CN113684307A - 与葡萄早熟性状相关的snp分子标记、引物对、试剂盒和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种与葡萄早熟性状相关的SNP分子标记、引物对、试剂盒和应用，属于分子标记技术领域。本发明的与葡萄早熟性状相关的SNP分子标记，位于葡萄第16号染色体第360203位碱基，SNP分子标记多态性为A/G，该位点所在的一段核苷酸序列片段如SEQ ID NO.1所示。本发明的SNP分子标记，不受环境因素的影响，通过鉴定该SNP分子标记在葡萄基因组中存在的类型，可以在早期通过分子筛选来判断葡萄品种是否早熟，进而对葡萄品种进行选育，降低葡萄的育种成本，加速早熟葡萄品种的选育进程。

Description

与葡萄早熟性状相关的SNP分子标记、引物对、试剂盒和应用

技术领域

本发明涉及一种与葡萄早熟性状相关的SNP分子标记、引物对、试剂盒和应用，属于分子标记技术领域。

背景技术

葡萄是世界第二大水果，因其美味可口，营养价值高而深受消费者喜爱。我国鲜食葡萄栽培和生产位居世界第一，同时也是鲜食葡萄消费大国。‘巨峰’和‘红地球’这几个中晚熟品种是我国鲜食葡萄的主栽品种。相对集中的果实的成熟期造成葡萄量大价低，经济效益难以提升。为此，培育早熟鲜食葡萄品种能够有效改变葡萄品种结构，增加果农收益，降低田间管理成本。

早熟葡萄栽培品种主要是通过杂交和芽变的方法培育的。杂交育种成功的重要前提是是否有具有优良农艺性状和较强遗传性的亲本；芽变的选择取决于概率，具有不确定性。通过这两种育种方法培育出的新品种需要经过多年的筛选，选择和鉴定所需的基因型，才能用于大面积种植。育种效率低下直接导致葡萄品种的开发总是落后于市场和消费者的需求。近年来，随着测序技术(特别是下一代测序技术)的发展，许多与农艺性状相关的分子标记被鉴定出来并应用于分子标记辅助育种，极大地促进了育种方式从单纯的表型选择向表型和基因型的组合选择转变，加快了育种效率。

发明内容

本发明的目的是提供一种与葡萄早熟性状相关的SNP分子标记，可以加快葡萄的育种效率。

本发明还提供了用于检测上述与葡萄早熟性状相关的SNP分子标记的特异性引物、试剂盒以及SNP分子标记、引物对或试剂盒的应用。

为了实现以上目的，本发明的所采用的技术方案是：

与葡萄早熟性状相关的SNP分子标记，位于葡萄第16号染色体第360203位碱基，SNP 分子标记多态性为A/G，该位点所在的一段核苷酸序列片段如SEQ ID NO.1所示。

本发明的与葡萄早熟性状相关的SNP分子标记，位于葡萄的第16号染色体，不受环境因素的影响，通过鉴定该SNP分子标记在葡萄基因组中存在的类型，可以在早期通过分子筛选来判断葡萄品种是否早熟，进而对葡萄品种进行选育，降低葡萄的育种成本，加速早熟葡萄品种的选育进程。

上述分子标记的位置信息基于Ensemble Plants vitis release-51版本的基因组数据。所述分子标记位于SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中第5位碱基。SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具体为TCTCAAGCAATG。

用于检测权利要求1所述的SNP分子标记的引物对。

进一步地，所述的引物对，序列如下：

正向引物：5’-TCTACTCCTCAGCAATCTTG-3’；

反向引物：5’-ACATTGGATGGACTCTTGG-3’。

含有如权利要求2或3所述的引物对的试剂盒。所述试剂盒还包括dNTPs、PCR反应缓冲液、DNA聚合酶中的一种或几种。

上述的SNP分子标记或引物对或试剂盒在葡萄辅助育种中的应用。

进一步地，上述的应用，包括以下步骤：利用检测所述SNP分子标记的引物对葡萄组织的基因组DNA进行扩增，对扩增产物进行凝胶电泳检测，而后对产物进行DNA测序获得SNP位点的基因型，选择基因型为G/G或A/G的葡萄进行育种。例如，DNA测序采用 Sanger-end法。

附图说明

图1为实验例中系谱群体中后代遗传自莎巴珍珠的IBD片段在各个染色体上的比例 (1A)，高频IBD片段在染色体上的分布(1B)和17号染色体上一个高频遗传片段的分布示意图(1C)；

图2为实验例中17号染色体的ROH片段在系谱和栽培群体中的分布图；

图3为实验例中2号和17号染色体上的高频ROH和已知驯化区的位置示意图(3A)、17号染色体驯化区的杂合子和纯合子等位基因在系谱和栽培群体中的数量示意图(3B)、17号染色体驯化区的系谱、栽培和野生群体间的序列相似性示意图(3C)；

图4为实验例中三种选择性扫描的前5％的受选择区域、高频IBD和成熟相关QTL的交集示意图(4A)、候选IBD片段基因上的非同义SNP的基因结构图(4B)、非同义SNP 在系谱、栽培和野生群体中的保守程度示意图(4C)；

图5为实验例中候选基因(CDAR1、PPR和FBT)在'巨峰'浆果的正常发育、过氧化氢和5-azac处理下的表达水平示意图(5A)、对具有CCAR1、PPR和FBT非同义SNP基因型的品种进行BDP(天)分析的结果示意图（5B）；

图6为实验例中PPR基因和FBT基因在早、晚熟葡萄品种中的凝胶电泳图；

图7为实验例中FBT基因非同义突变SNP位点的Sanger-end测序的原始结果峰值图；

图8为实验例中各葡萄浆果经叶酸处理后表型随时间推移的变化示意图。

具体实施方式

以下结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步的说明。

实施例1

本实施例的与葡萄早熟性状相关的SNP分子标记，位于葡萄第16号染色体第360203 位碱基，SNP分子标记多态性为A/G，该位点所在的一段核苷酸序列片段如SEQ IDNO.1 所示。

实施例2

本实施例的用于检测实施例1的SNP分子标记的引物对，序列如下：

正向引物(如SEQ ID NO.2)：5’-TCTACTCCTCAGCAATCTTG-3’；

反向引物(如SEQ ID NO.3)：5’-ACATTGGATGGACTCTTGG-3’。

实施例3

本实施例的试剂盒，包括实施例2的引物对、Taq聚合酶、dNTPs和PCR反应缓冲液。

实施例4

本实施例为实施例2中用于检测实施例1的SNP分子标记的引物对在葡萄辅助育种中的应用，包括以下步骤：

提取葡萄叶片组织的基因组DNA，利用实施例2中的引物对采用以下PCR程序对提取的基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

PCR程序为50μl系统，包括19μl无菌水、2μl实施例2的正反引物、25μl Taq聚合酶、2μl DNA，退火温度为56℃。通过凝胶电泳确认扩增产物，而后对扩增产物进行Sanger-end测序查看测序序列的第180位碱基(即16号染色体上360203位碱基)的基因型，选择基因型为G/G或A/G的葡萄个体进行育种。

实验例

发明人在2014-2015年，根据樊秀彩等人调查总结的莎巴珍珠与其衍生品种的系谱，在中国农业科学院—郑州果树研究所的国家种质资源圃收集了系谱中部分品系的果实发育天数，取平均值作为该品系的实际果实发育天数；其余品系的果实发育天数通过查阅相关文献资料得到。果实成熟期分类是基于刘崇怀的研究(具体见文献刘崇怀,潘兴,郭景南,等.葡萄品种浆果成熟期多样性及归类标准评价[J].果树学报,2004,21(6):535-539.)：果实发育天数≤60天为极早熟；≤80天为早熟；≤100天为中熟；≤120天为晚熟；>120 天为极晚熟。发明人进行了如下研究：

1、材料收集和DNA提取

2019年5月，在中国农业科学院郑州果树研究所-国家葡萄种质资源圃采集以莎巴珍珠为核心及衍生品系的在内的38份葡萄植株的叶片，叶片样品立即用锡纸包裹并放入液氮速冻，然后放于超低温冰箱(-80℃)中保存，用于DNA提取。DNA提取方法为改良 CTAB(Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide)法。

2、全基因组测序和变异检测

38个样品的DNA被送至百迈克公司进行测序。测序平台为illumina双端测序，实验流程按照Illumina公司提供的标准流程执行。测序得到的原始测序序列里面一般含有较多的带接头的、低质量的测序序列。为了保证数据分析质量，对原始测序序列进行质量控制，质控所用的软件是fastq软件工具包，主要步骤有：剔除用于测序的接头序列；过滤缺失碱基比例超过10％的原始序列；剔除质量值低于10(q<Q10)的碱基超过50％的原始序列。以此得到高质量测序序列，用于后续分析。使用BWA-MEM算法将过滤后的读段比对至参考基因组序列(黑比诺，基因序列版本为Ensemble Plants网站上的vitis release-51版本的基因组)。使用SAMtools对序列比对文件进行计数、索引并转换为二进制BAM文件。SNP 和indel检测主要使用GATK实现。(1)利用Picard v2.26.2的Mark Duplicate工具去除bam 文件中潜在的PCR重复，以减少错配；(2)利用HaplotypeCaller进行品种的SNP和Indel 检测；(3)利用CombineGVCFs合并各品种生成的GVCF文件；(4)利用GenotypeGVCFs 校正所有变异，生成各品种的基因型信息。变异结果存储在VCF文件中。使用SnpEff软件对检测到的SNPs和Indels进行注释。使用VCFtools过滤只包含SNP位点信息的VCF 文件，并设置以下参数：missing 0.1，maf 0.05，max-alleles 2，min-alleles 2。过滤后的SNPs 被用于后续分析。另外，已公开的表现为晚熟的15个野生品种和22个晚熟栽培品种的重测序数据和信息下载自NCBI网站下的PRJNA393611，并使用与上述相同的方法处理数据。

3、早熟系谱群体的IBD分析

系谱群体(38个早熟个体)中的单倍型定相是通过Beagle4的gtgl模式完成的。Ped参数输入信息来源于莎巴珍珠的系谱。使用hap-ibd软件检测系谱后代中遗传莎巴珍珠的IBD片段。使用定制的python脚本确定子代中从莎巴珍珠继承的IBD片段的遗传频率。在这里，遗传频率指的是相同的IBD片段在后代中出现的次数除以所有后代的数量。遗传频率大于0.8的IBD片段被认为是高频率的，并作为候选IBD片段。早熟系谱群体中的IBD 分析结果显示，后代遗传自莎巴珍珠的IBD片段分布在不同的染色体上，其中莎巴珍珠的17号染色体大部分片段都能遗传给后代，见图1A。进一步研究发现，后代共有943个高频IBD片段遗传自莎巴珍珠，见图1B，这些片段分布在不同的染色体上，在葡萄的19条染色体中均有涉及。为探究17号染色体上能有大部分片段遗传给后代的原因，发明人发现该染色体有一个长度从4.9Mb至6.7Mb的片段(方框标记)在后代中高频遗传，如图 1C所示，已知该区段是葡萄发生驯化的重要片段，说明这个区域高频遗传的片段并不与莎巴珍珠的早熟性状的遗传有关，而与葡萄驯化有关。

4、早熟系谱群体、晚熟栽培群体和野生群体的ROH分析

物种驯化会导致物种内存在保守且一致的基因组片段。(1)如果某些个基因组片段同时在早熟系谱群体和晚熟栽培群体存在，且与野生群体的序列不一致，则可以认为该片段与驯化有关，但与早熟性状无关；(2)相反地，如果某些个片段仅在早熟系谱群体存在，且DNA序列与晚熟栽培群体和野生群体都不一致，则认为该片段与系谱群体的早熟性状遗传有关。为了排除葡萄驯化对莎巴珍珠早熟性状遗传的IBD结果的影响，发明人采用 PLINK软件的ROH分析来探究群体中的保守且一致的基因组片段，设置-homozyg-match 0.95以获得每个群体中高度一致的纯合子片段(ROH片段)。R语言的Tidyverse软件包用于分析各群体中ROH片段的长度和频率分布。ROH分析发现确实前述莎巴珍珠上17号染色体上的高频遗传片段以纯合子的形式广泛分布在早熟群体和晚熟栽培群体中，见图2；同时其序列在早晚熟群体间几乎没有差异，但在野生群体间差异很大(见图3)，这与上述推论(2)一致，说明该区段确实是和葡萄驯化有关的片段但与早熟性状遗传无关，故该区段在后续早熟性状遗传的研究中不再考虑。图2中，每一行代表一个品种，共60个品种(38个早熟葡萄品种和22个晚熟栽培葡萄品种)，方框反映了已知的驯化区段 (4.9Mb-6.7Mb)；图3B中，Y轴代表等位基因的数量，统计分析采用t检验。查阅文献证明该片段是葡萄驯化的重要片段，存在了大量与葡萄栽培性状相关的基因，并且该片段的序列在两个群体间几乎一致，见图3A和3C。图3A中色块的宽度代表ROH的长度，图 3C中，黑比诺为对照，颜色的上下浮动代表标准偏差。通过ROH分析见图1和图2并结合已知的相关研究见图3，可以用来排除基因组由于作物在长期驯化过程中产生的一致性序列，显著降低了IBD分析结果的假阳性。

5、选择清除分析

为进一步从上百个高频遗传的IBD片段中寻找与早熟性状有关的遗传片段，发明人应用VCFtools计算核苷酸多样性(π)和固定指数(Fst)，窗口大小为20000。π-比率由π_pedigree/π_cultivar计算。使用python编写的XPCLR程序探测连锁不平衡角度的选择清除片段，滑动窗口的大小与Fst和π相同。根据经验选择在两种及以上检测方法中同时出现前5％数值的基因组区域作为与早熟性状有关的选择区域，并将驯化区段去除后的高频IBD结果，三种选择清除方法——π_pedigree/π_cultivar(为描述方便，下文称其为Pi_ratio)、Fst、XPCLR鉴定到的受选择区域，和已知的与葡萄浆果成熟有关QTL位点取交集，见图4A(其中灰色阴影代表高频IBD片段与成熟有关的QTL和三种选择清除指标交集的候选片段)，共得到 37个可能与早熟性状有关的候选基因。在这37个基因中1号染色体上的CCAR1和PTST2、 2号染色体上的LDHA、14号染色体上的PPR和16号染色体上的FBT这5个基因在编码区都具有一个非同义突变的SNP位点，非同义突变的SNP位点会导致基因编码的蛋白功能的改变，被认为与葡萄果实早熟密切相关，这5个基因的相关信息见表1。

表1与葡萄成熟密切相关的5个基因的相关信息

这五个基因PTST2、CDAR1、LDHA、PPR和FBT，分别位于1号，1号，2号，14 号和16号染色体上。五个基因都展示出了与早熟性状的密切联系：在系谱后代间的遗传频率都大于0.8(意味着有超过30个后代都具有该片段)，都与葡萄花期、转色或成熟的 QTL位点和早晚熟群体间两个以上的选择清除指标(Fst、XPCLR或Pi_ratio)检测到的受选择区域相重叠。通过计算非同义SNP在早熟和晚熟、野生群体间的保守程度(保守程度指SNP在群体中所有个体间出现的频率，值越高说明保守程度越强)以及SIFT算法模型预测SNP的突变效应(若为有害，说明该突变不利于农艺性状的维持；若为有利，则说明该突变不会影响或者有益于农艺性状的维持)，见表1，发现PTST2基因编码区的SNP保守程度较低，故先被排除；还发现LDHA上的SNP为有害突变，其余3个基因都是有利突变，所以LDHA也被排除。其中1号染色体上的CDAR1、14号染色体上的PPR和16 号染色体上的FBT(基因结构见图4B)是发明人进一步关注的基因，因为早熟系谱群体的38个个体的CDAR1、PPR和FBT基因在其编码区都有相同的、变异后的SNP，而栽培和野生群体共37个个体中大多数个体在该SNP位点与参考基因组一致，未发生变异(为图示方便，整合栽培和野生为一个群体)，见图4B和4C。值得注意的是，相比于CDAR1 和PPR，晚熟栽培和野生群体中有更多的个体在FBT基因(16号染色体)变异位点处的碱基为未发生变异的碱基，保守程度更强，见图4C。除此之外还有下述基因表达量等其它研究结果支撑该论断。

6、RNA-seq的基因表达分析

'巨峰'葡萄浆果的正常发育及其过氧化氢和甲基化抑制剂5-azac处理的浆果的转录数据来自发明人使用过氧化氢和5-azac处理‘巨峰’葡萄果实提前其成熟的转录组数据，在该研究中发明人分别使用过氧化氢和5-azac处理‘巨峰’葡萄果实都能促进其提前20-30 天成熟。过氧化氢处理研究所用试验材料是采自河南科技大学葡萄试验基地的5年生篱架栽培‘巨峰’葡萄果实。设置外源活性氧-H₂O₂浓度梯度为100、300、500mmol/L用蒸馏水配制所需浓度同时加入Silwet-77表面活性剂(北京索莱宝科技有限公司)，其最终浓度为 0.03％(v/v)，对葡萄果实进行均匀喷施，用蒸馏水(加入等量的Silwet-77表面活性剂，使其终浓度为0.03％)作为对照进行喷施。在花后25天(2017年6月3日)进行第一次喷施处理，花后35天(2017年6月13日)进行第二次喷施处理，共处理2次，每次每穗喷施20ml H₂O₂溶液。每个处理设置3次重复，每个重复5株树。花后25天第一次采集对照果粒样品，花后35天采集不同浓度H₂O₂处理及对照果粒样品，以后每隔10天采集一次，直至花后70天采样结束。5-azac处理试材为2017年采自河南科技大学葡萄试验基地的6年生篱架栽培‘巨峰’葡萄果实。用蒸馏水配制5-azaC(北京索莱宝科技有限公司) 溶液，设置浓度梯度为10、50和100μM，同时加入终浓度为0.03％的表面活性剂 Silwet-77(北京索莱宝科技有限公司)，然后对葡萄果实进行均匀喷施，蒸馏水(含0.03％ Silwet-77)处理作为对照。于花后15d(2017年5月24日)进行第一次5-azaC处理，花后25d进行第二次处理，共处理两次，均于晴朗无风的上午进行处理。每个处理设置3 个重复，每重复3株。而后采取果实样品并提取果肉的RNA，最后送至公司进行转录组测序。

候选基因(CDAR1、PPR和FBT)在‘巨峰’浆果的正常发育、过氧化氢和5-azac 处理下的表达水平如图5A所示，其中X轴为BDP(即从开花至果实成熟所用的天数，BDP 越小代表果实越早熟)，Y轴为归一化FPKM值，值越大说明基因表达量越高。可以看出三个基因的表达与果实发育密切相关，随着葡萄果实的发育，基因表达量也随之变化。特别是16号染色体上的FBT基因，在浆果正常发育条件下表达量随着果实发育逐渐升高；与正常发育相比，在5-azac和过氧化氢的处理下，该基因在果实发育后期(转色期)差异高表达，表达量提高了1.63倍。同时，对具有CCAR1(左)、PPR(中)和FBT(右)非同义SNP基因型的品种进行BDP(天)分析(***P<0.001，双端t检验)的结果见图5B，其中CCAR1的AA/GG和AG/GG两组基因型间的P值分别为4.2e-07和1.5e-07，PPR的 GG/CC和CG/CC的P值分别为1.5e-05和2.1e-06，FBT的GG/AA和AG/AA的P值分别为1.4e-07和5.4e-06，同时16号染色体上的FBT基因包含的SNP位点在根据各个基因型区分果实发育天数时离群点更少，只有2个，而CDAR1有4个，PPR有7个。这说明 FBT基因编码区上的SNP能更稳健将早晚熟品种区分开来。其中，BDP指从葡萄开花至果实成熟所需的天数。

以上结果显示16号染色体上的FBT基因能够积极响应过氧化氢和甲基化抑制剂5-azac的处理，在巨峰果实发育后期显著上调(图5A)，同时与没有FBT非同义突变SNP 的个体与相比，具有该基因非同义突变的基因型个体的有更短的果实发育期(图5B)，故 16号染色体上的FBT基因被认为是控制早熟性状的关键候选基因。

7、Sanger测序验证非同义的SNP

发明人随机选择了几个早熟品种(莎巴珍珠、京玉、京紫晶、红双味)和晚熟品种(黑歌海娜、白鸡心)进行Sanger测序。用BEDtools软件取16号染色体上的FBT基因的非同义SNP位点上下游的300bp序列，作为Primer 6的输入序列来设计引物，设计的引物对见表2。

表2设计的引物对序列

Primer	Sequence(5’to 3’)
		FBT F(SEQ ID NO.2)	TCTACTCCTCAGCAATCTTG
FBT R(SEQ ID NO.3)	ACATTGGATGGACTCTTGG

PCR程序为50μl系统，包括19μl无菌水，2μl正反引物，25μl Taq聚合酶，2μl DNA，退火温度为56℃。

采用凝胶电泳对扩增结果进行检测，得到的凝胶电泳图见图6。图6中，从左至右分别为Marker、莎巴珍珠(早熟)、京玉(早熟)、红双味(早熟)、京紫晶(早熟)、黑歌海娜(晚熟)和白鸡心(晚熟)的凝胶电泳图。由图6可知扩增条带长度接近400，大于300bp，符合目的产物的长度。

通过凝胶电泳确认扩增产物后，直接将利用表1中引物FBT R和FBT F进行PCR扩增的产物送至上海生工生物技术公司进行单端测序(Sanger-end)，同时结合已有的全基因组重测序(Reseq)数据分别确定SNP位点的基因型，以此验证检测到的16号染色体上的 FBT基因SNP位点的准确性，结果见表3，Sanger-end测序的原始结果峰值图见图7。

表3测序得到的基因型

注：黑歌海娜和白鸡心没有进行全基因组测序，故表3中使用./.表示未知基因型

由表3和图7可知，全基因组重测序检测的基因型与Sanger测序检测到基因型一致，同时也进一步验证了含有FBT基因突变位点碱基G的品种一般为早熟，而突变位点仅含有碱基A的品种表现为晚熟。因此Sanger-end测序验证了FBT基因非同义突变位点的准确性和可靠性。

9、用叶酸溶液处理'巨峰'葡萄果实

FBT基因的功能是负责在细胞(器)间运输叶酸。基于定位的葡萄早熟性状遗传变异与FBT相关，发明人外施叶酸溶液处理‘巨峰’葡萄果实考察期对葡萄果实成熟的影响。叶酸易溶于碱性溶液，为了保证不同浓度的叶酸溶液的pH值稳定，发明人用磷酸盐缓冲液(磷酸盐缓冲液由磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和水组成，磷酸氢二钠和磷酸二氢钾的质量比为2.44:1)来溶解叶酸(同时添加Silwet L-77型表面活性剂)，使三种浓度的叶酸溶液 (叶酸浓度分别为0.1mmol/L、0.55mmol/L、1mmol/L，Silwet L-77型表面活性剂的浓度均为0.3075g/L)都保持pH约为7。然后发明人在2021年6月7日(开花后35天)将'巨峰 '葡萄果实浸泡在叶酸溶液中10分钟。对照组是用磷酸盐缓冲液(磷酸盐缓冲液由磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和水组成，磷酸氢二钠和磷酸二氢钾的质量比为2.44:1)添加Silwet L-77 型表面活性剂(pH约为7)处理。分别记录各处理后葡萄果实随时间推移的表型变化，见图8。在叶酸溶液处理‘巨峰’葡萄果实的试验中可以明显看到与对照相比，叶酸溶液处理会提前果实转色和成熟；并且随着处理的溶液中叶酸浓度的增加，葡萄果实更早地转色。结合上述地数据分析和基因型与果实发育天数(BDP)的联系，这些结果都证明了FBT基因确实是控制葡萄早熟的关键基因。

<110> 河南科技大学

<120> 与葡萄早熟性状相关的SNP分子标记、引物对、试剂盒和应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 12

<212> DNA

<213> 葡萄（grape）

<400> 1

tctcaagcaa tg 12

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<221> FBT F

<400> 2

tctactcctc agcaatcttg 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<221> FBT R

<400> 3

acattggatg gactcttgg 19

Claims (6)

1.与葡萄早熟性状相关的SNP分子标记，其特征在于：位于葡萄第16号染色体第360203位碱基，SNP分子标记多态性为A/G，该位点所在的一段核苷酸序列片段如SEQ ID NO.1所示。

2.用于检测权利要求1所述的SNP分子标记的引物对。

3.根据权利要求2所述的引物对，其特征在于：序列如下：

正向引物：5’-TCTACTCCTCAGCAATCTTG-3’；

反向引物：5’-ACATTGGATGGACTCTTGG-3’。

4.含有如权利要求2或3所述的引物对的试剂盒。

5.如权利要求1所述的SNP分子标记或如权利要求2或3所述的引物对或如权利要求4所述的试剂盒在葡萄辅助育种中的应用。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：包括以下步骤：利用检测所述SNP分子标记的引物对葡萄组织的基因组DNA进行扩增，对扩增产物进行凝胶电泳检测，而后对产物进行DNA测序获得SNP位点的基因型，选择基因型为G/G或A/G的葡萄进行育种。

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