CN113754740A - 新型冠状病毒特异性抗原肽及其用途 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及一种新型冠状病毒特异性抗原肽及其用途。具体来说，本公开涉及一种多肽，所述多肽为SARS‑CoV‑2病毒的抗原肽，位于SARS‑CoV‑2病毒的RBD区域的RBM区，及其前述抗原肽在制备COVID‑19疫苗、制备预防、治疗COVID‑19的药物中的用途。

Description

新型冠状病毒特异性抗原肽及其用途
技术领域
本公开属于生物技术领域。具体来说，本公开涉及一种SARS-CoV-2病毒RBD区域的抗原肽，及其前述抗原肽在制备COVID-19疫苗、制备预防、治疗COVID-19的药物中 的用途。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)属于乙型冠状病毒属，线性单链RNA(ssRNA)病 毒。其基因组全长约29903个核苷酸，共包含10个基因。自2020年1月10日，第一个 SARS-CoV-2基因组序列数据被公布，此后陆续有多个从患者身上分离的新型冠状病毒 的基因组序列发布。2020年1月22日，基因组科学数据中心正式发布2019新型冠状病毒 资源库。经数据分析，2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)与2003年爆发的SARS病毒基因 组序列相似度为80％，与2017年2月从国内的蝙蝠中采集到的Bat SARS-like coronavirus isolate bat-SL-CoVZC45基因组序列相似性最高，相似度为88％。截止到2020年1月30日， 全球已有6家机构在“全球共享流感病毒数据库GISAID”上发布了13例新型冠状基因组 序列。
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是一种包膜的正链RNA病毒，含有30kb的基因组和 四种结构蛋白，即刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)。S 蛋白调节病毒对目标宿主细胞上受体的附着。E蛋白质的功能是组装病毒并充当离子通 道；M蛋白与E蛋白一起在病毒组装中发挥作用，并参与新病毒颗粒的生物合成；N蛋 白与病毒RNA形成核糖核蛋白复合物。新型冠状病毒的表面刺状糖蛋白(S蛋白)负责通 过与宿主细胞表面受体(ACE2)的相互作用附着到宿主细胞上。S蛋白以同型三聚体的 形式存在，每个单体含有1200多个氨基酸。在SARS-CoV-2的S蛋白中，一个含有306-575 残基的小结构域被鉴定为受体结合域(RBD)，其中被称为受体结合基序(RBM)的439-508 残基直接介导了与ACE2的相互作用。利用冷冻电镜技术，西湖大学周强实验室已经解 析出了新冠受体ACE2的全长结构。已经发现新型冠状病毒的关键刺突蛋白(S蛋白)与 人体细胞的受体蛋白ACE2蛋白的结合能力要远高于SARS病毒，这部分解释了为什么新 型冠状病毒传染性要比SARS病毒强得多。借助冷冻电镜技术，科学家能够更好地观察 新型冠状病毒S蛋白的结构，以及它与ACE2蛋白之间的相互作用。这一研究发现为进一 步解析全长ACE2和新冠病毒的S蛋白复合物的三维结构奠定了基础，将为理解新冠病毒 侵染细胞，提供更多线索。而对ACE2全长结构的解析，有助于为后续疫苗和抗病毒药 物的研发，提供重要的结构生物学数据支撑。将有助于理解冠状病毒进入靶细胞的结构 基础和功能特征，对发现和优化阻断进入细胞的抑制剂有重要作用。
在感染COVID-19初期，患者表现症状不明显，但具有极高的传染性，可通过接触传播，飞沫传播等方式人传人，严重者可导致死亡。在经历过SARS大爆发之后，根据 WHO应对新发传染病的各类指南，政府及有关部门已经制定出一系列预防和控制新发 传染病的策略和规划，以有效应对突出和肆虐人类的新发传染病。但是对于病毒性传染 病，可应用的药物非常有限，疫苗是最有效的手段之一。然而由于新发传染病的新发及 不可预见性，大多数新发和烈性传染病并无有效的疫苗储备。
前期有科研人员使用来自结构生物学和机器学习的计算工具来识别基于病毒蛋白 抗原呈现和抗体结合特性的SARS-CoV-2T细胞和B细胞表位。这些表位可用于开发更有效的疫苗和鉴定中和抗体。已经在人类MHC-I和MHC-II等位基因中鉴定了405个抗原表 达分数良好的病毒肽，并在SARS-CoV-2Spike蛋白受体结合域附近发现了两个潜在的中 和B细胞表位(440-460和494-506)。然而，目前还没有针对SARS-CoV-2或任何形式的冠 状病毒的批准疫苗。
发明内容
发明要解决的问题
由于SARS-CoV-2通过表面ACE2细胞受体进入细胞，其表面抗原通过抗原递呈给B细胞，刺激B细胞分化为记忆B细胞和浆细胞，浆细胞分泌抗SARS-CoV-2特异性抗体中 和病毒。因此找到能特异性激活机体免疫系统，并且能刺激B细胞免疫应答从而产生中 和抗体的抗原肽具有关键作用。因此，我们通过预测模型筛选出关于新型冠状病毒表面 特异性抗原肽，通过结合结构生物学分析，临床数据检测，实验验证新型冠状病毒抗原 肽的有效性，从而达到及时准确的诊断新型冠状病毒的目的。
用于解决问题的方案
本公开提供了如下技术方案。
(1)一种多肽，其中，所述多肽为如下(i)-(ii)任一项所示的多肽：
(i)所述多肽为如SEQ ID NO：1-3任一项所示的序列编码的多肽；
(ii)所述多肽为在(i)所示的多肽的基础上，取代、重复、缺失或添加一个或多 个氨基酸的多肽。
(2)根据(1)所述的多肽，其中，所述多肽相对于如SEQ ID NO：1-3任一项所 示的序列编码的多肽，具有至少80％的同源性；优选的，具有至少90％以上的同源性。
(3)根据(1)-(2)任一项所述的多肽，其中，所述多肽的氨基酸残基的个数为 15-24个。
(4)一种检测是否被SARS-CoV-2感染或患有COVID-19的试剂盒，其中，所述试 剂盒中含有根据(1)-(3)任一项所述的多肽。
(5)一种药物组合物或疫苗，其中，所述药物组合物或疫苗中含有根据(1)-(3) 任一项所述的多肽。
(6)根据(1)-(3)任一项所述的多肽在制备用于检测是否被SARS-CoV-2感染 或患有COVID-19的试剂中的用途。
(7)根据(1)-(3)任一项所述的多肽在制备用于治疗或预防被SARS-CoV-2感 染或患有COVID-19的药物中的用途。
(8)一种治疗被SARS-CoV-2感染或患有COVID-19的方法，其中，所述方法包括 向患者施用根据(1)-(3)任一项所述的多肽或根据(5)所述的药物组合物或疫苗。
本项目通过噬菌体展示技术将冠状病毒β种属表面全蛋白序列进行位移切割，并且 通过高效转染进噬菌体基因组，表达在噬菌体的表面，根据抗原抗体结合的相互作用的原理，将COVID19患者血清与噬菌体展示文库相互结合，筛选出能够相互作用的抗原肽 序列，通过二代测序技术确定其序列。
同时通过IEDB网站预测B细胞表位抗原肽进行补充验证，最终能得到候选 SARS-CoV-2特异性抗原肽。我们目前已经将已经获得的全部抗原肽进行了有效性功能 验证，通过体外ELISA检测病人血清，正常人血清，病毒中和实验，体内病毒感染对于 小鼠的免疫保护性实验等，评估抗原肽的灵敏度和特异性以及对于病毒的免疫保护性。
发明的效果
在一个实施方式中，本公开得到的抗原肽对于新型冠状病毒具有良好的准确性和特异性，能够用于SARS-CoV-2的检测。
在另一个实施方式中，本公开得到的抗原肽对于SARS-CoV-2具有良好的抑制作用， 能够用于SARS-CoV-2所导致的疾病的治疗。
附图说明
图1表示噬菌体展示技术初步筛选特异性抗原肽；
图2A、图2B表示SARS-CoV-2S蛋白3-D结构；
图3表示S431-454、S470-486、S501-515序列同源性比对
图4表示ELISA检测COVID19阳性和阴性患者血清；
图5示出ELISA检测核酸检测结果呈阳性血清与正常人之间的差异；
图6示出ELISA检测核酸检测结果呈阴性血清与正常人之间的差异；
图7A、图7B示出统计感染病人在住院治疗过程中抗体检测水平变化；
图8A、图8B示出S672-691多肽检测SARS-CoV-2-IgG/IgM灵敏度和准确性 (POS/NEG):POS代表核酸检测阳性，NEG代表核酸检测阴性。
图9A、图9B示出多肽抑制SARS-CoV-2真病毒和假病毒感染实验的结果。
具体实施方式
定义
当在权利要求和/或说明书中与术语“包含”联用时，词语“一(a)”或“一(an)”可以指 “一个”，但也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。
如在权利要求和说明书中所使用的，词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。
在整个申请文件中，术语“约”表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。
虽然所公开的内容支持术语“或”的定义仅为替代物以及“和/或”，但除非明确表示 仅为替代物或替代物之间相互排斥外，权利要求中的术语“或”是指“和/或”。
当用于权利要求书或说明书时，选择/可选/优选的“数值范围”既包括范围两端的数 值端点，也包括相对于前述数值端点而言，所述数值端点中间所覆盖的所有自然数。
如本公开所使用的，术语“SARS-CoV-2”，也被称为“2019-nCoV”，其含义为2019 新型冠状病毒。
如本公开所使用的，术语“COVID-19”的含义为新型冠状病毒肺炎(Corona VirusDisease 2019)，简称“新冠肺炎”，是指2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染导致的 肺炎。
如本公开所使用的，术语“氨基酸突变”，包括“取代、重复、缺失或添加一个或多个氨基酸”。在本公开中，术语“突变”是指氨基酸序列的改变。在一个具体的实施方式 中，术语“突变”是指“取代”。
在一个实施方式中，本公开的“突变”可以选自“保守突变”。在本公开中，术语“保守突变”是指可正常维持蛋白质的功能的突变。保守突变的代表性例子为保守置换。
如本公开所使用的，术语“保守置换”涉及用具有类似侧链的氨基酸残基替换氨基酸残基。本领域已经定义了具有类似侧链的氨基酸残基家族，并且包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸和谷氨酸)、不带电极性侧链(例 如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、和半胱氨酸)、非极性侧 链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸和色氨酸)、 β-支链(例如苏氨酸、缬氨酸和异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨 酸和组氨酸)。
如本公开所使用的，“保守置换”通常在蛋白质的一个或多个位点上交换一种氨基酸。这种取代可以是保守的。作为被视作保守置换的置换，具体而言，可以举出Ala向 Ser或Thr的置换、Arg向Gln、His或Lys的置换、Asn向Glu、Gln、Lys、His或Asp的置换、 Asp向Asn、Glu或Gln的置换、Cys向Ser或Ala的置换、Gln向Asn、Glu、Lys、His、Asp 或Arg的置换、Glu向Gly、Asn、Gln、Lys或Asp的置换、Gly向Pro的置换、His向Asn、 Lys、Gln、Arg或Tyr的置换、Ile向Leu、Met、Val或Phe的置换、Leu向Ile、Met、Val或 Phe的置换、Lys向Asn、Glu、Gln、His或Arg的置换、Met向Ile、Leu、Val或Phe的置换、 Phe向Trp、Tyr、Met、Ile或Leu的置换、Ser向Thr或Ala的置换、Thr向Ser或Ala的置换、 Trp向Phe或Tyr的置换、Tyr向His、Phe或Trp的置换、及Val向Met、Ile或Leu的置换。此 外，保守突变还包括起因于基因所来源的个体差异、株、种的差异等天然产生的突变。
如本公开所使用的，在两种核酸或多肽比较中的术语“序列同一性”或“同一性百分 比”，是指当使用核苷酸或氨基酸残基序列比较算法或通过目视检查测量，以最大的对应性进行比较和比对时，它们是相同的或具有相同序列特定百分比数。也就是说，核苷 酸或者氨基酸序列的同一性可以利用下述比例来定义，该比例是将两个或多个核苷酸或 氨基酸序列按照一致的核苷酸或氨基酸数达到最大的方式，并根据需要加入空位来进行 比对时一致的核苷酸数或氨基酸数，在比对部分的全部核苷酸或氨基酸数中的比例。
如本公开所使用的，两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列同一性可通过以下方法测定：将多核苷酸或多肽的核苷酸或氨基酸序列对准且对经对准的多核苷酸或多肽中含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行评分，且将其与经对准的多核苷酸或多肽中含有不同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行比较。多核苷酸可例如通过含有不同核苷酸或缺失核苷酸而在一个位置处不同。多肽可例如通过含有不同氨基酸或缺失氨基酸而在一个位置处不同。序列同一性可通过用含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中氨基酸残基的总数来计算。举例而言，可通过用含有相同核苷酸 或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中核苷酸或氨基酸残基的总数且乘以100 来计算同一性百分比。
示例性的，在本公开中，当使用序列比较算法或通过目视检查测量以最大的对应性进行比较和比对时，两个或多个序列或子序列具有至少40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％核苷酸或氨基酸残 基的“序列同一性”或“同一性百分比”。“序列同一性”或“同一性百分比”的判断/计算可以 基于序列任何合适的区域上。例如，长度至少约10个残基的区域、至少约15个残基的区 域，至少约18个残基的区域，至少约20个残基的区域。在某些实施方案中，所述序列在 任一或两个相比较的生物聚合物(就是核酸或多肽)的整个长度上基本相同。
研究表明新型冠状病毒是通过S-蛋白与人ACE2互作的分子机制，来感染人的呼吸道上皮细胞，S蛋白调节冠状病毒对目标宿主细胞上受体的附着，在结合到宿主细胞产 生相互作用时具有重要作用。因此我们通过对新型冠状病毒表面S蛋白进行特异性抗原 表位预测研究，以及本实验室噬菌体展示技术平台筛选出三条抗原肽。根据抗原肽在S 蛋白的氨基酸位点，分别定位在431-454(GCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYR)， 470-486(TEIYQAGSTPCNGVEGF)，501-515(NGVGYQPYRVVVLSF)，具体序列如下 表1所示。在拿到预测抗原表位后，我们进行了抗原肽的免疫原性检测研究。我们在体 外将这些抗原肽全部合成，使用酶联免疫吸附实验ELISA初步筛选了新冠患者以及正常 人的血清样本。根据采样时的核酸检测结果我们将新冠患者血清样本分为核酸检测阳性 和阴性两个组别。
表1筛选到的抗原肽序列
Figure BDA0002526894210000071
在一个具体的实施方式中，通过对抗原肽的初步筛选，我们得出这三条抗原肽能明显检测到新冠患者血清中的抗体水平，并且和正常人存在明显差异的结论，并且进行 了抗原肽的病毒感染抑制中和实验进行深入研究。
人体在感染病毒之后会在第二周至三周左右产生相应的抗病毒抗体。我们收集了大量感染SARS-CoV-2临床样本，并对这些样本进行分类，并对被收集血清样品的个体 信息和健康指标进行详细的记录，包括感染日期，采样日期，病史等等。
通过合成预测到的抗原肽序列，我们首先在体外用ELISA实验对新型冠状病毒感染病人血清进行筛查。根据检测结果，我们分别将抗体检测水平比较高，比较低的患者 血清样本单独取出进行病毒中和实验，进而验证检测到的抗体对于病毒的中和效果。同 时，我们也进行了多肽抑制病毒感染的实验，与其他研究类药物相比较，在多肽剂量达 到1μg时，对病毒感染具有明显的抑制作用。
我们将筛选到的S蛋白中可能具有抗原性的多肽表位进行合成，在多肽的筛选过程 中发现这三条序列能检测出患者与正常人之间的抗体差异，针对这三条多肽序列我们又 展开了进一步研究。
通过序列比对，我们得知这条多肽位于S蛋白的RBD区域，而恰好有一条完全位于RBM区(470-486抗原肽)，而另外两条大部分也都位于RBM区。前面我们已经详细介绍 了新冠病毒S蛋白通过RBD受体结合区域与人的受体ACE2相互结合形成复合物进而感 染细胞，其中具有高亲和力的属于RBM区。
我们通过ELISA实验检测到核酸检测呈阳性的新冠患者血清对于特异性抗原肽检测呈比较高的抗体水平，并且检出率相对较高。同时我们对抗原肽的IgG和IgM两个指 标进行检测。我们根据多肽检测结果，挑选出抗体水平比较高的病人血清，抗体水平比 较低的病人血清以及正常人血清去做假病毒中和实验。根据中和实验结果来验证抗体检 测的准确性。同时我们使用多肽抑制假病毒感染细胞，能明显观察到抑制作用。
在本公开的技术方案中，说明书核苷酸和氨基酸序列表的编号所代表的含义如下所示：
SEQ ID NO：1所示的是冠状病毒S蛋白的抗原肽431-454位点的氨基酸序列；
SEQ ID NO：2所示的是冠状病毒S蛋白的抗原肽470-486位点的氨基酸序列；
SEQ ID NO：3所示的是冠状病毒S蛋白的抗原肽501-515位点的氨基酸序列。
本公开中的“本领域的常规生物学方法”，可以参见“最新分子生物学实验方法汇编 (Current Protocols in Molecular Biology，Wiley出版)”，“分子克隆实验指南(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，冷泉港实验室出版)”等公开出版物中记载的相应方法。
实施例
本公开的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是，应当理解的是，详细描述和具体实施例(虽然表示本公开的具体实施方式)仅为解释性目的而给出，因为在阅读该详细说明后，在本公开的精神和范围内所作出的各种改变和修饰，对于本 领域技术人员来说将变得显而易见。
除非有特别说明，否则本公开中采用的所有试剂和原料均可以通过商业渠道购买。
实施例1a
抗原表位筛选和合成
我们合成得到三条可能具有抗体反应的多肽表位，分别定位在冠状病毒S蛋白的431-454、470-486、501-515位氨基酸。
抗原肽的合成方法如下：
将多肽序列给金斯瑞生物科技合成，纯度≥85％，毛重4mg，每1mg分装1管。
实施例1b
噬菌体展示实验步骤
文库构建
根据2019-nCoV与SARS同源性较高，且同属于冠状病毒β种属，我们选取了β种属冠状病毒所有病毒株。又因为病毒表面抗原肽能诱导机体产生免疫保护作用抗体，我们 在NCBI数据库中调取了全部抗原蛋白序列进行抗原表位分析。一般情况下，一个抗原 多肽表位包含5-6个氨基酸，为了涵盖抗原蛋白的所有抗原表位，我们利用生物信息学 方法对抗原蛋白以25个氨基酸为单位进行分割。切割后的氨基酸序列进行去冗余分析后 转换为cDNA序列，并在两端加上特定酶切位点，交由生物公司合成DNA序列文库。采 用PCR技术扩增合成的DNA序列文库，经酶切后将抗原肽的DNA片段克隆至m13质粒上， 电转至Tg1菌株中，用噬菌体感染菌株包装产生噬菌体文库，从而使抗原肽以与噬菌体 外壳蛋白融合的形式表达在噬菌体的表面。对包装完成的噬菌体颗粒进行大量复制扩增 并通过噬斑实验测定滴度，使库容足以涵盖所有的抗原肽，完成文库的构建。
新冠噬菌体文库淘筛
1.5％脱脂牛奶(Solarbio，Cat#D8340)封闭1.5ml EP管，置于旋转混合仪上4℃过夜；
2.次日取出EP管，倒掉牛奶，加入80μl protein A/G磁珠(Bimake，Cat#B23202)，吸打混匀；
3.将EP管放在磁力架上去除上清，用1ml 0.05％的PBST(10X PBST：Solarbio，Cat#P1033-500)清洗磁珠2次，用80μl无菌PBS(Gibco，Cat#C10010500BT)重悬磁珠；
4.取50μl磁珠转移至新的封闭好的EP管内，加入10μl新冠噬菌体文库，吸打混匀后 置于混合仪上室温缓慢旋转1h；
5.将EP管放在磁力架上，吸取上清至新的封闭好的EP管内；
6.用无菌PBS稀释待测血清(1:50)至终体积100μl，吸取100μl稀释后的血清于步骤5中的EP管内，室温下混合仪上缓慢旋转1h，静置1h；
7.加入剩余的30μl磁珠，旋转混合20分钟；
8.将EP管放在磁力架上弃上清，用0.05％PBST洗8次，PBS洗2次，弃上清；
9.加入300μl胰蛋白酶(工作浓度为1mg/mL；Gibco，Cat#25200072)，37℃消化10min， 反复上下吹打20遍，重复一次37℃消化10min，反复上下吹打20遍；
10.放入磁力架，取150μl液体感染15ml TG1(OD600＝0.4-0.8)，充分混匀后，37℃静置35min；
11.菌液8000rmp离心10min，弃上清，梯度10倍稀释，涂2×YT(Amp)培养板，倒 置培养过夜；
12.第三日收集平板上的菌提取质粒；
13.第一轮PCR的反应组份如表2所示：
表2第一轮PCR反应组分
Figure BDA0002526894210000101
第一轮PCR的反应程序如表3所示：
表3第一轮PCR反应程序
Figure BDA0002526894210000102
14.第二轮PCR的反应组份如表4所示：
表4第二轮PCR反应组分
上游引物 1μl
下游引物 1μl
一轮PCR产物 10μl
2XQ5高保真酶 25μl
无酶水 13μl
总体系 50μl
第二轮PCR的反应程序如表5所示：
表5第二轮PCR反应程序
Figure BDA0002526894210000111
15.PCR产物中加入0.9X的AMPure beads(KAPA，Cat#KK8002)，吸打混匀，室温 静置10min；
16.放入磁力架，弃上清；
17.用无酶水配制80％的乙醇，每管加入200μl配好的乙醇清洗磁珠，重复两次；
18.放入磁力架，弃上清，开盖室温干燥磁珠表面的乙醇；
19.加入22μl无酶水吹打混匀，室温静置2min；
20.放入磁力架，吸取20μl上清至新的EP管内，跑凝胶电泳，测浓度，送测序。
实施例2
SARS-CoV-2S蛋白3-D结构标注B细胞表位
在NCBI GeneBank下载SARS-CoV-2全基因组序列(NC_045512)，然后提取S蛋白全长序列进行结构模拟。我们在SWISS-MODEL在线服务器提交了S蛋白序列，以SARScoronavirus S蛋白(PDB ID:6VSB)为模板模拟出了SARS-CoV-2S蛋白结构，在PYMOL 上进行表位标注。
图2A、图2B表示SARS-CoV-2S蛋白3-D结构图，蛋白S431-454，蛋白S470-486， 蛋白S501-515，RBM区分别通过箭头进行标注。
实施例3
S431-454、S470-486、S501-515序列同源性比对
冠状病毒S蛋白中RBD区域是病毒感染细胞与细胞表面受体结合的主要区域，并且我们对S431-454、S470-486、S501-515序列和human、bat SARS-like CoVs以及MERS进 行了同源性比对，比对使用的软件是MEGA7。
图3表示SARS-CoV-2S蛋白RBD区域，以及S431-454、S470-486、S501-515序列与human和bat SRARS-like CoVs、MERS之间的同源性。
实施例4
ELISA检测核酸检测结果呈阳性血清
酶联免疫吸附反应ELISA实验步骤：
1.将MES粉末(SIGMA，Lot#SLBZ3485)用ddH2O配制成0.1M、pH＝6.0的MES buffer；将EDC(C8H17N3，Thermo Scientific，Lot#TB257918)用ddH2O稀释成10mg/ml。
2.将多肽用0.1M的MES buffer稀释成4μg/ml。
3.在微孔板设阴性对照，每孔中加入10μl EDC溶液和50μl多肽溶液；其余孔中加入 10μl EDC溶液和50μl MES buffer。轻轻震动混匀。用不干胶条封板后于4℃过夜或室温放置两个小时以上。
4.去掉不干胶条，吸去孔内液体，每孔加300μl ddH2O，静置2分钟，弃去液体，拍干板子。再重复以上步骤2次。
5.用1×PBST配制1％BSA的封闭液(10X PBST：Solarbio，Cat#P1033-500；BSA:Solarbio，Cat#A8020)，每孔加入200μl封闭液，室温封闭1小时。
6.弃去孔内液体，拍干板子。将待测血清用封闭液按1:500稀释，每孔加入100μl稀释血清，室温反应1小时。
7.弃去孔内液体，每孔加300μl 1×PBST，静置2分钟，弃去液体，拍干板子。再重复以上步骤2次。
8.将HRP标记的Goat Anti-Human IgG(Cwbio，Cat#CW0169S)用封闭液按1：5000稀释，每孔100μl，室温反应40分钟。
9.重复操作步骤7，用1X PBST洗板5次。
10.每孔加入TMB-ELISA显色液(Thermo Scientific，Lot#TK2666052)100μl，避光反应5-15分钟。
11.每孔加入2M H2SO4溶液50μl终止反应。
12.将酶标仪设定波长450nm测量各孔OD值，应在终止反应后30分钟内读值。
实验结果如图4所示。图4表示S431-454、S470-486、S501-515三条抗原肽分别用ELISA检测2019-nCoV阳性和阴性患者血清，根据IgG结果OD450读值画图。
合成S431-454、S470-486、S501-515三条抗原肽序列后，在体外设计ELISA实验，检测核酸检测结果呈阳性的血清样本。每组实验都设置了血清背景对照组。我们收集到 的血清均为新冠患者发病后到医院就医时的样本，其中核酸检测结果阳性表示进行核酸 检测时体内存在新冠病毒。
实施例5
ELISA检测核酸检测结果呈阳性血清与正常人之间的差异
实验步骤同示例4筛选到的三条抗原肽都能检测出患者与正常人之间的抗体水平差异。
实施例6
ELISA检测核酸检测结果呈阴性血清与正常人之间的差异
实验步骤同示例4在核酸检测结果呈阴性的病人血清中也能检测到特异性抗体，并 且通过统计分析该抗原肽在阴性血清中也具有比较高的灵敏度。说明病人在感染新冠肺 炎病毒发病后虽然体内病毒被清除，但是抗体也是确实存在的。
实施例7
统计感染病人在住院治疗过程中抗体检测水平变化
同实施例4的ELISA步骤
图7A、图7B示出我们追踪的五名病人在确诊新冠肺炎之后，住院治疗的过程中，血清中抗体水平变化，以及根据病情的临床综合打分情况。
由图7A、图7B可以看出，S431-454、S470-486、S501-515蛋白能检测出病人在治 疗过程中的血清中抗体水平变化，并且趋势和临床综合打分基本一致。这代表我们的这 条多肽能很灵敏的检测病人体内的抗体水平，也能够通过这种抗体水平来反映对 SARS-CoV-2的免疫情况。
实施例8
特异性抗原肽灵敏度和特异性检测
我们将检测到的SARS-CoV-2PCR+/-以及正常人的血清中抗体水平进行统计，在GraphPad Prism 7.0中进行ROC curve统计分析。
图8A、图8B示出SARS-CoV-2-IgG(POS/NEG):POS代表核酸检测阳性，NEG代 表核酸检测阴性。
根据ROC曲线统计结果，统计出灵敏度和特异性。发明人共检测了新冠患者核酸阳性50例，新冠患者核酸阴性118例，正常人50例，统计SARS-CoV-2-IgG。
ELISA实验能高效灵敏的检测出样本中的抗体，因此在体外大规模开展ELISA实验检测新型冠状病毒感染患者以及正常人的血清样本，验证多肽的灵敏度和准确性。根据ROC曲线统计结果如下：
1.S431-454抗原肽检测正常人37例，新冠患者(核酸检测阳性)50例血清中 SARS-CoV-2-IgG的水平：
以0.419为判定值，检测灵敏度为100％，特异性为100％
2.S431-454抗原肽检测正常人37例，新冠患者(核酸检测阴性)118例血清中SARS-CoV-2-IgG的水平：
以0.3385为判定值，检测灵敏度为90.68％，特异性为94.59％
3.S470-486抗原肽检测正常人58例，新冠患者(核酸检测阳性)49例血清中 SARS-CoV-2-IgG的水平：
以0.3695为判定值，检测灵敏度为97.96％，特异性为93.1％
4.S470-486抗原肽检测正常人58例，新冠患者(核酸检测阴性)118例血清中SARS-CoV-2-IgG的水平：
以0.4515为判定值，检测灵敏度为99.15％，特异性为98.28％
5.S501-515抗原肽检测正常人50例，新冠患者(核酸检测阳性)43例血清中 SARS-CoV-2-IgG的水平：
以0.3615为判定值，检测灵敏度为97.67％，特异性为98％
6.S470-486抗原肽检测正常人50例，新冠患者(核酸检测阴性)117例血清中SARS-CoV-2-IgG的水平：
以0.3525为判定值，检测灵敏度为94.87％，特异性为98％
基于上述结果，统计出如下表6的灵敏度以及特异性：
表6.抗原肽灵敏度和特异性
新冠患者阳性IgG 新冠患者阴性IgG
S431-454灵敏度 100％ 90.68％
S431-454特异性 100％ 94.59％
S470-486灵敏度 97.96％ 99.15％
S470-486特异性 93.1％ 98.28％
S501-515灵敏度 97.67％ 94.87％
S501-515特异性 98％ 98％
上述结果表明，本公开中的抗原肽在检测时，具有良好的灵敏度和特异性。
实施例9
多肽抑制病毒感染实验
按2×104个细胞/孔的密度铺Huh7.5细胞于96孔板中，第二天按照图中所示的剂量加 入BSA偶联的S431-454、S470-486、S501-515多肽，预处理2hr后，按2倍稀释加入SARS-CoV-2假病毒感染液，24hr后收取细胞，测定Lciferase荧光素酶活性(PromegaE151A)。
图9A、图9B示出多肽抑制病毒感染实验的结果。从图9A、图9B可以看出，当 S470-486、S501-515多肽剂量为1μg时能明显抑制病毒感染，与对照组之间的差异具有 统计学意义。
本公开并不旨在限于具体公开的实施方案的范围，提供所述实施方案例如来说明本公开的各方面。从本文的描述和教导，对所述组合物和方法的各种修改将变得明显。 可以在不脱离本公开的真正范围和精神的情况下实践这类变化，并且这类变化旨在落入 本公开的范围内。
序列表
<110> 苏州方科生物科技有限公司
苏州系统医学研究所
<120> 新型冠状病毒特异性抗原肽及其用途
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
1 5 10 15
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg
20
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly
1 5 10 15
Phe
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe
1 5 10 15

Claims (8)

1.一种多肽，其中，所述多肽为如下(1)-(2)任一项所示的多肽：
(1)所述多肽为如SEQ ID NO：1-3任一项所示的序列编码的多肽；
(2)所述多肽为(1)所示的多肽的基础上，取代、重复、缺失或添加一个或多个氨基酸的多肽。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中，所述多肽相对于如SEQ ID NO：1-3任一项所示的序列编码的多肽，具有至少80％的同源性；优选的，具有至少90％以上的同源性。
3.根据权利要求1-2任一项所述的多肽，其中，所述多肽的氨基酸残基的个数为15-24个。
4.一种检测是否被SARS-CoV-2感染或患有COVID-19的试剂盒，其中，所述试剂盒中含有根据权利要求1-3任一项所述的多肽。
5.一种药物组合物或疫苗，其中，所述药物组合物或疫苗中含有根据权利要求1-3任一项所述的多肽。
6.根据权利要求1-3任一项所述的多肽在制备用于检测是否被SARS-CoV-2感染或患有COVID-19的试剂中的用途。
7.根据权利要求1-3任一项所述的多肽在制备用于治疗或预防被SARS-CoV-2感染或患有COVID-19的药物中的用途。
8.一种治疗被SARS-CoV-2感染或患有COVID-19的方法，其中，所述方法包括向患者施用根据权利要求1-3任一项所述的多肽或根据权利要求5所述的药物组合物或疫苗。
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