CN113777329A - 一种视黄醇结合蛋白测定试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种视黄醇结合蛋白测定试剂盒及其检测方法。本发明的视黄醇结合蛋白测定试剂盒，通过表面活性剂的组合并配合盐的使用，显著提高了测定试剂的灵敏度和稳定性，可适用于各类全自动生化分析仪进行分析，适应性好。

Description

一种视黄醇结合蛋白测定试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及体外诊断试剂技术领域，尤其涉及一种视黄醇结合蛋白测定试剂盒及其检测方法。
背景技术
视黄醇结合蛋白(RBP)是血液中维生素的转运蛋白，由肝脏合成、广泛分布于血液、脑脊液、尿液及其他体液中。
RBP是一种小分子蛋白质，半衰期较短，是血液中维生素A的特异转运蛋白，能较敏感地反映机体的疾病状况。以往认为RBP是肾脏疾病早期诊断和疗效观察的敏感指标，但近年越来越多的研究发现，血清RBP或尿液RBP水平与人体肾功能、肝功能、肿瘤诊断等方面均密切相关。当肾脏疾病发生时，由于肾小球滤过率下降，肾小管重吸收障碍，血清和尿液中RBP均显著增高。在糖尿病肾病、高血压肾病等引起肾小球滤过率(GFR)或肾血流量降低时，RBP的滤过率也相应减少，因而致使血液中RBP蓄积而浓度增高。而其他慢性肾病患者尿中出现管状蛋白尿亦可引起血液中RBP升高，早期比肌酐、尿素氮更敏感，而且不受饮食的干扰影响。除肾脏外，因RBP在肝脏内合成，当肝脏受各种因素损害后，RBP的合成功能降低，反映在血液中RBP水平的下降，同时，RBP的半衰期较前白蛋白更短，故更能早期敏感地反映肝脏的合成功能与分解代谢的变化。此外，肿瘤疾病在发展过程中机体病理改变以及治疗过程中一些化疗药物蓄积，都会对肾功能造成不同程度损害，特别是晚期肿瘤患者肾功能损害更明显。因而血清RBP浓度将会产生较大浮动。
目前市场上缺乏灵敏度高、特异性强的视黄醇结合蛋白检测试剂，尤其是质量好的自动化检验试剂。现有的视黄醇结合蛋白测定方法主要使用荧光免疫层析法，化学发光免疫分析法等。时间分辨荧光免疫层析法稳定性好，但是灵敏度不高；化学发光法灵敏度较高，但是试剂稳定性较差，而且需要昂贵的专用化学发光检测设备，不利于常规实验室开展，临床应用局限性明显。现有胶乳免疫比浊法虽然操作简单、快速，但是灵敏度低，线性范围窄，并且试剂盒中的抗体在保存过程中很容易出现絮状或片状沉淀，导致抗体性能变差、重复性不好、变异系数(CV)变大，直接造成试剂检测结果不准确，不利于临床推广使用。
发明内容
为了解决现有技术中存在的缺陷，本发明提供一种视黄醇结合蛋白测定试剂盒，所述试剂盒包括组合的表面活性剂、无机盐、缓冲液、视黄醇结合蛋白抗体和抗冻剂。
在一种实施方式中，本发明表面活性剂为Poloxamer188和Brij35的组合物，优选的，所述Poloxamer188和Brij35的比例为1:1。
在一种实施方式中，本发明中的无机盐为钾盐、镁盐与钙盐的组合物中的一种或几种，优选的，本发明中的无机盐为钙盐和镁盐的组合；
在一种实施方式中，本发明中的防腐剂为Proclin 300、苯甲酸、苯甲酸钠、叠氮钠中的一种，优选的，本发明中的防腐剂为Proclin 300；
在一种实施方式中，本发明中的缓冲液为磷酸盐缓冲液(TRIS)、三羟甲基甲氨基丙磺酸(TAPS)缓冲液、醋酸盐缓冲液中的一种或者几种，优选的，本发明中的缓冲液为磷酸盐缓冲液；
在一种实施方式中，本发明中的细胞保护剂为卵清蛋白、牛转铁蛋白、人血清白蛋白、牛血清白蛋白及血蓝蛋白中的一种或者几种，优选的，本发明中的细胞保护剂为牛血清白蛋白。
在一种实施方式中，本发明的视黄醇结合蛋白抗体，源自动物或人工重组的抗体，例如兔、羊、鸡、骆驼、小鼠、大鼠。最为优选的，本发明视黄醇结合蛋白抗体为羊抗人视黄醇结合蛋白抗体。
在一种实施方式中，所述视黄醇结合蛋白抗体可选用视黄醇结合蛋白抗体胶乳微球颗粒，更为优选的，所述抗体与胶乳微球偶联使用的偶联剂为组合型偶联剂，所述的组合型偶联剂包括有以下组分：碳二亚胺、O-苯并三氮唑-N,N,N”,N”-四甲基脲四氟硼酸和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐三者质量比为1.2﹕1.2﹕1。
在一种实施方式中，本发明的抗冻剂为甲醇、乙醇、乙二醇、水溶性酰胺和氯化钙、盐水等的一种或者几种。优选的，本发明中的抗冻剂为乙二醇。
在一种优选的实施方式中，本发明的试剂盒至少包含试剂1和试剂2：
试剂1
Figure BDA0003265255680000031
试剂2
Figure BDA0003265255680000032
本发明取得的有益效果如下：
1、试剂盒中的具体的物质的制备步骤简单，成本低，更适用于工业生产和临床推广应用；
2、申请人通过在试剂盒中组合添加了表面活性剂的组合，并配合无机盐的使用，明显提高了试剂盒的分析灵敏度以及精密度，扩大检测的线性范围；
3、通过在试剂盒中添加乙二醇，提高了试剂盒的抗冻能力，使试剂盒可以在低温的条件下运输或储存仍保持很好的检测性能。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：校准曲线的绘制
试剂1
Figure BDA0003265255680000041
试剂2
Figure BDA0003265255680000042
Figure BDA0003265255680000051
将试剂1、试剂2和视黄醇结合蛋白校准品包装成试剂盒。
在日立-7180全自动生化分析仪上的设定参数：
测定模式 终点法 样本量 6μl
试剂1 180μl 试剂2 60μl
测定温度 37℃ 波长 600nm
光径 1cm 反应方向 正
操作步骤
Figure BDA0003265255680000052
校准程序
使用视黄醇结合蛋白校准品校准，多点定标，采用非线性校准模式，如Logit、Spline等。
结果计算
五点定标，第①管取纯化水，输入值为0.0ng/ml，第②～⑤管取校准品，输入相应值。根据吸光度与校准品的值作剂量/响应曲线，样品含量可根据其吸光度值在剂量/响应曲线上算出。
实施例2：线性性能的测定
将某一高视黄醇结合蛋白浓度样本(血清)与某一低视黄醇结合蛋白浓度样本做等差混合稀释，测定稀释后的浓度，测定三次求平均值，再与理论浓度相比较，计算其线性偏差。可以看出本申请试剂盒线性范围可达0.7-146mg/l。
线性结果
Figure BDA0003265255680000061
实施例3：精密度和回收率
重复测定高、中、低浓度(浓度分别为35、70、140mg/l)血清样本20次，检测数据及数据分析见下表。
Figure BDA0003265255680000062
Figure BDA0003265255680000071
表5.精密度和回收率
本申请的胶乳免疫比浊测定试剂盒的准确度高，回收率可达90.3％-98.2％之间，精密度良好，CV均不超过5.4％。
实施例4(对比例)：
使用Brij35、Poloxamer188单一表面活性剂作为对比例对其单一使用的效果进行验证：
对比例1：
试剂1
Figure BDA0003265255680000072
试剂2
Figure BDA0003265255680000073
Figure BDA0003265255680000081
将试剂1、试剂2和胶原校准品包装成试剂盒。
对比例2：
试剂1
Figure BDA0003265255680000082
试剂2
Figure BDA0003265255680000083
将试剂1、试剂2和胶原校准品包装成试剂盒。
对比例1的线性结果如下表所示：
Figure BDA0003265255680000084
Figure BDA0003265255680000091
对比例2的线性结果如下表所示：
Figure BDA0003265255680000092
按照实施例1的程序进行校准后，用于线性范围的测量，实验参数和样本同实施例2，仅使用的表面活性剂不同。结果显示:当使用相同量的单一表面活性剂Poloxamer188或Brij35时，试剂盒的线性范围都仅能达到120.0mg/l左右，Poloxamer188和Brij35的组合的技术效果具有显著的优越性。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (8)

1.一种视黄醇结合蛋白测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括表面活性剂、无机盐、视黄醇结合蛋白抗体、缓冲液和抗冻剂，所述表面活性剂为非离子表面活性剂的组合，所述无机盐选自钾盐、镁盐或钙盐中的一种或两种，所述视黄醇结合蛋白抗体为源自动物或人工重组的抗体，所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液、三羟甲基甲氨基丙磺酸(TAPS)缓冲液、醋酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液中的一种或者几种，所述抗冻剂选自甲醇、乙醇、乙二醇、水溶性酰胺和氯化钙、盐水等的一种或者几种。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述表面活性剂的组合为Poloxamer188和Brij35的组合物。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述无机盐为镁盐与钙盐的组合物。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述防腐剂为Proclin 300、苯甲酸、苯甲酸钠、叠氮钠、Krovin100中的一种，所述细胞保护剂为牛血清白蛋白。
5.如权利要求1-4任一所述的试剂盒，其特征在于，所述防腐剂为Krovin100，所述抗冻剂为乙二醇。
6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在与，所述视黄醇结合蛋白抗体为羊抗人视黄醇结合蛋白抗体。
7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒至少包括试剂1和试剂2:
试剂1
Figure FDA0003265255670000011
Figure FDA0003265255670000021
试剂2
Figure FDA0003265255670000022
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括试剂1和试剂2：
试剂1
Figure FDA0003265255670000023
试剂2
Figure FDA0003265255670000024
Figure FDA0003265255670000031
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