CN113684173A - 一种分离西瓜果实原生质体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种分离西瓜果实原生质体的方法，包括以下步骤：(1)溶液配制；(2)取成熟期西瓜果实，去掉果肉，将果皮切成小段，然后加入酶解液；(3)25±2℃下避光摇动酶解；(4)常压下，加入溶液A并继续摇30～60min后，让其经滤网流入离心管中；(5)用溶液A洗涤剩余的残渣，经滤网后流入到离心管中；(6)离心去上清；(7)用溶液A洗涤沉淀，离心去上清；(8)用溶液A重悬，静置，吸取上清至含有溶液A的新离心管中，离心，去上清；(9)用溶液B重悬原生质体，备用。本发明以西瓜果实为供体材料分离得到高产量、高活率以及大小均匀的原生质体材料，为今后西瓜果实原生质体的研究提供关键材料，弥补了本领域中的技术空白。

Description

一种分离西瓜果实原生质体的方法
技术领域
本发明属于植物细胞原生质体分离技术领域，具体涉及一种分离西瓜果实原生质体的方法。
背景技术
原生质体是指脱去细胞壁的、裸露的、有生活力的原生质团，包括细胞质、细胞核、线粒体、高尔基体、核糖体、溶酶体等。原生质体除没有细胞壁外，它具有活细胞的一切特征，是遗传转化的理想受体。
供体材料是影响原生质体分离效果的关键因素之一。植物细胞的复杂程度因植物种类、器官种类、成熟度、生理状态而异。由于供体的种类、年龄、生理状态等都可能影响原生质体的得率、质量及后续的培养，因此一般选用生长旺盛、生命力强的组织作为供体材料。目前较多采用叶片、愈伤组织或悬浮培养细胞来分离原生质体。这类材料的原生质体产率高，活性强，培养后细胞植板率高。
西瓜(学名：Citrullus lanatus(Thunb.)Matsum.et Nakai)为葫芦科西瓜属植物，中国各地均有栽培，品种甚多，外果皮、果肉及种子形式多样。王静等(2015)以同源二倍体、四倍体西瓜为试验材料，对其叶片及叶片制备的原生质体进行低温处理，分别测定叶片电解质外渗率、原生质体细胞膜导水系数，分析不同倍性西瓜对亚低温的耐受能力。结果表明：(1)将2.7％纤维素酶+0.78％离析酶R-10溶于0.4mol/L甘露醇中，于80r/min下酶解120min，西瓜叶片原生质体产率最高，制备效果最好；(2)四倍体西瓜原生质体直径为11.26μm，比二倍体直径为10.41μm的高8.2％。目前鲜见关于西瓜果实原生质体分离方法的相关报道。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明提供一种分离西瓜果实原生质体的方法。
本发明技术方案主要包括以下内容：
一种分离西瓜果实原生质体的方法，包括以下步骤：
(1)溶液配制：
酶解液包括以下成分：甘露醇0.4～0.6M、KCl 18～20mM、MES 10～12mM、纤维素酶R10 10～12g/L、离析酶R10 4～5g/L、果胶酶4～5g/L、CaCl2 8～10mM、BSA 10～12g/L；
溶液A包括以下成分：NaCl 150～160mM、CaCl2 120～130mM、KCl 5～5.5mM、MES 2～2.5mM；
溶液B包括以下成分：甘露醇0.4～0.5M、MgCl2 12～15mM、MES 4～4.5mM；
(2)取成熟期西瓜果实，去掉果肉，将果皮切成小段，然后加入酶解液；
(3)25±2℃环境下避光摇动酶解；
(4)常压下，加入溶液A并继续摇30～60min后，让其经滤网流入离心管中；
(5)用溶液A洗涤剩余的残渣，经滤网后流入到离心管中，重复多次；
(6)离心，去上清；
(7)用溶液A洗涤沉淀，离心，去上清；
(8)用溶液A重悬，静置，吸取上清至含有溶液A的新离心管中，离心，去上清；
(9)加入溶液B重悬原生质体，备用。
优选的，摇动转速为40～50r/min。
优选的，酶解时间为2～6h。
优选的，离心参数为100～200g，离心5～10min。
优选的，所述供体材料为二倍体、三倍体或四倍体。
优选的，所述西瓜的品种包括蜜枚、京牟、黑蜜。
优选的，步骤(2)：取成熟期西瓜果实，去掉果肉，将果皮切成小段，于15～20℃条件下静置30～60min，然后加入酶解液。步骤(3)：25±2℃，-0.01～-0.02Mpa真空环境下避光摇动酶解。借助15～20℃预处理及真空辅助酶解进一步提高产量和大小均一度。
优选的，酶解液中还含有3-呋喃硼酸0.1～0.5g/L。
本发明所取得的效果：
本发明实现了以西瓜果实为供体材料分离得到高产量、高活率以及大小均匀的原生质体材料，为今后西瓜果实原生质体的研究提供关键材料，弥补了本领域中的技术空白。
本发明原生质体产量达到4～6×105个/g，活率达到70％以上。原生质体直径分布在9～30μm之间，直径分布在15～20μm的原生质体占比达到47％以上，所得原生质体的大小均一。还意外发现添加3-呋喃硼酸对于提高原生质体的活率和大小均一性具有进一步的促进作用。
任何酶制剂都不是绝对纯的，一般都含有对原生质体不利的脂酶、蛋白酶、核酸酶等，因此在分离原生质体时一般追求采用尽可能少的酶制剂种类和用量，而得到高产量、高质量的原生质体。本发明仅使用三种酶且用量较少，符合越来越严格的技术要求且有效控制成本。
本发明所需仪器设备少，操作简便。
本发明对于不同品种、不同倍性的西瓜果实细胞都能够得到有效的分离。
附图说明
图1为实施例1效果图
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
实施例1
(1)溶液配制：
母液：
Figure BDA0003284699750000031
Figure BDA0003284699750000041
酶解液(0.45μm滤膜过滤除菌)：
Figure BDA0003284699750000042
溶液A(过滤除菌)：
Figure BDA0003284699750000043
溶液B(过滤除菌)：
Figure BDA0003284699750000044
(2)取成熟期西瓜(蜜枚二倍体)果实，去掉果肉，将果皮在滤纸上切成0.1～1mm的小段，移到盛有酶解液的锥形瓶中，酶解的材料量以铺满为准；
(3)25±2℃，常压下避光摇动(50r/min)酶解2h；
(4)常压下，加入溶液A并继续摇60min后，让其经过过滤网(100μm)过滤后流入到50mL圆底离心管中；
(5)用溶液A洗涤锥形瓶中剩余的残渣，经滤网后流入到离心管中，重复2～3次(尽量收集到更多的原生质体)，尼龙网可重复使用；
(6)200g，离心5min，尽可能去上清；
(7)用溶液A(约10mL)洗涤沉淀，200g，离心5min，去上清；
(8)用1mL溶液A重悬，静置2min，吸取上清至含有9mL溶液A的新离心管中，200g，离心5min，去上清。
(9)加入溶液B重悬原生质体，备用。
实施例2
(1)溶液配制：同实施例1。
(2)取成熟期西瓜(蜜枚二倍体)果实，去掉果肉，将果皮在滤纸上切成0.1～1mm的小段，于15℃条件下静置30min，移到盛有酶解液的锥形瓶中，酶解的材料量以铺满为准；
(3)25±2℃，-0.02Mpa真空环境下避光摇动(50r/min)酶解2h；
(4)常压下，加入溶液A并继续摇60min后，让其经过过滤网(100μm)过滤后流入到50mL圆底离心管中；
(5)用溶液A洗涤锥形瓶中剩余的残渣，经滤网后流入到离心管中，重复2～3次(尽量收集到更多的原生质体)，尼龙网可重复使用；
(6)200g，离心5min，尽可能去上清；
(7)用溶液A(约10mL)洗涤沉淀，200g，离心5min，去上清；
(8)用1mL溶液A重悬，静置2min，吸取上清至含有9mL溶液A的新离心管中，200g，离心5min，去上清。
(9)加入溶液B重悬原生质体，备用。
实施例3
(1)溶液配制：母液参见实施例1
酶解液(0.45μm滤膜过滤除菌)：
Figure BDA0003284699750000051
Figure BDA0003284699750000061
溶液A(过滤除菌)：
Figure BDA0003284699750000062
溶液B(过滤除菌)：
Figure BDA0003284699750000063
(2)取成熟期西瓜(蜜枚二倍体)果实，去掉果肉，将果皮在滤纸上切成0.1～1mm的小段，于20℃条件下静置60min，移到盛有酶解液的锥形瓶中，酶解的材料量以铺满为准；
(3)25±2℃，-0.01Mpa真空环境下避光摇动(40r/min)酶解6h；
(4)常压下，加入溶液A并继续摇30min后，让其经过过滤网(100μm)过滤后流入到50mL圆底离心管中；
(5)用溶液A洗涤锥形瓶中剩余的残渣，经滤网后流入到离心管中，重复2～3次(尽量收集到更多的原生质体)，尼龙网可重复使用；
(6)100g，离心10min，尽可能去上清；
(7)用溶液A(约10mL)洗涤沉淀，100g，离心10min，去上清；
(8)用1mL溶液A重悬，静置5min，吸取上清至含有9mL溶液A的新离心管中，100g，离心10min，去上清。
(9)加入溶液B重悬原生质体，备用。
实施例4
(1)溶液配制：母液参见实施例1
酶解液(0.45μm滤膜过滤除菌)：
Figure BDA0003284699750000071
溶液A(过滤除菌)：
Figure BDA0003284699750000072
溶液B(过滤除菌)：
Figure BDA0003284699750000073
(2)取成熟期西瓜(蜜枚二倍体)果实，去掉果肉，将果皮在滤纸上切成0.1～1mm的小段，于15℃条件下静置30min，移到盛有酶解液的锥形瓶中，酶解的材料量以铺满为准；
(3)25±2℃，-0.02Mpa真空环境下避光摇动(50r/min)酶解2h；
(4)常压下，加入溶液A并继续摇60min后，让其经过过滤网(100μm)过滤后流入到50mL圆底离心管中；
(5)用溶液A洗涤锥形瓶中剩余的残渣，经滤网后流入到离心管中，重复2～3次(尽量收集到更多的原生质体)，尼龙网可重复使用；
(6)200g，离心5min，尽可能去上清；
(7)用溶液A(约10mL)洗涤沉淀，200g，离心5min，去上清；
(8)用1mL溶液A重悬，静置2min，吸取上清至含有9mL溶液A的新离心管中，200g，离心5min，去上清。
(9)加入溶液B重悬原生质体，备用。
实施例5
(1)溶液配制：母液参见实施例1
酶解液(0.45μm滤膜过滤除菌)：
Figure BDA0003284699750000081
溶液A(过滤除菌)：
Figure BDA0003284699750000082
溶液B(过滤除菌)：
Figure BDA0003284699750000091
(2)取成熟期西瓜(蜜枚二倍体)果实，去掉果肉，将果皮在滤纸上切成0.1～1mm的小段，于15℃条件下静置30min，移到盛有酶解液的锥形瓶中，酶解的材料量以铺满为准；
(3)25±2℃，-0.02Mpa真空环境下避光摇动(50r/min)酶解2h；
(4)常压下，加入溶液A并继续摇60min后，让其经过过滤网(100μm)过滤后流入到50mL圆底离心管中；
(5)用溶液A洗涤锥形瓶中剩余的残渣，经滤网后流入到离心管中，重复2～3次(尽量收集到更多的原生质体)，尼龙网可重复使用；
(6)200g，离心5min，尽可能去上清；
(7)用溶液A(约10mL)洗涤沉淀，200g，离心5min，去上清；
(8)用1mL溶液A重悬，静置2min，吸取上清至含有9mL溶液A的新离心管中，200g，离心5min，去上清。
(9)加入溶液B重悬原生质体，备用。
实施例6
(1)溶液配制：同实施例4；
(2)取成熟期西瓜(蜜枚四倍体)果实，去掉果肉，将果皮在滤纸上切成0.1～1mm的小段，于15℃条件下静置30min，移到盛有酶解液的锥形瓶中，酶解的材料量以铺满为准；
(3)25±2℃，-0.02Mpa真空环境下避光摇动(50r/min)酶解2h；
(4)常压下，加入溶液A并继续摇60min后，让其经过过滤网(100μm)过滤后流入到50mL圆底离心管中；
(5)用溶液A洗涤锥形瓶中剩余的残渣，经滤网后流入到离心管中，重复2～3次(尽量收集到更多的原生质体)，尼龙网可重复使用；
(6)200g，离心5min，尽可能去上清；
(7)用溶液A(约10mL)洗涤沉淀，200g，离心5min，去上清；
(8)用1mL溶液A重悬，静置2min，吸取上清至含有9mL溶液A的新离心管中，200g，离心5min，去上清。
(9)加入溶液B重悬原生质体，备用。
实施例7
(1)溶液配制：同实施例4；
(2)取成熟期西瓜(京牟二倍体)果实，去掉果肉，将果皮在滤纸上切成0.1～1mm的小段，于15℃条件下静置30min，移到盛有酶解液的锥形瓶中，酶解的材料量以铺满为准；
(3)25±2℃，-0.02Mpa真空环境下避光摇动(50r/min)酶解2h；
(4)常压下，加入溶液A并继续摇60min后，让其经过过滤网(100μm)过滤后流入到50mL圆底离心管中；
(5)用溶液A洗涤锥形瓶中剩余的残渣，经滤网后流入到离心管中，重复2～3次(尽量收集到更多的原生质体)，尼龙网可重复使用；
(6)200g，离心5min，尽可能去上清；
(7)用溶液A(约10mL)洗涤沉淀，200g，离心5min，去上清；
(8)用1mL溶液A重悬，静置2min，吸取上清至含有9mL溶液A的新离心管中，200g，离心5min，去上清。
(9)加入溶液B重悬原生质体，备用。
实施例8
(1)溶液配制：同实施例4；
(2)取成熟期西瓜(黑蜜5号三倍体)果实，去掉果肉，将果皮在滤纸上切成0.1～1mm的小段，于15℃条件下静置30min，移到盛有酶解液的锥形瓶中，酶解的材料量以铺满为准；
(3)25±2℃，-0.02Mpa真空环境下避光摇动(50r/min)酶解2h；
(4)常压下，加入溶液A并继续摇60min后，让其经过过滤网(100μm)过滤后流入到50mL圆底离心管中；
(5)用溶液A洗涤锥形瓶中剩余的残渣，经滤网后流入到离心管中，重复2～3次(尽量收集到更多的原生质体)，尼龙网可重复使用；
(6)200g，离心5min，尽可能去上清；
(7)用溶液A(约10mL)洗涤沉淀，200g，离心5min，去上清；
(8)用1mL溶液A重悬，静置2min，吸取上清至含有9mL溶液A的新离心管中，200g，离心5min，去上清。
(9)加入溶液B重悬原生质体，备用。
效果测定：
原生质体产量的测定：用血球计数板进行计数。吸取稀释后的原生质体悬浮液滴在血球计数板上，显微镜下观察计数，样品数100，每个样品计数3次取平均值。产量用每克鲜重供体材料获得的原生质体个数来表示。
原生质体初始直径测定：取原生质体滴在血球计数板上显微观察，样品数100个/次，重复3次，对原生质体直径进行测定。
活率：采用Evans Blue染色法测定。
表1
Figure BDA0003284699750000111
Figure BDA0003284699750000121
结果显示：各实施例所得原生质体的产量和或率均较高，产量达到(4～6)×105个/g，活率达到70％以上。原生质体直径分布在9～30μm之间，直径分布在15～20μm的原生质体占比达到47％以上，所得原生质体的大小均一。其中，实施例3和实施例4的原生质体高达80％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种分离西瓜果实原生质体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)溶液配制：
酶解液包括以下成分：甘露醇0.4～0.6M、KCl 18～20mM、MES 10～12mM、纤维素酶R1010～12g/L、离析酶R10 4～5g/L、果胶酶4～5g/L、CaCl2 8～10mM、BSA 10～12g/L；
溶液A包括以下成分：NaCl 150～160mM、CaCl2 120～130mM、KCl 5～5.5mM、MES 2～2.5mM；
溶液B包括以下成分：甘露醇0.4～0.5M、MgCl2 12～15mM、MES 4～4.5mM；
(2)取成熟期西瓜果实，去掉果肉，将果皮切成小段，然后加入酶解液；
(3)25±2℃下避光摇动酶解；
(4)常压下，加入溶液A并继续摇30～60min后，让其经滤网流入离心管中；
(5)用溶液A洗涤剩余的残渣，经滤网后流入到离心管中，重复操作；
(6)离心，去上清；
(7)用溶液A洗涤沉淀，离心，去上清；
(8)用溶液A重悬，静置，吸取上清至含有溶液A的新离心管中，离心，去上清；
(9)加入溶液B重悬原生质体，备用。
2.根据权利要求1所述分离西瓜果实原生质体的方法，其特征在于，摇动转速为40～50r/min。
3.根据权利要求1所述分离西瓜果实原生质体的方法，其特征在于，酶解时间为2～6h。
4.根据权利要求1所述分离西瓜果实原生质体的方法，其特征在于，离心参数为100～200g，离心5～10min。
5.根据权利要求1所述分离西瓜果实原生质体的方法，其特征在于，所述供体材料为二倍体、三倍体或四倍体。
6.根据权利要求1所述分离西瓜果实原生质体的方法，其特征在于，所述西瓜的品种包括蜜枚、京牟、黑蜜。
7.根据权利要求1所述分离西瓜果实原生质体的方法，其特征在于，步骤(2)：取成熟期西瓜果实，去掉果肉，将果皮切成小段，于15～20℃条件下静置30～60min，然后加入酶解液。
8.根据权利要求1所述分离西瓜果实原生质体的方法，其特征在于，步骤(3)：25±2℃，-0.01～-0.02Mpa真空环境下避光摇动酶解。
9.根据权利要求1所述分离西瓜果实原生质体的方法，其特征在于，酶解液中还含有3-呋喃硼酸0.1～0.5g/L。
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