marullo et al., Combinatorial epigenetic therapy in diffuse large Bcell lymphoma pre-clinical models and patients.Clin Epigenetics. 2016；8:79))中评价了化合物6和阿卡替尼的联合治疗作用。简言之，OCI-LY19肿瘤细胞接种后第二天根据小鼠体重进行随机分组，分为溶媒对照组、化合物6单药组、阿卡替尼单药组以及阿卡替尼与化合物6联合用药组。随机分组当天开始给药(定义为第1天)。第14天时，当溶媒对照组荷瘤鼠平均肿瘤体积达142mm³时间时，开始所有组给药。阿卡替尼给药剂量为12.5mg/kg，p.o.，一天给药两次，从分组当天开始给药，共给药64次。化合物6给药剂量为100mg/kg，p.o.，每天给药1次，从第14天开始给药，共给药19次。另外设置了阿卡替尼与化合物6的联合用药组(阿卡替尼12.5mg/kg， p.o.，一天两次(bid)+化合物6 100mg/kg，p.o.，每天给药1 次(qd))。

(2)实验结果

如图4A和4B以及表2所示，化合物6单药显示出微弱的抗肿瘤作用，T/C(％)值为61.4，阿卡替尼单药未显示出抗肿瘤作用，联合用药组相对于溶媒对照组及阿卡替尼单药组均有显著的抗肿瘤作用，P值均<0.05，且较化合物6具有增强的抗肿瘤作用，协同因子为2.27。各给药组未见显著的体重下降(图 4B)。

表2.化合物6单药或与阿卡替尼联合用药在人OCI-LY1 (DLBCL)小鼠异种移植瘤模型中的抗肿瘤作用

(3)小结

化合物6与阿卡替尼联合用药无明显副作用(图4B)，可增加单药在OCI-LY19细胞的DLBCL模型中的抗肿瘤效果，且具有显著的协同作用(协同因子为2.27>1)。因此，化合物6与阿卡替尼联合用药可能使临床上弥漫性大B细胞淋巴瘤 (DLBCL)患者获益。

实施例8.依鲁替尼和化合物72联合用药对人源DOHH-2 细胞系FL小鼠异种移植瘤模型的影响

(1)实验方法

实验方法如实施例2第(5)部分所述。本实验在来源于人 DOHH-2细胞来源的FL小鼠异种移植瘤模型(请参考Donnou S,Galand C,Touitou V et al.,Murine Models of B-Cell Lymphomas:Promising Tools for Designing Cancer Therapies. Advances inHematology,Volume 2012,Article ID 701704,13 pages和Ackler S,Mitten MJ,Chen Jet al.,Navitoclax(ABT- 263)and bendamustine±rituximab induce enhancedkilling of non-Hodgkin’s lymphoma tumours in vivo.British Journal ofPharmacology(2012)167 881-891.)中评估了化合物72与BTK 抑制剂依鲁替尼联合用药的抗肿瘤作用。

(2)实验结果

如图5A和表3所示，在第32天时，依鲁替尼(25mg/kg) 单药组显示出微弱的抗肿瘤作用，T/C值(％)为89.8％；化合物72(75mg/kg)单药未显示抗肿瘤作用，T/C(％)值为137.9％；依鲁替尼和化合物72联合用药显示出显著的抗肿瘤作用，T/C(％)值为39.2％(P<0.05，与溶媒对照组比较； P<0.001，与化合物72单药组比较；P<0.05，与依鲁替尼单药组比较)，且协同因子为3.16，具有协同作用，停药12天后在第 46天时联合给药组仍显示出协同的抗肿瘤作用，T/C(％)值为36.2％，协同因子为1.44。各给药组未见显著的体重下降(图5B)。

表3.化合物72单药或依鲁替尼以及化合物72与依鲁替尼联合用药在人DOHH-2(FL)小鼠异种移植瘤模型中的抗肿瘤作用

(3)小结

化合物72与依鲁替尼联合用药无明显副作用(图5B)，且显著增加单药在人DOHH-2(FL)小鼠异种移植瘤模型中的抗肿瘤效果，具有显著的协同作用(32天、39天、46天协同因子分别为3.16、2.44、1.44，均大于1)。因此，化合物72 与依鲁替尼联合用药可能使临床上滤泡性淋巴瘤(FL)患者获益。

实施例9.依鲁替尼或阿卡替尼与化合物72联合用药对人源DOHH-2细胞系FL小鼠异种移植瘤模型的影响

(1)实验方法

实验方法如实施例2第(5)部分所述。本实验在来源于人 DOHH2细胞来源的FL小鼠异种移植瘤模型(请参考Donnou S,Galand C,Touitou V et al.,Murine Models of B-Cell Lymphomas:Promising Tools for Designing Cancer Therapies.Advances inHematology,Volume 2012,Article ID 701704,13pages和Ackler S,Mitten MJ,Chen Jet al., Navitoclax(ABT-263)and bendamustine±rituximab induce enhancedkilling of non-Hodgkin’s lymphoma tumours in vivo.British Journal ofPharmacology(2012) 167 881-891.)中评估了化合物72与BTK抑制剂依鲁替尼或阿卡替尼联合用药的抗肿瘤作用。

(2)实验结果

如图6A和表4所示，在治疗46天时，依鲁替尼(25 mg/kg)单药组显示出微弱的抗肿瘤作用，T/C(％)值为 89.6％。化合物72(75mg/kg)单药组未显示出抗肿瘤作用， T/C(％)值为118.9％，化合物72与依鲁替尼联合用药组相对于单药组具有增强的抗肿瘤作用，T/C值(％)为74.3％(P <0.01，与溶媒对照组比较)。各给药组未见显著的体重下降 (图6B)。

表4.化合物72单药或与依鲁替尼或阿卡替尼联合用药在人 DOHH2(FL)小鼠异种移植瘤模型中的抗肿瘤作用

(3)小结

化合物72与依鲁替尼或阿卡替尼联合用药无明显副作用 (图6B)。化合物72与依鲁替尼联合用药可增加两单药在人 DOHH2(FL)小鼠异种移植瘤模型中的抗肿瘤效果，且具有协同作用(协同因子1.43大于1)。因此，化合物72与依鲁替尼联合用药可能使临床上滤泡性淋巴瘤(FL)患者获益。

实施例10.依鲁替尼或阿卡替尼与化合物72联合用药对人源Z138细胞来源的MCL小鼠异种移植瘤模型的影响

(1)实验方法

实验方法如实施例2第(5)部分所述。本实验在来源于人 Z138细胞来源的MCL小鼠异种移植瘤模型(请参考Donnou S,Galand C,Touitou V et al.,Murine Models of B-Cell Lymphomas:Promising Tools for Designing Cancer Therapies.Advances inHematology,Volume 2012,Article ID 701704,13pages和Ackler S,Mitten MJ,Chen Jet al., Navitoclax(ABT-263)and bendamustine±rituximab induce enhancedkilling of non-Hodgkin’s lymphoma tumours in vivo.British Journal ofPharmacology(2012) 167 881-891.)中评估了化合物72与BTK抑制剂依鲁替尼和阿卡替尼联合用药的抗肿瘤作用。

(2)实验结果

如图7A和表5所示，在治疗29天时，依鲁替尼(25 mg/kg)单药组显示出微弱的抗肿瘤作用，T/C(％)值为 65.59％。化合物72(65mg/kg)单药组未显示出显著的抗肿瘤作用，T/C(％)值为40.11％(P<0.001，与溶媒对照组比较)，化合物72与依鲁替尼联合用药组具有显著的抗肿瘤作用，T/C值(％)为41.04％(P<0.001，与溶媒对照组比较)。阿卡替尼(12.5mg/kg)单药组未显示出抗肿瘤作用，T/C (％)值为101.51％，化合物72与阿卡替尼联合联合用药组显示出显著的抗肿瘤作用，T/C值(％)为29.59％(P<0.001，与溶媒对照组比较；P<0.001，与阿卡替尼单药组比较)。各给药组未见显著的体重下降(图7B)。

表5.化合物72单药或与依鲁替尼或阿卡替尼联合用药在人 Z138(MCL)小鼠异种移植瘤模型中的抗肿瘤作用

(3)小结

化合物72与依鲁替尼或阿卡替尼联合用药无明显副作用 (图7B)。化合物72与阿卡替尼联合显示出显著的协同抗肿瘤效果(协同因子1.38大于1)。因此，化合物72与阿卡替尼联合用药可能使临床上套细胞淋巴瘤(MCL)患者获益。

实施例11.化合物72及其代谢物(化合物88)以及ABT- 263在NK/TCL细胞系中的抗增殖作用

(1)实验目的

化合物72是新型的、静脉注射的BCL-2/BCL-xL双靶点抑制剂，而ABT-263是BCL-2/BCL-xL/BCL-w的抑制剂。在本实验中，评估了化合物72及其代谢物(化合物88)以及 ABT-263在NK/TCL细胞系中的抗增殖活性。

(2)实验材料及其来源

如实施例1所述。

(3)实验方法

如实施例2第(1)部分所述。在CTG实验中，测定依化合物72及其代谢物以及ABT-263分别在下述恶性肿瘤细胞中的IC50值：SNK-1、SNK-6和SNK-8。

如实施例2第(2)部分所述。在细胞凋亡检测中，测定依化合物72及其代谢物以及ABT-263诱导NK/TCL细胞SNK-6 的凋亡。

如实施例2第(3)部分所述。在免疫印迹实验中，测定依化合物72诱导NK/TCL细胞SNK-6的CASPASE-3和PARP-1 裂解。

如实施例2第(4)部分所述。在免疫共沉淀检测中，测定依化合物72抑制BCL-XL与BAK或BAX的结合。

(4)实验结果

体外抗增殖试验结果表明，BCL-2/BCL-XL抑制剂化合物72及其活性代谢物化合物88在NK/TCL细胞系中表现良好的细胞增殖抑制作用。化合物72对SNK-1、SNK-6和SNT-8 细胞系的IC₅₀值分别为2.652±2.606、1.568±1.109、0.557±0.383μM(表6)。

表6：BCL-2/BCL-XL抑制剂化合物72和化合物88在 NK/TCL细胞系中的抗增殖作用

流式细胞检测凋亡细胞的结果表明，化合物72和化合物88 可诱导SNK-6细胞凋亡(图8)。Co-IP检测表明，化合物72 通过和BCL-XL/BAX以及BCL-XL/BAK复合物竞争性结合释放BAX和BAK，进而诱导凋亡相关标志物CASPASE-3和 PARP-1剂量依赖性的裂解活化，促进凋亡的发生(图9)。

(5)小结

由此可见，体外实验中，化合物72在NK/TCL细胞系中具有抗增殖作用。

实施例12.化合物72或其代谢物(化合物88)分别与西达本胺、APG-115、吉西他滨、门冬酰胺酶和托法替尼的联合用药对NK/TCL细胞SNK-6的影响

(1)实验目的

在本实验中，评估了化合物72或其代谢物与西达本胺、 APG-115、吉西他滨、门冬酰胺酶和托法替尼的联合用药治疗是否可以进一步增强单药在这些细胞系中的抗增殖活性。

(2)实验材料及其来源

如实施例1所述。

(3)实验方法

如实施例2第(1)部分所述。在CTG实验中，化合物72 或其代谢物分别与西达本胺、APG-115、吉西他滨、门冬酰胺酶和托法替尼的联合用药在NK/TCL细胞SNK-6中的细胞存活率(％)。

(4)实验结果

如图10所示，在NK/TCL细胞SNK-6中，化合物72或其代谢物分别与西达本胺、APG-115、吉西他滨、门冬酰胺酶和托法替尼的联合用药，对细胞系中的抗增殖活性具有增强单药的抑制作用(CTG测定CI<1)。

在实验中，在用指定浓度的化合物72或其代谢物、西达本胺、APG-115、吉西他滨、门冬酰胺酶和托法替尼或两种药物的联合用药处理后72小时，通过CTG测定评估NK/TCL细胞 SNK-6的增殖作用。显示了细胞存活率的剂量-效应曲线，计算在指定浓度下用化合物72或其代谢物与西达本胺、APG-115、吉西他滨、门冬酰胺酶和托法替尼的联合用药治疗的CI值。 CI<1表示两种单药的协同效应。药物剂量矩阵表示相对于溶媒对照组，被处理的细胞的生长抑制百分比。

具体地，来自NK/TCL细胞SNK-6的细胞存活率测定显示，与单药相比，化合物72或其代谢物(化合物88)与西达本胺、APG-115、吉西他滨、门冬酰胺酶和托法替尼的联合用药的剂量效应曲线向左移动，表明有增强的抗肿瘤增殖作用。

如所示地，针对不同剂量的联合用药，计算化合物72或其代谢物(化合物88)与西达本胺、APG-115、吉西他滨、门冬酰胺酶和托法替尼的联合用药的组合指数(CI)，CI<1认为有协同性(图下方数据)。

(5)小结

由此可见，体外实验中，当化合物72或其代谢物(化合物88)与另外的药剂(即西达本胺、APG-115、吉西他滨、门冬酰胺酶和托法替尼)联合使用时，化合物72或其代谢物(化合物88)的体外抗增殖活性得到进一步增强，且在大多数联合用药组中CI<1。因此，化合物72或其代谢物与西达本胺、APG-115、吉西他滨、门冬酰胺酶和托法替尼在NK/TCL细胞系中具有协同作用。因此，化合物72或其代谢物与西达本胺、 APG-115、吉西他滨、门冬酰胺酶和托法替尼可能使临床上 NK/T细胞淋巴瘤患者获益。

实施例13.化合物72或其代谢物(化合物88)或ABT-263 对人NK/TCL细胞SNK-6小鼠异种移植瘤模型的影响

(1)实验方法

实验方法如实施例2第(6)部分所述。在本实验中评价了化合物72或其代谢物(化合物88)或ABT-263对人NK/TCL 细胞SNK-6小鼠异种移植瘤模型的影响。简言之，SNK-6肿瘤细胞接种后第二天根据小鼠体重进行随机分组，分为溶媒对照组、化合物72不同给药方案组(65mg/kg,IV,BIW×2W； 65mg/kg,IV,BIW×2W；100mg/kg,IV,BIW×2W；65mg/kg,IV, QW×2W；100mg/kg,IV,QW×2W)、化合物72M1组 (40mg/kg,IV,BIW×2W)和ABT-263组(50mg/kg，PO， QD×14D)。

(2)实验结果

如图11A和11B以及表7所示，化合物72各给药方案组、化合物88组以及ABT-263组相对于溶媒对照组显示出抗肿瘤作用，P值均<0.01。同时，化合物72(100mg/kg,IV,BIW×2W) 相对于ABT-263组具有更佳的抗肿瘤作用。

具体地，在NK/TCL细胞SNK-6异种移植瘤模型中，检测了化合物72及其活性代谢物化合物88的抗肿瘤作用。化合物72 按65或100mg/kg剂量，静脉给药，每周两次(BIW)或每周一次(QW)，给药2周。化合物88按40mg/kg剂量，静脉给药，每周两次(BIW)，给药2周。ABT-263按50mg/kg剂量，灌胃给药，每天一次(QD)，给药2周作为对照。给药结束时，化合物72的65和100mg/kg剂量组表现出剂量和给药方案(BIW、QW)依赖的抗肿瘤作用，T/C值(％)分别为23.6％ (p<0.05)、13.7％(p<0.01)、30.7％(p<0.05)和27.6％ (p<0.05)(图11A)。化合物88 40mg/kg BIW的T/C值(％) 为27.3％(p<0.05)。其中化合物72 100mg/kg BIW组的肿瘤生长抑制作用优于ABT-263 50mg/kg QD组(T/C％为30.1％， p<0.05vs溶媒对照)，组间比较有显著差异(p<0.05)(图11A)。各给药组未见显著的体重下降 (图11B)。

表7.化合物72或其代谢物(化合物88)或ABT-263对人 NK/TCL细胞SNK-6小鼠异种移植瘤模型的影响

^*:p<0.05,^**:p<0.01,vs.溶媒对照

⁺:p<0.05,vs.ABT-263 50mg/kg

(3)小结

化合物72各给药方案组、化合物88组以及ABT-263组相对于溶媒对照组显示出抗肿瘤作用(例如，NK/T细胞淋巴瘤)。

实施例14.化合物72联合用药对人NK/TCL细胞SNK-6 小鼠异种移植瘤模型的影响

(1)实验方法

实验方法如实施例2第(6)部分所述。在本实验中评价了化合物72与西达本胺或APG-115的联合治疗作用。简言之，人NK/TCL细胞SNK-6接种后第二天根据小鼠体重进行随机分组，分为溶媒对照组(IV，BIW×2W)、化合物72单药组 (65mg/kg，IV，BIW×2W)、西达本胺单药组(5mg/kg(D1, 5)，15mg/kg(D6-14)，PO，QD)、APG-115单药组(50 mg/kg,QD×2W)以及化合物72(65mg/kg，IV，BIW×2W) 与西达本胺联合用药组(5mg/kg(D1,5)，15mg/kg(D6-14)，PO，QD)或化合物72(65mg/kg，IV，BIW×2W)与 APG-115联合用药组(50mg/kg,QD×2W)。

(2)实验结果

如图12A-C以及表8所示，化合物72单药显示出抗肿瘤作用，T/C(％)值为24.7。联合用药组相对于溶媒对照组及各单药组均有显著的抗肿瘤作用，P值均<0.05，且相对于单药组具有协同作用。各给药组未见显著的体重下降(图12B)。

表8.化合物72联合用药对人NK/TCL细胞SNK-6小鼠异种移植瘤模型的影响

(3)小结

化合物72与HDAC抑制剂西达本胺或MDM2抑制剂 APG-115合用时均可增加单药的抑制作用，表现协同抗肿瘤作用。因此，化合物72与西达本胺或与APG-115联合用药可能使临床上NK/T细胞淋巴瘤患者获益。

Claims (16)

1.一种组合产品，所述组合产品包含Bcl-2抑制剂和另外的药剂，或包含Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和另外的药剂，

其中所述Bcl-2抑制剂是下述化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物：

所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂是下述化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物：

或

且

所述另外的药剂选自BTK抑制剂、HDAC抑制剂、MDM2抑制剂、JAK抑制剂、抗代谢药和酶中的一种或多种，其中所述BTK抑制剂选自：依鲁替尼(Ibrutinib)、ICP-022、阿卡替尼(Acalabrutinib)、泽布替尼(BGB3111)、ONO/GS-4059、Spebrutinib(CC-292或AVL-292)、CNX-774、Olmutinib(HM61713，

BI1482694)、M7583、HM71224、PCI-32765外消旋体(PCI-32765Racemate)、GDC-0853、ONO-4059、RN486、CGI-1746、QL47、LFM-A13、(±)-赞鲁替尼((±)-Zanubrutinib)、SNS-062、BMS-935177、BMS-986195、PCI29732、Btk抑制剂2、Evobrutinib、依鲁替尼-生物素(Ibrutinib-biotin)、BMX-IN-1、GDC-0834和CB1763。

2.根据权利要求1的组合产品，其中所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂是下述化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物：

3.根据权利要求1的组合产品，其中BTK抑制剂选自：依鲁替尼(Ibrutinib)、阿卡替尼(Acalabrutinib(ACP-196))和泽布替尼(BGB3111)。

4.根据权利要求1的组合产品，其中HDAC抑制剂是西达本胺；和/或MDM2抑制剂是APG-115；和/或JAK抑制剂是托法替尼；和/或抗代谢药是吉西他滨；和/或酶是门冬酰胺酶。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的组合产品，其中所述组合产品呈药物组合物的形式。

6.根据权利要求1-4中任一项所述的组合产品，其中所述Bcl-2抑制剂和另外的药剂各自呈单独的制剂形式，或其中所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和另外的药剂各自呈单独的制剂形式。

7.根据权利要求1-4中任一项所述的组合产品，其中所述Bcl-2抑制剂和另外的药剂同时或先后施用，或其中所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和另外的药剂同时或先后施用。

8.根据权利要求1-4中任一项所述的组合产品，所述组合产品还包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

9.根据权利要求9所述的组合产品，其中所述组合产品呈片剂、胶囊剂、颗粒剂、糖浆剂、粉剂、锭剂、药囊、扁囊剂、酏剂、混悬剂、乳剂、溶液、糖浆剂、气雾剂、软膏剂、乳膏剂或注射剂的形式。

10.根据权利要求1-9中任一项的组合产品在制备用于预防和/或治疗疾病的药物中的用途，所述疾病选自癌症、自身免疫性疾病和炎性疾病。

11.一种用于预防和/或治疗疾病的组合产品，所述组合产品如权利要求1-9中任一项所定义，且所述疾病选自癌症、自身免疫性疾病和炎性疾病。

12.一种预防和/或治疗疾病的方法，包括对有此需要的受试者施用根据权利要求1-9中任一项的组合产品，所述疾病选自癌症、自身免疫性疾病和炎性疾病。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述癌症选自急性髓细胞性白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)/小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、边缘区淋巴瘤(MZL)、慢性骨髓性白血病(CML)、套细胞淋巴瘤(MCL)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(WM)、多发性骨髓瘤(MM)、T幼淋巴细胞白血病(T-PLL)、小细胞肺癌(SCLC)和NK/T细胞淋巴瘤。

14.根据权利要求12或13所述的方法，其中将所述组合产品中的Bcl-2抑制剂、Bcl-2/Bcl-xL抑制剂或其药学上可接受的盐或溶剂化物以约0.0025-1500mg/日的量给药。

15.根据权利要求12或13所述的方法，其中将所述组合产品中的另外的药剂或其药学上可接受的盐或溶剂化物以约0.0025-1000mg/日的量给药。

16.根据权利要求12或13所述的方法，其中所述受试者对BTK抑制剂不响应或者耐药。

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