CN113698929A - 碳点及其制备方法和在制备靶向线粒体的荧光探针中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种碳点及其制备方法和在制备靶向线粒体的荧光探针中的应用，该碳点的制备方法，包括如下步骤：称取0.1～1g的2,6‑二氟苯甲酸，0.25～2.5g的甘氨酸以备用；将上述药品放入装有超纯水和无水乙醇的反应釜中；将上述反应釜在150～220℃条件下加热6～72小时，再将其温度降为室温；将获得的棕色溶液放入超纯水中透析以除去杂质，获得淡黄色碳点溶液，进行真空干燥得到碳点粉末；称取1～30mg碳点粉末和0.1～10g的三聚氰胺放入装有超纯水的反应釜中，在160～220℃下恒温1～5小时，降至室温后离心取上清溶液，将上清溶液进行透析除杂，获得修饰后的碳点溶液。本发明制备的碳点具有高的荧光量子产率和稳定的荧光性质，无毒性，可作为线粒体荧光探针。
Description
技术领域
本发明属于荧光碳点技术领域，尤其涉及一种碳点及其制备方法和在制备靶向线粒体的荧光探针中的应用。
背景技术
线粒体是细胞的动力源。它们是维持细胞功能和新陈代谢的重要细胞器。线粒体在这生物代谢过程中表现出包括裂变、融合和运输在内的动态特性，其在某些特定的环境下会产生线粒体功能障碍可导致多种疾病的发生。因此，制备线粒体成像探针尤为重要。到目前为止，各种探针已被应用于线粒体成像，包括荧光蛋白、有机小分子、半导体量子点。但是他们都存在一些不足，例如，荧光蛋白总是需要高效的蛋白表达和合适的抗体；对于有机小分子荧光染料，其具有制备方法复杂、抗光漂白性低和细胞毒性高；半导体量子点具有低的生物相容性和高的细胞毒性。尽管碳点具有制备方法简单，无毒，良好的生物相容性以及抗光漂白等优点，而成为制备靶向线粒体的首选。但其细胞器靶向性差成为它的最大弊端。因此，利用简单表面修饰的方法，制备可以靶向细胞线粒体且其在水溶液中具有较高荧光量子产率的碳点是有待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明利用水热方法两步制备出高纯度且具有高荧光量子产率的碳点，并验证出其可以作为荧光探针靶向活细胞线粒体。
本发明具体是通过以下技术方案来实现的：
本发明第一方面提供一种碳点的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：分别称取0.1～1g的2,6-二氟苯甲酸，0.25～2.5g的甘氨酸以备用；
步骤2：将称量好的上述药品放入装有超纯水和无水乙醇的反应釜中，搅拌混匀；
步骤3：将上述反应釜在150～220℃条件下加热6～72小时，再将其温度降为室温；
步骤4：将获得的棕色溶液装入透析袋中，并放入超纯水中透析以除去杂质，获得淡黄色碳点溶液，然后进行真空干燥得到碳点粉末；
步骤5：称取1～30mg制备的碳点粉末和0.1～10g的三聚氰胺放入装有超纯水的反应釜中，在160～220℃下恒温1～5小时，降至室温后离心取上清溶液，然后将上清溶液装入透析袋中透析除杂，获得修饰后的碳点溶液。
作为本发明的进一步说明，步骤1中，所述2,6-二氟苯甲酸的称取量为0.5g，所述甘氨酸的称取量为1.25g。
作为本发明的进一步说明，步骤2中，所述超纯水用量为25mL，水电阻率为18.4MΩ·cm-1；所述无水乙醇用量为2mL；且所述反应釜为30mL的聚四氟乙烯反应釜。
作为本发明的进一步说明，步骤3中，所述反应釜的反应条件具体为：将所述反应釜置于烘箱中恒温200℃加热48小时后，将温度降为25℃。
作为本发明的进一步说明，步骤4中，所用透析袋为500Da的透析袋，所述超纯水用量为2L，且真空干燥温度为-160℃。
作为本发明的进一步说明，步骤5中，所述碳点粉末的称取量为10mg，所述三聚氰胺的称取量为1g；所述超纯水用量为30mL；反应条件具体为在200℃下恒温2.5小时；所用透析袋为500Da的透析袋。
本发明第二方面提供一种荧光碳点，所述荧光碳点由上述的制备方法制得。
作为本发明的进一步说明，所述荧光碳点中的化学键以C-C/C＝C、C-O/C-N、N-C＝N和C-F为主。
作为本发明的进一步说明，所述荧光碳点的最佳激发波长和发射波长分别为413nm和497nm，且在365nm的紫外灯下呈绿色。
本发明还提供了上述的荧光碳点在制备能够靶向活细胞线粒体的荧光探针中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明利用水热方法两步制备的碳点具有高的荧光量子产率和稳定的荧光性质，且无毒性。细胞成像实验表明制备的碳点可以作为线粒体荧光探针，并在疾病诊断、细胞成像以及分子检测等领域有潜在的应用。
附图说明
图1为本发明制备的碳点的透射电镜图；
图2为本发明制备的碳点的粒径分布图；
图3为本发明制备的碳点的红外图谱；
图4为本发明制备的碳点的X射线光电子能的全谱谱图；
图5为本发明制备的碳点中碳元素的X射线光电子能的窄谱谱图；
图6为本发明制备的碳点溶液的紫外可见吸收光谱；
图7为本发明制备的碳点溶液的最佳激发(左边第一条)和发射光谱；
图8为本发明制备的碳点溶液在不同激发波长下的3D光谱；
图9为本发明制备的碳点溶液的荧光量子产率；
图10为本发明制备的碳点溶液在不同离子下的荧光强度变化；
图11为本发明制备的碳点溶液在不同pH值下的荧光强度变化；
图12为本发明制备的碳点溶液在不同离子强度下的荧光强度变化；
图13为本发明制备的碳点的细胞毒性图；
图14为本发明制备的碳点的共定位双染图。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
实施例1：
提供一种碳点的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：分别称取0.5g的2,6-二氟苯甲酸，1.25g的甘氨酸以备用。
步骤2：将称量好的上述药品放入装有25mL超纯水(水电阻率为18.4MΩ·cm-1)和2mL无水乙醇的30mL的聚四氟乙烯反应釜中，搅拌混匀。
步骤3：将该反应釜至于烘箱中恒温200℃加热48小时，再将其温度降为25℃。
步骤4：将获得的棕色溶液装入500Da的透析袋中，并放入装有2L超纯水的烧杯中透析以除去杂质，获得淡黄色碳点溶液，最后在-160℃下真空干燥得到碳点粉末。
步骤5：称取10mg制备碳点粉末和1g的三聚氰胺放入装有30mL超纯水的反应釜中，在200℃下恒温2.5小时，降至室温后10000转离心取上清溶液，将其装入500Da的透析袋中透析除杂；获得修饰后的可以靶向细胞线粒体的碳点溶液。
实施例2：
提供一种碳点的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：分别称取0.1g的2,6-二氟苯甲酸，0.25g的甘氨酸以备用。
步骤2：将称量好的上述药品放入装有25mL超纯水(水电阻率为18.4MΩ·cm-1)和2mL无水乙醇的30mL的聚四氟乙烯反应釜中，搅拌混匀。
步骤3：将该反应釜至于烘箱中恒温150℃加热6小时，再将其温度降为25℃。
步骤4：将获得的棕色溶液装入500Da的透析袋中，并放入装有2L超纯水的烧杯中透析以除去杂质，获得淡黄色碳点溶液，最后在-160℃下真空干燥得到碳点粉末。
步骤5：称取1mg制备碳点粉末和0.1g的三聚氰胺放入装有30mL超纯水的反应釜中，在160℃下恒温1小时，降至室温后10000转离心取上清溶液，将其装入500Da的透析袋中透析除杂；获得修饰后的可以靶向细胞线粒体的碳点溶液。
实施例3：
提供一种碳点的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：分别称取1g的2,6-二氟苯甲酸，2.5g的甘氨酸以备用。
步骤2：将称量好的上述药品放入装有25mL超纯水(水电阻率为18.4MΩ·cm-1)和2mL无水乙醇的30mL的聚四氟乙烯反应釜中，搅拌混匀。
步骤3：将该反应釜至于烘箱中恒温220℃加热72小时，再将其温度降为25℃。
步骤4：将获得的棕色溶液装入500Da的透析袋中，并放入装有2L超纯水的烧杯中透析以除去杂质，获得淡黄色碳点溶液，最后在-160℃下真空干燥得到碳点粉末。
步骤5：称取30mg制备碳点粉末和10g的三聚氰胺放入装有30mL超纯水的反应釜中，在220℃下恒温5小时，降至室温后10000转离心取上清溶液，将其装入500Da的透析袋中透析除杂；获得修饰后的可以靶向细胞线粒体的碳点溶液。
对实施例1制备的碳点进行表征，具体表征结果如下：
1、通过透射电镜对上述实施例1制备的碳点进行表征，可知其粒径大约为～4nm(如图1)。
2、利用动态光散射粒度仪对碳点溶液进测试可知，制备的碳点粒径基本为～4.3nm(如图2)，这与透射电镜获得的结果相当。
3、制备的碳点通过红外测试表征可知(如图3)，该碳点含有多种化学键和基团，即–OH、–NH2和C–N。
4、从制备碳点的X射线光电子能谱可知，碳点含有C、O、N和F四种元素，且元素含量分别为46％、14.6％、34.7％和4.7％(如图4)。由碳点中C元素的X射线光电子能谱可知，碳点中的化学键以C-C/C＝C、C-O/C-N、N-C＝N和C-F为主(如图5)。
5、对碳点水溶液品荧光性质的研究发现，制备的碳点溶液在274和349nm处有两个吸收峰，274nm的吸收对应了C＝C的π-π*跃迁，349nm处的吸收对应的为C＝O/C–O/C–N的n-π*跃迁(如图6)。此外，碳点水溶液的最佳激发波长和发射波长分别为413nm和497nm(如图7)，且在365nm的紫外灯下呈绿色。对其在不同激发波长(300～600nm)下的荧光光谱的研究发现，碳点的发射峰位置会随着激发峰的改变而改变(如图8)。对碳点荧光量子产率的测试，可知其在水溶液的荧光量子产率高达24.6％(如图9)。
6、对碳点荧光稳定性的研究可以发现，测试了在不同阴阳离子下、不同pH值及在不同离子强度下的碳点的荧光强度。如图10，碳点在不同阴阳离子的作用下，其荧光强度基本保持不变。说明生物体内的不同离子对碳点荧光没有影响。图11显示了不同pH值对碳点荧光强度的影响。结果表明碳点的荧光强度变化不随着PH的变化成线性变化且碳点的荧光强度无明显改变。接下来，测试了不同离子强度(即加入不同浓度的NaCl的)对碳点荧光强度的影响。结果发现碳点的荧光强度无明显的变化(图12)。对碳点的细胞毒性研究表明，当碳点浓度为300μg/mL时，细胞的存货率大约为90％，说明制备的碳点基本无毒(如图13)。
将制备的碳点作为荧光探针，与人食管鳞癌细胞(KYSE150)共孵育，利用共定位的方法，确定了该碳点作为荧光探针可以靶向活细胞的线粒体。
综上所述，本发明利用水热方法两步制备的碳点具有高的荧光量子产率和稳定的荧光性质，且无毒性。细胞成像实验表明制备的碳点可以作为线粒体荧光探针，并在疾病诊断、细胞成像以及分子检测等领域有潜在的应用。
最后应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种碳点的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：分别称取0.1～1g的2,6-二氟苯甲酸，0.25～2.5g的甘氨酸以备用；
步骤2：将称量好的上述药品放入装有超纯水和无水乙醇的反应釜中，搅拌混匀；
步骤3：将上述反应釜在150～220℃条件下加热6～72小时，再将其温度降为室温；
步骤4：将获得的棕色溶液装入透析袋中，并放入超纯水中透析以除去杂质，获得淡黄色碳点溶液，然后进行真空干燥得到碳点粉末；
步骤5：称取1～30mg制备的碳点粉末和0.1～10g的三聚氰胺放入装有超纯水的反应釜中，在160～220℃下恒温1～5小时，降至室温后离心取上清溶液，然后将上清溶液装入透析袋中透析除杂，获得修饰后的碳点溶液。
2.根据权利要求1所述的碳点的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述2,6-二氟苯甲酸的称取量为0.5g，所述甘氨酸的称取量为1.25g。
3.根据权利要求1所述的碳点的制备方法，其特征在于，步骤2中，所述超纯水用量为25mL，水电阻率为18.4MΩ·cm-1；所述无水乙醇用量为2mL；且所述反应釜为30mL的聚四氟乙烯反应釜。
4.根据权利要求1所述的碳点的制备方法，其特征在于，步骤3中，所述反应釜的反应条件具体为：将所述反应釜置于烘箱中恒温200℃加热48小时后，将温度降为25℃。
5.根据权利要求1所述的碳点的制备方法，其特征在于，步骤4中，所用透析袋为500Da的透析袋，所述超纯水用量为2L，且真空干燥温度为-160℃。
6.根据权利要求1所述的碳点的制备方法，其特征在于，步骤5中，所述碳点粉末的称取量为10mg，所述三聚氰胺的称取量为1g；所述超纯水用量为30mL；反应条件具体为在200℃下恒温2.5小时；所用透析袋为500Da的透析袋。
7.一种荧光碳点，其特征在于，所述荧光碳点由权利要求1-6中任一项所述的制备方法制得。
8.根据权利要求7所述的荧光碳点，其特征在于，所述荧光碳点中的化学键以C-C/C＝C、C-O/C-N、N-C＝N和C-F为主。
9.根据权利要求7所述的荧光碳点，其特征在于，所述荧光碳点的最佳激发波长和发射波长分别为413nm和497nm，且在365nm的紫外灯下呈绿色。
10.权利要求7所述的荧光碳点在制备能够靶向活细胞线粒体的荧光探针中的应用。
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2021
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