CN113720670B - 一种快速切片样本染色的方法和系统 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种切片染色方法,包括:步骤一,将样本附着在载玻片表面、放置在倾斜的工作台面上,台面的上下面方向分别装有磁场发生器,发生器正对载玻片位置;步骤二,将盖玻片放在载玻片上、以分隔块隔开,盖玻片、载玻片与分隔块包围形成不封闭的间隙空间、留有进液口和排液口;步骤三,将掺杂了微小磁棒的染液从进液口注入间隙空间;步骤四,控制磁场发生器产生变化的磁场,吸引磁棒在染液中运动;步骤五,将清洗液注入间隙空间以清洗。上述方法利用盖玻片与载玻片间的毛细效应保持染液不会滴落而保持浸润样本,利用磁场驱动染液中磁棒运动而搅动染液,在不增加染料消耗的同时实现自动化的快速切片样本染色。
Description
技术领域
本发明涉及一种快速切片样本染色方法和系统,主要应用于显微镜观察样本的制备。
背景技术
在病理学上,由于生物切片样本近乎透明,通常需要染色以使不同成分呈现不同色彩以便观察。
特别的,具有特异性的染料能够对同一类成分的不同亚型产生不同染色效果。例如免疫组织化学中,使用针对特定抗体绑定的染料进行浸染,可以对特定蛋白质染色,以量化判断其在组织中存在与否以及浓度。
但是,高特异性的新型染料常需通过复杂、高度专用的合成方法制备,单价高昂,现有的自动染色方法将玻片浸没在染液中再冲洗的方法意味着大量染液消耗,成本极高。
与之相对的,人工加样进行特定区域浸染的方法能一定幅度降低染料消耗,但应对要对同一片玻片定时加入、冲洗、再加入、再冲洗多种染料的工作流程要耗费大量人工。
无论自动还是人工加样,染色过程都受染料浸染速度的制约,对于粘稠的、热稳定性差的染料这一速度通常更慢。搅动染料加速浸染速度则极易破坏厚度只有几微米、机械强度较低的切片样本。
发明内容
对此,本发明提供一种快速切片样本染色方法和系统。利用分隔块分隔开特定距离的盖玻片与载玻片间的毛细效应保持染液在一定体积内不会向外滴落而保持浸润样本,在继续加入染液或清洗液时能突破毛细效应而排出染液。在染液中加入微米级磁棒颗粒,利用盖玻片上方和载玻片下方的磁场发生器产生变化磁场驱动磁棒运动而搅动染液,加快染液与样本间物质交换而在不增加染料消耗的同时实现自动化的快速切片样本染色。
为了达成上述目的,本发明提供一种快速切片样本染色方法,步骤如下。
步骤之一,将待染色切片样本附着在载玻片表面,将所述载玻片放置在预先调整倾斜的工作台面上;接近所述工作台面的上、下两面方向分别安装有磁场发生器,所述磁场发生器正对所述载玻片的摆放位置。
步骤之二,将盖玻片放置在所述载玻片上,两者间以若干分隔块隔开,所述盖玻片、所述载玻片与所述分隔块包围形成不完全封闭的间隙空间;所述间隙空间至少留有一个进液口和一个排液口,所述进液口在所述倾斜的工作台面较高处、所述排液口在所述倾斜的工作台面较低处。
步骤之三,将预设体积的、掺杂了微小磁棒的染液从所述进液口注入所述间隙空间。
步骤之四,周期性控制所述磁场发生器以产生变化的磁场,吸引所述微小磁棒在所述染液中运动、进而搅动染液,直到所述染液对所述待染色切片样本完成浸染。
步骤之五,将预设体积的清洗液从所述进液口注入所述间隙空间以清洗去除所述染液。
步骤之六,更换另一种染液,重复步骤之三至步骤之五,直到完成所有染液浸染和清洗。
其中,所述分隔块的厚度的选择方法是,根据试剂液的流体特性预先建模,通过列举尝试,获得所述载玻片和所述盖玻片在所述间隙空间产生的适当强度的毛细效应对应的所述分隔块厚度。
所述试剂液为各种染液和清洗液的统称。
所述流体特性包括粘稠度和液体张力等物理属性。
所述适当强度的毛细效应是指,在合适的所述台面倾角时,注入所述间隙空间的所述试剂液不超过体积上限时,所述毛细效应足以抵抗所述试剂液所受重力沿所述工作台面表面方向的分量而保持所述试剂液在排液口形成稳定液面,不会流出;在继续加入试剂液时,额外试剂液的重力将进一步推挤所述排液口的试剂液,最终能够超过所述毛细效应的承载能力,破坏所述稳定液面,使所述试剂液流出,直到所述试剂液低于体积上限。
在其中一个实施例中,所述排液口的结构为:所述载玻片、所述盖玻片和所述分隔块围绕形成的长条状开口,且长条的长边与重力方向垂直。
在其中一个实施例中,所述磁场发生器划分为若干磁场发生单元,每个单元可独立激活以产生磁场或休眠。
在其中一个实施例中,称靠近所述载玻片的所述磁场发生器上的所述磁场发生单元为下磁场发生单元,称靠近所述盖玻片的所述磁场发生器上的所述磁场发生单元为上磁场发生单元,则所述磁场发生器产生的磁场的变化的基本规则如下。
步骤之一一,激活部分所述下磁场发生单元、休眠所有所述上磁场发生单元。
步骤之一二,激活与已激活的所述下磁场发生单元正对的所述上磁场发生单元。
步骤之一三,休眠所有所述下磁场发生单元。
步骤之一四,激活部分未激活的所述上磁场发生单元,并休眠步骤之一二激活的所述上磁场发生单元。
步骤之一五,激活与已激活的所述上磁场发生单元正对的所述下磁场发生单元。
步骤之一六,休眠所有所述上磁场发生单元。
步骤之一七,重复步骤之一二到步骤之一六。
所述正对是指两者中轴连线垂直于或接接近垂直于工作平台表面的方向。
一种快速切片样本染色系统,包括染液特性输入模块、控制模块、存储模块、加液器驱动模块、磁场驱动模块、磁场发生模块。
所述染液特性输入模块接收人工输入或从读取标签读取染液的流体特性。
所述控制模块根据预设的程序,依照所述流体特性从所述存储模块查取预设的磁场驱动信号变化流程和试剂液加注流程,向所述磁场驱动模块和所述加液器驱动模块发出驱动信号。
所述加液器驱动模块驱动加液器获取染液和清洗液后向切片样本玻片间加注。
所述磁场驱动模块将所述磁场驱动信号转换为所述磁场发生模块的驱动能量。
所述磁场发生模块受所述驱动能量控制,产生不同空间分布、强度变化的磁场。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他实施例的附图。
图1是一组毛细效应的原理图。
图2是毛细效应影响下,试剂液的受力分析图。
图3是载玻片、盖玻片、分隔块和加液器的组合关系图。
图4是载玻片、盖玻片、分隔块和加液器的组合关系左视图,同时标出间隙空间位置。
图5是磁场发生器、磁场发生器固定架、载玻片、盖玻片、分隔块、加液器和工作台面的组合关系图。
图6是磁场发生器、磁场发生器固定架、载玻片、盖玻片、分隔块、加液器和工作台面的组合关系的正视图,同时标出进液口和排液口位置。
图7是磁场发生器控制磁棒搅动试剂液的原理图。
图8是染色系统模块图。
具体实施方式
现在详细参考附图并描述实施例。为了全面理解本发明,在以下详细描述中提到了众多具体细节。但是本领域技术人员应该理解,本发明可以无需这些具体细节而实现。在其他实例中,不详细描述公知的方法、过程、组件和电路,以免不必要地使实施例模糊。
毛细效应是一种广泛存在的物理效应,毛巾纤维吸水、植物茎内导管向顶端传递水分均利用了这种效应。其成因本质成因是液体的表面张力,体现出的效果是固体表面对液体液面的吸引力。
图1为一组四幅典型的毛细效应原理图。图1之左1图中,一枚液滴110将落入两片相互平行、同时平行于重力方向且相互保持接近的壁210。由于液滴表面张力,其呈现为近似球形的水滴状。
图1之左2图中,液滴120进入壁220之间。液滴120表面张力使自身表面倾向于均匀的圆弧形,同时受足够接近的壁220两侧制约,液滴120只能在水平方向充满空间后向上下拉伸。在表面接触下,液滴120与壁220产生毛细效应,受表面张力影响,液滴与壁倾向于形成圆弧状接触面,因而液滴在与壁的接触之处向上下延伸,如同受到平行于壁表面方向的吸引力,使液滴120整体呈工字形。同时,液滴受到重力作用倾向于下坠,因此液滴上表面比下表面更凹陷。
图1之右2图中,随着液滴130受惯性作用继续滑落至壁230的下端,液滴持续受到向下的重力作用,但同时毛细效应的吸引力阻止液滴的脱离,类似于在上、下液面从两侧拉住液滴,使液滴处于受力稳定状态,下端可能从壁的下端排液口突出但不至于滴落。
图1之右1图中,由于壁240的间距不变,因此壁240的对液滴上下液面的毛细效应造成的吸引力不变;当滴入更多液滴时,液滴140高度变大、体积变大、受重力增大,壁对液滴的上下液面吸引力的合力的极限值将逐级接近、最终低于液滴重力,无法继续拉住液滴,液滴将滴下。
由以上分析可见,调整壁的间距以改变对毛细效应程度,以及改变壁的倾角,可以改变液滴突破壁下端排液口所需的体积阈值。
针对一般情形,试剂液在壁间可能运动方向上的受力分析如图2所示。其中,如图2之左图所示,间距为d1的壁250经过旋转的仰角为θ度,试剂液150受到两个力:两壁对试剂液上下表面的阻止其下坠的吸引力的合力F1,以及重力G沿壁平行方向的分力G’,其中G’=G·cos(θ)。当G’>F1时,试剂液所受合力向下,将滴落;当G’=F1时,试剂液所受合力为0,不运动;当G’<F1时,试剂液将被吸入壁间,也就是常见的毛细管吸水的效果。
如图2之右图所示,当壁260间距增大至d2时,假定试剂液的表面张力仍能维持其充满两壁之间,试剂液160的体积不变、因而高度下降。根据毛细效应的原理,由于试剂液与壁的接触面积变大,其因毛细效应受的吸引力的合力的最大值增大,可保证合力F2>F1。
但是,由于试剂液160的高度降低,壁260内可灌入更多试剂液。当继续灌入一定量后、试剂液160的高度与试剂液150相同时,两者所受所受重力与d2/d1的平方呈正比(体积等于高度乘以截面积,截面积正比于直径的平方),同时因毛细效应所受的吸引力与d2/d1呈正比(吸引力正比于接触面积,接触面积正比于直径),即重力的随壁间距的增长率高于毛细效应的吸引力。
由此可见,壁间距越大,能维持不滴落的液体的高度越小,而这正是流体力学中毛细效应的液体高度近似公式h=2·S·cos(β)/(r·ρ·g)所反映的。其中,S是液-气接触面的张力常数,β是液-固接触面的接触角常数,r是壁间半径,ρ是液体密度常数,g是重力加速度常数。即,毛细效应维持的液体高度与容器半径r呈反比。
以上解释了毛细效应的原理,例子中的壁正对应本实施例中的载玻片和盖玻片、壁的间距对应弹性分隔块的厚度。以下结合实施例解释染色方法的典型实施方式。
在本实施例中,如图3,加液器300位于玻片上方未被盖玻片覆盖位置,可受控制精确供给染液或清洗液。盖玻片400与载玻片600间有若干弹性分隔块500将之分离。载玻片上的切片样本不影响分析说明,并未单独标出。
图3所示位置关系的左视图如图4,此时可直观看出由于弹性分割块500的存在,盖玻片400与载玻片600间存在间隙空间700。间隙空间足够小时,由于毛细效应,上下玻片间充入的液体会自发的扩展而排挤出上下玻片间空气,使得待染色玻片上附着的待染色切片被充分浸润在染液中。
典型的间隙空间高度为10微米至3000微米。
相比于没有盖玻片的情形,盖玻片对液体上液面的限制造成液体的厚度下降。这样不仅在染色面积相同的情况下减少了消耗染液的体积,而且盖玻片与载玻片对液面的压力增强了染液的渗透压,加快浸染速度。
图5为图3的以载玻片600为基础的玻片组合放置在工作台面800上。磁场发生器固定架911和921连接在设备外壳上,可以机械移动到工作台面的正上方和正下方。磁场发生器912和922分别连接在固定架911和912上,各自有个一面正对且平行于盖玻片400。易知,当磁场发生器912和922工作时,其发生的磁场线可以高密度的穿过载玻片600和盖玻片400间的间隙区域。
图6是图5组合关系的正视图,可见工作台面仰角为𝜃1。
由于此时下玻片向左下倾斜,加液器300滴下的染液自然因重力从进液口701沿载玻片600表面流动进入载玻片600与盖玻片400之间的间隙空间。
浸染开始时,由加液器300加入适量染液后,由于间隙空间较薄造成毛细效应,液体受张力作用会倾向于在上下玻片间扩展;同样由于毛细效应,在玻片的最左侧排液口702尽管开放,但由于玻片所受吸引力大于重力平行于玻片的分量,因而染液不会从排液口702流出,从而保持在上下玻片间,实现浸染。
浸染过程中,磁场发生器1010和1020产生并不断改变磁场环境,推动染液中的磁棒运动,以此搅动染液,原理如图7所示。
完成浸染后,当加液器继续滴下清洗液,清洗液的重力将传导、累加在染液上,将染液向下推挤而超过玻片的吸引力,染液将从排液口702流出,此即图2分析中G’>F的情形。
同时,由于毛细效应和液体张力,染液和清洗液各自在上下玻片间形成稳定的液面,使得两者相溶能力大大下降,持续加入清洗液并不逐步稀释染液,而是近似两种不相溶的液体一样,由清洗液逐渐排挤出染液,从而实现彻底的清洗。
加入预设量的清洗液可保证将全部染液排空。此时即可按需加入另一种染液进行浸染,而不与已被排空的第一种染液发生反应。
图7展示的从间隙空间横切面角度展示的磁场发生器借助磁棒搅动染液的原理图。
在时间点1,如图7之左图,载玻片600与盖玻片400间的间隙空间700中的染液中有预先加入的磁棒1110,磁场发生器1010与1020平行放置在盖玻片400和载玻片600外侧。当激活磁场发生器1020中的磁场发生段1021激活、其他磁场发生段休眠时,其产生的磁场将吸引染液中所有磁棒向其方向聚集、并按照点虚线所示磁场线方向类似磁棒1110的形式排列。
在时间点2,如图7之中图,磁场发生器1010中的磁场发生段1012激活、其他磁场发生段休眠时,其产生的磁场将吸引染液中所有磁棒向其方向聚集、并按照点虚线所示磁场线方向类似磁棒1120的形式排列。
在时间点3,如图7之右图,磁场发生器1020中的磁场发生段1023激活、其他磁场发生段休眠时,其产生的磁场将吸引染液中所有磁棒向其方向聚集、并按照点虚线所示磁场线方向类似磁棒1130的形式排列。
对比三个时间点的磁棒1110、1120、1130位置及排列,可见通过磁场发生器产生的磁场,可以吸引磁棒在染液中移动并翻滚,因而可以搅动染液。
图8所示为染色系统的模块图。其中染液种类输入模块可接受人工输入染液种类,也可以自动从染液容器上标签读取;控制模块根据染液种类,从存储模块中查询对应的磁场驱动信号变化流程、以及试剂与清洗液的加入速度、加入体积,以控制磁场驱动模块和加液器驱动模块完成对对应机械部件的驱动。
磁场驱动模块接受驱动信号后,产生对应的、放大后的驱动能量,使磁场发生模块发出变化的磁场。
本发明的不局限于上述实施方式,本发明的上述各个实施方式的技术方案彼此可以交叉组合形成新的技术方案,另外凡采用等同替换形成的技术方案,均落在本发明要求的保护范围内。
Claims (5)
1.一种快速切片样本染色方法,其特征在于,步骤包括:
步骤之一,将待染色切片样本附着在载玻片表面,将所述载玻片放置在预先调整倾斜的工作台面上;接近所述工作台面的上、下两面方向分别安装有磁场发生器,所述磁场发生器正对所述载玻片的摆放位置;
步骤之二,将盖玻片放置在所述载玻片上,两者间以若干分隔块隔开,所述盖玻片、所述载玻片与所述分隔块包围形成不完全封闭的间隙空间;所述间隙空间至少留有一个进液口和一个排液口,所述进液口在所述倾斜的工作台面较高处、所述排液口在所述倾斜的工作台面较低处;
步骤之三,将预设体积的、掺杂了微小磁棒的染液从所述进液口注入所述间隙空间;
步骤之四,周期性控制所述磁场发生器以产生变化的磁场,吸引所述微小磁棒在所述染液中运动、进而搅动染液,直到所述染液对所述待染色切片样本完成浸染;
步骤之五,将预设体积的清洗液从所述进液口注入所述间隙空间以清洗去除所述染液;
步骤之六,更换另一种染液,重复步骤之三至步骤之五,直到完成所有染液浸染和清洗;
其中,
所述分隔块的厚度的选择方法是,根据试剂液的流体特性预先建模,通过列举尝试,获得所述载玻片和所述盖玻片在所述间隙空间产生的适当强度的毛细效应对应的所述分隔块厚度;
所述试剂液为各种染液和清洗液的统称;
所述流体特性包括粘稠度和液体张力等物理属性;
所述适当强度的毛细效应是指,在合适的所述台面倾角时,注入所述间隙空间的所述试剂液不超过体积上限时,所述毛细效应足以抵抗所述试剂液所受重力沿所述工作台面表面方向的分量而保持所述试剂液在排液口形成稳定液面,不会流出;在继续加入试剂液时,额外试剂液的重力将进一步推挤所述排液口的试剂液,最终能够超过所述毛细效应的承载能力,破坏所述稳定液面,使所述试剂液流出,直到所述试剂液低于体积上限。
2.根据权利要求1所述染色方法,其特征在于,所述排液口的结构为:所述载玻片、所述盖玻片和所述分隔块围绕形成的长条状开口,且长条的长边与重力方向垂直。
3.根据权利要求1所述染色方法,其特征在于,所述磁场发生器划分为若干磁场发生单元,每个单元可独立激活以产生磁场或休眠。
4.根据权利要求3所述染色方法,其特征在于,称靠近所述载玻片的所述磁场发生器上的所述磁场发生单元为下磁场发生单元,称靠近所述盖玻片的所述磁场发生器上的所述磁场发生单元为上磁场发生单元,则所述磁场发生器产生的磁场的变化的基本规则是,
步骤之一一,激活部分所述下磁场发生单元、休眠所有所述上磁场发生单元;
步骤之一二,激活与已激活的所述下磁场发生单元正对的所述上磁场发生单元;
步骤之一三,休眠所有所述下磁场发生单元;
步骤之一四,激活部分未激活的所述上磁场发生单元,并休眠步骤之一二激活的所述上磁场发生单元;
步骤之一五,激活与已激活的所述上磁场发生单元正对的所述下磁场发生单元;
步骤之一六,休眠所有所述上磁场发生单元;
步骤之一七,重复步骤之一二到步骤之一六;
所述正对是指两者中轴连线垂直于或接接近垂直于工作平台表面的方向。
5.一种快速切片样本染色系统,其特征在于:包括染液特性输入模块、控制模块、存储模块、加液器驱动模块、磁场驱动模块、磁场发生模块;
所述染液特性输入模块接收人工输入或从读取标签读取染液的流体特性;
所述控制模块根据预设的程序,依照所述流体特性从所述存储模块查取预设的磁场驱动信号变化流程和试剂液加注流程,向所述磁场驱动模块和所述加液器驱动模块发出驱动信号;
所述加液器驱动模块驱动加液器获取染液和清洗液后向切片样本玻片间加注;
所述磁场驱动模块将所述磁场驱动信号转换为所述磁场发生模块的驱动能量;
所述磁场发生模块受所述驱动能量控制,产生不同空间分布、强度变化的磁场。
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