CN113707316A - 免疫状态评估方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种免疫状态评估方法及应用，属于免疫评价技术领域。该方法包括：免疫组库分析：提取待评估目标样本基因组，构建免疫组库文库；进行高通量测序，分析TCR和/或BCR的克隆多样性，获得免疫组库指标值；免疫功能分析：取待评估目标血液样本，分为对照和刺激样本，取刺激样本加入刺激物，使刺激样本中免疫细胞产生免疫应答反应，检测免疫组分在刺激前后表达差异，分析得到免疫功能得分；数据分析：综合免疫组库分析结果和免疫功能分析结果，获得免疫年龄，根据免疫年龄、免疫功能得分和免疫组库指标值中的至少一种，获得待评估目标的免疫状态。该方法结合高通量免疫组库测序技术和免疫功能检测两种方法，从不同层面全面综合评估免疫状态。

Description

免疫状态评估方法及应用
本申请是申请号为202011262746.1、于2020年11月12日提交中国知识产权局、申请名称为“免疫状态评估方法及应用”的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及免疫评价技术领域，特别是涉及一种免疫状态评估方法及应用。
背景技术
人类无时无刻无处不处于微生物的包围之中，微生物无处不在。当某种传染病流行时，会感染一部分人，有时还会扩散开来，形成一种流行的趋势。然而，并不是所有的人都会被感染，有的人即使感染也不发病，反映出这部分人机体形成了抗御外来物质的能力，称为免疫状态。
免疫系统是机体担负免疫功能的物质基础，包括免疫器官、免疫细胞及免疫分子三部分。其主要功能是防御、监视、清除，分为非特异性免疫和特异性免疫两大类。免疫系统具有两面性，正常工作的免疫系统可保持机体各方面功能的健康运行，而当免疫系统受损或失控时，机体的免疫状态降低，易使人患病。所以免疫平衡很重要，如何精准科学的评估免疫状态是一项重要的技术。
传统的免疫学检测方法评估免疫状态强弱的有：①免疫五项，即免疫功能的检测。检测血液中免疫球蛋白和补体的含量。②血常规，利用细胞计数的方法分析外周血中白细胞的数量，白细胞数量的增高表明体内存在炎症反应。③自身抗体检测，用酶联免疫法或免疫荧光法等检测抗体的阳性率，不同抗体的阳性率与各种自身免疫性疾病的发生相关。④感染免疫检测，即针对特定细菌、病毒相关的一类抗体检测。⑤通过饮食、生活习惯、心理健康等影响免疫功能的因素间接评估免疫状态。目前，部分医院及第三方检测机构，大多通过流式细胞仪分选，可以了解各类免疫细胞群体的数量和比例。然而，传统的免疫学检测方法存在一定的局限性，均无法全面评估免疫状态。
近年来，利用免疫组库高通量测序技术从分子水平研究免疫与健康疾病的方法也被广泛应用。免疫组库(Immune Repertoire，IR)被定义为在任何特定时间下，机体适应性免疫系统的T淋巴细胞表面受体(T cell receptor，TCR)和B淋巴细胞表面受体(B cellreceptor，BCR)的总和。在T/B细胞成熟过程中，会发生VDJ基因的重排，在重排过程中随机选取一种V、D和J基因串联在一起，组成TCR/BCR的可变区，同时还会在接合部位发生碱基的随机的插入和删除，因此几乎每个新产生的T/B细胞的TCR/BCR基因都各不相同，组成数量庞大的TCR/BCR免疫组库，赋予机体识别各种不同抗原的能力。而通过高通量测序对TCR/BCR的编码基因进行分析，可以对免疫组库进行解码，用于对免疫系统的多样性和特异性进行分析。
随年龄的增长，淋巴细胞多样性下降，导致免疫功能下降。过多的内外部环境压力及疾病会导致免疫系统过多过早的消耗，造成免疫多样性明显低于同龄人。
因此，亟需一种能够精准评估免疫状态的方法，在充分了解免疫状态的基础上，可更为精准的找到维持免疫系统的正常运转的方式，才能更好的抵御疾病的发生。
发明内容
基于此，有必要针对上述问题，提供一种用于非诊断治疗目的的免疫状态评估方法，从免疫应答功能与抗原识别能力检测相结合出发，全面评估个体抵抗疾病的能力。
一种用于非诊断治疗目的的免疫状态评估方法，包括：
免疫组库分析：取待评估目标的生物样本，提取其中基因组DNA或RNA，构建免疫组库文库；进行高通量测序，分析TCR和/或BCR的克隆多样性，获得免疫组库指标值；
免疫功能分析：取待评估目标的血液样本，分为对照样本和刺激样本，取所述刺激样本，加入刺激物，使刺激样本中免疫细胞产生免疫应答反应，随后分别检测对照样本和刺激样本中免疫组分在刺激前后的表达差异，分析得到免疫功能得分；
数据分析：综合免疫组库分析结果和免疫功能分析结果，获得待评估目标的免疫年龄，根据所述免疫年龄，获得待评估目标的免疫状态。
在前期调研中发现，由于免疫系统的功能复杂，需要各种免疫途径、方式维持平衡，才能达到较好的免疫状态，目前常规技术中的评估方法均无法综合全面评估。虽然，也有通过检测应激免疫应答来评价免疫功能的方法，但免疫功能仅是免疫状态强弱的一部分；也有通过疫苗免疫应答的强弱、免疫细胞和免疫分子的影响进行部分评价。但是，还没有对免疫状态进行综合评估的方案。
因而，本发明人在对免疫系统功能方式进行大量研究后提出，可从细胞水平和分子水平，分别以抗原识别能力与免疫应答功能相结合，全面评估系统性的免疫状态，获得个体抵抗疾病的能力。
上述免疫状态评估方法，结合高通量免疫组库测序技术和免疫功能检测两种方法，从不同层面评估免疫状态。一方面通过构建免疫组库文库进行测序，分析TCR或BCR的克隆多样性；另一方面通过刺激样本，激发免疫细胞产生免疫应答，通过对比刺激前后的免疫因子变化，从而全面评估机体免疫水平。
可以理解的，上述用于免疫组库分析的生物样本，其类型可以是：血液或其组成(包括全血、PBMC或淋巴细胞等)，组织等，仅需能够提取其中基因组进行分析即可。
上述用于免疫功能分析的样本，由于需要其中的免疫细胞产生免疫应答，需采用血液样本或其组成(包括全血、PBMC或淋巴细胞等)，从便于取样的角度考虑，以外周血进行检测分析评估，具有较高的现实价值。
在其中一个实施例中，所述数据分析步骤中，优选以免疫年龄和/或免疫功能得分对待评估目标的免疫状态进行分析。
在其中一个实施例中，所述免疫功能分析步骤中，所述免疫组分为根据免疫细胞分型所得到的各免疫细胞的mRNA，分别提取所述对照样本和刺激样本中的RNA，构建RNA-seq文库，进行高通量测序，获得对照样本和刺激样本中各种类型的免疫细胞刺激前后mRNA的表达差异。
上述用于统计免疫组分表达差异的mRNA，按照对免疫功能的影响力进行选择，如可参考Nextseq软件的注释，按照不同mRNA的类型及对应的不同种类免疫细胞进行选取。
可以理解的，上述免疫组分也可以为蛋白，即以免疫蛋白为检测目标，直接通过蛋白质组学分析刺激前后免疫蛋白的表达量差异，也可以实现评估机体免疫功能的目的。
在其中一个实施例中，所述免疫功能分析步骤中，将每一种免疫组分定义为一种免疫分子，按照下述公式计算每一免疫分子的归一化值：
归一化值＝x-最小值/(最大值-最小值)
式中：x为待评估目标的免疫分子的表达值；
最小值为在群体样本中，该免疫分子表达量的最小值；
最大值为在群体样本中，该免疫分子表达量的最大值；
再根据刺激类型，按照如下公式，计算该刺激相关的免疫功能得分：
Figure BDA0003206497110000031
式中：n为该刺激类型下统计的免疫分子数量，g为免疫分子i经过上述归一化后的归一化值，α为权重。
由于不同免疫分子的表达量会有差异，无法在同一水平进行比较，上述分析中，先将各免疫分子的表达量进行归一化处理，使不同免疫分子在同一量级层面进行比较，获得评估值更为全面和准确。
并且，可通过上述公式将各免疫分子进一步换算为免疫功能得分，可以更为直观的评价免疫状态。其中，刺激类型如细菌，或病毒或产生粘膜免疫刺激源的类型等，而通过权重α的调整，能够体现出不同免疫分子在综合免疫功能中的重要程度，更为准确评估整体免疫状态。
可以理解的，由于生物体存在个体差异，为减少个体差异性对评估结果的影响，通过对群体样本(如不小于50例)进行检测，以获得该免疫分子在群体中的普遍范围，以此群体样本中最大最小值的矫正，可进一步提供评估准确性。
在其中一个实施例中，α通过以下方法得到：以健康群体样本中某免疫分子经过刺激前后得到归一化值的比值与真实年龄的相关性系数或者线性拟合值，作为该指标的权重。
可以理解的，所述健康群体指根据通常医学评估标准进行判定，并可依据具体情况进行调整。
在其中一个实施例中，所述刺激类型指：模拟细菌相关刺激，病毒相关刺激，T细胞活化刺激中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述免疫分子包括：IL1B、IL6、CXCL8、CCL19、CCL20、CD14、CD36、IL12B、MAPK3、RPS6KA1、CCL24、TLR1、MAPKAPK3、TLR6、ZBTB7B、IL23A、TLR9、SIGIRR、LOXL3、PELI3、IL27、AHR、CD86、DUSP7、NCKAP1、IFNB1、IL10、IL12A、IRF7、MEF2C、MAP2K6、RELA、STAT5A、TLR3、IL22、IL17F、TIRAP、CXCL10、IRF4、XCL1、RIPK2、TWSG1、NLRP3、FOS、IFNG、IL13、SOCS1、VSIR、JAML和DUSP4中的至少一种。
可以理解的，可根据免疫组分对免疫功能的影响力程度大小，提取最能反应免疫功能最有影响力的免疫分子，而发明人经过试验筛选和反复验证后发现，以上述免疫分子评估免疫功能，能够较为准确全面反映机体免疫水平。
在其中一个实施例中，所述免疫功能分析步骤中，所述刺激物选取模拟病毒刺激、细菌刺激和T细胞活化刺激中至少一种刺激情况下的代表性物质。
可以理解的，上述刺激物可以从常规技术中公开的能够代表不同类型免疫刺激的物质中进行选取。
在其中一个实施例中，所述免疫功能分析步骤中，模拟病毒刺激的刺激物包括：TLR7/8、3pRNA；模拟细菌刺激的刺激物包括：TLR4；模拟T细胞活化刺激的刺激物包括：Anti-CD3、Anti-CD28、植物凝集素(PHA)、刀豆球蛋白A(ConA)、美洲商陆有丝分裂原(PWM)、金黄色葡萄球菌肠毒素A～E(SEA～E)、表皮剥脱毒素(EXT)、关节炎支原体丝裂原(MAM)、小肠结肠耶氏菌膜蛋白及小鼠逆转录病毒的蛋白产物中的至少一种。以上述刺激物进行配合，能够较好的全面模拟真实环境中大部分免疫刺激源，可准确、客观评估机体遭受刺激后的免疫应答功能。
在其中一个实施例中，所述免疫组库分析步骤中，所述数据分析步骤中，按照下述方法计算得到免疫年龄：
Figure BDA0003206497110000041
式中：V1为免疫组库指标值，m为指标数量，W1为免疫组库各指标相应的权重，V2为免疫功能得分，n为指标数量，W2为免疫功能各指标相应的权重，β为免疫组库所占比重；
所述免疫组库指标包括：VJ基因使用多样性，免疫多样性，免疫细胞种类和免疫细胞均一性中的至少一种；
所述VJ基因使用多样性通过以下方法计算：对免疫组库分析得到的TCR和/或BCR中所有V-J配对及其频率求香浓指数，即为VJ基因使用多样性值；
所述免疫多样性通过以下方法计算：对免疫组库分析得到的所有TCR和/或BCR克隆以及频率求香浓指数，即为免疫多样性值；
所述免疫细胞种类通过以下方法计算：以免疫组库分析得到的所有TCR和/或BCR克隆种类数为免疫细胞种类值；
所述免疫细胞均一性通过以下方法计算：对免疫组库分析得到的所有TCR和/或BCR克隆以及频率求求基尼指数，即为免疫细胞均一性值。
上述香浓指数、基尼指数等的计算，均按照常规方法计算即得。
上述免疫年龄，是综合免疫组库和免疫功能的指标，对个体进行综合的免疫状态评估所得，免疫年龄低于或等于实际年龄，说明免疫系统状态正常，相反，则表示免疫状态异常。
在其中一个实施例中，所述数据分析步骤中，
W1通过以下方法得到：以真实年龄与该指标的相关性系数或者线性拟合值，作为该指标的权重；
W2通过以下方法得到：以真实年龄与该指标的相关性系数或者线性拟合值，作为该指标的权重；
β指免疫组库对免疫系统影响所占比重。
通过上述方法的调整，可以更精确的评估免疫年龄和免疫状态。将免疫组库和免疫功能结合比单方面评估更精确，两者同等重要，反应了免疫系统不同的方面，如免疫组库反应了抗原识别能力，免疫功能反应了细胞免疫应答能力。
在其中一个实施例中，该用于非诊断治疗目的的免疫状态评估方法还包括参考数据库建立，所述参考数据库建立步骤为：选取健康人群的全血样本，按照上述方法进行免疫组库分析和免疫功能分析，并进行数据分析，获得健康人群免疫组库参考数据和免疫功能参考数据，即得参考数据库。
基于全年龄段的健康人群的免疫组库数据和免疫功能参考数据，建立参考数据库，从而可以构建基于免疫组库的免疫潜能评估模型，与健康人员数据进行比对，精准的评价免疫状态，提示亚健康状态，进一步可以评价个体的疾病风险。
本发明还公开了上述的免疫状态评估方法在制备用于进行免疫状态评估的试剂和设备中的应用。
可以理解的，上述设备包括一体化检测仪或分别提供各功能模块的设备组合。
本发明还公开了一种免疫状态评估系统，包括：
免疫组库分析模块，用于分析得到免疫组库指标值，所述免疫组库指标值通过以下方法得到：取待评估目标的生物样本，提取其中基因组DNA或RNA，构建免疫组库文库；进行高通量测序，分析TCR和/或BCR的克隆多样性，获得免疫组库指标值；
免疫功能分析模块，用于分析得到免疫功能得分，所述免疫功能得分通过以下方法得到：取待评估目标的血液样本，分为对照样本和刺激样本，取所述刺激样本，加入刺激物，使刺激样本中免疫细胞产生免疫应答反应，随后分别检测对照样本和刺激样本中免疫组分在刺激前后的表达差异，分析得到免疫功能得分；
数据分析模块：用于综合免疫组库分析结果和免疫功能分析结果，获得待评估目标的免疫年龄，根据所述免疫年龄、免疫功能得分和免疫组库指标值中的至少一种，获得待评估目标的免疫状态。
在其中一个实施例中，该免疫状态评估系统还包括参考数据库模块，所述参考数据库模块用于存储健康人群免疫组库参考数据，所述健康人群免疫组库参考数据通过以下方法得到：选取健康人群的全血样本，按照上述方法进行免疫组库分析和免疫功能分析，获得健康人群免疫组库参考数据。
在其中一个实施例中，所述免疫功能分析模块中，所述免疫组分为根据免疫细胞分型所得到的各免疫细胞的mRNA，分别提取所述对照样本和刺激样本中的RNA，构建RNA-seq文库，进行高通量测序，获得对照样本和刺激样本中各种类型的免疫细胞刺激前后mRNA的表达差异。
在其中一个实施例中，所述免疫功能分析模块中，将每一种免疫组分定义为一种免疫分子，按照下述公式计算每一免疫分子的归一化值：
归一化值＝x-最小值/(最大值-最小值)
式中：x为待评估目标的免疫分子的表达值；
最小值为在群体样本中，该免疫分子表达量的最小值；
最大值为在群体样本中，该免疫分子表达量的最大值；
再根据刺激类型，按照如下公式，计算该刺激相关的免疫功能得分：
Figure BDA0003206497110000061
式中：n为该刺激类型下统计的免疫分子数量，g为免疫分子i经过上述归一化后的归一化值，α为权重。
在其中一个实施例中，α通过以下方法得到：以健康群体样本中某免疫分子经过刺激前后得到归一化值的比值与真实年龄的相关性系数或者线性拟合值，作为该指标的权重。
在其中一个实施例中，所述刺激类型指：模拟细菌相关刺激，病毒相关刺激，T细胞活化刺激中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述免疫分子包括：IL1B、IL6、CXCL8、CCL19、CCL20、CD14、CD36、IL12B、MAPK3、RPS6KA1、CCL24、TLR1、MAPKAPK3、TLR6、ZBTB7B、IL23A、TLR9、SIGIRR、LOXL3、PELI3、IL27、AHR、CD86、DUSP7、NCKAP1、IFNB1、IL10、IL12A、IRF7、MEF2C、MAP2K6、RELA、STAT5A、TLR3、IL22、IL17F、TIRAP、CXCL10、IRF4、XCL1、RIPK2、TWSG1、NLRP3、FOS、IFNG、IL13、SOCS1、VSIR、JAML和DUSP4中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述免疫功能分析步骤中，所述刺激物选取模拟病毒刺激、细菌刺激和T细胞活化刺激中至少一种刺激情况下的代表性物质。
在其中一个实施例中，所述免疫功能分析模块中，模拟病毒刺激的刺激物包括：TLR7/8、3pRNA；模拟细菌刺激的刺激物包括：TLR4；模拟T细胞活化刺激的刺激物包括：Anti-CD3、Anti-CD28、植物凝集素(PHA)、刀豆球蛋白A(ConA)、美洲商陆有丝分裂原(PWM)、金黄色葡萄球菌肠毒素A～E(SEA～E)、表皮剥脱毒素(EXT)、关节炎支原体丝裂原(MAM)、小肠结肠耶氏菌膜蛋白及小鼠逆转录病毒的蛋白产物中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述免疫组库分析模块中，所述数据分析步骤中，按照下述方法计算得到免疫年龄：
Figure BDA0003206497110000071
式中：V1为免疫组库指标值，m为指标数量，W1为免疫组库各指标相应的权重，V2为免疫功能得分，n为指标数量，W2为免疫功能各指标相应的权重，β为免疫组库所占比重；
所述免疫组库指标包括：VJ基因使用多样性，免疫多样性，免疫细胞种类和免疫细胞均一性中的至少一种；
所述VJ基因使用多样性通过以下方法计算：对免疫组库分析得到的TCR和/或BCR中所有V-J配对及其频率求香浓指数，即为VJ基因使用多样性值；
所述免疫多样性通过以下方法计算：对免疫组库分析得到的所有TCR和/或BCR克隆以及频率求香浓指数，即为免疫多样性值；
所述免疫细胞种类通过以下方法计算：以免疫组库分析得到的所有TCR和/或BCR克隆种类数为免疫细胞种类值；
所述免疫细胞均一性通过以下方法计算：对免疫组库分析得到的所有TCR和/或BCR克隆以及频率求求基尼指数，即为免疫细胞均一性值。
W1通过以下方法得到：以真实年龄与该指标的相关性系数或者线性拟合值，作为该指标的权重；
W2通过以下方法得到：以真实年龄与该指标的相关性系数或者线性拟合值，作为该指标的权重；
β指免疫组库对免疫系统影响所占比重。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的一种用于非诊断治疗目的的免疫状态评估方法，结合高通量免疫组库测序技术和免疫功能检测两种方法，从不同层面评估免疫状态。一方面通过构建免疫组库文库进行测序，分析TCR或BCR的克隆多样性；另一方面通过刺激样本，激发免疫细胞产生免疫应答，通过对比刺激前后的免疫因子变化，从而全面评估机体免疫水平。
该方法可从细胞水平和分子水平，分别以免疫应答功能与抗原识别能力相结合，全面评估系统性的免疫状态，获得个体抵抗疾病的能力，具有评估全面准确的优点。
附图说明
图1为实施例1中免疫状态评估方法流程示意图；
图2为实施例2中志愿者抗细菌免疫功能评估圆形柱状图；
图3为实施例2中志愿者抗病毒免疫功能评估圆形柱状图；
图4为实施例2中志愿者T细胞活化功能评估圆形柱状图；
图5为实施例2中志愿者免疫功能评估结果散点图；
图6为实施例3中志愿者抗细菌免疫功能评估圆形柱状图；
图7为实施例3中志愿者抗病毒免疫功能评估圆形柱状图；
图8为实施例3中志愿者T细胞活化功能评估圆形柱状图；
图9为实施例3中志愿者免疫功能评估结果散点图；
图10为实施例5中不同年龄段的普通人群免疫学年龄评估示意图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
以下实施例中所用各原料试剂，如无特别说明，均为市售购得。
实施例1
一种免疫状态评估方法，结合高通量免疫组库测序技术和免疫功能检测两种技术实现，其流程如图1所示，包括以下步骤：
一、免疫组库分析。
取待评估目标的全血样本，可静脉抽取5ml外周血备用，以1ml全血作为免疫组库分析样本，提取其中基因组(DNA或RNA)，构建免疫组库文库；进行高通量测序，分析TCR和/或BCR的克隆多样性，进行免疫细胞分型，例如可用IMonitor数据分析软件，获得淋巴细胞种类数量等数据。
二、免疫功能分析。
取待评估目标的全血样本，分为对照样本1ml和刺激样本3ml，取所述刺激样本，加入下表所示刺激物，进行模拟刺激，使刺激样本中免疫细胞产生免疫应答反应，之后37℃培养6h，随后收集刺激前和刺激后的细胞进行RNA提取，构建RNA-seq文库，进行高通量测序，测序后进行与免疫应答相关的表达谱分析，从而分别检测获得对照样本和刺激样本中免疫组分在刺激前后的表达差异，分析得到免疫功能得分。
表1.模拟刺激方案
Figure BDA0003206497110000081
本实施例中，对转录组数据分析，进行免疫细胞分型，免疫组分为根据免疫细胞分型所得到的各免疫细胞的mRNA，通过对每种类型的免疫细胞刺激前后mRNA表达差异的分析，对影响免疫功能的信号通路进行定性和定量。
具体的，将每一种免疫组分定义为一种免疫分子，按照下述公式计算每一免疫分子的归一化值：
归一化值＝x-最小值/(最大值-最小值)
式中：x为待评估目标的免疫分子的表达量；
最小值为在群体样本中，该免疫分子表达量的最小值；
最大值为在群体样本中，该免疫分子表达量的最大值；
再根据刺激类型，如细菌相关刺激，病毒相关刺激，T细胞活化刺激实验条件下的免疫分子表达差异，按照如下公式，计算该刺激相关的免疫功能得分：
Figure BDA0003206497110000091
式中：n为该刺激类型下统计的免疫分子数量，g为免疫分子i经过上述归一化后的归一化值，α为权重；
本实施例中，选用以下免疫分子进行评估：IL1B、IL6、CXCL8、CCL19、CCL20、CD14、CD36、IL12B、MAPK3、RPS6KA1、CCL24、TLR1、MAPKAPK3、TLR6、ZBTB7B、IL23A、TLR9、SIGIRR、LOXL3、PELI3、IL27、AHR、CD86、DUSP7、NCKAP1、IFNB1、IL10、IL12A、IRF7、MEF2C、MAP2K6、RELA、STAT5A、TLR3、IL22、IL17F、TIRAP、CXCL10、IRF4、XCL1、RIPK2、TWSG1、NLRP3、FOS、IFNG、IL13、SOCS1、VSIR、JAML、DUSP4。
α通过以下方法得到：以健康群体样本中某免疫分子经过刺激前后得到归一化值的比值与真实年龄的相关性系数或者线性拟合值，作为该指标的权重。
即分别根据不同刺激类型，得到抗细菌免疫功能得分，抗病毒免疫功能得分，T细胞活化功能评估值。
三、数据分析。
综合免疫组库分析结果和免疫功能分析结果，获得待评估目标的免疫年龄，根据所述免疫年龄和/或免疫功能得分，获得待评估目标的免疫状态，可以得到抗病毒功能、抗细菌功能、免疫防线(T细胞活化刺激)功能各项指标的评价结果。
本实施例中，按照下述方法计算得到免疫年龄：
Figure BDA0003206497110000092
式中：V1为免疫组库指标值，m为指标数量，W1为免疫组库各指标相应的权重，V2为免疫功能得分，n为指标数量，W2为免疫功能各指标相应的权重，β为免疫组库所占比重；
所述免疫组库指标包括：VJ基因使用多样性，免疫多样性，免疫细胞种类和免疫细胞均一性中的至少一种；
所述VJ基因使用多样性通过以下方法计算：对免疫组库分析得到的TCR和/或BCR中所有V-J配对及其频率求香浓指数，即为VJ基因使用多样性值；
所述免疫多样性通过以下方法计算：对免疫组库分析得到的所有TCR和/或BCR克隆以及频率求香浓指数，即为免疫多样性值；
所述免疫细胞种类通过以下方法计算：以免疫组库分析得到的所有TCR和/或BCR克隆种类数为免疫细胞种类值；
所述免疫细胞均一性通过以下方法计算：对免疫组库分析得到的所有TCR和/或BCR克隆以及频率求求基尼指数，即为免疫细胞均一性值。
所述V2包括上述计算得到的抗细菌免疫功能得分，抗病毒免疫功能得分，T细胞活化功能评估值等。
上述权重W1通过以下方法得到：以真实年龄与该指标的相关性系数或者线性拟合值，作为该指标的权重；权重W2通过以下方法得到：以真实年龄与该指标的相关性系数或者线性拟合值，作为该指标的权重；β指免疫组库对免疫系统影响所占比重，如本实施例中，认为免疫组库分析和免疫功能分析同等重要，α设为0.5。
上述免疫年龄综合免疫组库和免疫功能的指标，对个体进行综合的免疫状态评估所得，免疫年龄低于或等于实际年龄，说明免疫系统状态正常，相反，则表示免疫状态异常。
实施例2
一种免疫状态评估方法的应用实例。
1、样本收集
与一位志愿者签署知情同意书，在志愿者无任何不适，一个月内没有发生疾病然后在空腹的前提下，用EADT管抽取5ml静脉血，上下颠倒管子数次，防止凝血。
2、样本处理
分别取1ml全血到2ml EP管，一份用于DNA提取构建免疫组库(本实施例用DNA构建免疫组库文库)，一份用于RNA提取构建转录组文库(对照样本)，分析刺激前的mRNA表达量。剩下3ml全血(刺激样本)优先处理，需要维持细胞活性。
需要注意的是，为需要维持细胞活性，能够进行免疫应答反应，抽血后应立刻进行实验，如无法立刻进行实验，可用液氮冻存维持细胞活性，用时复苏。
3、全血模拟刺激
模拟刺激免疫系统产生非特异性免疫和特异性免疫免疫应答的方案，具体见下表。用刺激物TLR7(Toll-like receptor,TLR)、TLR4、Anti-CD3/CD28配制刺激混合物后加入存有全血样本的EDTA管中刺激培养，37℃培养6h。
表2.具体模拟刺激方案
Figure BDA0003206497110000101
Figure BDA0003206497110000111
4、RNA提取
刺激前后的全血分别用HiPure Blood RNA Mini Kit(R4161-01，Magen)进行RNA提取，按Magen相应的提取试剂盒操作说明书进行操作。用于进行免疫功能分析。
5、DNA提取
将收集在2ml EP管里的1ml全血用HiPure Blood DNA Midi Kit I(D3112-02，Magen)进行提取，按Magen相应的提取试剂盒操作说明书进行操作。用于进行免疫组库分析。
6、文库构建
6.1转录组文库构建
分别取1000ng刺激前和刺激后的RNA，按TruSeq Stranded mRNA Library PrepKit(RS-122-2101，Illumina)的标准操作流程构建转录组文库。
6.2免疫组库文库构建
1.2μg DNA起始进行TCRβ链(T cell receptor beta chain，TRB)建库，用多重PCR的方法捕获和富集TRB VJ区域，建库流程可参考现有技术(Systematic ComparativeEvaluation of Methods for Investigating the TCRβRepertoire，DOI:10.1371/journal.pone.0152464)。
7、测序上机
把以上构建的3个文库在NextSeqTM 550Sequencing System上机。刺激前后的转录组文库测序数据6G/个，读长2x 75bp；免疫组库文库测序数据2G/个，读长2x 100bp。
8、数据分析
转录组文库的数据比对用RNA-Seq Alignment软件,表达丰度分析用RNAExpress软件。这两个软件都在BaseSpace Sequence Hub(Illumina基因组学计算平台)使用。
免疫组库测序数据用IMonitor软件进行处理，分析流程可参考现有技术(IMonitor:A Robust Pipeline for TCR and BCR Repertoire Analysis，doi:10.1534/genetics.115.176735)。
9、免疫状态评估结果可视化
经过分析流程处理测序数据，用R语言的ggplot2对结果数据进行可视化。
9.1免疫组库分析
免疫组库测序数据用IMonitor软件进行处理，分析TCR和/或BCR的克隆多样性，进行免疫细胞分型，获得淋巴细胞种类数量。
9.2免疫功能分析
转录组文库的数据比对用RNA-Seq Alignment软件,表达丰度分析用RNAExpress软件行处理，分析得到免疫功能得分，具体如下：
将每一种免疫组分定义为一种免疫分子，按照下述公式计算每一免疫分子的归一化值：
归一化值＝x-最小值/(最大值-最小值)
式中：x为待评估目标的免疫分子的表达量；
最小值为在群体样本中，该免疫分子表达量的最小值；
最大值为在群体样本中，该免疫分子表达量的最大值；
再根据刺激类型，如细菌相关刺激，病毒相关刺激，T细胞活化刺激实验条件下的免疫分子表达差异，按照如下公式，计算该刺激相关的免疫功能得分：
Figure BDA0003206497110000121
式中：n为该刺激类型下统计的免疫分子数量，g为免疫分子i经过上述归一化后的归一化值，α为权重；
本实施例中，选用以下免疫分子进行评估：IL1B、IL6、CXCL8、CCL19、CCL20、CD14、CD36、IL12B、MAPK3、RPS6KA1、CCL24、TLR1、MAPKAPK3、TLR6、ZBTB7B、IL23A、TLR9、SIGIRR、LOXL3、PELI3、IL27、AHR、CD86、DUSP7、NCKAP1、IFNB1、IL10、IL12A、IRF7、MEF2C、MAP2K6、RELA、STAT5A、TLR3、IL22、IL17F、TIRAP、CXCL10、IRF4、XCL1、RIPK2、TWSG1、NLRP3、FOS、IFNG、IL13、SOCS1、VSIR、JAML和DUSP4。
上述免疫分子针对不同类型刺激后，其免疫反应如图2-4所示，图2、图3、图4的圆形柱状图分别表示抗细菌、抗病毒和粘膜免疫(T细胞活化免疫)的程度。该圆柱的高度表示刺激前归一化表达量和刺激后归一化表达量的比值。
再按照上述免疫功能得分公式，计算在不同刺激类型下，该志愿者的免疫功能得分。
其中，α通过以下方法得到：以健康群体样本中某免疫分子经过刺激前后得到归一化值的比值与真实年龄的相关性系数或者线性拟合值，作为该指标的权重。
得到本实施例志愿者免疫功能评估结果散点图如图5所示，其中该志愿者的抗细菌、抗病毒、粘膜免疫(即T细胞活化免疫)的免疫功能得分分别为92，88，80。
可以理解的，可通过健康人群的数据累积，评估人群正常状态下标准的抗细菌、抗病毒和免疫防线(T细胞活化刺激)的程度，然后通过检测待测个体，就可以评估待测个体抗细菌、抗病毒和免疫防线(T细胞活化刺激)的水平。
9.3综合评估。
按照下述方法计算免疫年龄：
Figure BDA0003206497110000122
式中：V1为免疫组库指标值，m为指标数量，W1为免疫组库各指标相应的权重，V2为免疫功能得分，n为指标数量，W2为免疫功能各指标相应的权重，β为免疫组库所占比重；
所述免疫组库指标包括：VJ基因使用多样性，免疫多样性，免疫细胞种类和免疫细胞均一性；
所述VJ基因使用多样性通过以下方法计算：对免疫组库分析得到的TCR和/或BCR中所有V-J配对及其频率求香浓指数，即为VJ基因使用多样性值；
所述免疫多样性通过以下方法计算：对免疫组库分析得到的所有TCR和/或BCR克隆以及频率求香浓指数，即为免疫多样性值；
所述免疫细胞种类通过以下方法计算：以免疫组库分析得到的所有TCR和/或BCR克隆种类数为免疫细胞种类值；
所述免疫细胞均一性通过以下方法计算：对免疫组库分析得到的所有TCR和/或BCR克隆以及频率求求基尼指数，即为免疫细胞均一性值。
通过免疫组库数据分析统计出本实施例案例的上述重要指标如下表所示。
表3.免疫组库指标的结果
Figure BDA0003206497110000131
上述评估结果的高低，是根据收集健康人群的免疫组库数据建立模型后，与参考数据的阈值范围进行比较，而得到待测个体的评估结果。
将上述免疫功能和免疫组库各指标值进行计算，得到待评估目标的免疫年龄，以该免疫年龄综合评估免疫状态，该志愿者免疫学年龄为24岁，实际年龄为23岁，免疫学年龄稍高于实际年龄。评估结论为：该志愿者抗病毒能力较弱，抗原识别能力低，应当做好流行性病毒感染的预防。
事实上，该志愿者自述免疫力低下，容易感冒，但是一周内会痊愈，有鼻炎和咽炎季节性发作，与本实施例评估方法得到的免疫状态相符合。
实施例3
一种免疫状态评估方法的应用实例，按照实施例2的方法进行评估。
本实施例的志愿者免疫分子针对不同类型刺激后，其免疫反应如图6-8所示，图6、图7、图8的圆形柱状图分别表示抗细菌、抗病毒和粘膜免疫(T细胞活化免疫)的程度。该圆柱的高度表示刺激前归一化表达量和刺激后归一化表达量的比值。
再分析得到本实施例的志愿者免疫功能评估结果散点图如图9所示。其中，该志愿者的抗细菌、抗病毒、粘膜免疫(即T细胞活化免疫)的免疫功能得分分别为93，92，93。
通过免疫组库数据分析统计出本实施例案例的上述重要指标如下表所示。
表4.免疫组库指标的结果
Figure BDA0003206497110000141
通过分析计算得到，本实施例志愿者免疫学年龄为25岁，实际年龄为25岁，免疫学年龄与实际年龄一致。评估结论为：该志愿者免疫功能正常。
事实上，该志愿者自述近期没有不适，饮食作息比较正常，2年没有感冒。通过检测总体来看，可以较好地应对外界抗原的入侵，建议继续保持良好习惯，与本实施例评估方法得到的免疫状态相符合。
实施例4
一种免疫状态评估系统，包括：免疫组库分析模块，免疫功能分析模块和数据分析模块。
所述免疫组库分析模块用于分析TCR和/或BCR的克隆多样性，进行免疫细胞分型，获得淋巴细胞种类数量，执行实施例2的方法步骤。
所述免疫功能分析模块用于分析得到免疫功能得分，执行实施例2的方法步骤。
所述数据分析模块综合免疫组库分析结果和免疫功能分析结果，获得待评估目标的免疫年龄，根据所述免疫年龄和/或免疫功能得分，分析获得待评估目标的免疫状态。
实施例5
采用实施例2的具体方法，分析100例志愿者样本，得到各样本免疫年龄值后，按照年龄段进行划分，得到如图10所示不同年龄段的普通人群免疫学年龄评估结果。
从图中可以看出，按照不同年龄段的普通个体免疫学年龄的评估情况，大部分健康人免疫学年龄与实际年龄接近，说明上述评估方法能够客观体现机体免疫水平。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (14)

1.一种用于非诊断治疗目的的免疫状态评估方法，其特征在于，包括：
免疫组库分析：取待评估目标的生物样本，提取其中基因组DNA或RNA，构建免疫组库文库；进行高通量测序，分析TCR和/或BCR的克隆多样性，获得免疫组库指标值；
免疫功能分析：取待评估目标的血液样本，分为对照样本和刺激样本，取所述刺激样本，加入刺激物，使刺激样本中免疫细胞产生免疫应答反应，随后分别检测对照样本和刺激样本中免疫组分在刺激前后的表达差异，分析得到免疫功能得分；
数据分析：综合免疫组库分析结果和免疫功能分析结果，获得待评估目标的免疫年龄，根据所述免疫年龄，获得待评估目标的免疫状态。
2.根据权利要求1所述的用于非诊断治疗目的的免疫状态评估方法，其特征在于，所述免疫功能分析步骤中，所述免疫组分为根据免疫细胞分型所得到的各免疫细胞的mRNA，分别提取所述对照样本和刺激样本中的RNA，构建RNA-seq文库，进行高通量测序，获得对照样本和刺激样本中各种类型的免疫细胞刺激前后mRNA的表达差异。
3.根据权利要求1所述的用于非诊断治疗目的的免疫状态评估方法，其特征在于，所述免疫功能分析步骤中，将每一种免疫组分定义为一种免疫分子，按照下述公式计算每一免疫分子的归一化值：
归一化值＝x-最小值/(最大值-最小值)
式中：x为待评估目标的免疫分子的表达值；
最小值为在群体样本中，该免疫分子表达量的最小值；
最大值为在群体样本中，该免疫分子表达量的最大值；
再根据刺激类型，按照如下公式，计算该刺激相关的免疫功能得分：
Figure FDA0003206497100000011
式中：n为该刺激类型下统计的免疫分子数量，g为免疫分子i经过上述归一化后的归一化值，α为权重。
4.根据权利要求3所述的用于非诊断治疗目的的免疫状态评估方法，其特征在于，α通过以下方法得到：以健康群体样本中某免疫分子经过刺激前后得到归一化值的比值与真实年龄的相关性系数或者线性拟合值，作为该指标的权重。
5.根据权利要求3所述的用于非诊断治疗目的的免疫状态评估方法，其特征在于，所述刺激类型指：模拟细菌相关刺激，病毒相关刺激，T细胞活化刺激中的至少一种。
6.根据权利要求4所述的用于非诊断治疗目的的免疫状态评估方法，其特征在于，所述免疫分子包括：IL1B、IL6、CXCL8、CCL19、CCL20、CD14、CD36、IL12B、MAPK3、RPS6KA1、CCL24、TLR1、MAPKAPK3、TLR6、ZBTB7B、IL23A、TLR9、SIGIRR、LOXL3、PELI3、IL27、AHR、CD86、DUSP7、NCKAP1、IFNB1、IL10、IL12A、IRF7、MEF2C、MAP2K6、RELA、STAT5A、TLR3、IL22、IL17F、TIRAP、CXCL10、IRF4、XCL1、RIPK2、TWSG1、NLRP3、FOS、IFNG、IL13、SOCS1、VSIR、JAML和DUSP4中的至少一种。
7.根据权利要求1所述的用于非诊断治疗目的的免疫状态评估方法，其特征在于，所述免疫功能分析步骤中，所述刺激物选取模拟病毒刺激、细菌刺激和T细胞活化刺激中的至少一种刺激情况下的代表性物质。
8.根据权利要求7所述的用于非诊断治疗目的的免疫状态评估方法，其特征在于，所述免疫功能分析步骤中，模拟病毒刺激的刺激物包括：TLR7/8、3pRNA；模拟细菌刺激的刺激物包括：TLR4；模拟T细胞活化刺激的刺激物包括：Anti-CD3、Anti-CD28、植物凝集素、刀豆球蛋白A、美洲商陆有丝分裂原、金黄色葡萄球菌肠毒素A～E、表皮剥脱毒素、关节炎支原体丝裂原、小肠结肠耶氏菌膜蛋白及小鼠逆转录病毒蛋白产物中的至少一种。
9.根据权利要求1所述的用于非诊断治疗目的的免疫状态评估方法，其特征在于，所述数据分析步骤中，按照下述方法计算得到免疫年龄：
Figure FDA0003206497100000021
式中：V1为免疫组库指标值，m为指标数量，W1为免疫组库各指标相应的权重，V2为免疫功能得分，n为指标数量，W2为免疫功能各指标相应的权重，β为免疫组库所占比重；
所述免疫组库指标包括：VJ基因使用多样性，免疫多样性，免疫细胞种类和免疫细胞均一性中的至少一种；
所述VJ基因使用多样性通过以下方法计算：对免疫组库分析得到的TCR和/或BCR中所有V-J配对及其频率求香浓指数，即为VJ基因使用多样性值；
所述免疫多样性通过以下方法计算：对免疫组库分析得到的所有TCR和/或BCR克隆以及频率求香浓指数，即为免疫多样性值；
所述免疫细胞种类通过以下方法计算：以免疫组库分析得到的所有TCR和/或BCR克隆种类数为免疫细胞种类值；
所述免疫细胞均一性通过以下方法计算：对免疫组库分析得到的所有TCR和/或BCR克隆以及频率求求基尼指数，即为免疫细胞均一性值。
10.根据权利要求9所述的用于非诊断治疗目的的免疫状态评估方法，其特征在于，所述数据分析步骤中，
W1通过以下方法得到：以真实年龄与该指标的相关性系数或者线性拟合值，作为该指标的权重；
W2通过以下方法得到：以真实年龄与该指标的相关性系数或者线性拟合值，作为该指标的权重；
β指免疫组库对免疫系统影响所占比重。
11.根据权利要求1-10任一项所述的用于非诊断治疗目的的免疫状态评估方法，其特征在于，还包括参考数据库建立，所述参考数据库建立步骤为：选取健康人群的全血样本，按照上述方法进行免疫组库分析和免疫功能分析，并进行数据分析，获得健康人群免疫组库和免疫功能参考数据，即得参考数据库。
12.权利要求1-11任一项所述的免疫状态评估方法在制备用于进行免疫状态评估的试剂和设备中的应用。
13.一种免疫状态评估系统，其特征在于，包括：
免疫组库分析模块，用于分析得到免疫组库指标值，所述免疫组库指标值通过以下方法得到：取待评估目标的生物样本，提取其中基因组DNA或RNA，构建免疫组库文库；进行高通量测序，分析TCR和/或BCR的克隆多样性，获得免疫组库指标值；
免疫功能分析模块，用于分析得到免疫功能得分，所述免疫功能得分通过以下方法得到：取待评估目标的血液样本，分为对照样本和刺激样本，取所述刺激样本，加入刺激物，使刺激样本中免疫细胞产生免疫应答反应，随后分别检测对照样本和刺激样本中免疫组分在刺激前后的表达差异，分析得到免疫功能得分；
数据分析模块：用于综合免疫组库分析结果和免疫功能分析结果，获得待评估目标的免疫年龄，根据所述免疫年龄、免疫功能得分和免疫组库指标值中的至少一种，获得待评估目标的免疫状态。
14.根据权利要求13所述的免疫状态评估系统，其特征在于，还包括参考数据库模块，所述参考数据库模块用于存储健康人群免疫组库参考数据，所述健康人群免疫组库参考数据通过以下方法得到：选取健康人群的全血样本，按照上述方法进行免疫组库分析和免疫功能分析，获得健康人群免疫组库和免疫功能参考数据。
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