CN113792568B - 确定用于判断细胞状态的关键特征的方法 - Google Patents
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Abstract
本文提供了一种确定用于判断细胞状态的关键特征的方法，包括以下步骤：在第一拉曼位移下针对细胞的样本执行受激拉曼散射成像，以获得关于样本脂质信号强度的第一SRS图像；在第二拉曼位移下针对样本执行受激拉曼散射成像，以获得关于样本的蛋白质信号强度的第二SRS图像；根据第一和第二SRS图像确定样本中脂质和蛋白质的分布信息；基于分布信息提取至少一个形态特征、至少一个代谢特征和至少一个成像特征，计算上述特征中任意两个特征之间的相关系数和/或相同特征的统计学差异，根据计算得到的相关系数和/或统计学差异判断对应的特征是否为关键特征。
Description
技术领域
本文涉及一种判断生物组织状态的方法，具体而言，本文涉及一种确定用 于判断细胞状态的关键特征的方法。
背景技术
外科手术的众多目的之一是将病变组织(即，病灶组织)从患者身体上切 除，从而达到治疗的目的。手术切缘等级是评价手术的重要指标，它与病变组 织(例如，肿瘤)浸润深度密切相关，可作为局部复发、远处转移率及患者存 活率的预测指标之一。
倘若外科医生在手术期间能够随时得知切缘状态，便能够及时调整手术方 案，在保证对患者造成的损伤最小的同时最大程度切除病变组织，从而保证手 术成功率、降低术后复发率、提高患者生存率。常用的病变组织切缘检测包括 病理学检测、冰冻切片，对于特定的癌症组织还有荧光示踪、OCT、显微成像、拉曼光谱等切缘检测方法。其中病理学检测是切缘检测的金标准。
病理学检测首先观察样本的病理改变，然后用病理组织学方法制成病理切 片，在显微镜下使用免疫组化的方法进一步检查病变。冰冻切片指在低温条件 下使组织快速冷却到一定硬度，制作成切片用于快速检测，相比于病理学检测 更迅捷，可用于术中检测。荧光示踪指在切缘处喷洒特异性荧光药物，能与病 变细胞紧密结合，在特制眼镜下能够观察到病变组织发出的淡淡荧光OCT又 称光学相干断层扫描技术，它可以实现对生物组织高分辨率的非侵入层析测量， 常用于眼科、皮肤科、牙科。显微成像技术指视频帧率的结构化照明显微镜，对病变组织的成像结果能够与病理切片结果相互对应。拉曼光谱利用的是不同分子键振动频率不同，激发光下所产生的拉曼光谱频移不同，从而识别病变细 胞与正常细胞。
然而，上述常规方法存在各种不足。例如，荧光示踪方案对病变组织的特 异性不足70％，且需要佩戴特制的眼镜并保持环境光较暗才能识别；病理学检 测虽然特异性和敏感性都极高，是临床检测金标准，但耗时非常长，往往超过 了24小时，不能够运用到术中检查；冰冻切片相对于病理学检测所需时长明 显降低，但仍大于30分钟，且对于特定的病变组织(例如，胰腺癌细胞)敏 感性只有50％；显微镜成像的方案特异性高于80％，但耗时在一小时以上，且 上述高特异性也仅是针对前列腺癌；OCT成像方案敏感性和特异性均高于90％， 但同样存在实时性较差的问题，做一次检测所需时间在30分钟以上，不利于术中检测；拉曼光谱方法的敏感性和特异性都在90％以上，且能够做到实时检 测，但其给医生反馈的是光谱信息，与医生所习惯的组织细胞图像差异较大， 因此存在较高的学习成本。
因此，需要一种能够快速且相对精确地判断生物组织(特别是细胞)的当 前状态的方法，特别是需要一种能够确定用于判断细胞状态的关键特征的筛选 方法。
发明内容
为了解决上述提及的常规方法中存在的(1)短耗时、高特异性、高灵敏 性不可得兼；(2)普适性较差，部分方法仅能用于特定的病变组织切缘检测； 以及(3)学习成本较高，与医生习惯不符，不利于上手的缺点，发明人一直致力于是否能够从细胞中的一些特定特征中快速且较准确地判断细胞当前状 态。
为了能够确定用于判断细胞当前状态的关键特征，本申请使用双通道受激 拉曼散射(SRS)成像的方法对切缘脱落细胞成像，利用Two-Colour成像方案 绘制高分辨率化学分布图，并基于该化学分布图提取“蛋白质-脂质比”、“核质 比”等多个细胞特征，并从中确定能够用于快速且较准确地判断细胞当前状态 的关键特征。
为了实现上述目的，根据本文的一个方面，一种确定用于判断生物组织状 态的关键特征的方法，包括以下步骤：在第一拉曼位移下，针对样本中的细胞 执行受激拉曼散射成像，以获得关于所述样本的脂质信号强度的第一受激拉曼 散射(SRS)图像；在第二拉曼位移下，针对所述样本执行受激拉曼散射成像，以获得关于所述样本的蛋白质信号强度的第二SRS图像；根据所述第一SRS 图像和所述第二SRS图像确定所述样本中关于脂质和蛋白质分布的分布信息； 基于所述分布信息进行提取所述样本中的所述细胞的至少一个形态特征、至少 一个代谢特征和至少一个成像特征，并且计算所述至少一个形态特征、所述至少一个代谢特征和所述至少一个成像特征中的任意两个特征之间的相关系数； 以及根据所述相关系数确定对应的特征是否为所述关键特征。
优选地，在上述方法中，所述第一拉曼位移介于2840-1和2860cm-1之间， 且所述第二拉曼位移介于2920cm-1和2940cm-1之间。
优选地，在上述方法中，所述第一拉曼位移为2850cm-1，所述第二拉曼位 移为2930cm-1。
优选地，在上述方法中，根据以下公知确定所述样本中关于脂质和蛋白质 分布的所述分布信息：
其中S1是所述第一SRS图像中的所述脂质信号强度，S2是所述第二SRS 图像中的所述蛋白质信号强度，A1、A2、B1和B2是系数，P1是所述样本中脂 质的比例，并且P2是所述样本中蛋白质的比例。
优选地，在上述方法中，进一步包括以下步骤：对纯样脂质执行受激拉曼 散射成像，以获得所述纯样脂质的S1和S2，其中所述纯样脂质的P1＝1并且 P2＝0；将所获得的所述纯样脂质的S1、S2、P1和P2代入所述公式中，以获得 系数A1和A2；对纯样蛋白质执行受激拉曼散射成像，以获得所述纯样蛋白质 的S1和S2，其中所述纯样蛋白质的P1＝0并且P2＝1；将所获得的所述纯样蛋白 质的S1、S2、P1和P2代入所述公式中，以获得系数B1和B2。
优选地，在上述方法中，所述至少一个形态特征包括所述多个样本中的所 述细胞的面积、长轴长、短轴长、离心率、直径、周长、细胞重心横坐标、细 胞重心纵坐标、细胞方向或上述特征的组合；所述至少一个代谢特征包括所述 多个样本中的所述细胞的脂滴数量、脂滴面积、脂滴到细胞重心的平均距离、 脂滴到细胞重心的相对距离、脂质和蛋白质的比率、核质比、细胞核面积、细胞质面积或上述特征的组合；并且所述至少一个成像特征包括所述多个样本中 的所述细胞的脂质平均强度、蛋白质平均强度、脂滴平均强度、细胞核平均强 度或上述特征的组合。
根据本文的另一个方面，提供了一种确定用于判断细胞状态的关键特征的 方法，包括以下步骤：在第一拉曼位移下，针对所述细胞的多个样本的细胞执 行受激拉曼散射成像，以获得关于所述多个样本的脂质信号强度的多个第一受 激拉曼散射(SRS)图像；在第二拉曼位移下，针对所述多个样本的细胞执行 受激拉曼散射成像，以获得关于所述多个样本的蛋白质信号强度的多个第二 SRS图像；根据所述多个样本的每一个的所述第一SRS图像和所述第二SRS 图像确定相应样本中关于脂质和蛋白质分布的分布信息；基于所述分布信息进 行提取所述多个样本的所述细胞的至少一个形态特征、至少一个代谢特征和至少一个成像特征；计算所述多个样本中的所述至少一个形态特征、所述至少一 个代谢特征和所述至少一个成像特征中的相同特征的统计学差异；以及根据所 述统计学差异确定对应的特征是否为所述关键特征。
优选地，在上述方法中，所述第一拉曼位移介于2840cm-1和2860cm-1之 间，且所述第二拉曼位移介于2920cm-1和2940cm-1之间。
优选地，在上述方法中，所述第一拉曼位移为2850cm-1，所述第二拉曼位 移为2930cm-1。
优选地，在上述方法中，根据以下公知确定所述样本中关于脂质和蛋白质 分布的所述分布信息：
其中S1是所述第一SRS图像中的所述脂质信号强度，S2是所述第二SRS 图像中的所述蛋白质信号强度，A1、A2、B1和B2是系数，P1是所述样本中脂 质的比例，并且P2是所述样本中蛋白质的比例。
优选地，在上述方法中，进一步包括以下步骤：对纯样脂质执行受激拉曼 散射成像，以获得所述纯样脂质的S1和S2，其中所述纯样脂质的P1＝1并且 P2＝0；将所获得的所述纯样脂质的S1、S2、P1和P2代入所述公式中，以获得 系数A1和A2；对纯样蛋白质执行受激拉曼散射成像，以获得所述纯样蛋白质 的S1和S2，其中所述纯样蛋白质的P1＝0并且P2＝1；将所获得的所述纯样蛋白 质的S1、S2、P1和P2代入所述公式中，以获得系数B1和B2。
优选地，在上述方法中，所述至少一个形态特征包括所述多个样本中的所 述细胞的面积、长轴长、短轴长、离心率、直径、周长、细胞重心横坐标、细 胞重心纵坐标、细胞方向或上述特征的组合；所述至少一个代谢特征包括所述 多个样本中的所述细胞的脂滴数量、脂滴面积、脂滴到细胞重心的平均距离、脂滴到细胞重心的相对距离、脂质和蛋白质的比率、核质比、细胞核面积、细 胞质面积或上述特征的组合；并且所述至少一个成像特征包括所述多个样本中 的所述细胞的脂质平均强度、蛋白质平均强度、脂滴平均强度、细胞核平均强 度或上述特征的组合。
优选地，在上述方法中，进一步包括以下步骤：针对所述多个样本中的每 一个样本，计算每一个样本中的所述细胞的所述至少一个形态特征、所述至少 一个代谢特征和所述至少一个成像特征中的任意两个特征之间的相关系数；和 根据所述统计学差异和所述相关系数两者来确定对应的特征是否为所述关键 特征。
附图说明
为了能够更详细地理解本文的上述特征，可以通过参考实施方式来获得已 简要概述于前的本文的更详细的描述，实施方式中的一些绘示于附图中。然而， 值得注意的是，附图仅绘示了本文的典型实施方式，而由于本文可允许其他等 效的实施方式，因此附图并不会视为对本公开内容的范围的限制。
图1示出了根据本文的一个实施方式的确定用于判断细胞状态的关键特 征的方法的流程图。
图2示出了脂质与蛋白质的特征拉曼光谱图。
图3示出了样本细胞的蛋白质通道SRS原始成像和脂质通道SRS原始成 像的示例。
图4示出了样本细胞的Two-Color图像的示例。
图5示出了提取样本细胞的形态特征的示意图。
图6示出了提取样本细胞的代谢特征的示意图。
图7示出了计算特征之间的相关系数的示意图。
图8示出了根据本文的另一个实施方式的确定用于判断细胞状态的关键 特征的方法的流程图。
图9示出了计算特征的统计下差异的示意图。
为便于理解，在可能的情况下，使用相同的附图标记代表附图中相同的元 件。可以预期的是一个实施方式中的元件与特征可有利地用于其他实施方式中 或与其他实施方式结合以获得另外的实施方式，而无需赘述。
然而，值得注意的是，附图仅绘示了本发明的典型实施方式，而由于本发 明可允许其他等效的实施方式，因此附图并不会视为对本公开内容的范围的限 制。
具体实施方式
下面结合附图描述本文的具体技术方案。
图1示出了根据本文的一个实施方式的确定用于判断细胞状态的关键特 征的方法100的流程图。
方法100始于步骤S110，在步骤S110中，对样本细胞执行受激拉曼散射 成像，以获得关于样本细胞中脂质和蛋白质的SRS图像，其中SRS图像指示 了样本细胞中脂质和蛋白质在特定拉曼位移下的拉曼光强。接着，在步骤S120 中，根据在步骤S110中所获得的脂质和蛋白质的SRS图像进行后处理，从而 确定样本细胞中关于脂质和蛋白质分布的精确分布信息。接着，在步骤S130 中，从在步骤S120中确定的脂质和蛋白质的分布信息提取关于样本细胞的多 个特征。接着，在步骤S140中，对在步骤S130中所提取的多个特征计算这些特征两两之间的相关系数。最后，在步骤S150中，根据在步骤S140中所计算 的相关系数来确定相应的特征是否为可用于判断细胞状态的关键特征。
下文将详细描述图1中的方法100的各个步骤。
对于步骤S110，本文采用了双通道受激拉曼散射(SRS)成像的方法对切 缘脱落细胞成像。图2示出了脂质与蛋白质的典型拉曼光谱图。如图2所示， 其中横轴是拉曼位移，惯用单位是相对于激发光波长偏移的波数，若以厘米计， 则波数就是波长的倒数(cm-1)，纵轴是拉曼光强。
从图2中可以获知，脂质的拉曼光谱特点是在2850-2950cm-1之间有三个 峰，其中2850cm-1处的峰被公认为脂质的特征峰；蛋白质的拉曼光谱特点是在2850-2950cm-1间有一个峰和一个较低的“肩膀”，其中2930cm-1处的峰被 公认为蛋白质的特征峰。因此，在受激拉曼散射成像时，针对任一物质的特征 峰的拉曼位移大小来设置照射至检测物质的激光，即可激发该物质分子振动， 对其分布进行成像。例如，若希望大致获得脂质的空间分布情况，则可针对介于2840cm-1和2860cm-1之间的拉曼位移(例如，2850cm-1)进行激发成像， 若希望大致获得蛋白质的空间分布情况，则可针对介于2920cm-1和2940cm-1之间的拉曼位移(例如，2930cm-1)进行激发成像。因此，调整激光组合方式， 可以获得脂质通道和蛋白质通道的成像结果。
鉴于上述内容，在步骤S110中，根据本文的一个实施方式，在对样本细 胞执行受激拉曼散射成像时，针对第一拉曼位移进行激发成像，以获得大致关 于样本细胞的脂质分布(脂质的拉曼光强)的第一受激拉曼散射(SRS)图像， 并且针对第二拉曼位移进行激发成像，以获得大致关于样本细胞的蛋白质分布 (蛋白质的拉曼光强)的第二SRS图像。其中，如上文所述，第一拉曼位移可介于2840cm-1和2860cm-1之间，优选2850cm-1，且第二拉曼位移对介于2920cm-1和2940cm-1之间，优选2930cm-1。
在SRS系统中，通过对照射至样本细胞的PUMP光和STOKES光进行组 合以获得用于样本细胞的特定拉曼位移。通过公式(1)来基于特定拉曼位移 调整PUMP光和STOKES光的组合。
其中，λpump表示PUMP光的波长，λstokes表示STOKES光的波长。一般 而言，系统中STOKES光是固定不变的，例如，已知系统STOKES光固定在 1031nm。因此，可通过调制PUMP光的波来获得特定的拉曼位移 (Raman Shift)。例如，当需要检测样本细胞中脂质的分布而针对2850cm-1的拉曼位移进行激发成像时，通过公式(1)可计算得到PUMP光波长应为796.8nm。对于其他特定的拉曼位移以可以根据公式(1)计算特定的PUMP光和 STOKES光的组合。
然而，从图2中可以看出，在作为脂质特征峰的拉曼位移2850cm-1处， 蛋白质的信号强度并不为零。此时获得的第一SRS图像虽然能够大致指示样 本细胞中脂质的分布，而第二SRS图像中的信号强度既有脂质的贡献，也有 蛋白质的贡献，二者均有一定的占比。
同样，从图2中可以看出，在作为蛋白质特征峰的拉曼位移2930cm-1处， 脂质的信号强度也并不为零。此时获得的第二SRS图像虽然能够大致指示样 本细胞中蛋白质的分布，而第二SRS图像中的信号强度既有蛋白质的贡献， 也有脂质的贡献，二者均有一定的占比。
图3示出了样本细胞的SRS原始成像的示意图。其中，图3的(a)是样 本细胞的蛋白质通道的SRS原始成像，图3的(a)虽然能够大致指示样本细 胞中蛋白质的分布，但是该成像既有蛋白质的贡献，也有少量脂质的贡献，二 者均有一定的占比；图3的(b)是样本细胞的脂质通道的SRS原始成像，图 3的(b)虽然能够大致指示样本细胞中蛋白质的分布，但是该成像既有脂质的 贡献，也有少量蛋白质的贡献，二者均有一定的占比。
在步骤S120中，需要对在步骤S110中获得的关于脂质分布的第一SRS 图像和关于蛋白质分布的第二SRS图像进行后处理，以分别从第一SRS图像 和第二SRS图像中将脂质信号分量和蛋白质信号分量进行分离。
因此，在步骤S120中，根据本文的一个实施方式，使用Two-Colour图像 处理思路，利用矩阵运算将SRS图像中的两种信号进行分离。
根据以下公式(2)确定SRS图像中的脂质信号分量和蛋白质信号分量。
在公式(2)中，S1是在步骤S110中获得的第一SRS图像中的大致关于 脂质的信号强度，S2是在步骤S110中获得的第二SRS图像中的大致关于蛋白 质的信号强度，如上所述，S1和S2实际均包含有脂质信号分量和蛋白质信号 分量。在公式(2)中，A1、A2、B1和B2是系数，P1是样本细胞中脂质的比例， 并且P2是样本细胞中蛋白质的比例。
由于S1和S2是已知的，因此当确定了系数A1、A2、B1和B2之后，则可 以通过公式(2)分别计算出第一SRS图像和第二SRS图像中脂质和蛋白质的 实际比例。
根据本文的一个实施方式，可通过如下方式确定公式(2)中的系数A1、 A2、B1和B2。首先，准备纯样脂质的样本，并分别对纯样脂质的样本执行针 对第一拉曼位移和第二拉曼位移的受激拉曼散射成像，以获得纯样脂质的样本 在第一的SRS图像和第二SRS图像(即，纯样脂质的样本的S1和S2值)。由 于受激拉曼散射成像是针对纯样脂质的样本执行的，因此，在此情况下，P1必 然为1且P2必然为0。因此，可通过对纯样脂质的样本执行受激拉曼散射成像 确定系数A1和A2。其次，准备纯样蛋白质的样本，并分别对纯样蛋白质的样 本执行针对第一拉曼位移和第二拉曼位移的受激拉曼散射成像，以获得纯样蛋 白质的样本在第一的SRS图像和第二SRS图像(即，纯样蛋白质的样本的S1和S2值)。由于受激拉曼散射成像是针对纯样蛋白质的样本执行的，因此，在 此情况下，P1必然为0且P2必然为1。因此，可通过对纯样蛋白质的样本执行 受激拉曼散射成像确定系数B1和B2。结果，可确定系数A1、A2、B1和B2， 并通过公式(2)分别计算出样本细胞的第一SRS图像和第二SRS图像中脂质 和蛋白质的实际比例。
在通过公式(2)计算得到样本细胞的第一SRS图像和第二SRS图像中脂 质和蛋白质的实际比例之后，可通过从第一SRS图像中减去蛋白质分量以及 从第二SRS图像中减去脂质分量来对第一SRS图像和第二SRS图像进行后处 理，以获得样本细胞中关于脂质和蛋白质分布的分布信息。
图4示出了对样本细胞的第一SRS图像和第二SRS图像执行了后处理后 的示意图。其中，图4示出了准确反映了样本细胞的脂质分布的脂质分布图像、 准确反映了样本细胞的蛋白质分布的蛋白质分布图像和反映了样本细胞的脂 质和蛋白质的化学分布的Two-Colour合成图像。
在步骤S130中，从在步骤S120中确定的脂质和蛋白质的分布信息提取 关于样本细胞的多个特征。具体而言，根据本文的一个实施方式，期望从样本 细胞的脂质和蛋白质的分布信息提取的特征包含至少一个形态特征、至少一个 代谢特征和至少一个成像特征。
样本细胞的形态特征是指细胞物理上的特点，如细胞面积、长轴长、短轴 长、离心率、直径、周长、细胞重心横坐标、细胞重心纵坐标、细胞方向等。 样本细胞的代谢特征包含生物化学组分信息，如脂滴数量、脂滴面积、脂滴到 细胞重心的平均距离、脂滴到细胞重心的相对距离、脂质和蛋白质的比率、核 质比、细胞核面积、细胞质面积等。样本细胞的成像特征是指SRS图像信号 的强弱，由于SRS信号与分子浓度呈线性关系，因此SRS图像信号的平均强 度能够反映细胞中个生物化学组分的平均浓度，例如脂质平均强度、蛋白质平 均强度、脂滴平均强度、细胞核平均强度等。
根据本文的一个实施中，从样本细胞的脂质和蛋白质的分布信息提取的至 少一个形态特征包含细胞的细胞面积、长轴长、短轴长、离心率、直径、周长、 细胞重心横坐标、细胞重心纵坐标、细胞方向或上述特征的组合。
图5示出了提取样本细胞的形态特征的示意图。从图3可知，蛋白质比脂 质在细胞中的分布更加均匀，成像中细胞形态更加完整，因此，在一个实施方 式中，可利用样本细胞的蛋白质通道原始图像提取形态特征。首先，作为预处 理步骤，选择合适的阈值进行阈值分割，保留细胞信号，即，对蛋白质通道原 始图像进行二值化处理；接着，删除面积小于1000像素的连通域，从而最大 程度减少细胞碎片等杂质的干扰；接着，填充面积小于3000的孔洞，保证细胞形态的完整性；接着，做一次开运算，先腐蚀再膨胀，改善细胞间的连接状态，以便于后续分割细胞，结果如图5(a)所示。。
在如图5(a)所示的那样进行了预处理之后，使用基于距离变换的分水岭 算法，对预处理后的图像进行进一步分割。分水岭分割方法的基本思想是把图 像看作是地质学上的拓扑地貌，每一点的灰度值表示海拔高度，从局部极值慢 慢向外扩展，从而形成分水岭分割图像。先通过距离变换，细胞的中心位置成为局部极值点，标记后作为每个细胞的初始点，应用分水岭分割的方法，即可 获得较好的分割结果，其结果如图5(b)所示，不同的颜色表示不同的细胞。 若出现了过分割的情况，将在之后的数据处理过程中，基于细胞离心率、细胞 面积等特征值，去除非正常结果。
最后，基于分割结果，提取每一个细胞的形态特征。其中细胞面积、周长 的信息，直接来自于分割结果的图像的面积与周长；细胞的长轴长、短轴长、 离心率、重心横坐标、重心纵坐标信息，则来自于与细胞具有相同标准二阶中 心矩的椭圆；细胞方向来自于细胞长轴与X轴的夹角。
虽然上文描述了基于图3的蛋白质通道原始图像提取细胞的形态特征，但 在另一个实施方式中，也可以基于图4的示出的经处理的蛋白质分布图像来提 取细胞的形态特征。
需要注意，根据本文的一个实施方式，在执行对蛋白质和脂质原始SRS成 像进行处理并合成Two-Color图像的步骤120之前，可以进一步将图5(b)所 示的细胞分割结果作为掩模(mask)来对图3中的蛋白质和脂质原始SRS成 像进行过滤。通过将非细胞区域置零，去除不感兴趣的背景的干扰并保留感兴 趣的细胞区域，从而使得保证图像的干净清晰。
根据本文的一个实施中，从样本细胞的脂质和蛋白质的分布信息提取的至 少一个代谢特征包括所述样本中的脂滴数量、脂滴面积、脂滴到细胞重心的平 均距离、脂滴到细胞重心的相对距离、脂质和蛋白质的比率、核质比、细胞核 面积、细胞质面积或上述特征的组合。
对于关于样本细胞中脂滴的代谢特征，由于脂滴主要成分是脂质，因此可 以基于样本细胞的脂质分布(例如，上述所讨论的经后处理的第一SRS图像) 提取样本细胞的代谢特征。
图6示出了提取样本细胞的代谢特征的示意图。由图3(b)可知，细胞核 内脂质含量远小于细胞质，在脂质通道下亮度远小于细胞质，因此可以基于脂 质通道SRS原始成像提取细胞核信息。
首先，选取合适的阈值进行阈值分割，接着进行一次闭运算先膨胀后腐蚀， 填补部分裂缝，再基于图5(b)的分割结果过滤非细胞区域。其处理结果如图 6(a)所示，其中白色区域为细胞质，中间或边缘的黑色区域为细胞核。然后 计算细胞质的面积与细胞核的面积，从而得出核质比，即，互为倒数的“蛋白 质-脂质比”与“脂质-蛋白质比”。
此外，由图3(b)可知，脂滴是细胞中最亮的部分，因此设置2％为阈值， 将细胞亮度的前2％的像素视为脂滴，其结果如图6(b)所示，灰色小点即为 脂滴。故可基于图6(b)中由灰色小点表示的脂滴统计脂滴数量、脂滴面积、 脂滴重心坐标，计算每一个脂滴重心到细胞重心的距离的平均值，再用这个平 均值与细胞长轴长做比值，得到脂滴到细胞重心的相对距离。
虽然上文描述了基于图3的脂质通道原始图像提取细胞的形态特征，但在 另一个实施方式中，也可以基于图4的示出的经处理的脂质分布图像来提取细 胞的形态特征。
根据本文的一个实施中，从样本细胞的脂质和蛋白质的分布信息提取的至 少一个成像特征包括所述样本中的脂质平均强度、蛋白质平均强度、脂滴平均 强度、细胞核平均强度或上述特征的组合。
由于已经通过上文描述了如何获得样本细胞的脂质和蛋白质的分布、脂滴 的分布、细胞核的分布，因此，计算样本细胞内脂质、蛋白质、脂滴、细胞核、 细胞边界的灰度之和，分别除以对应的面积，可得其平均强度，从而获得样本 细胞的脂质平均强度、蛋白质平均强度、脂滴平均强度、细胞核平均强度。
接着描述步骤S140。在通过步骤S130测定了样本中细胞中的上述多个特 征的特征值之后，计算上述多个特征之间的任意两个特征之间的相关系数，该 相关系数表示了所选定的两个特征之间的相关程度。
图7示出了计算特征之间的相关系数的示意图。如图7的(a)所示，其 示出了同一样本中的所有细胞的特征A的统计分布直方图，横坐标表示特征 值的大小，纵坐标表示细胞数量，每一条统计柱的大小表示细胞数量的多少， 虽然没有示出，但可以基于相同的方式获得同一样本中的所有细胞的与特征A 不同的特征B的统计分布直方图。
如图7的(b)所示，其示出了同一样本中的所有细胞的特征A与特征B 的关系的细节体现，图中的每一个点代表了样本中的一个细胞，因此，图中的 点的数量对应于样本中所有细胞的数量。对于图7的(b)中的每一个点，其 Y轴的坐标表示了对应的细胞的特征A的特征值，并且其X轴的坐标表示了 对应的细胞的特征B的特征值。因此，由于图中的所有点所代表的细胞信息来 自同一样本，因此如图7(a)所示的这种散点的统计结果能够反映该组织样本 的特征A与特征B的关系。在图7(b)中，斜线Q表示采用最小二乘拟合的 方法获得的线性拟合结果。如果图7(b)中的所有点越接近拟合线Q，则特征 A和特征B的相关系数R的绝对值越接近1(相关系数R为0至1的范围内)， 表示该组织中的特征A与特征B越相关。因此，R的绝对值越接近1，特征A 与特征B越线性相关；R的绝对值越接近0，特征A与特征B越线性无关。
如图7的(c)所示，其示出了样本的所有细胞的所有特征的任意两个特 征之间的相关系数的可视化结果，横坐标依次为每一个特征，纵坐标依次同样 为每一个特征，例如，第一行第二列表示特征A与特征B的相关系数。如果两种特征的相关程度越高，则灰度越高，即越白(最高为1)，反之则灰度越 低，即，越黑(最低为0)。例如，图7的(b)所示的相关系数矩阵是对称矩 阵，因此对角线上的值全部为1。
接着描述步骤S150。发明人发现，了解同一样本的细胞不同特征的相关 程度，有助于分析其背后可能存在的生物学意义。有些特征相关性强是显然的， 如细胞长轴长与离心率的关系，而有些特征相关性强是意外的，这背后可能存 在值得深度发掘的生物学机制，而这种出乎意料的两特征之间的高相关性可能正是由于样本细胞处于不同的状态(例如正常状态和病变状态)所导致的。因 此，本文将上述具有出乎意料的高相关性所涉及的特征确定为用于确定样本细 胞的生物状态的关键特征，这有助于快速且相对精确地判断生物组织(特别是 细胞)的当前状态。例如，可以将步骤S140中计算得到的所有特征之间的相 关系数与预先确定的阈值相比较，当高于预定阈值且不属于必然高相关的特征 (例如细胞长轴长与离心率)时，则将该相关系数所涉及的特征确定为用于确 定样本细胞的生物状态的关键特征。在一些实施方式中，该阈值可以是0.5以 上，在另一些实施方式中，该阈值可以是0.6、0.7、0.8或甚至0.9。
图8示出了根据本文的一个实施方式的确定用于判断细胞状态的关键特 征的方法200的流程图。
方法200始于步骤S110，在步骤S110中，对多个样本中的细胞执行受激 拉曼散射成像，以获得关于多个样本中的细胞的脂质和蛋白质的SRS图像， 其中SRS图像指示了细胞中脂质和蛋白质在特定拉曼位移下的拉曼光强。接 着，在步骤S220中，根据在步骤S210中所获得的脂质和蛋白质的SRS图像 进行后处理，从而确定样本细胞中关于脂质和蛋白质分布的精确分布信息。接 着，在步骤S230中，从在步骤S220中确定的脂质和蛋白质的分布信息提取关 于样本细胞的多个特征。接着，在步骤S240中，对在步骤S230中所提取的多 个特征计算不同样本中的相同特征的统计下差异。最后，在步骤S250中，根 据在步骤S240中所计算的统计下差异来确定相应的特征是否为可用于判断细胞状态的关键特征。
方法200相较于图1示出的方法100的一个不同之处在于，方法200针对 多个样本中的细胞执行受激拉曼散射成像，获得样本细胞的脂质和蛋白质分布， 以及提取特征的过程，而方法100是针对一个样本中的细胞进行上述过程。
对于步骤S210-S230，其与方法100的步骤S110-S130基本相同，仅有的 差异仅仅是多个样本和单一样本之间的区别，因此步骤S210-S230不再赘述。
接着描述步骤S240，在获得了多个样本中的每一个细胞的多个特征的特 征值之后，对这些样本中的不同样本之间的相同特征计算统计学差异。
图9示出了同一特征的统计下不同组织样本横向比较的差异的示意图。如 图9所示，其示出了三个组织样本(横轴上的样本1、2和3)中的选定的特 征A(纵轴)的统计结果，图9中的每一个点表示来相应组织样本中的一个细胞的特征A的特征值。按照具体特征分类，将所有样本中所有细胞的特征A 的特征值绘制成小提琴统计图，如图9所示。此举可以直观地横向比较不同样 本的某一特征值的差异。例如，如果特征值差异明显，则分布的越分散(即， 不同样本的小提琴统计图的长短差异大)，反之则越集中(即，不同样本的小 提琴统计图的长短差异小)。例如，在所示的图9中，样本2和3的小提琴统 计图的长短差异小，因此对于样本2和3而言，特征A的统计学差异小，然 而，在所示的图9中，样本1和样本2(3)的小提琴统计图的长短差异大，因 此，对于所有的样本1-3而言，由于样本1和样本2(3)的统计学差异大，因此可以认为特征A对于所有样本而言具有较大的差异。
接着描述步骤S250。发明人发现，了解不同样本的细胞相同特征的统计 学差异同样有助于分析其背后可能存在的生物学意义。有些特征的高统计学差 异可能是必然的，而有些特征的高统计学差异可能是意外的，这背后可能存在 值得深度发掘的生物学机制，而这种出乎意料的高统计学差异的特征可能正是由于样本细胞处于不同的状态(例如正常状态和病变状态)所导致的。因此， 本文将上述具有出乎意料的高统计学差异所涉及的特征确定为用于确定样本 细胞的生物状态的关键特征，这有助于快速且相对精确地判断生物组织(特别 是细胞)的当前状态。例如，可以将步骤S240中计算得到的相同特征的统计 下差异的相关系数与预先确定的阈值相比较，当高于预定阈值且不属于必然高 统计学差异的特征时，则将该相关系数所涉及的特征确定为用于确定样本细胞的生物状态的关键特征。在一些实施方式中，当将统计学差异正规化为0-1之 间的值时，该阈值可以是0.5以上，在另一些实施方式中，该阈值可以是0.6、 0.7、0.8或甚至0.9。
回到图8，替代地，在执行了步骤S230之后，可以执行步骤S240’和步骤 S250’。
在步骤S240’中，除了如上文在步骤S240中那样计算多个样本中的不同 样本之间的相同特征计算统计学差异之外，还如上文在方法100的步骤S140 那样计算相同样本中的每个细胞的多个特征之间的任意两个特征之间的相关 系数。
在步骤S250’中，根据计算得到的统计学差异和相关系数两者来确定用于 确定样本细胞的生物状态的关键特征。例如，具有出乎意料的高统计学差异所 涉及的特征同样时具有出乎意料的高相关性所涉及的特征时，才将该特征视为 确定用于确定样本细胞的生物状态的关键特征。
如上文所述，本文描述了用于确定细胞状态的关键特征的判定方法，通过 上述方法所确定的关键特征可以用于判断细胞状态的许多场景中。
例如，这些关键特征可以用于分辨处于不同细胞周期的细胞。由于处于分 裂期与间期的细胞在DNA含量、蛋白质含量、细胞形态等方面存在差异，可 以基于但不限于形态特征之细胞面积、离心率，代谢特征之脂质和蛋白质的比 率、核质比，成像特征之细胞核平均强度，等特征分辨处于不同细胞周期的细 胞。
又例如，这些特征可以用于分辨活细胞与凋亡细胞。由于活细胞与凋亡细 胞在细胞核大小、代谢活跃程度、细胞形态等方面存在差异，可以基于但不限 于形态特征之离心率、形状因子，代谢特征之核质比、脂质和蛋白质的比率、 脂滴到细胞核的平均距离，成像特征之脂质平均强度，等特征分辨活细胞与凋 亡细胞。
又例如，这些特征可以用于分辨不同激活状态的免疫细胞。由于激活后的 免疫细胞在呈递抗原等行为中形态和代谢发生了变化，可以基于但不限于形态 特征之离心率、形状因子，代谢特征之脂质和蛋白质的比率、脂滴到细胞重心 的平均距离，成像特征之细胞边界平均强度，等特征分辨不同激活状态的免疫 细胞。
又例如，这些特征可以用于分辨不同程度的干细胞诱导分化的细胞。由于 分化程度不同的细胞在细胞形态、细胞代谢活跃程度存在差异，可以基于但不 限于形态特征之形状因子、离心率，代谢特征之脂质和蛋白质的比率、核质比， 成像特征之脂质平均强度，等特征分辨不同程度的干细胞诱导分化的细胞。
又例如，这些特征可以用于分辨癌变等不同病变阶段的细胞。由于癌变程 度越高的细胞的脂质含量越高、细胞形态越不规则，可以基于但不限于形态特 征之形状因子、离心率、脂滴到细胞核的平均距离，代谢特征之脂质和蛋白质 的比率、核质比，成像特征之细胞核平均强度，等特征分辨癌变不同阶段的细 胞。
虽然上文针对本公开内容的实施方式，但在不背离本发明基本范围下，可 设计本公开内容的其他与进一步的实施方式，而本发明的保护范围由随附的权 利要求书界定。
Claims (13)
1.一种确定用于判断生物组织状态的关键特征的方法，包括以下步骤：
在第一拉曼位移下，针对样本中的细胞执行受激拉曼散射成像，以获得关于所述样本的脂质信号强度的第一受激拉曼散射图像；
在第二拉曼位移下，针对所述样本执行受激拉曼散射成像，以获得关于所述样本的蛋白质信号强度的第二受激拉曼散射图像；
根据所述第一受激拉曼散射图像和所述第二受激拉曼散射图像确定所述样本中关于脂质和蛋白质分布的分布信息；
基于所述分布信息进行提取所述样本中的所述细胞的至少一个形态特征、至少一个代谢特征和至少一个成像特征，其中所述代谢特征包含所述细胞的生物化学组分信息，并且所述成像特征是指反映所述细胞中的生物化学组分的平均浓度的受激拉曼散射图像信号的平均强度；
计算所述至少一个形态特征、所述至少一个代谢特征和所述至少一个成像特征中的任意两个特征之间的相关系数；
根据所述相关系数确定对应的特征是否为所述关键特征。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一拉曼位移介于2840-1和2860cm-1之间，且所述第二拉曼位移介于2920cm-1和2940cm-1之间。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述第一拉曼位移为2850cm-1，所述第二拉曼位移为2930cm-1。
4.根据权利要求1所述的方法，其中根据以下公式确定所述样本中关于脂质和蛋白质分布的所述分布信息：
其中S1是所述第一受激拉曼散射图像中的所述脂质信号强度，S2是所述第二受激拉曼散射图像中的所述蛋白质信号强度，A1、A2、B1和B2是系数，P1是所述样本中脂质的比例，并且P2是所述样本中蛋白质的比例。
5.根据权利要求4所述的方法，进一步包括以下步骤：
对纯样脂质执行针对所述第一拉曼位移和所述第二拉曼位移的受激拉曼散射成像，以获得所述纯样脂质的S1和S2，其中所述纯样脂质的P1＝1并且P2＝0；
将所获得的所述纯样脂质的S1、S2、P1和P2代入所述公式中，以获得系数A1和A2；
对纯样蛋白质执行针对所述第一拉曼位移和所述第二拉曼位移的受激拉曼散射成像，以获得所述纯样蛋白质的S1和S2，其中所述纯样蛋白质的P1＝0并且P2＝1；
将所获得的所述纯样蛋白质的S1、S2、P1和P2代入所述公式中，以获得系数B1和B2。
6.根据权利要求1所述的方法，其中
所述至少一个形态特征包括所述样本中的所述细胞的面积、长轴长、短轴长、离心率、直径、周长、细胞重心横坐标、细胞重心纵坐标、细胞方向或上述特征的组合；
所述至少一个代谢特征包括所述样本中的所述细胞的脂滴数量、脂滴面积、脂滴到细胞重心的平均距离、脂滴到细胞重心的相对距离、脂质和蛋白质的比率、核质比、细胞核面积、细胞质面积或上述特征的组合；并且
所述至少一个成像特征包括所述样本中的所述细胞的脂质平均强度、蛋白质平均强度、脂滴平均强度、细胞核平均强度或上述特征的组合。
7.一种确定用于判断细胞状态的关键特征的方法，包括以下步骤：
在第一拉曼位移下，针对多个样本的细胞执行受激拉曼散射成像，以获得关于所述多个样本的脂质信号强度的多个第一受激拉曼散射图像；
在第二拉曼位移下，针对所述多个样本的细胞执行受激拉曼散射成像，以获得关于所述多个样本的蛋白质信号强度的多个第二受激拉曼散射图像；
根据所述多个样本的每一个的所述第一受激拉曼散射图像和所述第二受激拉曼散射图像确定相应样本中关于脂质和蛋白质分布的分布信息；
基于所述分布信息进行提取所述多个样本的所述细胞的至少一个形态特征、至少一个代谢特征和至少一个成像特征，其中所述代谢特征包含所述细胞的生物化学组分信息，并且所述成像特征是指反映所述细胞中的生物化学组分的平均浓度的受激拉曼散射图像信号的平均强度；
计算所述多个样本中的所述至少一个形态特征、所述至少一个代谢特征和所述至少一个成像特征中的相同特征的统计学差异；
根据所述统计学差异确定对应的特征是否为所述关键特征。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述第一拉曼位移介于2840cm-1和2860cm-1之间，且所述第二拉曼位移介于2920cm-1和2940cm-1之间。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述第一拉曼位移为2850cm-1，所述第二拉曼位移为2930cm-1。
10.根据权利要求7所述的方法，其中根据以下公式确定所述样本中关于脂质和蛋白质分布的所述分布信息：
其中S1是所述第一受激拉曼散射图像中的所述脂质信号强度，S2是所述第二受激拉曼散射图像中的所述蛋白质信号强度，A1、A2、B1和B2是系数，P1是所述样本中脂质的比例，并且P2是所述样本中蛋白质的比例。
11.根据权利要求10所述的方法，进一步包括以下步骤：
对纯样脂质执行针对所述第一拉曼位移和所述第二拉曼位移的受激拉曼散射成像，以获得所述纯样脂质的S1和S2，其中所述纯样脂质的P1＝1并且P2＝0，
将所获得的所述纯样脂质的S1、S2、P1和P2代入所述公式中，以获得系数A1和A2；
对纯样蛋白质执行针对所述第一拉曼位移和所述第二拉曼位移的受激拉曼散射成像，以获得所述纯样蛋白质的S1和S2，其中所述纯样蛋白质的P1＝0并且P2＝1，
将所获得的所述纯样蛋白质的S1、S2、P1和P2代入所述公式中，以获得系数B1和B2。
12.根据权利要求7所述的方法，其中
所述至少一个形态特征包括所述多个样本中的所述细胞的面积、长轴长、短轴长、离心率、直径、周长、细胞重心横坐标、细胞重心纵坐标、细胞方向或上述特征的组合；
所述至少一个代谢特征包括所述多个样本中的所述细胞的脂滴数量、脂滴面积、脂滴到细胞重心的平均距离、脂滴到细胞重心的相对距离、脂质和蛋白质的比率、核质比、细胞核面积、细胞质面积或上述特征的组合；并且
所述至少一个成像特征包括所述多个样本中的所述细胞的脂质平均强度、蛋白质平均强度、脂滴平均强度、细胞核平均强度或上述特征的组合。
13.根据权利要求7所述的方法，进一步包括以下步骤：
针对所述多个样本中的每一个样本，计算每一个样本中的所述细胞的所述至少一个形态特征、所述至少一个代谢特征和所述至少一个成像特征中的任意两个特征之间的相关系数；和
根据所述统计学差异和所述相关系数两者来确定对应的特征是否为所述关键特征。
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