CN113797219A

CN113797219A - Xpr1抑制剂在制备抑制甲状腺癌细胞迁移和/或增殖的产品的应用

Info

Publication number: CN113797219A
Application number: CN202111068922.2A
Authority: CN
Inventors: 陈恩东; 尤捷; 陈不染; 陈盈盈; 李�权; 胡孝渠; 项晓; 蔡业丰; 王青煊; 杜远
Original assignee: First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University
Current assignee: Zhejiang Kangfulong Instrument Co.,Ltd.
Priority date: 2021-09-13
Filing date: 2021-09-13
Publication date: 2021-12-17
Anticipated expiration: 2041-09-13
Also published as: CN113797219B

Abstract

本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及XPR1抑制剂在制备抑制甲状腺癌细胞迁移和/或增殖的产品的应用。本发明发现甲状腺癌细胞中XPR1基因的表达显著高于正常甲状腺细胞，通过CCK‑8实验、集落形成实验、Transwell迁移实验、Matrigel侵袭实验、流式细胞术、细胞凋亡实验和蛋白印迹实验验证了XPR1基因对甲状腺癌细胞迁移和增殖能力的影响。本发明发现敲减XPR1基因的表达能有效地降低甲状腺癌细胞的迁移和增殖能力。

Description

XPR1抑制剂在制备抑制甲状腺癌细胞迁移和/或增殖的产品的应用

技术领域

本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及XPR1抑制剂在制备抑制甲状腺癌细胞迁移和/或增殖的产品的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

生物标志物（Biomarker）是指可以标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能的改变或可能发生的改变的生化指标，具有非常广泛的用途。生物标志物可用于疾病诊断、肿瘤负荷监测、判断肿瘤复发转移的风险评估或者用来评价新药或新疗法在目标人群中的安全性及有效性。

甲状腺癌（TC）是最常见的内分泌肿瘤，在过去的十年中，其发病率在全球范围内迅速且急剧增加。甲状腺癌在女性癌症中排名第五。大多数甲状腺癌患者手术后预后良好，十年生存率> 90％。然而，一些患者在治疗后仍然会出现复发和转移。局部复发患者的总生存率约为70％-85％，而远处转移患者的长期生存率则为30％-60％。因此，寻找并确定可以区分高危和低危甲状腺癌患者的生物标志物就显得非常重要。

异种和多型逆转录病毒受体（XPR1）是具有多个跨膜结构域的696个氨基酸的蛋白质。XPR1最开始被定义为异嗜性和多嗜性类鼠白血病病毒的特异性细胞表面受体。据报道，XPR1 还介导 G 蛋白募集并在G蛋白偶联信号转导中发挥一定作用。基于其与参与磷酸转运调节的蛋白质（包括 PHO1、PHO90和 PHO91）的同源性，XPR1 也被认为是人体细胞中的无机磷酸盐输出蛋白。也有多项研究发现，XPR1已被证明与β型血小板衍生生长因子受体（PDGFRB）相互作用，并在维持大脑中的细胞磷酸盐平衡方面发挥重要作用，是一种涉及原发性家族性遗传病脑钙化（PFBC）的致病基因。然而，XPR1在人类恶性肿瘤中，尤其是在甲状腺癌中的作用还有待于进一步阐明。

发明内容

本发明的主要目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种XPR1抑制剂在制备抑制甲状腺癌细胞迁移和/或增殖的产品的应用。

本发明的第一方面，提供一种XPR1抑制剂在制备抑制甲状腺癌细胞迁移和/或增殖的产品的应用。

所述抑制甲状腺癌细胞迁移和/或增殖的产品为如下a~g至少一种；

其中，a制备抑制甲状腺癌细胞迁移和/或增殖的产品；

b制备抑制甲状腺癌细胞内周期蛋白D1（Cyclin D1）表达的产品；

c制备抑制甲状腺癌细胞内MYC原癌基因（c-Myc）表达的产品；

d制备抑制甲状腺癌细胞内基质金属蛋白酶9（MMP9）表达的产品；

e制备抑制甲状腺癌细胞内基质金属蛋白酶13（MMP13）表达的产品；

f制备抑制甲状腺癌细胞内磷酸化的RelA原癌基因（p-p65）表达的产品；

g制备促进甲状腺癌细胞内BCL-2相关X的凋亡调节蛋白（Bax）表达的产品。

所述产品为药物。

所述甲状腺癌细胞为TPC-1细胞、BCPAP细胞、FTC细胞中的一种或多种。

所述XPR1抑制剂为靶向XPR1的特异性小干扰Si-RNA。

所述XPR1抑制剂是指能够降低XPR1含量或表达水平的产品。

本发明的第二方面，提供一种抑制甲状腺癌细胞迁移和/或增殖的药物组合物，其包括XPR1抑制剂。

所述XPR1抑制剂为靶向XPR1的特异性小干扰Si-RNA。

所述XPR1抑制剂是指能够降低XPR1含量或表达水平的产品。

本发明的第三方面，提供一种抑制甲状腺癌细胞迁移和/或增殖的产品，其包含如上所述的药物组合物。

本发明的有益效果如下：本发明发现甲状腺癌细胞中XPR1基因的表达显著高于正常甲状腺细胞，通过CCK-8实验、集落形成实验、Transwell迁移实验、Matrigel侵袭实验、流式细胞术、细胞凋亡实验和蛋白印迹实验验证了XPR1基因对甲状腺癌细胞迁移和增殖能力的影响。本发明发现敲减XPR1基因的表达能有效地降低甲状腺癌细胞的迁移和增殖能力。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据这些附图获得其他的附图仍属于本发明的范畴。本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1 相较于正常甲状腺细胞，XPR1在甲状腺癌细胞中过表达；

图2 在三种甲状腺癌细胞系中，Si-XPR1组XPR1的mRNA水平均低于Si-NC组；

图3 在蛋白水平，Si-XPR1组的XPR1表达低于Si-NC组；

图4 对TPC-1，BCPAP，FTC三种细胞系的CCK-8测定；

图5 对TPC-1，BCPAP，FTC三种细胞系的克隆形成实验；

图6 对三种细胞系的Si-XPR1组和Si-NC组进行迁移实验；

图7 对三种细胞系的Si-XPR1组和Si-NC组进行侵袭实验；

图8 基于来自TCGA数据库的GSEA分析表明XPR1与细胞凋亡通路相关；

图9 在三种甲状腺癌细胞系中表明，敲低XPR1能促进其凋亡；

图10 沉默XPR1在蛋白水平增加了Bax的表达，同时降低了BCL-2和p-p65的表达；

图11 分离胞浆胞核蛋白，检测胞浆和胞核中p65的表达变化；

图12 通过实时RT-qPCR分析细胞增殖和迁移相关基因的表达变化。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式。此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语包含和/或包括时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，目前XPR1在人类甲状腺癌中的作用机制还有待于充分阐明，为了解决上述问题，在本发明的第一个典型的实施方式中，提供一种XPR1抑制剂在如下a~g至少一种中的应用：

其中，a制备抑制甲状腺癌细胞迁移和/或增殖的产品；

c制备抑制甲状腺癌细胞内MYC原癌基因（c-Myc）表达的产品；

在本发明的一个或一些实施方式中，所述产品为药物。

在本发明的一个或一些实施方式中，所述XPR1抑制剂是指能够降低XPR1含量或表达水平的产品，包括了拮抗剂、下调剂、阻滞剂、阻断剂等，在本发明的一些实施例中，所述XPR1抑制剂具体采用以下物质中的一种或多种：通过Si-RNA以及CRISPR介导的基因敲低策略获得的抑制XPR1表达水平的Si-RNA表达载体和Cas9-sgRNA共表达载体，以及降低XPR1含量或表达水平的化合物、组合物或试剂等。其中，本领域技术人员根据生物工程技术领域的公知常规技术手段构建得到通过敲低方法抑制XPR1表达水平的Si-RNA表达载体和Cas9-sgRNA共表达载体。

在本发明的一个或一些实施方式中，抑制甲状腺癌细胞内Cyclin D1表达是指降低Cyclin D1表达水平；抑制甲状腺癌细胞内c-Myc表达是指降低c-Myc表达水平；抑制甲状腺癌细胞内MMP9表达是指降低MMP9表达水平；抑制甲状腺癌细胞内MMP13表达是指降低MMP13表达水平；促进甲状腺癌细胞内Bax表达是指提高Bax表达水平。

在本发明的第二个典型的实施方式中，提供一种抑制甲状腺癌细胞迁移和/或增殖的药物组合物，其活性成分为XPR1抑制剂。

在本发明的一个或一些实施方式中，所述药物组合物还包括与所述抑制剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。

在本发明的第三个典型的实施方式中，提供一种抑制甲状腺癌细胞迁移和/或增殖的产品，其特点是：包含所述药物组合物。

在本发明的一个或一些实施方式中，所述产品为药物。

在本发明的一个或一些实施方式中，所述产品还包含药学上可接受的辅料，所述辅料为药物制剂中的常规辅料，如润滑剂、黏合剂、崩解剂等，优选为淀粉、羧甲基纤维素钠、甘油、甜菜碱等其中的一种或多种。

在本发明的一个或一些具体的实施方式中，所述甲状腺癌细胞为TPC-1细胞和/或BCPAP细胞和/或FTC细胞。

在本发明中，药物可以是任何可药用的剂型，包括片剂、胶囊剂、口服液、糖浆剂、颗粒剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、注射剂、栓剂、霜剂、喷雾剂、滴丸剂、缓释制剂和控释制剂等。

在本发明中，所述表达水平是指基因表达水平，所述基因表达水平是通过该基因转录的mRNA的多少来衡量的。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例

一、材料与方法

1.1 生物信息学分析

从TCGA数据库下载具有完整临床病例特征（年龄、性别、LNM、肿瘤大小、临床分期等）的甲状腺癌患者信息进行分析。GSEA 软件（GSEA v3.0，http://www.broadinstitute.org/gsea）用于在 TCGA 数据库的低 XPR1和高 XPR1表达组之间进行单基因富集分析。

1.2 RNA提取、逆转录以及定量实时荧光聚合酶链反应（qRT-PCR）

1.2.1 RNA提取

1.2.1.1 组织标本：从冻存管中取出，放入1.5 ml EP管，加入1 ml Trizol裂解液。之后用组织匀浆机将其充足裂解，后于冰上静置。细胞标本：弃板上清，加入1 ml PBS洗涤一次，尽量吸尽废液，加入1 ml Trizol裂解液，静置5 min后吹打转至1.5 ml EP管中。

1.2.1.2预冷离心机4℃，向EP管中打入200 µl氯仿，剧烈震荡20下左右，然后静置五分钟。随后12000 rpm 20分钟离心。同时准备相同管数的EP管，预先加入400 µl异丙醇，将管子插到冰上预先降温。

1.2.1.3取EP管中分层最上面的上清液，转至事先准备好的EP管中，注意不要抽到其他层次的液体。然后轻柔旋转EP管，于-20℃静置至少1小时。随后12000 rpm离心1小时。

1.2.1.4吸尽上清，加入1 ml预冷的无水乙醇，以12000 rpm离心5分钟。

1.2.1.5 尽量吸尽上清，可见底部白色沉淀，于室温静置干燥，待其转为啫喱状时，加入50 µl去酶水轻轻吹打混匀。将样品置于冰上。

1.2.1.6用分光光度计检测RNA纯度（260 nm/280 nm吸光度比值于1.8 - 2.0之间最为理想）及浓度，并记录。

1.2.2 RNA逆转录

1.2.2.1 miRNA逆转录：本流程遵循瑞博公司的miRNA逆转录试剂盒的标准实验流程。反应液的配制体系为10 µl: 5 µl（RNA模板1 µg+去酶水）+2 µl反应1×buffer+2 µl酶+1 µl特定miRNA逆转录引物。轻轻打匀混合液后，于PCR机进行反应：42℃ 60 min, 98℃ 5min，4℃维持。可将得到的cDNA置于在-20℃冰箱中保存。

1.2.2.2 qRT-PCR：根据Takara公司PCR试剂盒RR820A操作说明进行实验。体系为10 µl: 4 µl cDNA+5 µl buffer+0.5 µl正反引物+0.2 µl ROX染料。于ABI 7500fast进行如下反应：95℃预变性30 s，随后95℃加热变性5 s、60℃退火延伸34 s循环40次。miRNA引物及其对照U6由瑞博公司提供，其他基因及其内参基因GAPDH引物由上海生工公司合成。最后用2^-△△CT检测基因的相对于参照的表达量。△CT等于目标基因CT减去内部参考基因CT。所用基因引物如下所示：

XPR1：

Forward-TGTGTATCCACTTGCCCTTTAT（序列表SEQ ID No:3），

Reverse-CAGCCAAAACCGGGATTTATAG（序列表SEQ ID No:4）；

Cyclin D1:

Forward-GCTGCGAAGTGGAAACCATC（序列表SEQ ID No:5），

Reverse-CATGGAGGGCGGATTGGAA（序列表SEQ ID No:6）；

c-Myc：

Forward-CGACGAGACCTTCATCAAAAAC（序列表SEQ ID No:7），

Reverse-CTTCTCTGAGACGAGCTTGG（序列表SEQ ID No:8）；

MMP9：

Forward-GACATCGTCATCCAGTTTGG（序列表SEQ ID No:9），

Reverse-TGGCCTTGGAAGATGAATGG（序列表SEQ ID No:10）；

MMP13：

Forward-AGTTCCAAAGGCTACAACTT（序列表SEQ ID No:11），

Reverse-CGCCAGAAGAATCTGTCTTT（序列表SEQ ID No:12）；

GAPDH：

Forward-GGTCGGAGTCAACGGATTTG（序列表SEQ ID No:13），

Reverse-ATGAGCCCCAGCCTTCTCCAT（序列表SEQ ID No:14）。

1.3 细胞培养

1.3.1 细胞培养条件：TPC-1及KTC-1于10%血清浓度的1640培养液中培养，FTC在10% DMEM培养基中进行培养。培养条件为37℃、5%CO₂、95%空气。每周至少更换培养液2次。

1.3.2 细胞复苏：将储存细胞的管子从液氮中取出后马上放入37℃水浴箱中，待管内无成形冰柱后，抽出并加到已放置2 ml新鲜10%血清的培养液的15 ml离心管中，2000rpm离心5分钟。之后轻轻取出试管，随机用移液器弃去上清，加入培养液3 ml吹打混匀，移至培养瓶中，十字摇匀。一小时后或第二天早上显微镜下评估细胞整体情况。

1.3.3 细胞传代及冻存：吸尽培养瓶中液体，加入1 ml PBS洗尽剩下的培养液，再加入1 ml PBS及1 ml胰酶。待细胞整体变圆，部分飘落的时候，加入1 ml带血清培养液来停止消化。吹打并收集残留细胞，1000 rpm离心5分钟。吸尽上清，1 ml培养液打匀重悬后，取1/4细胞加入已加有培养液的细胞培养瓶。十字摇匀，移至培养箱中培养。或弃上清，2 ml含10%二甲基亚砜培养液重悬后，各取1ml细胞加入冻存管中，后将管子移至程序性降温盒（内含异丙醇）。将盒子放到-80℃冰箱，次日取出细胞，登记记录，移至液氮。

1.4 细胞转染

1.4.1 铺板：将TPC-1，KTC-1及FTC细胞按上述传代流程消化下来，进行细胞计数，将10万细胞铺至事先加入1 ml培养液润盘的六孔板上。十字摇匀后放入细胞培养箱。

1.4.2 转染：第二天，取出细胞并于镜下注意细胞的密度，若汇合度达50%到65%之间，可进行下一步的转染操作。用OPTI培养基配置转染混合液，Si-RNA每孔7 µl，用LipofectamineTM RNAiMAX（每个孔3.5 µl）辅助转染；质粒每孔约1 µg，各用2 µlLipofectamineTM 3000及p3000辅助转染。所有的脂质体均需预先混合后平均分配至各孔。将混合液打入细胞前将需更换培养液。转染后48小时收集细胞用于下一步实验。

靶向XPR1的Si-RNA序列为:

Sense 5’-GCAUGCUUCUUUGCUCCAATT-3’（序列表SEQ ID No:1）

Antisense 5’-UUGGAGCAAAGAAGCAUGCTT-3’（序列表SEQ ID No:2）

1.4.3 转染效率检测：用上述提取RNA、逆转录、qRT-PCR的方法检测转染效率。

1.5 集落形成实验及CCK-8实验

CCK-8试剂中含有WST-8，它能被线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原产生黄色物质。该颜色在450 nm波长测到的吸光度能间接得出细胞的活性。

1.5.1 收集细胞：取出上述铺板转染后的细胞，于镜下查看细胞情况，若状态良好可进行下一步实验。抽尽六孔板中的培养液，用1 ml PBS洗一次，再加入1 ml胰酶消化，待细胞变圆或部分细胞离壁即用含血清培养液终止，吹收细胞至15 ml离心管，1000 rpm离心5分钟。

1.5.2 计算细胞量：吸尽上清，利用1 ml 培养液重悬，取10 µl进行计数。CCK-8实验测量先于96孔板中铺上细胞，集落形成实验预先于6孔板中铺上细胞，两个实验的细胞量要求：每孔1000个细胞，CCK-8每组细胞一共测量4天，每天设置5个副孔，集落形成实验每组设置2个副孔，结合误差总需25个孔。取2.5万个细胞混入2.5 ml培养液中（每100 µl有1000个细胞）。

1.5.3 CCK-8实验测量：取上述配好的悬液100 µl，沿着孔侧壁铺入96孔板中。尽量铺在96孔板的中间位置，避免蒸发对细胞生长带来的影响。分别于铺板后第24、48、72以及96小时加入CCK-8试剂进行测量：先抽尽当天需测量孔内的培养液，然后用培养液配置10%的CCK-8试剂，每孔避光加入100 µl后置于培养箱，于加入后3 h于酶标仪中检测（450nm波长），绘制增殖曲线。

1.5.4 集落形成实验：事先于六孔板各孔中加入2 ml培养液，随后取上述悬液100µl加入孔中，十字摇匀后静置5 min，移入培养箱。第5-7天取出显微镜下观察，若有多于30个克隆群，每群多于50个细胞，即可进行下一步操作。吸尽培养液，用PBS洗一遍，然后用4%的多聚甲醛固定15分钟。吸尽液体，可回收再利用一次，最后用0.1%的结晶紫染色10分钟。吸尽液体后纯水洗一次，后拍照手动计算细胞数目。

1.6 Transwell迁移实验及Matrigel侵袭实验

1.6.1收集细胞：使用上述方法收集铺板转染后的细胞，进行细胞计数。

1.6.2计算细胞量：Transwell实验上室需3.5万的细胞量，而Matrigel Transwell小室上室需5万的细胞量。

1.6.3 Transwell小室放置及收取：将Transwell小室放入含600 µl 10%有血清培养液的24孔板中，以斜角方向放置，避免产生气泡。取相应细胞量的液体加到小室，用无血清培养液补足各孔上室液体至300 µl。用100 µl移液器轻柔打匀。后将24孔板放到37℃、5%CO₂培养箱。20小时后取出小室，弃去上面的培养液，PBS清洗一遍。对下表面进行固定染色。操作同1.5.4。然后用棉棒擦去上室表面剩余的液体及细胞，晾干后置于倒置显微镜下观察（物镜20×），随机选取五个视野计数。

1.6.4 Matrigel小室放置及收取：从-20℃冰箱中取出Matrigel小室，预先将小室放入含600 µl 10%有血清培养液的24孔板中，以斜角方向放置，避免产生气泡。随后将24孔板移入培养箱中存放30分钟，使冰冻的基质胶液化。随后取出，将上述细胞量的细胞悬液加入上室，用无血清培养液补足各孔上室液体至300 µl。随后用100 µl移液器打匀。后将24孔板移到培养箱内。24小时后取出，弃上室培养液，PBS清洗一遍。对下表面进行固定染色，操作同上。然后用棉棒擦去上室面剩余液体及细胞，晾干后置于镜下观察（物镜20×），随机选取五个视野计数。

1.7 细胞凋亡的检测

1.7.1 收集细胞：取出转染后48小时的细胞，准备相应管数的15 ml离心管，并标记。抽尽液体，将液体移至离心管。加入1 ml PBS洗一次，收集洗涤液于离心管，再加入1 mlPBS及1 ml胰酶进行消化，待细胞稍变圆或稍有飘动时加入有血清培养液，吹打收集于离心管，1000 rpm离心5分钟。

1.7.2 洗涤细胞：弃上清，用1 ml PBS洗涤一次，1000 rpm离心5分钟。重复洗三次。之后用ddH₂O配置1×的缓冲液。

1.7.3 Annexin V染色：吸尽上清，尽量吸干，然后加入300 µl 1×缓冲液，微微吹打混匀细胞，并将悬液移至流式管，加入3 µl 异硫氰酸荧光素（FITC），避光孵育15分钟。

1.7.4 PI（碘化丙啶）染色：加入3 µl PI，避光孵育5分钟。

1.7.5 上机及分析：用流式细胞仪高速收集细胞并记录储存。用Flowjo分析数据结果，并计算凋亡率（Apoptosis rate）% = 早期凋亡百分比（第三象限）+ 晚期凋亡百分比（第二象限）。

2.1 蛋白印迹法

2.1.1 细胞蛋白提取：收集转染后48小时的细胞，步骤同1.5.1。加入1000 µlRIPA裂解液（强），静置5分钟，用刮刀收集细胞至1.5 ml EP管中，将其12000 rpm离心15min，取上清液移至新的1.5 ml EP管中。

2.1.2 蛋白浓度测定：根据说明书绘制标准曲线。配置测定蛋白样品浓度的体系，（5 µl样品+95 µl双蒸水），将5 µl待测样品加入96孔板之中，再加95 µl双蒸水并充分吹打。按照1: 50的比例加入BCA试剂B和A配制BCA显色液，在样品的孔中分别加入200 µl新制的BCA显色液，37℃恒温敷箱中孵育30 min，BCA显色液液需现配现用。使用多功能酶标仪测量所有标准品及样品在A562处的吸光度，结合蛋白标准曲线，根据待测蛋白样品吸光度计算出相应样品中蛋白的浓度。

2.1.3 上样蛋白样品的制备

向细胞提取的总蛋白中加入将适当体积的5×Buffer（加入1/4总蛋白体积的5×Buffer，使总蛋白中Buffer终浓度为1×），振荡混匀后，放置在97℃的金属煮样器上将蛋白样品煮沸10 min，取出后放置于冰上冷却。根据测定的蛋白浓度，调整每个样品的上样量为20 µg，随后用1×Buffer将所有蛋白样品的体积补齐到20 µl。

2.1.4 蛋白电泳

配制5%的浓缩胶和10%的分离胶，将胶架到电泳槽内槽架子上，在电泳槽内槽加入1×电泳液，将预制胶内侧上样孔浸没，再将样品加入上样孔内。在电泳槽外槽倒入1×电泳液，50V恒压电泳跑胶，当蛋白中的溴酚蓝出现在凝胶底部后，关闭电源，停止电泳，取下玻璃板，取出含有蛋白样品的凝胶放入转膜液中准备转膜。

2.1.5 转膜

转膜前先将PVDF膜裁剪为合适大小，浸泡于甲醇中，放置于摇床上活化5 min。将厚滤纸和薄滤纸浸润在预冷好的转膜液中，按照以下顺序放入转膜夹上：转膜夹白板-海绵垫-厚滤纸1层-薄滤纸2层-PVDF膜-含有蛋白样品的凝胶-薄滤纸2层-厚滤纸1层-海绵垫-转膜夹黑板，各层叠加时应当注意排出各层之间的气泡，再锁紧转膜夹，并将转膜夹白板面对转膜红黑盒子红面，然后把红黑盒子放入转膜槽中，红面放在正极处，随后加入预冷的1×电转液，使电转液浸没转膜内凝胶所在位置，将转膜槽放冰中，恒压25V过夜转膜。

2.1.6 封闭

转膜结束后，将PVDF膜用镊子取出，浸泡在1×TBST中，比对蛋白Marker大小，根据所需蛋白的大小对PVDF膜进行裁剪，然后将裁剪好的膜放入预先配制好的5%脱脂牛奶中（每条膜约10 ml），在摇床上轻轻摇晃，常温封闭90 min 后，回收牛奶，用1×TBST洗膜4次，每次5 min。

2.1.7 孵育一抗

一抗的使用比例根据抗体说明书上的推荐比例进行配制，抗体稀释液使用含有5%BSA的1×TBST溶液。将洗好的膜浸泡在稀释后的一抗中，放在4℃冰箱的摇床上孵育8-10 h后，收回一抗，保存在4℃冰箱内，再用1×TBST洗膜4次，每次5 min。

2.1.8 孵育二抗

分别选取一抗相对应种属的二抗，用封闭后回收的5%脱脂牛奶，按照二抗的抗体说明稀释二抗（浓度1: 10000）。洗膜完成后弃去TBST，将PVDF放入稀释好的二抗中，放置于室温低速摇床上孵育60 min，孵育完成后弃去二抗，用1×TBST洗膜4次，每次5 min，1×TBST洗膜两遍，每次4 min。

2.1.9 曝光

加入显影试剂后，用Odyssey扫描仪曝光。

2.2 统计分析

所有的实验部分内容都单独重复了三次。对于计量资料，利用Shapiro-Wilk检验数据是否符合正态分布。正态分布的两组数据采用t检验来比较，而非正态分布的两组数据使用Mann-Whitney秩和检验。双因素方差分析用于CCK-8检测的数据分析。所有统计分析的结果，以p值<0.05认为其结果有显著性差异（*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001）。

二、实验结果

通过上述实验过程，可以发现以下结果：

1. XPR1在甲状腺癌细胞系中高表达，并促进其增殖，XPR1抑制剂可有效抑制甲状腺癌细胞系的增殖能力

首先检查了甲状腺癌细胞和正常甲状腺细胞中XPR1的mRNA水平。发现相较于正常甲状腺细胞HTORI-3，XPR1在TPC-1、BCPAP和FTC三种细胞系中显著高表达（图1）。于是使用小干扰RNA（Si-RNA）敲低TPC-1、BCPAP和FTC三种细胞系中的XPR1。在三种细胞系中，Si-RNA能够在mRNA水平和蛋白水平均降低了XPR1的表达（图2-3）。然后，评估了XPR1对甲状腺癌细胞增殖能力的影响。使用细胞计数试剂盒（CCK-8）分析，发现敲低XPR1会降低甲状腺癌细胞的增殖能力（图4）。此外，克隆形成实验也表明了同样的结论（图5）。因此，降低甲状腺癌细胞系中XPR1的表达会抑制其增殖能力。即高表达的XPR1能促进甲状腺癌细胞增殖，XPR1抑制剂可有效抑制甲状腺癌细胞系的增殖能力。

2.XPR1的过表达促进了甲状腺癌细胞的迁移和侵袭能力，XPR1抑制剂可有效抑制甲状腺癌细胞系的迁移和侵袭能力

为了评估XPR1对甲状腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响，我们进行了Transwell迁移实验和Matrigel侵袭实验。相较于转染Si-NC的细胞，转染Si-XPR1后的TPC-1、BCPAP和FTC的迁移和侵袭能力明显下降（图6-7）。因此，推断高表达的XPR1能促进甲状腺癌细胞的侵袭转移，XPR1抑制剂可有效抑制甲状腺癌细胞系的迁移和侵袭能力。

3. XPR1在甲状腺癌细胞系中抑制凋亡，并且激活细胞增殖和迁移相关基因的表达，XPR1抑制剂可有效促进甲状腺癌细胞系的凋亡

为了探索XPR1在甲状腺癌中致癌作用的机制，采用了单基因富集分析（GSEA）来查找甲状腺癌组织中可能受XPR1调控的基因。根据XPR1表达水平，将TCGA数据库中的甲状腺癌患者分为高表达组和低表达组。发现参与细胞凋亡的基因与XPR1的表达相关（图8）。因此，先用流式细胞仪检测敲低XPR1后甲状腺癌细胞的凋亡程度。发现每个细胞系敲低组的凋亡率均高于对照组，并且以晚期凋亡增加为主（图9）。进一步探究敲减XPR1加速甲状腺癌细胞凋亡的机制，发现敲低XPR1，减少了p65的磷酸化（图10），并且抑制了p65的核易位（图11）。图12所示的RT-qPCR结果显示，XPR1调控了细胞增殖和迁移相关基因的表达。即高表达的XPR1能抑制甲状腺癌细胞凋亡，并激活细胞增殖和迁移相关基因的表达，XPR1抑制剂可有效促进甲状腺癌细胞系的凋亡。

三、讨论与总结

甲状腺癌（TC）的发病率在近30年里已增长了三倍以上，是最常见的内分泌肿瘤。虽然大多数的甲状腺癌通过手术和放射性碘治疗后可得到有效的控制，但仍有一些分化良好的甲状腺癌和多数低分化型及未分化型甲状腺癌有着较高的死亡率。局部复发患者的总生存率约为70％-85％，而远处转移患者的长期生存率则为30％-60％。因此，寻找并确定可以区分高危和低危甲状腺癌患者的生物标志物就显得尤为重要。

异种和多型逆转录病毒受体（XPR1）是具有多个跨膜结构域的696个氨基酸的蛋白质。XPR1最开始被定义为异嗜性和多嗜性类鼠白血病病毒的特异性细胞表面受体。据报道，XPR1 还介导 G 蛋白募集并在G蛋白偶联信号转导中发挥一定作用。基于其与参与磷酸转运调节的蛋白质（包括 PHO1、PHO90和 PHO91）的同源性，XPR1 也被认为是人体细胞中的无机磷酸盐输出蛋白。也有多项研究发现，XPR1已被证明与β型血小板衍生生长因子受体（PDGFRB）相互作用，并在维持大脑中的细胞磷酸盐平衡方面发挥重要作用，是一种涉及原发性家族性遗传病脑钙化（PFBC）的致病基因。然而，XPR1在人类恶性肿瘤中，尤其是在甲状腺癌中的作用还有待于进一步研究。本发明发现高表达的XPR1能促进甲状腺癌细胞增殖和侵袭转移，同时抑制甲状腺癌细胞凋亡。并发现XPR1基因通过激活细胞增殖和迁移相关基因的表达而发挥其致癌作用。敲减XPR1基因能有效地降低甲状腺癌的增殖和迁移能力。同样的，在流式细胞实验中亦证实了敲减XPR1基因能明显促进甲状腺癌细胞的凋亡。

综上所述，XPR1基因能够促进甲状腺癌细胞的增殖和迁移能力，XPR1抑制剂可以有效抑制甲状腺癌细胞的增殖和迁移能力。

以上所揭露的仅为本发明较佳的实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

序列表

<110> 温州医科大学附属第一医院

<120> XPR1抑制剂在制备抑制甲状腺癌细胞迁移和或增殖的产品的应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213>人工序列

<400> 1

gcaugcuucu uugcuccaat t 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213>人工序列

<400> 2

uuggagcaaa gaagcaugct t 21

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 3

tgtgtatcca cttgcccttt at 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 4

cagccaaaac cgggatttat ag 22

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gctgcgaagt ggaaaccatc 20

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 6

catggagggc ggattggaa 19

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 7

cgacgagacc ttcatcaaaa ac 22

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 8

cttctctgag acgagcttgg 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 9

gacatcgtca tccagtttgg 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 10

tggccttgga agatgaatgg 20

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<212> DNA

<213>人工序列

<400> 11

agttccaaag gctacaactt 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 12

cgccagaaga atctgtcttt 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 13

ggtcggagtc aacggatttg 20

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 14

atgagcccca gccttctcca t 21

Claims

1. XPR1抑制剂在制备抑制甲状腺癌细胞迁移和/或增殖的产品的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述产品为药物。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述甲状腺癌细胞为TPC-1细胞、BCPAP细胞、FTC细胞中的一种或多种。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述XPR1抑制剂是指能够降低XPR1含量或表达水平的产品。

5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于：所述XPR1抑制剂为靶向XPR1的特异性小干扰Si-RNA。

6.一种抑制甲状腺癌细胞迁移和/或增殖的药物组合物，其特征在于：其包括XPR1抑制剂。

7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于：所述XPR1抑制剂是指能够降低XPR1含量或表达水平的产品。

8.根据权利要求6或7所述的药物组合物，其特征在于：所述XPR1抑制剂为靶向XPR1的特异性小干扰Si-RNA。