CN113702376A - 一种利用斑马鱼评价环境污染物h2s发育毒性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用斑马鱼评价环境污染物H2S发育毒性的方法，其通过将斑马鱼受精卵置于不同浓度的H2S环境下进行培育，对不同浓度的H2S对斑马鱼受精卵的孵化及其幼鱼的成活率进行统计，并对幼鱼的脊索、体态、鱼鳔等形态进行观察，以此可评价环境污染物H2S发育毒性。本发明提供一种操作简便、评价周期短、高效、直观地利用斑马鱼评价环境污染物H2S发育毒性的方法。其在10天内即可完成评价周期，且操作简单方便，快速高效，可极大的降低成本；本发明的评价方法的评价结果，不仅可为水体中的环境污染物H2S对其他水体生物的发育毒性提供一定的参考，还可为水体中的H2S的控制提供一定的数据支持与参考。
Description
技术领域
本发明涉及毒理学检测技术领域，尤其涉及一种利用斑马鱼评价环境污染物H2S发育毒性的方法。
背景技术
当前人类工业化不断向前发展，氮、磷等营养物质大量进入湖泊、河湖、海湾等缓流水体，引起藻类及其他浮游生物迅速繁殖，水体溶解氧迅速降低，造成部分耗氧量大的水生动物死亡，在厌氧微生物的发酵下，这些动物尸体腐败产生的大量H2S对其他水生动物造成极其严重的危害，进而使水质进一步恶化。
水污染严重威胁人们的身心健康，也是目前世界各国政府严格管控治理的当务之急，而对水质进行生物危害评价以了解其污染程度是解决水污染问题的前提，当前利用物理或化学等方法只能单一的分析各种物质浓度含量，并不能对生态系统当前状态做一个准确的评估或预测。
斑马鱼是一种新颖的模式生物，活体斑马鱼筛选模型具有诸多优势，是取代青蛙、果蝇、小白鼠等作为研究对象的优良试验模式鱼。斑马鱼喂养和维持的费用更便宜，所需空间场地不大，易于室内大规模繁殖。成体鱼长3～4cm，一次交配能获得100～200个胚胎，每周产卵一次，这样中等规模的鱼缸每年就能养殖成鱼数百万只，成本仅为养小鼠的0.1％-1％。斑马鱼基因组序列与人类基因组高度相似，包括心血管系统、神经系统在内的多个重要组织器官在形态结构、生理功能及病理反应上与人类相仿，使其作为一种理想的脊椎模式生物，在发育生物学、化合物毒性评价和人类疾病模型研究等领域迅速得到广泛应用。
发明内容
因此，基于以上背景，本发明提供一种操作简便、评价周期短、高效、直观地利用斑马鱼评价环境污染物H2S发育毒性的方法。
本发明提供的技术方案为：
一种利用斑马鱼评价环境污染物H2S发育毒性的方法，其包括如下步骤：
S1：利用至少5对雌雄野生斑马鱼(AB型)交配并产卵，收集受精卵；
S2：将受精卵置入装有斑马鱼胚胎培养液的6孔板的孔中，将受精卵分为实验组和对照组；
S3：对照组进行正常培养，实验组中加入0.025μM-2.0μM的NaHS溶液，后续培养过程中，实验组每天更换斑马鱼胚胎培养液并重新加入NaHS溶液；
S3：培养的第五天开始投喂幼鱼饲料，并对受精卵孵化率和斑马鱼幼鱼成活率每天均进行统计；
S4：在培养第六天始用显微镜对斑马鱼的形态进行观察，所述形态包括脊索、体态、鱼鳔。
进一步地，其包括如下步骤：
S1：利用至少5对雌雄野生斑马鱼(AB型)交配并产卵，收集受精卵；
S2：将受精卵置入装有10ml的斑马鱼胚胎培养液的6孔板的孔中，每孔30枚，每3孔为一组平行重复，将受精卵分为实验组和对照组；
S3：对照组进行正常培养，实验组再进行分组，分组后分别加0.025μM、0.05μM、0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM、0.7μM、0.8μM、0.9μM、1.0μM、1.5μM、2.0μM的NaHS溶液，后续培养过程中，实验组每天更换斑马鱼胚胎培养液并重新加入NaHS溶液；
S3：培养的第五天开始投喂幼鱼饲料，并对受精卵孵化率和斑马鱼幼鱼成活率每天均进行统计；
S4：在培养第六天用显微镜对斑马鱼的形态进行观察，所述形态包括脊索、体态、鱼鳔。
进一步地，所述斑马鱼胚胎培养液为：每升ddH2O中含有5g的KCl、10g的Ca2+、2.5g的NaHCO3及26ml甲基蓝。
进一步地，所述NaHS溶液的浓度为0.1mM/ml。
采取上述技术方案，具有的有益效果如下：
本发明利用生长周期短的斑马鱼用于评价环境污染物H2S的发育毒性，相较于其青蛙、老鼠等动物，可极大地缩短周期，在10天内即可完成评价，周期短，且操作简单方便，快速高效，可极大的降低成本；并且从受精卵孵化率、幼鱼成活率、形态直观观察等多方面考察环境污染物H2S的发育毒性，提高其准确度；本发明的方法可准确地评价环境污染物H2S的发育毒性，不仅可为水体中的环境污染物H2S及其HS-对其他水体生物的发育毒性提供一定的参考，还可为水体中的H2S及其HS-的控制提供一定的数据支持与参考。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例中的斑马鱼幼鱼暴露在不同浓度H2S条件下的表型。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面结合附图对本发明做进一步说明。
实施例1：一种利用斑马鱼评价环境污染物H2S发育毒性的方法，其具体操作步骤如下：
S1：利用至少5对雌雄野生斑马鱼(AB型)交配并产卵，收集受精卵；
S2：将受精卵置入装有10ml的斑马鱼胚胎培养液的6孔板的孔中，每孔30枚，每3孔为一组平行重复，将受精卵分为实验组和对照组；
S3：对照组进行正常培养，实验组再进行分组，分组后分别加入0.025μM、0.05μM、0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM、0.7μM、0.8μM、0.9μM、1.0μM、1.5μM、2.0μM的NaHS溶液，后续培养过程中，实验组每天更换斑马鱼胚胎培养液并重新加入NaHS溶液；NaHS溶液在配制过程中，在将NaHS溶于水时，HS-与水中的H+结合形成有毒气体H2S，而气体H2S易溶于水，因此在将NaHS溶液加入酸性的斑马鱼胚胎培养液中时，也即是溶液中存有分子形式的H2S。
S3：培养的第五天开始投喂幼鱼饲料，并对受精卵孵化率和斑马鱼幼鱼成活率每天均进行统计；
S4：在培养第六天用显微镜对斑马鱼的形态进行观察，所述形态包括脊索、体态、鱼鳔。
所述斑马鱼胚胎培养液为：每升ddH2O中含有5g的KCl、10g的Ca2+、2.5g的NaHCO3及26ml甲基蓝。所述NaHS溶液的浓度为0.1mM/ml。
在本实施例中，见表1的不同发育阶段斑马鱼幼鱼露在不同浓度NaHS溶液中成活率(每孔30条，
每三孔为一组，发育第五天开始统计)，见表1。
表1不同发育阶段斑马鱼幼鱼露在不同浓度H2S溶液中成活率统计
对表1统计的数据进行分析，在加入NaHS溶液0.6μM—1μM时，幼鱼虽能孵化，但无法成活(成活率都为0)，而当加入浓度大于1μM时，斑马鱼幼鱼无法孵化，因此表1中数据只记载到加入NaHS溶液0.7μM及其以下的幼鱼成活率。从表1可以明显看出经过八天暴露在H2S溶液中的培养的斑马鱼，加入NaHS溶液0.3μM及以下时,斑马鱼幼鱼成活率仍可以达到50％以上；而加入NaHS溶液0.4μM—1μM时(NaHS母液浓度为0.1mM/l，因此需要加入NaHS溶液的量为4ul、5ul、6ul、7ul、8ul、9ul、10ul)斑马鱼幼鱼可以孵化，但培养到第八天时全部死亡。从表1的数据中，可以看出NaHS在8天内对斑马鱼幼鱼的半致死浓度为0.04μM/ml，由于0.4μM/ml及以上浓度对幼鱼发育的毒性过大，因此选择对0.04μM/ml及其以下浓度的实验组的斑马鱼幼鱼的形态进行观察。
从培养的第六天用体式显微镜观察斑马鱼的形态，通过对实验组和对照组的斑马鱼幼鱼的形态进行比较，发现高浓度(0.04μM/ml以上)NaHS处理后的实验组的15％的幼鱼出现脊索弯曲、严重水肿等症状，随后死亡；而且观察到的所有幼鱼的鱼鳔发育畸形，并且毒素沉积严重(见附图1)。从本实施例的结果可以看出，斑马鱼幼鱼的鱼鳔的发育对NaHS溶液的浓度具有较强的敏感性。附图1中a、b为正常培养条件下正常生长斑马鱼的形态，箭头所指为正常发育鱼鳔；c、d、e为脊索发育畸形，箭头为0.04μM/ml及其以上实验组的鱼鳔发育畸形图片；f为0.04μM/ml及其以上实验组的腹部水肿伴随鱼鳔发育畸形图片。
本发明中用于培育斑马鱼幼鱼的培养液的pH值在6.8-7.0(NaHS加入培养液后，会有部分H2S生成)，所加入的NaHS在水溶液中电离为Na+和HS-，部分HS-与H+结合以H2S的形式存在于培养液中，少量随水进入斑马鱼幼鱼体内，而游离的HS-进入斑马鱼体内，继续与幼鱼体内H+结合产生有毒性效应的H2S，因此本发明实质上不仅仅是评价了H2S的发育毒性，也可以评价作为H2S的供体的NaHS的发育毒性。
由于斑马鱼基因组序列与人类基因组高度相似，包括心血管系统、神经系统在内的多个重要组织器官在形态结构、生理功能及病理反应上与人类相仿，本发明利用斑马鱼对环境污染物中的H2S的发育毒性分析，可为水体中高浓度的H2S对人的发育毒性提供可靠的参考依据。
以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，附图中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种利用斑马鱼评价环境污染物H2S发育毒性的方法，其特征在于，其包括如下步骤：
S1：利用至少5对雌雄野生斑马鱼(AB型)交配并产卵，收集受精卵；
S2：将受精卵置入装有斑马鱼胚胎培养液的6孔板的孔中，将受精卵分为实验组和对照组；
S3：对照组进行正常培养，实验组中加入0.025μM-2.0μM的NaHS溶液，后续培养过程中，实验组每天更换斑马鱼胚胎培养液并重新加入NaHS溶液；
S3：培养的第五天开始投喂幼鱼饲料，并对受精卵孵化率和斑马鱼幼鱼成活率每天均进行统计；
S4：在培养第六天始用显微镜对斑马鱼的形态进行观察，所述形态包括脊索、体态、鱼鳔。
2.根据权利要求1所述一种利用斑马鱼评价环境污染物H2S发育毒性的方法，其特征在于，其包括如下步骤：
S1：利用至少5对雌雄野生斑马鱼(AB型)交配并产卵，收集受精卵；
S2：将受精卵置入装有10ml的斑马鱼胚胎培养液的6孔板的孔中，每孔30枚，每3孔为一组平行重复，将受精卵分为实验组和对照组；
S3：对照组进行正常培养，实验组再进行分组，分组后分别加0.025μM、0.05μM、0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM、0.7μM、0.8μM、0.9μM、1.0μM、1.5μM、2.0μM的NaHS溶液，后续培养过程中，实验组每天更换斑马鱼胚胎培养液并重新加入NaHS溶液；
S3：培养的第五天开始投喂幼鱼饲料，并对受精卵孵化率和斑马鱼幼鱼成活率每天均进行统计；
S4：在培养第六天用显微镜对斑马鱼的形态进行观察，所述形态包括脊索、体态、鱼鳔。
3.根据权利要求1或2所述一种利用斑马鱼评价环境污染物H2S发育毒性的方法，其特征在于，所述斑马鱼胚胎培养液为：每升ddH2O中含有5g的KCl、10g的Ca2+、2.5g的NaHCO3及26ml甲基蓝。
4.根据权利要求1或2所述一种利用斑马鱼评价环境污染物H2S发育毒性的方法，其特征在于，所述NaHS溶液的浓度为0.1mM/ml。
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2021
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