CN113677349B - 用于抗炎化合物的结构化分子载体及其用途 - Google Patents

用于抗炎化合物的结构化分子载体及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及式(I)的结构化分子载体、式(II)的化合物和包含此类化合物的药物组合物。本发明还涉及用于预防和/或治疗选自炎性疾病或与认知障碍相关的疾病的疾病的此类药物组合物。本发明还涉及用于在脑损伤和/或创伤性脑损伤和/或神经炎性疾病和/或神经变性疾病中防止认知减退或恢复改变的认知功能的此类药物组合物。

Description

用于抗炎化合物的结构化分子载体及其用途
技术领域
本发明涉及不同生物活性化合物的载体化合物，所述生物活性化合物特别地具有强烈的抗炎性能，能够恢复认知和防止认知减退和/或降低癫痫发作严重程度和频率。本发明还涉及此类化合物在治疗神经、精神和外周类型的障碍、特别是具有炎性起源的障碍中的用途。本发明还涉及乙醇胺、乙醇胺-膦酸酯和乙醇胺-磷酸酯脂肪酸衍生物及其在同样的治疗性和非治疗性应用中的用途。
背景技术
考虑到其众多优点，ω-3脂肪酸类型的化合物代表了健康领域的重要市场。事实上，这些化合物在以炎症为共同特征的大量疾病的预防中具有活性。炎症是许多疾病或障碍例如关节、心血管以及神经系统障碍的组成部分。
目前市场上存在的ω-3化合物仅限于两种类型的脂肪酸载体，即乙基形式和甘油三酯形式。在药理方面，乙基形式相对低效，这部分是由于其较差的生物利用度和较差的脑趋向性。甘油三酯形式这种在当今市场上最流行的载体化形式，在功效和脑趋向性方面也表现出矛盾的结果。
因此，一种新型的ω-3脂肪酸载体出现在市场上。与乙基和甘油三酯形式的载体相比，这些甘油磷脂型载体具有更好的脑积累的优点。然而，这些甘油磷脂形式的载体通常从在分子水平上不纯的总提取物例如磷虾总提取物中获得。此外，使用这些从磷虾提取物获得的甘油磷脂形式会引起环境和可持续发展的问题，因为它们会加剧渔业资源的稀缺。
所述开发的ω-3脂肪酸的甘油磷脂载体是例如磷脂酰丝氨酸载体。另一种是模拟溶血磷脂酰胆碱的载体，其用于包括二十二碳六烯酸或DHA在内的特定家族的ω-3脂肪酸(WO 2018/162617)。尽管基于甘油磷脂的载体具有比基于乙基和甘油三酯形式的载体更好的脑靶向性，但它们具有是脂肪酸的单价载体(例如仅仅二十二碳六烯酸)并且只能短期递送的不便性。
因此，目前迫切需要开发新的载体化合物，其允许沿着消化道以急性(短期)和延长(长期)方式递送一种或多种活性化合物如脂肪酸，以便不仅在炎症和癫痫发作的情况下，而且在与行为和/或心理作用性障碍相关或不相关的认知功能的保护和/或恢复中提供有效的治疗。此外，在这些应用中脂肪酸衍生物的开发仍然是重要的需求。
发明内容
本发明人开发了一种新的分子载体家族和新的活性化合物，特别是饱和或不饱和脂肪酸的乙醇胺、乙醇胺-膦酸酯或乙醇胺-磷酸酯衍生物。所述活性化合物具有强烈的抗炎活性，并且可以降低癫痫发作严重程度和频率和/或恢复或改善可能在具有显著炎性组分的神经障碍中改变的认知功能。所述新的分子载体家族包括两个亚家族，即鞘氨醇突触脂氧素(SSL)和氨基甘油磷酸突触脂氧素(AGPSL)。
因此，本发明涉及一种式(I)的化合物及其水合物或非对映异构体或可药用盐：
其中：
n是等于0或1的整数；
A表示选自下述的基团：
·式(A’)的基团：
其中：
-R1’表示任选地被选自羟基和卤素的至少一个基团取代的饱和或不饱和的(C1-C24)烷基链；并且
-R2’表示氢、包含2至30个碳原子的饱和或不饱和的脂肪酰基、其含氧衍生物之一或通过酰基结合到所述分子的其余部分的生物活性化合物；或
·式(A”)的基团：
其中：
-R1”表示脂肪酰基，优选为包含2至30个碳原子的饱和的脂肪酰基；并且
-R2”表示氢、包含2至30个碳原子的饱和或不饱和的脂肪酰基、其含氧衍生物之一或通过酰基结合到所述分子的其余部分的生物活性化合物；
R3表示氢、包含2至30个碳原子的饱和或不饱和的脂肪酰基、其含氧衍生物之一或通过酰基结合到所述分子的其余部分的生物活性化合物；并且
R4表示氢或(C1-C6)烷基。
在特定实施方式中，本发明的化合物具有式(I’)：
其中：
n是等于0或1的整数；
R1’表示任选地被选自羟基和卤素的至少一个基团取代的饱和或不饱和的(C1-C24)烷基链；
R2’表示氢、包含2至30个碳原子的饱和或不饱和的脂肪酰基、其含氧衍生物之一或通过酰基结合到所述分子的其余部分的生物活性化合物；
R3表示氢、包含2至30个碳原子的饱和或不饱和的脂肪酰基、其含氧衍生物之一或通过酰基结合到所述分子的其余部分的生物活性化合物；并且
R4表示氢或(C1-C6)烷基，优选为甲基。
在另一个特定实施方式中，本发明的化合物具有式(I”)：
其中：
n是等于0或1的整数；
R1”表示脂肪酰基，优选为包含2至30个碳原子的饱和的脂肪酰基；
R2”表示氢、包含2至30个碳原子的饱和或不饱和的脂肪酰基、其含氧衍生物之一或通过酰基结合到所述分子的其余部分的生物活性化合物；
R3表示氢、包含2至30个碳原子的饱和或不饱和的脂肪酰基、其含氧衍生物之一或通过酰基结合到所述分子的其余部分的生物活性化合物；并且
R4表示氢或(C1-C6)烷基，优选为甲基。
在优选实施方式中，式(I)、(I’)和(I”)的R3不是氢。
在优选实施方式中，式(I)、(I’)和(I”)的R2’、R2”和R3如下所述：
R2’和R2”独立地表示：
-氢，
-包含2至30个碳原子的饱和或不饱和的脂肪酰基，其选自：乙酸，丙酸，丁酸，戊酸，辛酸，癸酸，月桂酸，肉豆蔻酸，棕榈酸，硬脂酸，花生酸，山嵛酸，木蜡酸，肉豆蔻烯酸，棕榈烯酸，油酸，异油酸，亚油酸，α-亚油酸，花生四烯酸，二十碳五烯酸，芥酸和二十二碳六烯酸，优选为二十二碳六烯酸，或
-包含2至30个碳原子的饱和或不饱和的脂肪酰基的含氧衍生物，其选自消退素(resolvin)、maresin、神经保护素(neuroprotectin)和神经前列烷(neuroprostane)；并且
R3表示：
-包含2至30个碳原子的饱和或不饱和的脂肪酰基，其选自：乙酸，丙酸，丁酸，戊酸，辛酸，癸酸，月桂酸，肉豆蔻酸，棕榈酸，硬脂酸，花生酸，山嵛酸，木蜡酸，肉豆蔻烯酸，棕榈烯酸，油酸，异油酸，亚油酸，α-亚油酸，花生四烯酸，二十碳五烯酸，芥酸和二十二碳六烯酸，优选为二十二碳六烯酸，或
-包含2至30个碳原子的饱和或不饱和的脂肪酰基的含氧衍生物，其选自消退素、maresin、神经保护素和神经前列烷。
本发明还涉及包含2至30个碳原子的饱和或不饱和脂肪酸或其含氧衍生物之一的乙醇胺、乙醇胺-膦酸酯或乙醇胺-磷酸酯衍生物，其可以通过本文中公开的载体递送。
因此，本发明还涉及一种式(II)的化合物及其水合物或非对映异构体或可药用盐：
R5-NH-CH2-CH(R7)-O(n)-R6(II)，
其中：
n是等于0或1的整数；
R5表示包含2至30个碳原子的饱和或不饱和的脂肪酰基或其含氧衍生物之一；并且
R6是-PO3 2-基团；
R7表示氢或(C1-C6)烷基；
前提是当n等于1时，R5不是花生四烯酸。
在优选实施方式中，在式(II)的化合物中：
n是等于0的整数；
R5表示包含2至30个碳原子的饱和或不饱和的脂肪酰基，其是二十二碳六烯酸；并且
R7表示氢。
在另一个优选实施方式中，R5表示：
-包含2至30个碳原子的饱和或不饱和的脂肪酰基，其选自：乙酸，丙酸，丁酸，戊酸，辛酸，癸酸，月桂酸，肉豆蔻酸，棕榈酸，硬脂酸，花生酸，山嵛酸，木蜡酸，肉豆蔻烯酸，棕榈烯酸，油酸，异油酸，亚油酸，α-亚油酸，花生四烯酸，二十碳五烯酸，芥酸和二十二碳六烯酸，优选为癸酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸，或
-包含2至30个碳原子的饱和或不饱和的脂肪酰基的含氧衍生物，其选自消退素、maresin、神经保护素和神经前列烷。
本发明的另一个目的是一种式(I)、(I’)、(I”)或(II)的化合物，其用作药物。
本发明的另一个目的是式(I)、(I’)、(I”)或(II)的化合物的用途，其用作食品增补剂。
本发明还涉及一种药物组合物，其包含至少一种式(I)、(I’)、(I”)或(II)的化合物和可接受的药物赋形剂。
本发明的一个特定实施方式是一种本文中所公开的药物组合物，其用于预防和/或治疗选自炎性疾病或与认知障碍相关的疾病的疾病。优选地，所述炎性疾病是中枢神经系统的炎性疾病、消化道的炎性疾病、炎性关节疾病或视网膜的炎性疾病。
本发明的另一个特定实施方式是一种本文中所公开的药物组合物，其用于预防和/或治疗选自癫痫、创伤性脑损伤、阿兹海默氏病、帕金森氏病、多发性硬化症、克罗恩病、肠综合征、痴呆症和亨廷顿氏病的疾病。
本发明的另一个特定实施方式是一种本文中所公开的药物组合物，其用于在脑损伤或伤害和/或创伤性脑损伤和/或神经炎性疾病和/或神经变性疾病中防止认知减退或恢复改变的认知功能。
本发明的另一个目的是一种药物组合物，其包含可接受的药物赋形剂和式(II’)的化合物及其水合物或非对映异构体或可药用盐：
R5’-NH-CH2-CH(R7’)-O(n)-R6’(II’)，
其中：
n是等于1的整数；
R5’表示包含2至30个碳原子的饱和或不饱和的脂肪酰基或其含氧衍生物之一；
R6’是氢；并且
R7’表示氢或(C1-C6)烷基；
所述药物组合物用于预防和/或治疗与认知相关的疾病或选自癫痫、创伤性脑损伤、阿兹海默氏病、帕金森氏病、多发性硬化症、克罗恩病、肠综合征、痴呆症和亨廷顿氏病的疾病。
本发明的另一个目的是一种药物组合物，其包含可接受的药物赋形剂和如上所定义的式(II’)的化合物，所述药物组合物用于在脑损伤和/或创伤性脑损伤和/或神经炎性疾病和/或神经变性疾病中防止认知减退或恢复改变的认知功能。
在优选实施方式中，R5’表示：
-包含2至30个碳原子的饱和或不饱和的脂肪酰基，其选自：乙酸，丙酸，丁酸，戊酸，辛酸，癸酸，月桂酸，肉豆蔻酸，棕榈酸，硬脂酸，花生酸，山嵛酸，木蜡酸，肉豆蔻烯酸，棕榈烯酸，油酸，异油酸，亚油酸，α-亚油酸，花生四烯酸，二十碳五烯酸，芥酸和二十二碳六烯酸，优选为癸酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸，或
-包含2至30个碳原子的饱和或不饱和的脂肪酰基的含氧衍生物，其选自消退素、maresin、神经保护素和神经前列烷。
根据优选实施方式，本文中所公开的药物组合物通过口服途径给药。
附图说明
图1：制备SSL-X化合物的通用程序。
图2：SSL-X1、SSL-X2和SSL-X3在氨基丙基(LC-NH2)柱上的分离。
图3：SSL-X1在消化道中的水解。
每只动物经口给药227μg SSL-X1，并在16、21、26、40和50小时后收集粪便。A：在不同时间点的粪便中测量到的SSL-X1的量。B：分子的给药量(给药)、在不同时间点的粪便中测量到的总量(粪便)和被水解/吸收的量(水解/吸收)。这些以SSL-X1中的磷(P)的μg为单位表示的量通过假定SSL-X1(水解/吸收)的量对应于给药量减去总粪便中积累的实测量来计算。结果是5个独立实验的平均值±标准偏差。
图4：SSL-X1沿着被治疗大鼠的肠道的时间依赖性分布
每只动物经口给药227μg SSL-X1。在所述分子给药后5小时(图A)、8小时(图B)和36小时(图C)将大鼠处死。取出肠道并每～10cm切段。收集每一段的内含物，如所述萃取脂质并纯化。每个脂质萃取物中SSL-X1的量通过磷测定来确定。
图5：二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯对被IL-1β活化的人类小神经胶质细胞中炎性标志物的表达的影响的测试流程。
图6：在永生化的人类小神经胶质细胞中二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯(SYN Pn)降低IL-1β介导的促炎性标志物的诱导。将IHM小神经胶质细胞在暴露于IL-1β之前3小时用如图中所示的不同浓度的SYN Pn处理。在IL-1β处理后5小时提取炎性标志物的RNA，并通过RT-qPCR进行定量。结果被表示成(IL-1β–NaCl)的％±SEM(n＝3)。
图7：二十二碳六烯酸乙醇胺和二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯对大鼠中LPS诱导的神经炎症的体内效应。将LPS注射到21日龄幼崽中。在LPS注射后1分钟，动物以2mg/Kg二十二碳六烯酸乙醇胺当量的剂量接受二十二碳六烯酸乙醇胺(SYN)或二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯(SYN Pn)。在LPS注射后6小时将大鼠处死，并收集海马体和新皮层。通过RT-qPCR确定炎性标志物转录本的表达水平。IL1β：白介素1β；IL6：白介素6；TNFα：TNFα。神经炎症指数(IN)从在海马体和新皮层中获得的数据确定。CTR：对照大鼠。结果被表示成平均值±SEM(n＝5)。
图8：SSL-X1载体对大鼠中SE诱导的神经炎症的效应。使21日龄大鼠经历SE。在SE发作后1小时经口给药SSL-X1载体。在SE后24小时收集感兴趣的脑结构(海马体和腹侧边缘区)。通过RT-qPCR确定白介素6(IL6)、环氧合酶2(COX2)和趋化因子MCP1(MCP1)的mRNA水平。CTRL：用NaCl给药的对照；SE-NaCl：经历SE并用NaCl给药的大鼠组：SE-SSL-X1：经历SE并用载体SSL-X1给药的大鼠组：HI：海马体；VLR：腹侧边缘区。结果被表示成平均值±SEM(n＝7-10)。
图9：在Pilo-SE后1至2周海马体LTP被减弱并被二十二碳六烯酸乙醇胺挽救。图9A：在来自于健康大鼠(Cont)和经历Pilo-SE的动物(SE)的海马体切片中，在通过θ脉冲配对方案刺激(TBP，由箭头指示)的长期增强(LTP)诱导之前和之后兴奋性突触后电位(EPSP)幅度的概述时间过程(左侧)。图9B-C：来自于经历Pilo-SE并用无二十二碳六烯酸乙醇胺的人工脑脊液(ACSF)(SE)或100nM(B)和400nM(C)的二十二碳六烯酸乙醇胺(SE-SYN)灌注的大鼠的海马体切片中的LTP诱导(左侧)。图9D：来自于经历Pilo-SE并用NaCl(SE)或二十二碳六烯酸乙醇胺(SE-SYN，2mg/kg；i.p)注射的大鼠的海马体切片中的LTP诱导(左侧)。图9E：来自于经历Pilo-SE并用NaCl(SE)或者2或10mg/kg的二十二碳六烯酸乙醇胺(SE-SYN)注射(i.p)的大鼠的海马体切片中的LTP诱导(左侧)。二十二碳六烯酸乙醇胺在SE停止后1h给药，然后在6天中每天给药。对照组只接受盐水溶液。在该图以及所有后续的图中，概括数据被呈现为平均值±SEM，括号之间的数目指示细胞的数目，并且柱状图(右侧)示出了在每种条件下记录的最后5分钟期间测量到的EPSP的平均幅度(±SEM)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图10：在Pilo-SE后1至2周海马体LTP被二十二碳六烯酸乙醇胺磷酸酯挽救。图10A-B：来自于经历Pilo-SE并用无二十二碳六烯酸乙醇胺磷酸酯的ACSF(SE)或100nM(A)和400nM(B)的二十二碳六烯酸乙醇胺磷酸酯(SE-SYN Ph)灌注的大鼠的海马体切片中的LTP诱导。图10C：来自于经历Pilo-SE并用NaCl(SE)或二十二碳六烯酸乙醇胺磷酸酯(SE-SYNPh，5mg/kg；i.p)注射的大鼠的海马体切片中的LTP诱导。图10D：来自于经历Pilo-SE并用NaCl(SE)或2mg/kg的二十二碳六烯酸乙醇胺磷酸酯(SE-SYNPh)注射(i.p)的大鼠的海马体切片中的LTP诱导(左侧)。二十二碳六烯酸乙醇胺磷酸酯在SE停止后1h给药，然后在6天中每天给药。对照组只接受盐水溶液。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图11：在Pilo-SE后1至2周海马体LTP被二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯挽救。图11A-B：来自于经历Pilo-SE并用无二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯的ACSF(SE)或100nM(A)和400nM(B)的二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯(SE-SYN Pn)灌注的大鼠的海马体切片中的LTP诱导。图11C：来自于经历Pilo-SE并用NaCl(SE)或二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯(SE-SYNPn，5mg/kg；i.p)注射的大鼠的海马体切片中的LTP诱导。图11D：来自于经历Pilo-SE并用NaCl(SE)或者2或10mg/kg的二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯(SE-SYN Pn)注射(i.p.)的大鼠的海马体切片中的LTP诱导(左侧)。图11E：来自于经历Pilo-SE并用10、30和100mg/kg的二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯(SE-SYN Pn)治疗(经口)的大鼠的海马体切片中的LTP诱导。二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯在SE停止后1h给药，然后在6天中每天给药。对照组只接受盐水溶液。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图12：二十二碳六烯酸乙醇胺或二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯治疗在健康大鼠中改善海马体LTP。图12A：来自于用NaCl(HT)或二十二碳六烯酸乙醇胺(HT-SYN，2mg/kg；i.p)注射的健康大鼠的海马体切片中的LTP诱导。图12B：来自于用NaCl(HT)或二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯(HT-SYN Pn，2mg/kg；i.p)注射的健康大鼠的海马体切片中的LTP诱导。二十二碳六烯酸乙醇胺或二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯在7天(P21-P27)中每天给药。对照组只接受盐水溶液。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图13：在完全点燃大鼠中以5、10和50mg/kg i.p.给药SYN-PN对癫痫发作严重程度的影响。图13A：大鼠的总群体，n＝15。图13B-D：首次观察到对5(13B)、10(13C)或50(13D)mg/kg SYN-PN做出响应、癫痫发作严重程度降低的大鼠。结果被表示成平均值±sem。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；与D0相比降低的显著性水平，遵照重复测量的单向方差分析的事后Fisher LSD检验。
图14：在对5、10和50mg/kg响应的大鼠中观察到的SYN-PN对癫痫发作严重程度的影响。结果被表示成平均值±sem。
图15：使用二十二碳六烯酸乙醇胺或二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯的治疗显著提高癫痫大鼠的学习能力。图15A：图示出了与对照大鼠(Cont，n＝15)相比癫痫(Epi，n＝14)大鼠中受损的空间学习，其通过在MMW实验期间定位平台所需的时间的增加来评估。图15B-C：图示出了在SE后第一周期间用二十二碳六烯酸乙醇胺(B，Epi-SYN，n＝14)或二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯(C，Epi-SYN-PN，n＝14)注射的癫痫大鼠中改进的空间学习，其通过在MMW实验期间定位平台所需的时间的减少来评估。括号之间的数目指示大鼠的数目。结果表示平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图16：以100mg/kg的剂量口服给药二十二碳六烯酸不阻止SE后海马体LTP受损。来自于经历Pilo-SE并用二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯(SE-SYN Pn；100mg/kg)或二十二碳六烯酸(SE-DHA；100mg/kg)治疗(经口)的大鼠的海马体切片中的LTP诱导(左侧)。二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯或二十二碳六烯酸在SE停止后1h给药，然后在6天中每天给药，然后在2周内每隔一天给药一次。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图17：SSLX2的口服给药阻止SE后海马体LTP受损。图17A-C：来自于经历Pilo-SE(SE)并用10(A-B)和30mg/kg(A和C)的二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯(SE-SYN Pn)或SSLX2(SE-SSLX2)治疗(经口)的大鼠的海马体切片中的LTP诱导(左侧)。二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯和SSLX2在SE停止后1h给药，然后在6天中每天给药，然后在2周内每隔一天给药一次。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图18：二十碳五烯酸乙醇胺膦酸酯和癸酸乙醇胺膦酸酯的腹膜内注射阻止SE后海马体LTP受损。来自于经历Pilo-SE(SE)并用癸酸乙醇胺膦酸酯(SE-DEC-EA-Pn；5mg/kg)或二十碳五烯酸乙醇胺膦酸酯(SE-EPA-EA-Pn；5mg/kg)注射(i.p.)的大鼠的海马体切片中的LTP诱导(左侧)。癸酸乙醇胺膦酸酯或二十碳五烯酸乙醇胺膦酸酯在SE停止后1h给药，然后在6天中每天给药，然后在2周内每隔一天给药一次。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图19：在完全杏仁核点燃大鼠中停止治疗后二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯的持续抗癫痫发作效果。来自于5mg/kg二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯(n＝8/15)、10mg/kg(n＝3/15)或50mg/kg(n＝4/15)的所有完全点燃大鼠(15)均显示出癫痫发作严重程度的降低。无花纹的条指示在3个大鼠亚组中在50mg/kg急性给药后观察到的癫痫发作严重程度。带阴影线的条指示在5、10或20mg/kg的二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯的4次每天给药后的癫痫发作严重程度。带斑点的条示出了在停止二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯治疗后观察到的对癫痫发作严重程度的长期持续的效果。在x-轴下指示了每种条件下无癫痫发作的大鼠的数目。结果被表示成整个亚组群体的平均值±SEM(n＝8，n＝3或n＝4)。
图20：二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯促进SE后大鼠体重减轻的恢复。大鼠在第0天经历毛果芸香碱诱导的癫痫持续状态，并每天给药(10mg/Kg，i.p)二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯(SynPn)共7天。每天测量动物的体重。结果被表示成第0天时动物(10-15只动物/组)体重的百分数。对照/SE+NaCl之间(*：p<0.05，***：p<0.001)和SE+NaCl/SE+SynPn之间(#：p<0.05)的统计学差异。
图21：在NR8383细胞系中DECA-EA-Pn和EPA-EA-Pn降低响应于LPS处理的促炎性细胞因子IL6-mRNA水平的诱导。将大鼠巨噬细胞NR8383细胞用LPS(100ng/mL)刺激，并在LPS后<2min内用所指示浓度(10、100、500和1,000nM)的DECA-EA-Pn和EPA-EA-Pn处理。在5小时后收集细胞，这是LPS后IL6-mRNA水平诱导的表观峰值的时间。IL-6 mRNA水平通过RT-qPCR来定量。结果被表示成在用LPS单独处理的细胞中测量到的水平的平均百分数±SEM(n＝3)(与单独的LPS相比：*：p<0.05；**：p<0.01；***：p<0.001)。
图22：SYN-Pn和SYN对癫痫持续状态后大鼠海马体中炎症的消解的效果。幼龄(42日龄)雄性Sprague-Dawley大鼠经历毛果芸香碱诱导的癫痫持续状态(Pilo-SE)，并在SE发作后2h用SYN(2mg/kg；n＝7)或SYN-Pn(2mg/kg；n＝7)治疗。未治疗的大鼠接受NaCl(n＝5)来代替SYN或SYN-Pn。在SE后9h、即炎性反应的峰值处收集脑。将海马体显微解剖并通过RT-qPCR定量mRNA水平。数据显示了IL1β和TNFαmRNA以及整合了IL1β和TNFα两者的指数的变动。结果被表示成在经历Pilo-SE并用NaCl治疗的大鼠中测量到的值的平均百分数±SEM(与单独的Pilo-SE相比：*：p<0.05；**：p<0.01；ANOVA1，然后是事后Tukey HSD检验)。
具体实施方式
正如由本发明人在下面的实例中证实的，本发明提供了一种新的载体家族，它们具有重要的结构可塑性，从而允许递送生物活性化合物例如ω-3类型的长链脂肪酸。这些载体表现出特定的吸收动力学和特定的肠内吸收定位。它们可以递送具有不同结构的脂肪酸及其代谢衍生物，并靶向几种不同的分子靶。更具体来说，本发明人证实了由本发明的式(I)的化合物的水解产生的代谢衍生物可以抑制关键的分子炎性标记物，并且可以在脑损伤、创伤性脑损伤和/或神经炎性疾病和/或神经变性疾病中阻止认知减退或缺损和/或挽救或恢复认知功能。
根据本发明，下面的术语具有下述定义：
术语“烷基链”是指一个直链或支链的饱和或不饱和烃链，其包含至少2个碳原子，并且更具体来说具有10至24个、12至18个、12至16个碳原子，优选地具有14个碳原子。
术语“烷基”是指饱和或不饱和的、直链或支链的脂族基团。术语“(C1-C6)烷基”是指具有1至6个碳原子，优选地1、2、3、4、5或6个碳原子的烷基。在优选实施方式中，术语“(C1-C6)烷基”是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基或己基。
术语“脂肪酰基”是指一种如上所定义的烷基链，其具体来说具有2至30个碳原子，并被酰基官能化。术语“脂肪酰基”还包括相应的羧酸，其中所述羧酸的羟基已被移除。“脂肪酰基”或相应的羧酸的实例是例如乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山嵛酸、木蜡酸、肉豆蔻烯酸、棕榈烯酸、油酸、异油酸、亚油酸、α-亚油酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、芥酸和二十二碳六烯酸。优选的“脂肪酰基”或其相应的羧酸是癸酸、二十碳五烯酸或二十二碳六烯酸(DHA)，更优选为二十二碳六烯酸(DHA)。
术语一种脂肪酰基的“含氧衍生物”是指一种如上所定义的脂肪酰基，其被至少一个羟基(-OH)取代。作为脂肪酰基的含氧衍生物的非限制性实例，可以提到的是消退素、maresin、神经保护素和神经前列烷。
术语“卤素”对应于氟、氯、溴或碘的一个原子。
术语“水合物”对应于采取水合物形式的化合物。在特定实施方式中，术语“水合物”包括半水合物、单水合物和多水合物。
表述“至少被……取代”意味着所述基团被名单中的一个或几个基团取代。
“可药用盐”是指具有所需生物活性的式(I)、(I’)、(I”)、(II)和(II’)的本发明的化合物的盐。所述“可药用盐”包括无机酸盐以及有机酸盐。适合的无机酸的代表性实例包括盐酸、氢溴酸、氢碘酸、磷酸等。适合的有机酸的代表性实例包括甲酸、乙酸、三氯乙酸、三氟乙酸、丙酸、苯甲酸、肉桂酸、柠檬酸、延胡索酸、马来酸、甲磺酸等。可药用无机或有机酸加成盐的其他实例包括在J.Pharm.Sci.1977,66,2和《制药用盐手册：性质、选择和使用》(Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use，P.HeinrichStahl和Camille G.Wermuth主编，2002)中列出的可药用盐。所述“可药用盐”还包括无机碱和有机碱盐。适合的无机碱的代表性实例包括钠盐或钾盐、碱土金属盐例如钙盐或镁盐或铵盐。适合的与有机碱的盐的代表性实例包括例如与甲胺、二甲胺、三甲胺、吡啶、吗啉或三-(2-羟乙基)胺的盐。
式(I)的化合物
因此，本发明涉及一种式(I)的化合物及其水合物或非对映异构体和/或可药用盐：
其中：
n是等于0或1的整数；
A表示选自下述的基团：
·式(A’)的基团：
其中：
-R1’表示任选地被选自羟基和卤素的至少一个基团取代的饱和或不饱和的(C1-C24)烷基链；并且
-R2’表示氢、包含2至30个碳原子的饱和或不饱和的脂肪酰基、其含氧衍生物之一或通过酰基结合到所述分子的其余部分的生物活性化合物；或
·式(A”)的基团：
其中：
-R1”表示脂肪酰基，优选为包含2至30个碳原子的饱和的脂肪酰基；并且
-R2”表示氢、包含2至30个碳原子的饱和或不饱和的脂肪酰基、其含氧衍生物之一或通过酰基结合到所述分子的其余部分的生物活性化合物；
R3表示氢、包含2至30个碳原子的饱和或不饱和的脂肪酰基、其含氧衍生物之一或通过酰基结合到所述分子的其余部分的生物活性化合物；并且
R4表示氢或(C1-C6)烷基。
在优选实施方式中，R3不是氢。
因此，优选地，本发明涉及一种式(I)的化合物及其水合物或非对映异构体和/或可药用盐：
其中：
n是等于0或1的整数；
A表示选自下述的基团：
·式(A’)的基团：
其中：
-R1’表示任选地被选自羟基和卤素的至少一个基团取代的饱和或不饱和的(C1-C24)烷基链；并且
-R2’表示氢、包含2至30个碳原子的饱和或不饱和的脂肪酰基、其含氧衍生物之一或通过酰基结合到所述分子的其余部分的生物活性化合物；或
·式(A”)的基团：
其中：
-R1”表示脂肪酰基，优选为包含2至30个碳原子的饱和的脂肪酰基；并且
-R2”表示氢、包含2至30个碳原子的饱和或不饱和的脂肪酰基、其含氧衍生物之一或通过酰基结合到所述分子的其余部分的生物活性化合物；
R3表示包含2至30个碳原子的饱和或不饱和的脂肪酰基、其含氧衍生物之一或通过酰基结合到所述分子的其余部分的生物活性化合物；并且
R4表示氢或(C1-C6)烷基。
根据本发明的特定实施方式，在式(I)、(I’)、或(I”)的化合物中，R2’、R2”和R3独立地表示：
-氢，
-包含2至30个碳原子的饱和或不饱和的脂肪酰基，其选自：乙酸，丙酸，丁酸，戊酸，辛酸，癸酸，月桂酸，肉豆蔻酸，棕榈酸，硬脂酸，花生酸，山嵛酸，木蜡酸，肉豆蔻烯酸，棕榈烯酸，油酸，异油酸，亚油酸，α-亚油酸，花生四烯酸，二十碳五烯酸，芥酸和二十二碳六烯酸，优选为二十二碳六烯酸，或
-包含2至30个碳原子的饱和或不饱和的脂肪酰基的含氧衍生物，其选自消退素、maresin、神经保护素和神经前列烷。
根据另一个特定实施方式，在式(I)、(I’)或(I”)的化合物中：
R2’和R2”独立地表示：
-氢，
-包含2至30个碳原子的饱和或不饱和的脂肪酰基，其选自：乙酸，丙酸，丁酸，戊酸，辛酸，癸酸，月桂酸，肉豆蔻酸，棕榈酸，硬脂酸，花生酸，山嵛酸，木蜡酸，肉豆蔻烯酸，棕榈烯酸，油酸，异油酸，亚油酸，α-亚油酸，花生四烯酸，二十碳五烯酸，芥酸和二十二碳六烯酸，优选为二十二碳六烯酸，或
-包含2至30个碳原子的饱和或不饱和的脂肪酰基的含氧衍生物，其选自消退素、maresin、神经保护素和神经前列烷；并且
R3表示：
-包含2至30个碳原子的饱和或不饱和的脂肪酰基，其选自：乙酸，丙酸，丁酸，戊酸，辛酸，癸酸，月桂酸，肉豆蔻酸，棕榈酸，硬脂酸，花生酸，山嵛酸，木蜡酸，肉豆蔻烯酸，棕榈烯酸，油酸，异油酸，亚油酸，α-亚油酸，花生四烯酸，二十碳五烯酸，芥酸和二十二碳六烯酸，优选为二十二碳六烯酸，或
-包含2至30个碳原子的饱和或不饱和的脂肪酰基的含氧衍生物，其选自消退素、maresin、神经保护素和神经前列烷。
根据本发明的另一个特定实施方式，在式(I)、(I’)或(I”)的化合物中，R2’、R2”和R3表示通过酰基结合到所述分子的其余部分的生物活性化合物。
当在本文中使用时，术语“生物活性化合物”包括具有生物活性、更具体来说治疗活性的所有化合物和所有分子。例如，生物活性化合物是抗炎化合物、安定药、抗精神病药和抗癫痫化合物等。根据特定实施方式，所述生物活性化合物是如上所述的脂肪酰基或其含氧衍生物之一。
根据这个特定实施方式，所述生物活性化合物通过一个酰基(-C＝O)结合到所述分子的其余部分。优选地，所述生物活性化合物天然地或通过化学方法被羰基或羧基官能化，以便在所述载体与生物活性化合物之间形成酰胺键(-NH-CO)。优选地，所述被羰基或羧基官能化的生物活性化合物与所述载体的胺基形成酰胺键。
根据本发明，在所述式(I)的化合物中，R4表示氢原子或(C1-C6)烷基。优选地，R4表示氢原子或甲基，更优选为氢。
如上所定义的式(I)的化合物可以根据基团(A)的化学结构分为两个亚家族，式(I’)的鞘氨醇突触脂氧素(SSL)和式(I”)的氨基甘油磷酸突触脂氧素(AGPSL)。
鞘氨醇突触脂氧素(SSL)
SSL对应于如上所定义的式(I)的化合物，其中A表示式(A’)的基团：
其中：
-R1’表示任选地被选自羟基和卤素的至少一个基团取代的饱和或不饱和的(C1-C24)烷基链；并且
-R2’表示氢、包含2至30个碳原子的饱和或不饱和的脂肪酰基、其含氧衍生物之一或通过酰基结合到所述分子的其余部分的生物活性化合物。
因此，本发明的特定实施方式涉及一种式(I’)的SSL化合物：
其中：
n是等于0或1的整数；
R1’表示任选地被选自羟基和卤素的至少一个基团取代的饱和或不饱和的(C1-C24)烷基链；
R2’表示氢、包含2至30个碳原子的饱和或不饱和的脂肪酰基、其含氧衍生物之一或通过酰基结合到所述分子的其余部分的生物活性化合物；
R3表示氢、包含2至30个碳原子的饱和或不饱和的脂肪酰基、其含氧衍生物之一或通过酰基结合到所述分子的其余部分的生物活性化合物；优选为包含2至30个碳原子的饱和或不饱和的脂肪酰基、其含氧衍生物之一或通过酰基结合到所述分子的其余部分的生物活性化合物；并且
R4表示氢或(C1-C6)烷基，优选为甲基。
根据优选实施方式，R1’表示包含10至20个、12至18个碳原子、优选地12至16个碳原子、甚至更优选地14个碳原子的饱和或不饱和的烷基链，所述链任选地被选自羟基和卤素的至少一个基团取代。根据甚至更优选的实施方式，R1’表示包含14个碳原子的饱和烷基链，即十四烷基链。
根据另一个优选实施方式，R2’和R3独立地表示氢或二十二碳六烯酸。
根据另一个优选实施方式，R4表示氢。
根据特定实施方式，在式(I’)的化合物中n是等于0的整数。根据其中n是0的这个实施方式，式(I’)的化合物包含碳磷键(C-P)，其允许将R3-NH-CH2-CH(R4)-基团附连到磷。这些其中n等于0的式(I’)的化合物对应于本文所公开的化合物SSL-X。
本发明的一种优选化合物是式(I’)的化合物SSL-X1，其中：
n是等于0的整数；
R1’表示十四烷基；
R2’表示二十二碳六烯酸；
R3表示氢；并且
R4表示氢。
本发明的一种优选化合物是式(I’)的化合物SSL-X2，其中：
n是等于0的整数；
R1表示十四烷基；
R2’表示氢；
R3表示二十二碳六烯酸；并且/>
R4表示氢。
本发明的一种优选化合物是式(I’)的化合物SSL-X3，其中：
n是等于0的整数；
R1’表示十四烷基；
R2’表示二十二碳六烯酸；
R3表示二十二碳六烯酸；并且
R4表示一个氢。
所述式(I’)的化合物SSL-X可以通过基于生物的方法和/或通过全化学合成方法来制备。制备式(I’)的SSL化合物的通用程序示出在图1中。
在基于生物的方法的情形中，从海洋软体动物例如与其他海洋软体动物相比丰富且价格低廉的紫贻贝(Mytilus galloprovincialis)提取和纯化神经酰胺氨基乙基膦酸酯(CAEP)。为此，按照Folch方法提取和纯化总脂质(Folch J.,Lees M.和Stanley G.H.S.，(1957)，一种从动物组织分离和纯化总脂质的简单方法(A simple method for theisolation and purification of total lipids from animal tissues)，J.Biol.Chem.226,497-509)，然后皂化。在纯化不可皂化的级分后，通过强碱水解或酸水解将所述CAEP脱酰。然后将脱酰的CAEP纯化，定量，投入与限定量的二十二碳六烯酸的反应，以通过N-酰化获得化合物SSL-X1、SSL-X2和SSL-X3。
在全化学合成方法的情形中，第一步是使用例如乙酸酐将可商购的鞘磷脂的羟基乙酰化，以得到O-乙酰化鞘磷脂。第二步是用非特异性C型磷脂酶(产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens))水解O-乙酰化鞘磷脂，以得到O-乙酰化神经酰胺，然后将其纯化。第三步是用单氯代2-苯二甲酰亚胺基膦酸将O-乙酰化神经酰胺膦酰化，以得到O-乙酰基-神经酰胺-(2-苯二甲酰亚胺基乙基)-膦酸酯。第四步是O-乙酰基-神经酰胺-(2-苯二甲酰亚胺基乙基)-膦酸酯的肼解，以得到O-乙酰化鞘氨醇膦酰乙醇胺，然后将其纯化。然后将所述O-乙酰化鞘氨醇膦酰乙醇胺与一定量的DHA反应，以通过N-酰化然后是O-脱酰化提供化合物SSL-X1、SSL-X2和SSLX3。
根据另一个特定实施方式，在式(I’)的化合物中n是等于1的整数。根据这个其中n是1的实施方式，所述式(I’)的化合物包含酯-磷键(O-P)，其允许将R3-NH-CH2-CH(R4)-O-基团附连到磷。这些其中n等于1的式(I’)的化合物对应于本文所公开的化合物SSL-Y。
本发明的一种优选化合物是式(I’)的化合物SSL-Y1，其中：
n是等于1的整数；
R1’表示十四烷基；
R2’表示二十二碳六烯酸；
R3表示氢；并且
R4表示氢。
本发明的一种优选化合物是式(I’)的化合物SSL-Y2，其中：
n是等于1的整数；
R1’表示十四烷基；
R2’表示氢；/>
R3表示二十二碳六烯酸；并且
R4表示一个氢。
本发明的一种优选化合物是式(I’)的化合物SSL-Y3，其中：
n是等于1的整数；
R1’表示十四烷基；
R2’表示二十二碳六烯酸；
R3表示二十二碳六烯酸；并且
R4表示氢。
化合物SSL-Y1、SSL-Y2和SSL-Y3可以通过全化学合成方法，按照包括图1中示出的过程的脱酰化、纯化、定量和N-酰化步骤的过程，从作为商品化起始原料的神经酰胺磷酰基乙醇胺(CPEA)开始来合成。
氨基甘油磷酸突触脂氧素(AGPSL)
AGPSL对应于如上所定义的式(I)的化合物，其中A表示式(A”)的基团：
其中：
-R1”表示脂肪酰基，优选为包含2至30个碳原子的饱和的脂肪酰基；
-R2”表示氢、包含2至30个碳原子的饱和或不饱和的脂肪酰基、其含氧衍生物之一或通过酰基结合到所述分子的其余部分的生物活性化合物。
因此，本发明的另一个特定实施方式涉及一种式(I”)的AGPSL化合物：
其中：
n是等于0或1的整数；
R1”表示脂肪酰基，优选为包含2至30个碳原子的饱和的脂肪酰基；
R2”表示氢、包含2至30个碳原子的饱和或不饱和的脂肪酰基、其含氧衍生物之一或通过酰基结合到所述分子的其余部分的生物活性化合物；
R3表示氢、包含2至30个碳原子的饱和或不饱和的脂肪酰基、其含氧衍生物之一或通过酰基结合到所述分子的其余部分的生物活性化合物，优选为包含2至30个碳原子的饱和或不饱和的脂肪酰基、其含氧衍生物之一或通过酰基结合到所述分子的其余部分的生物活性化合物；并且
R4表示氢或(C1-C6)烷基，优选为甲基。
根据优选实施方式，R1”表示脂肪酰基，优选为饱和的并包含12至20个碳原子、12至18个碳原子、优选地12至16个碳原子、更优选地16个碳原子。根据甚至更优选的实施方式，R1”表示棕榈酸。
根据另一个优选实施方式，R2”和R3独立地表示氢或二十二碳六烯酸。
根据另一个优选实施方式，R4表示氢。
根据特定实施方式，在式(I”)的化合物中n是等于0的整数。根据这个其中n是0的实施方式，所述式(I”)的化合物包含碳磷键(C-P)，其允许R3-NH-CH2-CH(R4)-基团附连到磷。这些其中n等于0的式(I”)的化合物对应于本文所公开的化合物AGPSL-X。
本发明的一种优选化合物是式(I”)的化合物AGPSL-X1，其中：
n是等于0的整数；
R1”表示棕榈酸；
R2”表示二十二碳六烯酸；
R3表示氢；并且
R4表示氢。
本发明的一种优选化合物是式(I”)的化合物AGPSL-X2，其中：
n是等于0的整数；
R1”表示棕榈酸；
R2”表示氢；
R3表示二十二碳六烯酸；并且
R4表示氢。
本发明的一种优选化合物是式(I”)的化合物AGPSL-X3，其中：
n是等于0的整数；
R1”表示棕榈酸；
R2”表示二十二碳六烯酸；
R3表示二十二碳六烯酸；并且
R4表示一个氢。
所述AGPSL-X可以通过全化学合成方法来制备。在这种情形中，第一步是使用2-单氯代苯二甲酰亚胺基膦酸将可商购的二酰基甘油膦酰化，以获得二酰基甘油-(2-苯二甲酰亚胺基乙基)-膦酸酯。第二步是二酰基甘油-(2-苯二甲酰亚胺基乙基)膦酸酯的肼解，以获得甘油膦酰乙醇胺，然后将其纯化。然后将甘油膦酰乙醇胺与一定量的DHA反应，以通过N-酰化提供化合物AGPSL-X2。通过用磷脂酶A2将甘油膦酰乙醇胺脱酰化，并通过在DHA存在下重新O-酰化，得到AGPSL-X1。通过AGPSL-X1的甘油的sn-2位置中的脱酰化和在DHA存在下的重新O-酰化，得到AGPSL-X3。
根据另一个特定实施方式，在式(I”)的化合物中n是等于1的整数。根据这个其中n是1的实施方式，所述式(I”)的化合物包含酯-磷键(O-P)，其允许将R3-NH-CH2-CH(R4)-O-基团附连到磷。这些其中n等于1的式(I”)的化合物对应于本文所公开的化合物AGPSL-Y。
本发明的一种优选化合物是式(I”)的化合物AGPSL-Y1，其中：
n是等于1的整数；
R1”表示棕榈酸；/>
R2”表示二十二碳六烯酸；
R3表示氢；并且
R4表示氢。
本发明的一种优选化合物是式(I”)的化合物AGPSL-Y2，其中：
n是等于1的整数；
R1”表示棕榈酸；
R2”表示氢；
R3表示二十二碳六烯酸；并且
R4表示氢。
本发明的一种优选化合物是式(I”)的化合物AGPSL-Y3，其中：
n是等于1的整数；
R1”表示棕榈酸；
R2”表示二十二碳六烯酸；
R3表示二十二碳六烯酸；并且
R4表示氢。
所述AGPSL-Y可以通过全化学合成方法，从可商购的磷脂酰乙醇胺开始来制备。通过用磷脂酶A2将磷脂酰乙醇胺在甘油的sn-2位置中脱酰化并通过在DHA存在下重新O-酰化，得到AGPSL-Y1。通过用磷脂酶A2将磷脂酰乙醇胺在甘油的sn-2位置中脱酰化并通过在DHA存在下N-酰化，得到AGPSL-Y2。通过用磷脂酶A2将磷脂酰乙醇胺在甘油的sn-2位置中脱酰化并通过在二十二碳六烯酸存在下N-酰化和O-酰化，得到AGPSL-Y3。
式(II)的化合物
本发明还涉及一种式(II)的化合物及其水合物或非对映异构体或可药用盐：
R5-NH-CH2-CH(R7)-O(n)-R6(II)，
其中：
n是等于0或1的整数；
R5表示包含2至30个碳原子的饱和或不饱和的脂肪酰基或其含氧衍生物之一；并且
R6是-PO3 2-基团；
R7表示氢或(C1-C6)烷基；
前提是当n等于1时，R5不是花生四烯酸。
根据本发明的特定实施方式，在式(II)的化合物的化合物中R5表示：
-包含2至30个碳原子的饱和或不饱和的脂肪酰基，其选自：乙酸，丙酸，丁酸，戊酸，辛酸，癸酸，月桂酸，肉豆蔻酸，棕榈酸，硬脂酸，花生酸，山嵛酸，木蜡酸，肉豆蔻烯酸，棕榈烯酸，油酸，异油酸，亚油酸，α-亚油酸，花生四烯酸，二十碳五烯酸，芥酸和二十二碳六烯酸，优选为癸酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸，或
-包含2至30个碳原子的饱和或不饱和的脂肪酰基的含氧衍生物，其选自消退素、maresin、神经保护素和神经前列烷。
在本发明的优选实施方式中，在式(II)的化合物中R5表示包含2至30个碳原子的饱和或不饱和的脂肪酰基，其是二十二碳六烯酸。
根据本发明，在所述式(II)的化合物中R7表示氢或(C1-C6)烷基。优选地，R7表示氢原子或甲基，更优选为氢。
如上所定义的式(II)的化合物可以根据整数n分类为两个亚家族，即脂肪酸的乙醇胺-膦酸酯衍生物和脂肪酸的乙醇胺-磷酸酯衍生物。
乙醇胺-膦酸酯衍生物
在特定实施方式中，在所述式(II)的化合物中n等于0。此类特定化合物在本文中可以被称为“脂肪酸的乙醇胺-膦酸酯衍生物”。
根据这个特定实施方式，所述式(II)的化合物也可以由下式(IIA)表示：
R5-NH-CH2-CH(R7)-PO3 2-(IIA)，
其中R5和R7如上所定义。
在优选实施方式中，在所述式(IIA)的化合物中R5表示包含2至30个碳原子的饱和或不饱和的脂肪酰基，其选自癸酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸。
在另一个优选实施方式中，在所述式(IIA)的化合物中R7表示氢。
在更优选实施方式中，在式(IIA)的化合物中R5表示癸酸、二十碳五烯酸或二十二碳六烯酸，并且R7表示氢。
在甚至更优选实施方式中，在式(IIA)的化合物中R5表示二十二碳六烯酸，并且R7表示氢。
乙醇胺-磷酸酯衍生物
在特定实施方式中，在所述式(II)的化合物中n等于1。此类特定化合物在本文中可以被称为“脂肪酸的乙醇胺-磷酸酯衍生物”。
根据这个特定实施方式，所述式(II)的化合物也可以由下式(IIB)表示：
R5-NH-CH2-CH(R7)-O-PO3 2-(IIB)，
其中R5和R7如上所定义，前提是R5不是花生四烯酸。
在另一个特定实施方式中，在所述式(IIB)的化合物中R5表示包含2至30个碳原子的饱和或不饱和的脂肪酰基，其选自下述包含2至30个碳原子的饱和或不饱和的脂肪酰基：乙酸，丙酸，丁酸，戊酸，辛酸，癸酸，月桂酸，肉豆蔻酸，棕榈酸，硬脂酸，花生酸，山嵛酸，木蜡酸，肉豆蔻烯酸，棕榈烯酸，油酸，异油酸，亚油酸，α-亚油酸，二十碳五烯酸，芥酸和二十二碳六烯酸，优选为癸酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸。
在优选实施方式中，在所述式(IIB)的化合物中R5表示包含2至30个碳原子的饱和或不饱和的脂肪酰基，其选自癸酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸。
在另一个优选实施方式中，在所述式(IIB)的化合物中R7表示氢。
在更优选实施方式中，在式(IIB)的化合物中R5表示癸酸、二十碳五烯酸或二十二碳六烯酸，并且R7表示氢。
在甚至更优选实施方式中，在式(IIB)的化合物中R5表示二十二碳六烯酸，并且R7表示氢。
乙醇胺衍生物
本文中还公开了一种式(II’)的化合物及其水合物或非对映异构体或可药用盐：
R5’-NH-CH2-CH(R7’)-O(n)-R6’(II’)，
其中：
n是等于1的整数；
R5’表示包含2至30个碳原子的饱和或不饱和的脂肪酰基或其含氧衍生物之一；
R6’是氢；并且
R7’表示氢或(C1-C6)烷基。
此类特定化合物在本文中可以被称为“脂肪酸的乙醇胺衍生物”。
所述式(II)的化合物也可以由下式(IIC)表示：
R5-NH-CH2-CH(R7)-OH(IIC)，
其中R5和R7如上所定义。
在优选实施方式中，在所述式(IIC)的化合物中R5表示包含2至30个碳原子的饱和或不饱和的脂肪酰基，其选自癸酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸。
在另一个优选实施方式中，在所述式(IIC)的化合物中R7表示氢。
在更优选实施方式中，在式(IIC)的化合物中R5表示癸酸、二十碳五烯酸或二十二碳六烯酸，并且R7表示氢。
在甚至更优选实施方式中，在式(IIC)的化合物中R5表示二十二碳六烯酸，并且R7表示氢。
应用
如上所公开的本发明的式(I)的化合物包括式(I’)和(I”)的化合物以及式(II)的化合物包括式(IIA)和(IIB)的化合物，可以用作药物或医药。本发明的式(I)的化合物包括式(I’)和(I”)的化合物以及式(II)的化合物包括式(IIA)和(IIB)的化合物，可用于预防和/或治疗炎性疾病。本发明的式(I)的化合物包括式(I’)和(I”)的化合物、式(II)的化合物包括式(IIA)和(IIB)的化合物以及式(II’)的化合物，可用于在脑损伤和/或创伤性脑损伤和/或神经炎性疾病和/或神经变性疾病中预防认知减退/缺损和/或恢复改变的认知功能。在本发明的另一个特定实施方式中，根据本发明所述的式(I)、(I’)、(I”)、(II)、(IIA)、(IIB)和(II’)的化合物可用于预防和/或治疗与癫痫发作相关的疾病。在本发明的另一个特定实施方式中，根据本发明所述的式(I)、(I’)、(I”)、(II)、(IIA)、(IIB)和(II’)的化合物可用作抗癫痫药物。在本发明的另一个特定实施方式中，根据本发明所述的式(I)、(I’)、(I”)、(II)、(IIA)、(IIB)和(II’)的化合物可用于在非病理性衰老期间保护认知功能。在本发明的另一个特定实施方式中，根据本发明所述的式(I)、(I’)、(I”)、(II)、(IIA)、(IIB)和(II’)的化合物可用于在健康对象中增强认知功能。
当在本文中使用时，术语“治疗”是指对象中疾病或障碍例如炎性疾病或认知障碍的改善、预防或逆转。在一个实施方式中，术语“治疗”也可以是指在对象中抑制或延迟所述疾病或障碍的进展。在另一个实施方式中，这些术语是指在对象中延迟疾病或障碍的发生。在某些实施方式中，本发明的化合物作为预防性措施给药。在这种情形中，术语“治疗”可以对应于术语“预防”，它是指在对象中降低获得特定疾病或障碍的风险。
当在本文中使用时，术语“增强认知功能”是指在健康对象中改善能力，例如注意力、集中力、学习或记忆能力。
当在本文中使用时，“对象”对应于任何健康生物体或可能患有炎性疾病和/或与认知障碍和/或行为障碍相关的疾病的生物体和/或可能已经历脑损伤或创伤性脑损伤的生物体。在优选实施方式中，所述对象是哺乳动物，优选为人类。
不与特定作用机制相关，所述式(I)的化合物允许运载/递送具有抗炎和/或抗癫痫特性和/或对认知具有保护和恢复特性的分子。例如，所述式(I)的化合物可以运载脂肪酸(或其代谢衍生物)，由此体内递送所述脂肪酸、其乙醇胺衍生物或其乙醇胺-膦酸酯衍生物或其乙醇胺-磷酸酯衍生物。作为实例，当所述式(I)的化合物运载二十二碳六烯酸时，它们可以体内递送DHA和/或二十二碳六烯酸乙醇胺和/或二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯和/或磷酰化二十二碳六烯酸乙醇胺。当在本文中使用时，术语“二十二碳六烯酸乙醇胺”对应于“DHA-乙醇胺”。
本发明的化合物的抗炎特性使得它们在具有显著神经炎症组分的神经变性疾病的治疗中非常令人感兴趣。由于它们的特性，这些化合物在神经变性疾病之外的各种不同炎性疾病的治疗中也是有效的。
因此，本发明的一个目的涉及一种如本文中所定义的式(I)、(I’)、(I”)或(II)的化合物，其用作药物。本发明的另一个目的是一种药物组合物，其包含至少一种本文中所定义的本发明的式(I)、(I’)、(I”)或(II)的化合物以及可接受的药物赋形剂。本发明还公开了一种药物组合物，其包含至少一种本文中所定义的本发明的式(II’)的化合物以及可接受的药物赋形剂。
根据特定实施方式，本发明的包含式(I)、(I’)、(I”)或(II)的化合物的药物组合物用于预防和/或治疗炎性疾病。炎性疾病包括例如中枢神经系统的炎性疾病(神经炎性疾病)、视网膜的炎性疾病、炎性关节疾病和消化系统的炎性疾病。
神经炎性疾病的特征在于包括脑、脊髓在内的中枢神经系统(CNS)和视网膜中的炎症。神经炎性疾病的体征和症状可以随着受影响的CNS部分而变。CNS或视网膜的炎症可以引起局灶性障碍，例如中风、感觉异常、视力丧失、言语障碍、记忆丧失、精神警觉性降低以及集中力和行为的改变。CNS炎症还可以引起精神症状，例如幻觉、思维扭曲、意识混乱和情绪波动。根据CNS中炎症的程度和位置，癫痫发作和头痛可能是频繁的。癫痫、阿兹海默氏病、帕金森氏病、多发性硬化症、痴呆症和亨廷顿氏病，是神经炎性疾病的非穷举性实例。
消化系统的炎性疾病的特征在于部分消化道壁中消化免疫系统的过度活跃。克罗恩病、溃疡性结肠炎和肠综合征是消化系统炎性疾病的非穷举性实例。
炎性关节疾病的特征在于关节中的炎症。关节炎和类风湿病是炎性关节疾病的非穷举性实例。
在另一个特定实施方式中，本发明的包含式(I)、(I’)、(I”)、(II)或(II’)的化合物的药物组合物被用于预防和/或治疗与认知障碍相关的疾病。认知障碍意味着具体来说影响记忆力、注意力和灵活性的精神障碍。认知障碍的原因在不同类型的障碍之间不同，但它们大多数由脑损伤引起。阿兹海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、癫痫、谵妄、痴呆症和健忘症是与认知障碍相关的疾病的非穷举性实例。
在另一个特定实施方式中，本发明的包含式(I)、(I’)、(I”)、(II)或(II’)的化合物的药物组合物被用于预防和/或治疗与癫痫发作相关的疾病。“癫痫发作”可以由脑中神经元的过度、超同步放电引起的神经功能的阵发性改变引起。与癫痫发作相关的疾病的实例是癫痫，这是一种反复无端的癫痫发作的病症，以及触发(引发)导致癫痫发作的脑刺激的任何可逆性疾病，例如感染、中风、头部受伤或对药物的反应。在儿童中，发烧可引发非癫痫性发作(也被称为“热性惊厥”)。某些精神障碍可以引起类似于癫痫发作的症状，称为心因性非癫痫发作或假性癫痫发作。
因此，本发明涉及包含本文中所定义的式(I)、(I’)、(I”)或(II)的化合物的药物组合物，其用于预防和/或治疗选自炎性疾病、特别是中枢神经系统的炎症或神经炎性疾病、消化道的炎性疾病、视网膜的炎性疾病、炎性关节疾病的疾病。因此，本发明还涉及一种包含本文中所定义的式(I)、(I’)、(I”)、(II)或(II’)的化合物的药物组合物，其用于预防和/或治疗与认知障碍相关的疾病。
本发明还涉及一种治疗选自炎性疾病、特别是中枢神经系统的炎症或神经炎性疾病、消化道的炎性疾病、炎性关节疾病、视网膜的炎性疾病或与认知障碍相关的疾病的疾病的方法，所述方法包括在需要的对象中给药有效量的式(I)或(II)的化合物或包含此类化合物的药物组合物。
本发明还涉及式(I)或(II)的化合物的用途，其用于制造药物组合物，所述药物组合物用于治疗选自炎性疾病、特别是中枢神经系统的炎症或神经炎性疾病、消化道的炎性疾病、炎性关节疾病、视网膜的炎性疾病或与认知障碍相关的疾病的疾病。
在本发明的特定实施方式中，所述通过式(I)、(I’)、(I”)、(II)或(II’)的化合物预防和/或治疗的疾病/障碍选自癫痫、创伤性脑损伤、阿兹海默氏病、帕金森氏病、多发性硬化症、克罗恩病、肠综合征、痴呆症和亨廷顿氏病，优选为癫痫。
本发明的一个目的是一种如本文中所定义的包含式(I)、(I’)、(I”)、(II)或(II’)的化合物的药物组合物，其用于预防和/或治疗选自癫痫、创伤性脑损伤、阿兹海默氏病、帕金森氏病、多发性硬化症、克罗恩病、肠综合征、痴呆症和亨廷顿氏病的疾病。本发明的另一个目的是一种治疗此类疾病的方法，所述方法包括在需要的对象中给药本文中所定义的包含式(I)、(I’)、(I”)、(II)或(II’)的化合物的药物组合物。本发明的另一个目的是式(I)、(I’)、(I”)、(II)或(II’)的化合物的用途，其用于制造预防和/或治疗此类疾病的药物组合物。
当在本文中使用时，“癫痫”包括具有局灶性意识性癫痫发作、或具有局灶性意识受损性癫痫发作、或具有双侧强直阵挛性癫痫发作、或具有失神发作、或具有非典型失神发作、或具有强直阵挛性癫痫发作、或具有失张力癫痫发作、或具有阵挛性癫痫发作、或具有强直性癫痫发作、或具有肌阵挛性癫痫发作、或具有痴笑和哭泣性癫痫发作、或具有热性癫痫发作、或具有难治性癫痫发作的癫痫，以及不同的癫痫综合征，包括常染色体显性的夜间额叶癫痫、儿童失神癫痫、伴有中央颞区棘波的儿童癫痫(又称良性罗兰性癫痫)、Doose综合征、Dravet综合征、早期肌阵挛性脑病、伴有游走性局灶性癫痫发作的婴儿期癫痫、伴有眼睑肌阵挛的癫痫(Jeavons综合征)、单独伴有全身性强直-阵挛癫痫发作的癫痫、伴有肌阵挛性失神的癫痫、睡眠期间伴有连续棘波和波的癫痫性脑病、额叶癫痫、婴儿痉挛症(韦斯特综合征)和结节性硬化症、青少年失神癫痫、青少年肌阵挛癫痫、Lafora进行性肌阵挛癫痫、Landau-Kleffner综合征、Lennox-Gastaut综合征、Ohtahara综合征、Panayiotopoulos综合征、进行性肌阵挛性癫痫、反射性癫痫、颞叶癫痫。
本发明的特定目的是一种如本文中所定义的包含式(I)、(I’)、(I”)、(II)和(II’)的化合物的药物组合物，其用于降低/减少癫痫发作的严重程度和/或频率。本发明的另一个特定目的是一种降低/减少癫痫发作的严重程度和/或频率的方法，所述方法包括在需要的对象中给药如本文中所定义的包含式(I)、(I’)、(I”)、(II)和(II’)的化合物的药物组合物。本发明的另一个特定目的是式(I)、(I’)、(I”)、(II)和(II’)的化合物的用途，其用于制造用于降低/减少癫痫发作的严重程度和/或频率的药物组合物。
在另一个特定实施方式中，本发明涉及一种如本文中所定义的药物组合物，其用于在脑损伤和/或创伤性脑损伤和/或神经炎性疾病和/或神经变性疾病中预防认知减退/缺损和/或恢复改变的认知功能。
本发明的特定实施方式涉及一种用于在脑损伤和/或创伤性脑损伤和/或神经炎性疾病和/或神经变性疾病中恢复改变的认知功能的方法，所述方法包括在需要的对象中给药有效量的式(I)、(I’)、(I”)、(II)或(II’)的化合物或包含此类化合物的药物组合物。
本发明的另一个特定实施方式涉及式(I)、(I’)、(I”)、(II)或(II’)的化合物的用途，其用于制造药物组合物，所述药物组合物用于在脑损伤和/或创伤性脑损伤和/或神经炎性疾病和/或神经变性疾病中防止认知减退或恢复改变的认知功能。
当在本文中使用时，“认知功能”是指与知识相关的所有心智功能，包括执行功能、学习和记忆、注意力和处理速度、语言等。
当在本文中使用时，脑损伤包括由内部或外部来源引起的脑损伤。一种来自于外部来源的特定脑损伤是“创伤性脑损伤”，其是指头部损伤或颅脑创伤，包括头部和脑部损伤。在临床上存在三种主要类别的创伤性脑损伤：轻度(无意识丧失或颅骨骨折)，中度(具有超过几分钟的初始意识丧失或具有颅骨骨折)和重度(立即昏迷，没有或具有相伴的颅骨骨折)。在创伤性脑损伤的众多后遗症中，就对长期功能障碍的影响而言，认知损害可能是最严重的。
神经变性疾病是具有缓慢且分立的演化的失能性慢性疾病，其中炎性组分对病因有贡献。神经变性疾病还引起认知功能的丧失或改变。脊髓小脑共济失调、多系统萎缩、亚历山大病、阿尔珀斯病、阿兹海默氏病、路易体痴呆症、Creutzfeld病、亨廷顿氏病、帕金森氏病、皮克氏病、进行性核上性麻痹和肌萎缩性侧索硬化，是神经变性疾病的非穷举性实例。
根据另一个特定实施方式，本发明涉及本文中所定义的药物组合物的用途，其用于在衰老期间预防和/或保持认知功能和/或在健康对象中增强认知功能。
本发明的特定实施方式涉及一种在衰老期间保持认知功能和/或在健康对象中增强认知功能的方法，所述方法包括在所述健康对象中给药有效量的式(I)、(I’)、(I”)、(II)或(II’)的化合物或包含此类化合物的药物组合物。当在本文中使用时，“认知功能的保持”也意味着认知功能改变的风险的降低。
根据本发明，本文中所定义的药物组合物包括可药用支持物或载体。“可药用支持物”包括含有至少一种可接受的药物赋形剂的支持物。“可药用赋形剂”包括允许将本发明的药物组合物配制成所需盖仑制剂形式而不会对被治疗的对象产生不良作用的任何赋形剂。专业技术人员根据适用于目标给药途径的制剂选择所述可药用赋形剂的种类和比例。
当在本文中使用时，“有效量”或“有效剂量”确定了允许获得足以治疗和/或预防炎性疾病或以认知缺损为特征的疾病的治疗效果的本发明的化合物或包含本发明的化合物的药物组合物的量或数量。应当理解，本领域技术人员可以根据患者、病理、给药方式和疾病的严重程度等调整给药量。例如，本发明的式(I)、(I’)、(I”)、(II)或(II’)的化合物的有效量在0.01mg/kg至100mg/kg(BW)之间，0.01mg/kg至50mg/kg(BW)之间，0.01mg/kg至10mg/kg(BW)之间。具体来说，本发明的式(I)、(I’)、(I”)、(II)或(II’)的化合物的有效量为5mg/kg(BW)、10mg/kg(BW)或50mg/kg(BW)。该有效量可以被患者仅仅服用一次或偶尔服用例如每周一次、每周两次或每周三次，或更频繁地服用例如每天一次或多次，例如每天两次或三次。优选地，该量在对象中每天给药，即每天一次。
根据优选实施方式，本发明的式(I)、(I’)、(I”)、(II)或(II’)的化合物以0.01mg/kg至100mg/kg(BW)之间，优选地0.01mg/kg至10mg/kg(BW)之间，更优选地约5mg/kg(BW)、10mg/kg(BW)或50mg/kg(BW)的量或剂量在对象中给药。在特定情况下，本发明的化合物和药物组合物可以每周给药几天，例如4、5、6或7天。优选地，它们每天给药一次。
本发明的药物组合物的给药途径可以是口服或肠胃外(包括皮下、肌肉内、腹膜内、脑室内、静脉内和/或真皮内)。优选地，所述给药途径是肠胃外、口服或局部。在肠胃外注射的情形中，静脉内注射是优选的。
根据优选实施方式，所述包含式(I)的化合物的药物组合物经口给药。
根据另一个优选实施方式，所述包含式(II)或(II’)的化合物的药物组合物通过口服途径或肠胃外途径给药。优选的肠胃外途径是腹膜内途径。
正如在实施例中描述的，对应于式(I’)的化合物的SSL呈现出缓慢且延长的肠内水解/吸收，而对应于式(I”)的化合物的甘油磷脂AGPSL在肠道中相对快地水解/吸收(在胆汁分泌到十二指肠中之后磷脂的消化改变了胆汁组分的相行为(Digestion ofPhospholipids after Secretion of Bile into the Duodenum Changes the PhaseBehavior of Bile Components)，Woldeamanuel A.Birru.等，Mol.Pharmaceutics,2014,11,2825-2834)。这些药代动力学差异引入了大量潜在优点，并允许以急性或慢性方式治疗患者，从而根据临床病例提供多种治疗干预的可能性。对于慢性治疗来说，经口给药包含式(I’)的化合物的药物组合物是优选的。对于急性治疗来说，经口给药包含式(I”)的化合物的药物组合物是优选的。
在治疗紧急状况例如创伤性脑损伤和癫痫持续状态中，可以考虑静脉内、脑室内或皮下给药本文中所描述的脂肪酸的代谢衍生物，特别是二十二碳六烯酸的代谢衍生物如二十二碳六烯酸乙醇胺、二十二碳六烯酸乙醇胺磷酸酯和二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯。
因此，另一个目的涉及一种药物组合物，其包含二十二碳六烯酸的至少一种代谢衍生物，特别是二十二碳六烯酸乙醇胺、二十二碳六烯酸乙醇胺磷酸酯和/或二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯，所述药物组合物用于保护和/或恢复被创伤性脑损伤和/或癫痫持续状态改变的认知功能，其中所述药物组合物静脉内给药。
另一个目的涉及一种用于在对象中保护和/或恢复被创伤性脑损伤和/或癫痫持续状态改变的认知功能的方法，所述方法包括在该对象中静脉内给药有效量或剂量的二十二碳六烯酸的至少一种代谢衍生物，特别是二十二碳六烯酸乙醇胺、二十二碳六烯酸乙醇胺磷酸酯和/或二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯，或包含它们的药物组合物。
另一个目的涉及二十二碳六烯酸的至少一种代谢衍生物，特别是二十二碳六烯酸乙醇胺、二十二碳六烯酸乙醇胺磷酸酯和/或二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯的用途，其用于制造药物组合物，所述药物组合物用于保护和/或恢复被创伤性脑损伤和/或癫痫持续状态改变的认知功能，其中所述药物组合物静脉内给药。
根据优选实施方式，所述二十二碳六烯酸的至少一种代谢衍生物，特别是二十二碳六烯酸乙醇胺、二十二碳六烯酸乙醇胺磷酸酯和/或二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯，在对象中以0.01至10mg/kg(BW)、优选地0.5至5mg/kg(BW)的范围内的剂量，更优选地以约2mg/kg(BW)的剂量静脉内给药。
根据另一个实施方式，本文中所定义的本发明的式(I)的化合物、包括式(I’)和(I”)的化合物以及本发明的式(II)的化合物、包括式(IIA)和(IIB)的化合物，可以用作食品增补剂。
本发明的其他方面和优点公开在下面的实施例中，所述实施例应该被当作是说明性的，而不是限制本申请的范围。
实施例
实施例A：合成
I.1.SSL-X化合物(n＝0)的合成
1.基于生物的方法
使用在某些海洋生物、特别是双壳类软体动物例如紫贻贝(Mytilusgalloprovincialis)中相对丰富的神经酰胺氨基乙基膦酸酯(CAEP)进行SSL-X的合成。为此，按照Folch方法提取和纯化总脂质(Folch J.,Lees M.和Stanley G.H.S.，(1957)，一种从动物组织分离和纯化总脂质的简单方法(A simple method for the isolation andpurification of total lipids from animal tissues)，J.Biol.Chem.226,497-509)。然后将所述脂质皂化。在纯化不可皂化的脂质级分后，使用强碱性水解或酸性水解将所述CAEP脱酰化。然后将所述脱酰化的CAEP纯化并定量。然后通过N-酰化合成SSL-X1、SSL-X2和SSL-X3。图1示出了合成程序。
用于SSL合成的详细程序在后文中描述。
1.1.总脂质的提取和纯化
按照Folch方法提取和纯化总脂质。为此，使用Polytron将组织在氯仿-甲醇(2:1，v/v)混合物(25mL/g组织)中匀浆。允许脂质提取在4℃下进行12小时。使用无灰滤纸将所述样品过滤，并如下所述使用相分配来纯化脂质：
使用0.25％KCl水溶液(m/v)进行所述粗品脂质提取物的第一次清洗，它以脂质提取物体积的四分之一的比例添加到所述脂质提取物。在相分离后，舍弃水-甲醇相。通过向下层有机相添加甲醇来恢复初始的氯仿-甲醇比例，然后使用去离子水在与用于第一次清洗的条件相同的条件下进行第二次清洗。舍弃含有非脂质污染物的上层相，并使用旋转蒸发仪将下层氯仿相蒸发至干。通过顺序添加无水乙醇并再次干燥样品，然后将其在干燥器中放置过夜，来除去痕量的水。确定总脂质的质量，并在进一步使用之前将脂质在一定体积的苯-甲醇(1:1，v/v)中保持在-30℃下。
1.2.总脂质的皂化
对脂质进行弱碱性甲醇解，以便除去酯类脂质例如甘油三酯、胆甾醇酯和甘油磷脂。相反，鞘脂类(包括我们的感兴趣的分子)对皂化有抗性。
后者在室温下在含有0.3M NaOH的氯仿-甲醇混合物(1:1，v/v)中进行1小时。然后调整氯仿的浓度以便获得(2:1，v/v)的氯仿-甲醇比例。然后在添加去离子水(氯仿-甲醇体积的四分之一)后通过相分配纯化不可皂化的脂质级分。舍弃上层水相，并将下层氯仿相蒸发至干。然后将所述不可皂化的脂质级分溶解在一定体积的苯-甲醇(1:1，v/v)中。
1.3.神经酰胺氨基乙基膦酸酯的脱酰化及其溶血形式的纯化
脱酰化使用强碱性处理或酸性处理来进行。所述强碱性处理在搅拌下，使用甲醇中的1.5M KOH在100℃进行24小时。所述反应通过添加浓HCl来终止。
酸水解使用浓HCl-甲醇(1:5，v/v)在75℃进行6小时。在冷却后，使用己烷实现两次脂质提取。所述强碱性水解允许形成鞘氨醇氨基乙基膦酸酯(SAEP)，但仍然可检测到一些痕量的未水解的CAEP。为了分离前体和反应产物，我们开发了一种色谱程序以便纯化所述鞘氨醇氨基乙基膦酸酯。为此，我们利用了SAEP在与CAEP前体相比时表现出额外的氨基这一事实。化合物的分离使用弱阳离子交换LC-WCX柱来进行。首先，通过连续施加己烷、甲醇中的0.5M乙酸、甲醇、然后是己烷，对所述柱进行调制。将样品在氯仿-甲醇(9:2.5，v/v)中施加到所述柱上。所述未水解的CAEP用含有0.1M乙酸的氯仿-甲醇(9:4，v/v)洗脱在第一级分中。然后使用含有1M乙酸的甲醇作为溶剂系统将SAEP洗脱在第二级分中。
1.4.通过N-酰化合成SSL-X1、SSL-X2和SSL-X3
首先对在前一步(段落1.3)中产生并纯化的SAEP进行定量。这种定量是基于磷的测定，每个SAEP分子含有一个磷原子，因此允许直接确定SAEP的数量。所述定量在将所述分子在含有1g/L的作为催化剂的四氧化钒的浓硫酸-浓高氯酸(2:1，v/v)的混合物中矿化后，通过分光光度法来实现。无机磷的检测在与氨基萘磺酸反应后进行。
在定量后，将SAEP用二十二碳六烯酸(DHA)N-酰化。N-酰化在三乙胺存在下，在含有二乙基磷酰基氰化物作为偶联剂的的二氯甲烷-二甲基甲酰胺的混合物(3:1，v/v)中进行。允许所述反应在搅拌下，在暗处和氮气饱和气氛中，在室温进行90min。这个程序允许反应发生而没有DHA的羧基官能团的初步衍生化。建立反应条件，使得它以化学计量比率进行自动“降解”，其中在反应开始时DHA/SAEP的比例低于2:1(摩尔/摩尔)。在这种方法中，羧基以受限的量引入，允许SAEP的一个或两个游离氨基的随机N-酰化。这个合成程序允许在一锅中同时相伴地合成SSL-X1、SSL-X2和SSL-X3。然后使用用己烷预先调制的氨基丙基(LC-NH2)柱分离并纯化不同的反应产物(SSL-X1、SSL-X2和SSL-X3)。使用下述溶剂系统从所述柱洗脱并收集几个级分。F1(在图2中未示出)：己烷-乙酸乙酯(85:15，v/v)；F2：二异丙基醚-乙酸(9:5，v/v)；F3：丙酮-甲醇(9:1.35，v/v)；F4：氯仿-甲醇(2:1，v/v)；F5：氯仿-甲醇-3.6M乙酸铵水溶液(30:60:8，v/v/v)。SAEP：对照SAEP。将所述不同级分在氮气下蒸发，重悬浮一定体积的氯仿-甲醇(2:1，v/v)中，并施加到TLC上。脂质使用氯仿-甲醇-乙醇-乙酸乙酯-0.25％KCl水溶液(10:4:10:3.6，v/v/v/v/v)来分离，并通过碳化来揭示。结果示出在图2中。
2.化学合成
化合物SSL-X1、SSL-X2和SSL-X3按照下述合成程序来合成：
-O-乙酰化步骤可以中和由在这里充当合成感兴趣分子的基础材料的商品化鞘磷脂的鞘氨醇类碱所携带的羟基。这种O-乙酰化在吡啶和无水乙酸存在下，在室温进行18h。鞘磷脂的两个氨基被取代这一事实阻止了N-乙酰化现象。
-第二步是用非特异性C型磷脂酶(产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens))水解O-乙酰化鞘磷脂，以释放出O-乙酰化神经酰胺。所述O-乙酰化神经酰胺通过在氯仿-甲醇(1:1，v/v)中简单的相分离和添加去离子水来纯化。
-然后将所述纯化的O-乙酰化神经酰胺在与单氯代2-苯二甲酰亚胺基膦酸反应后膦酰化。这个膦酰化反应可以合成O-乙酰基-神经酰胺-(2-苯二甲酰亚胺基乙基)-膦酸酯。
-下一步是O-乙酰基-神经酰胺-(2-苯二甲酰亚胺基乙基)-膦酸酯的肼解。这允许O-乙酰基-神经酰胺-(2-苯二甲酰亚胺基乙基)-膦酸酯的N-脱酰化，同时释放出邻苯二甲酰基。然后将由此产生的O-乙酰化鞘氨醇膦酰乙醇胺通过过滤，在90％乙醇、然后在二异丙基醚中连续结晶，然后用强阳离子交换树脂Amberlite IR120 H处理，进行纯化。然后遵照在上文1.4章节中描述的程序将所述纯化的O-乙酰化鞘氨醇膦酰乙醇胺N-酰化(例如用二十二碳六烯酸)。通过受控碱性甲醇解(甲醇中的0.6N NaOH，在室温下1小时)，将在这个程序期间合成的SSL-X1、SSL-X2和SSL-X3 O-脱乙酰化，然后通过相分离和在氨基丙基柱上的分离进行纯化。
I.2.SSL-Y化合物(n＝1)的合成
SSL-Y1、SSL-Y2和SSL-Y3从作为前体的商品化神经酰胺磷酰基乙醇胺(CPEA)开始，遵照相同的过程来合成。所述合成遵照与用于CEAP的合成相同的程序来进行。为此，将CPEA如章节1.3中所述脱酰化，并将鞘氨醇磷酰基乙醇胺如章节1.4中所述N-酰化(用二十二碳六烯酸)。
I.3.AGPSL-X化合物(n＝0)的合成
用于AGPSL-X的化学合成的程序是基于与用于SSL-X的化学合成相同的合成程序，并具有下述差异：
AGPSL-X2的合成：
-用于合成AGPSL的前体是商品化来源的1,2-二酰基甘油，其在甘油的sn-1位置中优选地用中链饱和脂肪酸(棕榈酸、硬脂酸)酯化。第一个合成步骤包括用单氯代苯二甲酰亚胺基膦酸将1,2-二酰基甘油膦酰化。这个膦酰化反应可以获得1,2-二酰基甘油(2-苯二甲酰亚胺基乙基)膦酸酯。
-第二步包括后一种化合物的肼解，以得到1,2-二酰基甘油膦酰乙醇胺。将1,2-二酰基甘油膦酰乙醇胺溶解在氯仿-甲醇(2:1，v/v)中，并在添加去离子水(氯仿-甲醇的总体积的四分之一)后通过相分离进行纯化。
-第三步包括使用非特异性磷脂酶A2(来自于意大利蜂(Apis millifera)的PLA2)将1,2-二酰基甘油膦酰乙醇胺在甘油的R2位置处脱酰化。所述反应在含有200U磷脂酶A2的二乙醚-硼酸盐缓冲液(100mM，pH 8.9)(1:1，v/v)中，在37℃下搅拌40min来进行。在反应结束时，在氮气下蒸发掉二乙醚，并将样品用氯仿-甲醇(2:1，v/v)萃取。所述脂质通过添加氯仿-甲醇(2:1，v/v)的四分之一体积的去离子水，通过相分离进行纯化。
-然后在第四步中将所述在PLA2水解期间获得的2-溶血,1-酰基甘油膦酰乙醇胺通过氨基丙基柱固相萃取进行纯化。这允许消除在PLA2作用下释放的脂肪酸。
-测定所述纯化的2-溶血,1-酰基甘油膦酰乙醇胺(脂质磷测定法)，并用例如二十二碳六烯酸如章节1.4中对于SSL-X2的合成所述进行N-酰化，从而允许合成AGPSL-X2。
AGPSL-X3的合成：
AGPSL-X3的合成通过在1,3-二环己基碳二亚胺和4-(二甲基氨基)吡啶存在下将AGPSL-X2 O-酰化来进行。然后在氨基丙基柱上纯化AGPSL-X3。
AGPSL-X1的合成：
从在AGPSL-X2合成的第4步期间纯化的1-酰基,2-溶血甘油膦酰乙醇胺开始进行AGPSL-X1的合成。在1,3-二环己基碳二亚胺和4-(二甲基氨基)吡啶存在下将1-酰基,2-溶血甘油膦酰乙醇胺在R2位置中O-酰化，然后在氨基丙基柱上纯化。
I.4.AGPSL-Y化合物(n＝1)的合成
AGPSL-Y2的合成：
从商品化来源的磷脂酰乙醇胺(脑磷脂)开始进行AGPSL-Y的合成。使用非特异性磷脂酶A2(意大利蜂(Apis millifera)PLA2)将该磷脂酰乙醇胺脱酰化。所述反应在含有200U磷脂酶A2的二乙醚-硼酸盐缓冲液(100mM，pH 8.9)(1:1，v/v)中，在37℃下搅拌40min来进行。在反应结束时，在氮气下蒸发掉二乙醚，并将样品用氯仿-甲醇(2:1，v/v)萃取。得到的1-酰基-2-溶血甘油磷酰基乙醇胺通过以氯仿-甲醇(2:1，v/v)体积的四分之一的比例添加去离子水，通过相分离进行纯化，然后在LC-NH2柱上进行固相萃取。使用感兴趣的脂肪酸(例如DHA)的N-酰化在三乙胺存在下，在含有二乙基磷酰基氰化物作为偶联剂的二氯甲烷-二甲基甲酰胺(3:1，v/v)混合物中进行。这个反应在避光和饱和氮气气氛下，在环境温度下搅拌进行90分钟。然后通过过滤、相分离和氨基丙基柱萃取来纯化AGPSL-Y2。
AGPSL-Y3的合成：
然后用感兴趣的脂肪酸(DHA)将所述纯化的AGPSL-Y2在R2"位置处O-酰化，然后在氨基丙基柱上通过固相萃取来纯化。
AGPSL-Y1的合成：
AGPSL-Y1使用如上对于AGPSL-Y2的合成所述的非特异性磷脂酶A2(意大利蜂(Apis millifera)PLA2)，从商品化磷脂酰乙醇胺通过O-脱酰化来合成。然后将得到的1-酰基-2-溶血甘油磷酰基乙醇胺通过固相萃取进行纯化，然后用感兴趣的脂肪酸在R2"位置处O-酰化，以便获得AGPSL-Y1，其最终在氨基丙基柱上进行纯化。
I.5.由SSL和AGPSL的肠内水解产生的代谢产物的合成
使用的合成方法分为两个主要步骤：羟基琥珀酰亚胺化和转氨作用。下面的实施例描述了从作为脂肪酸的DHA开始合成二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯。用于合成任何其他N-酰基乙醇胺膦酸酯的方案使用相应的脂肪酸类似地进行。
DHA的羟基琥珀酰亚胺化步骤如下进行：将DHA(100mg，0.3mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(57.4mg，0.5mmol)在10ml乙酸乙酯中稀释。添加α-生育酚(40μM)以防止潜在的脂肪酸氧化。向前述溶液添加二环己基碳二亚胺(DCC，103mg)在乙酸乙酯(1mL)中的溶液。将所述用氮气饱和的反应混合物在室温下并避光搅拌至少12小时。为了终止反应，使用无灰滤纸过滤出DCC，并将滤液在氮气下结晶。为了获得更好的纯化，将得到的材料溶解在乙醇中，过滤并重结晶。N-羟基琥珀酰亚胺DHA酯的量通过称重来确定：126.3mg。转氨反应如下进行：将所述N-羟基琥珀酰亚胺DHA酯(50mg)在四氢呋喃(10mL)中稀释。将该溶液添加到磷酰化乙醇胺(23.5mg)或乙醇胺膦酸酯(21mg)和碳酸氢钠(14mg)的水性混合物(10mL)。所述反应在室温下，避光，并在氮气饱和气氛下搅拌进行至少16小时。将每种溶液转移到烧瓶，然后用旋转蒸发仪蒸发。在蒸发后，向烧瓶添加50mL H2O，并通过滤纸过滤到新烧瓶中。将每个烧瓶再次蒸发。向蒸发过的烧瓶添加40mL乙醇，再次过滤，然后添加20mL乙醇并过滤最后一次。将这些后面的烧瓶用旋转蒸发仪蒸发并称重，以便定量得到的磷酰化二十二碳六烯酸乙醇胺和膦酰化二十二碳六烯酸乙醇胺质量。向烧瓶添加5mL乙醇2次，并储存在-80℃下。产生的感兴趣分子(二十二碳六烯酸乙醇胺、二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯和磷酰化二十二碳六烯酸乙醇胺)通过反相液相色谱进行纯化。由此，通过质谱(HR-ESI/MS)监测合成的分子。二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯：MS m/z[M+H+]＝436.26；磷酰化二十二碳六烯酸乙醇胺：MS m/z[M+H+]＝452.25。
实施例B：生物学结果
实施例B-1：SSL在消化道中的代谢命运
材料和方法
动物
在我们的实验中使用的大鼠是Sprague Dawley雄性大鼠(Charles River,SaintGermain sur L'Arbresle,法国)，在批准的动物设施收到时～200g，维持在21℃的温度和昼行条件(光照期从06:00至18:00)下。所述大鼠以每个笼子5个个体为一组，随意取用水和食物。所有动物试验程序均符合通过87/848号法令转化成法国法律的欧洲指令86/609。尽一切努力将动物的痛苦和压力降至最低并减少使用动物的数目。动物在到达动物设施后两周使用。
向动物给药SSL
关于SSL在消化道中的命运的研究在SSL-X1上进行。为此，将对应于227μg脂质磷的SSL-X1的等分试样沉积在玻璃试管中。在氮气下蒸发掉溶剂。在添加无水乙醇后进行第二次蒸发。然后向试管添加625μl含葡萄糖的水性溶液(0.1g葡萄糖/mL)。通过轻柔超声处理(在40W功率下两次30s超声处理)使所述分子溶解在所述水性溶液中。使用微量移液器将所述分子经口给药到动物。通过饲管的口服给药并不必要，动物自发饮用呈递给它的溶液。
为了定量SSL在大鼠体内的潜在水解，我们进行了两组不同的实验：
首先我们如前一段中所述将所述分子经口给药到5只大鼠。所述动物之前被放置在各个笼子中。本实验的目的是定量大鼠粪便中可能存在的分子。为此目的，在所述分子给药后不同时间获取粪便。将在每个时间收集的粪便合并，并如下面的段落中所描述的对脂质进行提取和分析。
在第二步中，我们向其他大鼠给药所述分子。然后在所述分子给药后5h、8h、24h和36h处死大鼠。处死通过戊巴比妥的致死(250mg/Kg)腹膜内注射(Dolethal溶液，Vétoquinol,Lure)来实现。在死亡后立即切开腹腔以清除内脏。
取出从幽门区直至肛门的整个肠道。将整套肠道放置在塑料槽中以将组织展开。然后将后者每10厘米左右切断。盲肠也单独收集。将大肠取出并分成两个相等的部分。然后通过用9‰NaCl水溶液冲洗肠腔，除去每个肠段的内含物。将每个肠段的内含物收集在125ml烧瓶中，如下面的段落中所述用于提取和脂质分析。
粪便的脂质分析
脂质从粪便的提取和纯化如下进行：
-按照Folch的方法在50mL氯仿-甲醇(2:1，v/v)中研磨。在4℃下提取脂质24小时。
-将匀浆物在无灰滤纸上过滤。
-通过添加对应于氯仿-甲醇(2:1，v/v)总体积的1/4的0.25％KCl(w/v)水溶液，对所述脂质粗提物进行第一次清洗。
-通过添加对应于初始总体积的1/3的甲醇和对应于氯仿-甲醇(2:1，v/v)总体积的1/4的去离子水，对所述脂质提取物进行第二次清洗。
-使用旋转蒸发仪蒸发有机相。
-在4mL苯-甲醇(2:1，v/v)中回收总脂质两次。然后对所述脂质提取物进行加工，以便分离/纯化SSL-X1分子用于定量。简单来说，将所述脂质提取物皂化并清洗。然后将皂化的提取物直接沉积在10×10cm薄层层析板上。鉴于通过样品提取的脂质的量，脂质沉积在长度为7cm的条上进行。将神经酰胺氨基乙基膦酸酯的等分试样(对应于10微克纯化的磷脂)也平行地沉积在同一块板上作为标准品。
然后在二异丙基醚中分离所述沉积的脂质。这种溶剂用于将所有中性脂质与神经酰胺氨基乙基膦酸酯分离开。在这个系统中，该分子保留在沉积点处，而所有中性脂质(甾类、源自于皂化的脂质产物、胆酸盐)向溶剂前沿迁移。在分离后，将层析板在热空气流下干燥，并将所述板在氯仿-丙酮-甲醇-乙酸-去离子水(50:20:10:15:5，v/v/v/v/v)中展开。在干燥后，使用Dittmer和Lester试剂将板显色，并通过在迁移之前与所述样品平行沉积在板上的标准品鉴定SSL-X1分子的位置。然后将SSL-X1的斑点用剃须刀片刮到试管中，在那里进行样品的矿化。然后进行脂质磷测定。
结果
水解的定量-在笼中收集的粪便的分析
为了确定SSL-X1分子在大鼠消化道中是否高效水解/吸收，我们首先向动物给药特定量(～227μg磷/动物)的所述分子。然后在给药后16、21、26、40和50小时的不同时间点收集笼子中存在的所有粪便。在这些不同时间测量的粪便中SSL-X1的量示出在图3中。
在肠道中原位收集的粪便的分析
为了确定SSL-X1在大鼠肠道中的分布，在所述分子给药后的不同时间将动物处死。然后将整个肠道取出以回收肠腔的内含物。所述内含物的回收在我们在整个肠道上获得的区段(长度～10cm)上进行。在所述获取的每个肠段的内含物上制备的每种脂质提取物上测定SSL-X1。
图4示出了在摄入所述分子后5小时(图4A)、8小时(图4B)和36小时(图4C)处死的大鼠中获得的结果。在分析的所有肠段中检测/测量到神经酰胺氨基乙基膦酸酯。这些观察使得可以显示以下关于SSL-X1的脂解生理学的要点。该分子能够到达结肠。这些观察表明，如果所述分子在消化道中水解/吸收，则一部分神经酰胺氨基乙基膦酸酯能够到达大肠。这表明SSL-X1的肠道水解遵循与对于另一种鞘氨醇磷脂即鞘磷脂所知的相似的路径，尽管这两种分子由于SSL-X1中不存在磷酸酯键而结构不同。
实施例B-2：SSL及其代谢衍生物对神经炎症的影响
B.2.1.SSL和AGPSL的代谢物衍生物对人类来源的活化的小神经胶质细胞细胞系的炎性状态的影响
B.2.1.1.细胞培养
将永生化的人类小神经胶质细胞(IHM；Innoprot,Derio,西班牙)以13,000个细胞/cm2的密度接种在用I型人类胶原蛋白(10μL/mL，包被基质试剂盒，Innoprot)包被的T75瓶中。所述培养基被配制成适合于人类脑源性小神经胶质细胞在体外的最适生长，并含有1％青霉素/链霉素、1％小神经胶质细胞生长增补剂和5％胎牛血清(小神经胶质细胞培养基试剂盒，Innoprot)。
B.2.1.2.炎性反应的时间过程
将IHM接种(10,000个细胞/cm2)在1型胶原蛋白包被的6孔板中。当细胞培养物大约80％合生时，以0.5ng/mL、1.5ng/mL或3.0ng/mL向培养基添加IL-1β(R&D Systems)。在t＝0时，每个孔只接收1mL培养基(对照)或接收1mL含有所需浓度的IL-1β的培养基。在t＝0h、t＝3h、t＝8h和t＝24h时收获细胞。每个测试条件重复一式三份。
B.2.1.3.二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯对炎性标志物的表达的影响
如图5中所示测试了二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯的影响。IHM细胞如段落B.2.1.2中所述进行培养，并且当培养物大约80％合生时，将它们与下述3种浓度(10、150或300nM)中的任一者的二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯温育，3小时后添加IL-1β(3ng/mL，t＝0h)。然后在与IL-1β温育5小时后收获细胞，用于RNA提取。
B.2.1.4.使用RT-qPCR测量感兴趣的mRNA
1.总RNA的提取和纯化
使用Tri-Reagent(MRC,Inc.)，如制造商所推荐的提取总RNA。随后通过用TurboDNA-freeTM试剂盒(Ambion)处理从样品中除去污染的基因组DNA。
2.校准的mRNA的反转录(RT)
使用RT试剂(Ozyme)将包含在480ng纯化的RNA提取物中的信使RNA(mRNA)反转录。为了将RT步骤标准化，向RT反应混合物添加合成的外部且非同源的poly(A)标准RNA(SmRNA；Morales和Bezin，专利WO2004.092414)(在每个实验样品中150,000个拷贝)。
3.感兴趣的cDNA的qPCR扩增
靶cDNA的PCR扩增使用Rotor-Gene Q系统(Qiagen)和QuantiTect SYBR GreenPCR试剂盒(Qiagen)来进行。用于PCR扩增的不同引物对的序列列于表1中。
考虑到在RT步骤之前在所有样品中最初存在相同数目的SmRNA拷贝，将在qPCR后测量到的ScDNA拷贝数用来估算每个样品的RT步骤产率。该产率可以将为从同一样品测量的所有感兴趣的基因获得的值标准化。这种标准化方法可以将样品之间RT效率的变化考虑在内，而无需求助于内部标准品，即其表达被认为是先验不变的所谓的“看家基因”。
表1：
B.2.2.通过脂多糖(LPS)注射在体内诱导神经炎症
首先，我们确定了在LPS注射后可以在幼崽中观察到最大神经炎性反应的时间。为此目的，21日龄Sprague Dawley大鼠(Charles River,St Germain sur l'Arbresle,法国)以1mg/Kg的剂量接受LPS(Sigma，参考号055：B55)的腹膜内注射。该剂量对应于文献中常用的剂量。然后在LPS注射后2、4、6、10和24小时，使用致死剂量的戊巴比妥(250mg/Kg，i.p.)将大鼠处死，并用0.9％NaCl的冰冷溶液经心脏灌注。收集海马体(HI)和新皮层，在液氮中冷冻并储存在-80℃下直至分析。使用表1中示出的引物对，如上所述通过RT-qPCR进行神经炎症的关键标志物的表达水平的分析。这些初步实验事实上允许我们确定在LPS注射后6小时观察到脑炎症的峰值。随后，在LPS后6小时，将接受用于消解LPS诱导的神经炎症的任何治疗的大鼠处死。
所有旨在研究各种炎症标志物的基因表达的研究均分开地分析每个基因，因此难以建立关于炎症状态演变的结论，尤其是当某些基因的表达提高而其他基因的表达保持稳定或降低时。由于qPCR量化给定样本中cDNA的拷贝数，因此我们通过为每个样品开发神经炎症指数(NI)来规避上述困难，所述指数是通过qPCR定量的所有靶向cDNA的总和。然而，在该NI的计算中，我们一直小心地不用在基础条件下以高至极高水平表达的基因的细微表达变化来掩盖在基础条件下以低水平表达的基因的大的表达变化。为此，对于每只大鼠，将每个cDNA的拷贝数以在整个考虑的个体群体中测量到的平均拷贝数的百分比表示。在将每个cDNA以百分比表示后，通过将指数的组成中涉及的每个转录本的百分比相加来计算所述指数。
为了测试SSL和AGPSL的水解产物的影响，我们通过如上所述向大鼠注射LPS来诱导神经炎症。在LPS注射后1分钟，所述动物通过腹膜内注射接受由SSL和AGPSL带来的不同活性成分中的单独一者。
所述活性化合物(二十二碳六烯酸乙醇胺、二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯)以2mg/Kg的二十二碳六烯酸乙醇胺当量的剂量给药。鉴于所述两种分子之间摩尔质量的差异，对二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯的剂量进行调整，以便获得等同于以2mg/Kg给药的二十二碳六烯酸乙醇胺的剂量的以纳摩尔/Kg为单位表示的剂量。在6h(神经炎症指数NI的最佳诱导时间，参见上文)后，将动物处死，取出组织，并通过qPCR确定神经炎症的关键标志物的转录本水平。
B.2.3.在大鼠中SSL-X1的经口给药对癫痫持续状态诱导的神经炎性反应的影响
材料和方法
在这些实验中，如下文(§B.3)中详细描述的，使21日龄Sprague Dawley大鼠(ENVIGO，荷兰)经历毛果芸香碱诱导的癫痫持续状态(SE)。建立了三个大鼠组：(i)CTRL-NaCl，即每次在其他大鼠组中提供治疗时仅接受NaCl的对照大鼠；(ii)SE-NaCl，即经历SE且经口接受NaCl代替SSL-X1的大鼠；(iii)SE-SSL-X1，即经历SE且在SE发作后1h经口给药SSL-X1载体(100mg/Kg)的大鼠。所述载体被溶解在100μL NaCl中。由于它们的疏水性质，将所述制剂乳化，直至所述脂质载体完全溶解。24小时后，使用戊巴比妥的致死注射(250mg/Kg；i.p.)将大鼠处死，并如上所述(§B.2.2)收集并处理脑组织，即海马体(HI)和腹侧边缘区(VLR，其包括杏仁核、梨状和岛叶无颗粒皮质)。使用表1中示出的引物对，如上所述通过RT-qPCR进行神经炎症的关键标志物的表达水平的分析。处死小鼠的时间根据我们的初步实验来选择，所述初步实验允许我们确定在SE发作后7-24小时观察到脑部炎症的高峰。
结果
二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯对活化的小神经胶质细胞细胞系表达的炎性标志 物的影响
结果显示，在永生化人类小神经胶质细胞中，当将细胞用150nM和300nM二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯预处理时，IL-1β介导的对细胞因子和和趋化因子基因的诱导急剧减少(图6)。
二十二碳六烯酸乙醇胺和二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯这两种SSL和AGPSL的代 谢物衍生物对脂多糖(LPS)注射在体内诱导的神经炎性反应的影响
结果显示，当以2mg/Kg的剂量给药时，二十二碳六烯酸乙醇胺和二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯部分阻止LPS介导的对编码神经炎性标志物的转录本的诱导。值得注意的是，二十二碳六烯酸乙醇胺和二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯将在海马体和新皮层两者中测量到的神经炎性指数分别降低≈50％和≈70％(图7)。
在大鼠中SSL-X1的经口给药对针对癫痫持续状态的神经炎性反应的影响
图8中呈现的结果显示，在大鼠中毛果芸香碱诱导的癫痫持续状态(SE)后24h，在海马体和腹侧边缘区两者中编码MCP1、IL6和环加氧酶-2(COX-2)的转录本强烈增加。在SE发作后1h以100mg/Kg的剂量经口给药SSL-X1部分阻止了针对SE的神经炎性反应的关键标志物的这种强烈诱导。
B.2.4.在大鼠来源的活化的巨噬细胞细胞系中SSL和AGPSL的代谢物衍生物对IL-6 mRNA水平的影响
B.2.4.1.细胞培养、处理和RT-qPCR
将NR8383细胞以53,000个细胞/cm2的密度接种在T75瓶中，培养基由增补有1％青霉素/链霉素和15％胎牛血清的Ham’s F12K培养基构成。当它们达到合生时，将它们用浓度为100ng/mL的LPS(Sigma，参考号055：B55)处理，并在此后不到2min内，用下述条件之一处理：10、100、500或1,000nM的DECA-EA-Pn，或10、100、500或1,000ng/mL的EPA-EA-Pn。在5小时后收获细胞，并使用表1中列出的引物，如B.2.1.4中所述通过RT-qPCR测量IL-6 mRNA的水平。
B.2.4.2.结果
在以前的研究中，我们确定了NR8383细胞中IL6-mRNA水平的明显峰值出现在LPS(100ng/mL)处理后5小时。因此，我们测试了DECA-EA-Pn和EPA-EA-Pn对LPS处理后5小时的IL-6 mRNA水平的影响(图21)。结果显示，IL-6 mRNA水平的诱导被DECA-EA-Pn和EPA-EA-PN显著降低。
B.2.5.在大鼠中SYN和SYN-Pn对毛果芸香碱诱导的癫痫持续状态(Pilo-SE)后炎症的消解的影响
B.2.5.1.方法
使雄性Sprague-Dawley大鼠(Envigo,荷兰)在42日龄(185g)时经历Pilo-SE。在用于减轻毛果芸香碱的外周副作用的东莨菪碱甲基硝酸盐(1mg/kg，s.c.)给药后30min，通过毛果芸香碱盐酸盐(350mg/kg,i.p.)引发SE。在2h的连续SE后，向大鼠给药地西泮(10mg/kg，i.p.)以停止SE，然后立即用300μL NaCl中的SYN(2mg/kg，i.p.)、SYN-Pn(2mg/kg，i.p.)治疗。经历Pilo-SE的未治疗的大鼠用300μL NaCl(i.p.)代替SYN或SYN-Pn进行注射。在第一次地西泮给药后1h，所有大鼠接受第二次地西泮给药(5mg/kg，s.c.)，并在SE后9h处死。收集脑，将海马体在冰上显微解剖，提取RNA，并如上所述使用表1中示出的引物对进行RT-qPCR。大鼠被处死的时间根据我们的初步实验来选择，所述初步实验允许我们确定在SE发作后7-12小时观察到脑部炎症的峰值。
B.2.5.2.结果
2mg/kg的SYN和SYN-Pn两者均降低响应于Pilo-SE的IL1β诱导。SYN-Pn对TNFα-mRNA诱导具有显著影响。当如上所解释的将IL1β和TNFα两者的变动整合在指数中时，SYN-Pn在降低Pilo-SE后炎性反应的峰值方面具有提高的效果(图22)。
实施例B-3：SSL/AGPSL代谢衍生物对认知的影响
I.1.材料和方法
动物
在这个实验中，我们使用雄性Sprague-Dawley大鼠(ENVIGO，荷兰)。幼崽在14日龄(出生后第14天(P14))时与它们的养母一起接收，以10只一组维持在塑料笼(405mm x255mm x 197mm)中，自由取用食物和水。所有动物程序符合University Claude BernardLyon1的动物护理和使用委员会的指导方针。
毛果芸香碱诱导的癫痫持续状态(Pilo-SE)
所有注射液在无菌盐水(0.9％w/v)中制备。在断奶时(出生后第20天(P20))，将Sprague-Dawley雄性大鼠幼崽首先用氯化锂(127mg/Kg；Sigma-Aldrich)i.p.注射，以降低引发癫痫持续状态(SE)所需的毛果芸香碱的剂量。18h后s.c.注射东莨菪碱甲基硝酸盐(1mg/Kg；Sigma-Aldrich)，以减轻外周胆碱能不良副作用。30min后i.p.注射毛果芸香碱盐酸盐(25mg/Kg；Sigma-Aldrich)，以诱导SE。在30min的连续行为性SE后，以10mg/Kg的剂量i.p.注射地西泮(Roche)，以促进存活并开始停止行为性癫痫发作，其在90min后以5mg/Kg的剂量提供的地西泮的第二次s.c.注射后完全停止。将大鼠置于加热垫上，保持连续观察，直至它们从镇静状态恢复过来。在恢复后，将大鼠送回养母身边，直至P23。对照大鼠仅接受盐水注射。然后将所有大鼠每组10只饲养，并在随后的5天内每天称重以控制食物摄入量，然后每周两次称重直至实验结束(SE后三周)。将SE后第二天体重不增加的大鼠用致死剂量的dolethal(250mg/Kg；Vétoquinol,法国)处死。
Morris水迷宫(MWM)测试
在SE后5周通过Morris水迷宫(MWM)测量空间学习能力。训练装置是含有24℃的水的圆形白色水池(直径120cm)，通过添加黑色水粉颜料使其变得不透明。平台(直径10cm)被浸没在水面下1cm。所述水池被分为4个虚拟象限：北、东、南和西。平台隐藏在北象限内。进行了四场实验(每天每场进行三次试验)。在第一次试验中，将大鼠在平台上放置60秒。允许大鼠搜寻平台90秒。如果大鼠在90秒内没有找到平台，则将它们轻柔地引导到平台。所有大鼠都被允许在平台上停留15秒。
电生理学
急性切片制备和全细胞记录
在P28-38，将Sprague-Dawley大鼠用异氟烷麻醉，取出前脑并置于冰冷的标准人工脑脊液(ACSF)中，其包含(以mM为单位)：124 NaCl，5 KCl，1.25 Na2HPO4，2 MgSO4，2CaCl2，26 NaHCO3，增补有10 D-葡萄糖，并用95％O2和5％CO2鼓泡。使用振动切片机(LeicaVT1000S)将海马体横向切片切成350μm厚的切片，在ACSF中在室温下温育至少1小时，然后转移到记录室。用于灌注的ACSF补充有木防己苦毒素(100μM；Sigma-Aldrich)，以阻断GABA-A受体，并因此促进NMDA受体依赖性长期增强(LTP)的诱导。将CA1锥体细胞用配备X40物镜的Zeiss Axioskop 2，使用红外视频显微镜和差分干涉对比光学元件进行观察。来自于CA1层中锥体神经元的全细胞记录使用贴片电极来获得，所述电极填充有含有下述组分(以mM为单位)的溶液：120葡萄糖酸钾，20 KCl，0.2 EGTA，2 MgCl2，10 HEPES，4 Na2ATP，0.3 Tris-GTP和14mM磷酸肌酸(pH 7.3，用KOH调节)。药物被施加在海马体切片浴中。电极电阻在3-5MΩ的范围内。连续监测串联电阻，并且如果其变化>20％，则放弃实验。
将装有ACSF并连接到Iso-Flex刺激隔离装置(A.M.P.I.)的毛细管玻璃移液管置于放射层中，以在CA1锥体神经元中激发兴奋性突触后电位(EPSP)。将细胞保持在-70mV，以记录EPSP，并设置刺激强度以唤起5-8mV之间的EPSP。LTP由θ脉冲配对(TBP)方案诱导，所述方案包括将EPSP与单一反向传播动作电位(b-AP)配对，进行定时以使b-AP(～15ms延迟)发生在细胞体中测量到的EPSP的峰值时。单个脉冲含有以100Hz发送的五对，并且每次扫描以5Hz发送十个脉冲。以10秒的间隔发送3次扫描，总共30个脉冲(150个b-AP-EPSP对)。b-AP由直接体细胞电流注入(1ms，1-2nA)引发。这种诱导方案始终在实现全细胞配置的20min内应用，以避免LTP的“洗脱”。
电生理数据获取和分析
EPSP在全细胞电流钳(Multiclamp 700B，Molecular Devices)中记录，以5kHz过滤并以10kHz数字化(Digidata 1440A，Molecular Devices)。使用pClamp 10软件(Molecular Devices)获取和分析数据。为了产生LTP概要时间过程图，将各个实验归一化到基线，并对三个连续响应进行平均以产生1分钟的箱。然后对组内所有实验的分箱时间过程进行平均以生成最终图表。在TBP方案结束后36-40分钟的归一化EPSP振幅的基础上计算LTP的幅度。
药物
将N-二十二碳六烯腺乙醇胺(二十二碳六烯酸乙醇胺，Cayman Chemical，法国)、二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯、二十二碳六烯酸乙醇胺磷酸酯、二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸乙醇胺膦酸酯(EPA-EA-Pn)、癸酸乙醇胺膦酸酯(DECA-EA-Pn)和SSLX2溶解在盐水(NaCl 0.9％)中。对于体内实验来说，药物在SE停止后1h，然后在6天内每天，然后在2周内每隔一天i.p或经口给药一次。对照组仅接受盐水。对于离体实验来说，分子被添加在灌注浴中。
统计分析
统计分析使用SigmaPlot软件12版进行。使用配对学生t-检验确定同一途径中数据的显著性。使用Mann-Whitney U检验确定数据组之间的显著性。对于MWM测试来说，数据通过双向重复测量ANOVA然后是Fisher LSD事后检验进行分析，以比较几个时间点的组之间的差异。
结果被表示为平均值±SEM。p值<0.05被认为具有统计学意义。
I.2.结果
尽管在癫痫持续状态(SE)后可能出现多种神经心理缺陷，但认知障碍是癫痫患者报告的主要常见问题，记忆缺损也经常被报告，尤其是颞叶癫痫(TLE)患者以及动物模型中。由于LTP这种据信反映了海马体中学习和记忆形成过程的突触可塑性形式在患有癫痫的人和癫痫动物模型两者的海马体神经元中被显著废除，因此LTP的损伤被认为是构成癫痫中学习缺陷的基础的重要细胞机制。因此，毛果芸香碱诱导的实验性TLE模型被用于研究二十二碳六烯酸乙醇胺、二十二碳六烯酸乙醇胺磷酸酯和二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯对海马体LTP的影响。
二十二碳六烯酸乙醇胺挽救毛果芸香碱诱导的癫痫持续状态后的海马体LTP缺损
海马体LTP这种突触强度的活性依赖性变化，已被提出作为构成学习和记忆的基础的细胞机制。我们最近的研究表明，在毛果芸香碱诱导的癫痫持续状态(Pilo-SE)后海马体LTP发生改变。在这项研究中，我们通过使用来自于CA1锥体神经元的全细胞记录，在毛果芸香碱诱导的SE(Pilo-SE)后1-2周制备的急性海马体切片中证实了这些结果。尽管从对照健康动物制备的切片中的对照神经元表现出稳健的LTP(图9A；诱导后36–40min为基线的162.3±5.8％，p<0.001)，但在从经历Pilo-SE的大鼠制备的切片中LTP被显著抑制(图9A；109.6±6.1％；t＝45-50min；p＝0.13)。两个大鼠组之间LTP幅度的差异极为显著(p<0.001)。
然后我们调查了二十二碳六烯酸乙醇胺灌注是否可以逆转Pilo-SE诱导的LTP缺损。我们显示，与仅用ACSF灌注的Pilo-SE切片相比，二十二碳六烯酸乙醇胺浴的使用(100nM)显著增强LTP诱导(图9B；166.8±12.2％，t＝45-50min，p<0.001)(p<0.001)。同样地，与仅用ACSF灌注的Pilo-SE切片相比，在从经历Pilo-SE的大鼠制备的切片的浴中施加400nM二十二碳六烯酸乙醇胺显著增加LTP诱导(164.2±20.5％；t＝45-50min；p＝0.014)(图9C；p＝0.008)。有趣的是，在用100nM或400nM二十二碳六烯酸乙醇胺灌注的Pilo-SE切片中测量到的LTP幅度与对照健康大鼠相近(图9B-C，p>0.05)。
接下来，我们研究了二十二碳六烯酸乙醇胺的体内影响。因此，我们调查了在经历Pilo-SE的大鼠中，在SE后第0天(SE后1h)至第7天每天进行二十二碳六烯酸乙醇胺治疗(2mg/Kg；i.p)是否可以保护LTP诱导。对照大鼠接受盐水代替二十二碳六烯酸乙醇胺。我们发现，用二十二碳六烯酸乙醇胺注射的大鼠与它们的用盐水注射的对应体相比(p<0.001)，在海马体CA1神经元中表现出LTP的显著诱导(图9D；189.7±11.4％，t＝45-50min；p<0.001)。这些发现揭示出在癫痫发生期间海马体LTP的损伤可以通过二十二碳六烯酸乙醇胺治疗来挽救或阻止。
接下来，我们调查了在经历Pilo-SE的大鼠中，5和10mg/Kg二十二碳六烯酸乙醇胺的腹膜内给药是否可以保护LTP诱导。同样地，我们证实了与经历Pilo-SE并用盐水注射的大鼠相比，在从经历Pilo-SE并用5mg/kg二十二碳六烯酸乙醇胺注射的大鼠制备的切片中LTP诱导显著增强(151.54±7.15％，t＝45-50min；p<0.001)(图9E；p<0.01)。此外，我们揭示出与用盐水注射的Pilo-SE大鼠相比，用10mg/kg二十二碳六烯酸乙醇胺治疗经历Pilo-SE的大鼠显著提高LTP诱导(195.2±8％；t＝45-50min；p<0.001)(图9E；p<0.001)。
二十二碳六烯酸乙醇胺磷酸酯挽救毛果芸香碱诱导的癫痫持续状态后的海马体 LTP缺损
本发明人合成了二十二碳六烯酸乙醇胺相关化合物二十二碳六烯酸乙醇胺磷酸酯，其比二十二碳六烯酸乙醇胺水溶性更高。迄今为止，二十二碳六烯酸乙醇胺磷酸酯尚未被表征过，并且它的生物活性从未被调查过。因此，我们测试了二十二碳六烯酸乙醇胺磷酸酯在使用与上述用于二十二碳六烯酸乙醇胺的相似的方案在Pilo-SE后给药时，对海马体突触可塑性的体外和体内影响。我们发现与二十二碳六烯酸乙醇胺相似，与仅用ACSF灌注的Pilo-SE切片相比，在从经历Pilo-SE的大鼠制备的切片的浴中使用二十二碳六烯酸乙醇胺磷酸酯(100nM)显著增强LTP诱导(144.5±9.39％；t＝45-50min；p＝0.002)(图10A，p＝0.007)。同样地，与仅用ACSF灌注的Pilo-SE切片相比，在从经历Pilo-SE并用400nM二十二碳六烯酸乙醇胺磷酸酯灌注的动物制备的切片中LTP诱导也被逆转(150.4±15.4％，t＝45-50min；p＝0.01)(图10B，P＝0.046)。
接下来，我们评估了从经历Pilo-SE并用二十二碳六烯酸乙醇胺磷酸酯(5mg/Kg；i.p)注射的大鼠制备的切片中的LTP幅度。我们发现与经历Pilo-SE并用盐水注射的大鼠相比，在这些动物中LTP诱导被显著增强(162.3±10.8％，t＝45-50min；p<0.001)(图10C，p<0.001)。相反，在从二十二碳六烯酸乙醇胺磷酸酯治疗的大鼠和健康对照动物获得的切片中监测到的LTP的幅度不存在显著差异(p＝0.494)，指示了二十二碳六烯酸乙醇胺磷酸酯与二十二碳六烯酸乙醇胺相同的恢复和逆转Pilo-SE后LTP的能力。
接下来，我们评估了从经历Pilo-SE并用2mg/kg二十二碳六烯酸乙醇胺磷酸酯注射(i.p.)的大鼠制备的切片中的LTP幅度。我们揭示出与用盐水注射的Pilo-SE大鼠(p<0.001)相比，2mg/kg的二十二碳六烯酸乙醇胺磷酸酯治疗显著增强LTP诱导(图10D，168.9±7.1％；t＝45-50min；P<0.001)。这些发现揭示出在癫痫发生期间海马体LTP的损伤可以通过二十二碳六烯酸乙醇胺磷酸酯治疗来挽救或阻止。
二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯挽救毛果芸香碱诱导的癫痫持续状态后的海马体 LTP缺损
本发明人还合成了一种不可水解的二十二碳六烯酸乙醇胺衍生物二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯。与二十二碳六烯酸乙醇胺磷酸酯相同，二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯尚未被表征，并且它的生物活性也从未被调查过。因此，我们探索了在经历Pilo-SE的大鼠中二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯对海马体LTP诱导的体外和体内影响。我们发现，尽管在从经历Pilo-SE的大鼠制备的切片中LTP被阻断，但在用二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯(100nM)灌注的相同切片中神经元表现出稳健的LTP(图11A，132.2±5.01％；t＝36-40min；p<0.001)。当用400nM二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯灌注从经历Pilo-SE的大鼠制备的切片时，LTP幅度明显更高(159.9±10.7％，t＝45-50min；P<0.001)(图11B)。
此外，我们揭示出与用盐水注射的Pilo-SE大鼠相比，二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯治疗(5mg/Kg；i.p)显著增强LTP诱导(图11C，162.4±11.9％；t＝45-50min；P<0.001)(p<0.001)。在Pilo-SE大鼠中测量到的LTP幅度与对照健康大鼠相近(p＝0.726)。合在一起，我们的数据揭示出在癫痫发生期间海马体LTP的损伤可以通过二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯治疗来阻止或挽救。
接下来，我们探索了从经历Pilo-SE并用2或10mg/kg二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯注射(i.p)的大鼠制备的切片中的LTP幅度。我们证实了用2mg/kg二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯注射的大鼠与它们的用盐水注射的对应体相比(p<0.001)，在海马体CA1神经元中表现出显著的LTP诱导(图11D；183.07±9.02％，t＝45-50min；p<0.001)。此外，我们发现与经历Pilo-SE并用盐水注射的大鼠相比，在从用10mg/kg二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯注射的大鼠制备的切片中LTP诱导显著增强(162.78±12.23％，t＝45-50min；p<0.001)(图11D，p<0.001)。
最后，我们调查了在经历Pilo-SE的大鼠中口服给药10、30和100mg/kg的二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯是否可以保护LTP诱导。我们揭示出在从经历SE并用10mg/kg二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯治疗的大鼠制备的切片中，LTP诱导仍然受损(图11E，110.7±4.7％；t＝45-50min；p＝0.041)。事实上，这个组的LTP幅度与在健康大鼠的海马体切片中记录到的有极大不同(p<0.001)，但与经历Pilo-SE并接受盐水的大鼠相近(p＝0.79)。然而，我们揭示出与接受盐水的Pilo-SE大鼠相比(p＝0.007)，使用30mg/kg二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯的治疗显著增强LTP诱导(图11E，146.16±10％；t＝45-50min；P<0.001)。我们还发现，接受100mg/kg二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯的大鼠与它们的用盐水注射的对应体相比(p<0.001)，在海马体CA1神经元中表现出LTP的显著诱导(图11E；162.6±9.2％，t＝45-50min；p<0.001)。这些发现第一次揭示出二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯药剂的口服给药剂量依赖性地防止SE后的海马体LTP损伤。
总而言之，这是二十二碳六烯酸乙醇胺、二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯和二十二碳六烯酸乙醇胺磷酸酯针对与癫痫相关的认识缺损(LTP损伤)的保护作用的第一次证明。
二十二碳六烯酸乙醇胺和二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯在健康大鼠中改善海马 体LTP诱导
我们的下一个目标是研究在健康大鼠中二十二碳六烯酸乙醇胺或二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯治疗是否可以改善海马体LTP诱导。因此，我们首先探索了在从用二十二碳六烯酸乙醇胺注射的健康大鼠制备的切片中LTP的幅度。我们发现用二十二碳六烯酸乙醇胺注射的大鼠(2mg/Kg；i.p)与它们的用盐水注射的对应体相比(p<0.01)，在海马体CA1神经元中表现出显著的LTP诱导(图12A；211.9±15.14％；t＝45-50min；p<0.001)。此外，我们显示了与用盐水注射的对应体相比(p<0.001)，在健康大鼠中二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯治疗实质性提高LTP诱导(212.11±12.9％；t＝45-50min；p<0.001)。
总而言之，这也是二十二碳六烯酸乙醇胺和二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯在健康对象中通过调节海马体LTP来改善认知功能的有益作用的第一次证明。
在癫痫大鼠中二十二碳六烯酸乙醇胺和二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯治疗防止 学习受损
在这些实验中，我们研究了在SE后的早期阶段通过二十二碳六烯酸乙醇胺和二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯治疗产生的LTP诱导的保护是否也保护癫痫发作后(SE后5周)的空间学习。如图15中所示，所有4个组在4天的测试期间表现出水迷宫表现的改善，从第1天到第4天到达平台的延迟时间减少。对照健康大鼠的表现明显好于癫痫大鼠(图15A，p<0.001)。在SE后发生癫痫的大鼠中，在SE后第一周中用二十二碳六烯酸乙醇胺治疗显著提高了空间学习获取能力(图15B，p<0.01)。这种效应通过与用盐水注射的癫痫动物相比，在二十二碳六烯酸乙醇胺治疗的大鼠中在试验第2天和第4天找到平台的延迟时间增加来表征。此外，与用盐水注射的动物相比使用二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯的治疗增加了找到平台的平均延迟时间，这只在试验第2天和第4天观察到(图15C，p<0.05)。因此，这些数据揭示出在SE后的早期阶段用二十二碳六烯酸乙醇胺或二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯治疗，阻止了癫痫发作后的学习缺损。
在癫痫持续状态后的大鼠中二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯促进体重减轻的恢复.
大鼠在第0天经历毛果芸香碱诱导的癫痫持续状态，并在7天内每天给药(10mg/Kg，i.p)二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯(SynPn)。每天测量动物的体重。结果描述在图20中。结果被表示成第0天的动物体重的百分数(10-15只动物/组)。在对照/SE+NaCl之间(*：p<0.05，***：p<0.001)和SE+NaCl/SE+SynPn之间(#：p<0.05)存在统计学差异。
二十二碳六烯酸的口服给药不阻止癫痫持续状态后海马体LTP的受损
二十二碳六烯酸乙醇胺是DHA的一种内源代谢物。然而，二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯是一种不可水解的二十二碳六烯酸乙醇胺衍生物。在这个实验中，我们调查了以等同于100mg/kg二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯的剂量口服给药二十二碳六烯酸(DHA)，是否可以像二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯一样在经历Pilo-SE的大鼠中保护LTP诱导。我们发现，接受DHA的大鼠在海马体CA1神经元中表现出轻微的LTP诱导(图16；129.5±10.2％，t＝45-50min；p＝0.011)。然而，与经历Pilo-SE并接受盐水的大鼠相比，来自于这些动物的切片中EPSP幅度的增强在统计上不显著(p＝0.214)。这些发现证实了与二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯不同，以100mg/kg口服给药DHA不能挽救Pilo-SE后的海马体LTP缺损。这些数据还揭示出在经历SE的大鼠中，在增强LTP诱导方面二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯比DHA更加有效(令人震惊的效果)。
合在一起，这些数据表明二十二碳六烯酸乙醇胺及其相关化合物为与神经和/或神经变性疾病、特别是癫痫相关的认知损伤的治疗，提供了新的可能。
SSLX2的口服给药阻止了癫痫持续状态后的海马体LTP损伤
为了确定通过SSLX2脂质载体递送的二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯的益处，将二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯的口服给药对LTP的影响与递送相同量的活性成分的SSLX2进行比较。我们以前证实了二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯药剂的口服给药剂量依赖性地阻止SE后的海马体LTP损伤。接下来我们调查了SSLX2的口服给药(以等同于10和30mg/kg二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯的剂量给药)是否也可以在经历Pilo-SE的大鼠中保护LTP诱导。我们证实了接受10mg/kg的SSLX2的大鼠在海马体CA1神经元中表现出轻微的LTP诱导(图17A-B；135.6±9.9％，t＝45-50min；p＝0.003)。然而，与经历Pilo-SE并接受盐水的大鼠(p＝0.07)或在健康动物的海马体切片中记录到的结果(p＝0.07)相比，来自于这些动物的切片中EPSP幅度的增强在统计上没有差异。此外，这种LTP的量大于在来自于用相同剂量(10mg/kg)的二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯注射的大鼠的切片中所诱导的量，但没有统计学差异(图17B；P＝0.128)。引人注目的是，在从经历Pilo-SE并接受30mg/kg SSLX2注射的大鼠制备的切片中，LTP幅度明显更高(172.9±6.5％，t＝45-50min；P<0.001)(图17A和C)。事实上，与在来自于接受盐水溶液(图17C；P<0.001)或等同剂量的二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯(图17C；P＝0.46)的Pilo-SE大鼠的切片中记录到的结果相比，这种LTP的幅度是统计学显著的。这些发现证实，与二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯相同，SSLX2药剂的口服给药剂量依赖性地阻止SE后的海马体LTP损伤。这些数据还揭示出与单独的二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯相比，当二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯以SSLX2形式递送时，它对经历SE的大鼠中LTP诱导的影响被增强(令人震惊的效果)。
二十碳五烯酸乙醇胺膦酸酯和癸酸乙醇胺膦酸酯两者阻止SE后的海马体LTP损伤
SSLX2载体可以递送含有DHA的二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯。根据结合在R3位置处的脂肪酸的身份，它也可以递送其他潜在的二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯样活性成分。因此，我们测试了含有短/中脂肪酸链(癸酸(C10))或其他长链PUFA(二十碳五烯酸(C20:5w3))代替DHA(存在于二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯中)的二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯样化合物对海马体LTP诱导的潜在影响。为此，本发明人按照在实施例A的章节I.5.中公开的方案，合成了癸酸乙醇胺膦酸酯(DECA-EA-Pn)和EPA乙醇胺膦酸酯(EPA-EA-Pn)。迄今为止，这些分子尚未被表征，并且它们的生物活性从未被调查过。因此，我们调查DECA-EA-Pn和EPA-EA-Pn两者当在Pilo-SE后以与上述用于二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯相似的方案给药时，对海马体LTP的体内(i.p.)影响。我们揭示出与经历Pilo-SE并用盐水注射的大鼠相比，在从用DECA-EA-Pn(5mg/kg)注射的大鼠制备的切片中LTP诱导被增强(130.3±7％，t＝45-50min；p<0.001)(图18，p＝0.038)。此外，我们还证实了与经历Pilo-SE并用盐水注射的大鼠相比，在从经历Pilo-SE并用5mg/kg EPA-EA-Pn注射的大鼠制备的切片中LTP诱导被显著增强(154.4±12.1％，t＝45-50min；p<0.001)(图18，p＝0.006)。总的来说，这些发现揭示出与二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯相同，使用可以通过SSLX2载体递送的癸酸乙醇胺膦酸酯或EPA乙醇胺膦酸酯的治疗也可以在经历Pilo-SE的大鼠中阻止海马体LTP的损伤。
实施例B-4：二十二碳六烯酸乙醇胺膦酸酯(SYN-PN)对癫痫发作的影响
点燃模型是目前被抗癫痫发作药物发现计划(Anti-Seizure Drug(ASD)discovery programs)使用的一种慢性癫痫模型(等，2011,Seizure 20,359-368)。
1.材料和方法
所有动物程序均符合管理动物实验的欧盟(指令2010-63)的指导方针，并得到Claude Bernard Lyon 1大学伦理委员会批准。在这些实验中使用雄性Sprague-Dawley大鼠(Envigo,法国)。它们被饲养在控温房(23±1℃)中和昼行光照条件(在6a.m至6p.m开灯)下。大鼠在实验开始之前15天到达。将它们每组2只维持在包含最低环境富集(筑巢纸板材料，生长用木棍)800cm2塑料笼中，并自由取用食物和水。
对于点燃电极的手术植入来说，将体重为220-240g的大鼠用异氟烷(5％诱导；2％维持)麻醉，并用镇痛药丁丙诺啡(0.050mg/kg，i.m.)处理。将它们的头部放置在立体定位器中，将门牙棒设置在-3.3mm处。在左顶骨、右额骨和枕骨中钻孔用于放置三个不锈钢钟表螺钉，并在用于杏仁核点燃的电极的植入部位上方钻孔。这种刺激和记录电极由特氟龙隔离的双极不锈钢电极构成，瞄准右侧杏仁核基底外侧(相对于前囟的立体坐标：前-后，-2.8mm；横向，+4.8mm；背-腹侧，-8.5mm)。放置在顶叶皮层和额叶皮层上方的螺钉充当记录电极，放置在小脑上方的螺钉充当接地电极。双极电极、记录电极和接地电极被连接到用牙科丙烯酸粘固剂锚定到颅骨的插头上。
通过点燃电极进行的电刺激在手术后1周的恢复期后开始，并在每天的相同时间(9:00至11:00A.M.之间，然后是4:00至6:00P.M.之间)进行以避免动物间的日内差异。每天两次给予恒流刺激(500μA，双相方波脉冲，50个脉冲/s，持续2s)，直至引发至少5次完全点燃的癫痫发作(继发性全身性5期癫痫发作)。癫痫发作严重程度根据Racine量表在行为上分类：1期，不动，轻微面部阵挛(闭眼、鼻毛抽搐、嗅探)；2期，点头，伴有更严重的面部阵挛；3期，一个前肢阵挛；4期，用后肢站立，常伴有双侧前肢阵挛；5期，强直-阵挛癫痫发作，伴有失去平衡和跌倒。
为了评估SYN-PN对癫痫发作严重程度的影响，在盐水中制备SYN-PN，并在完全点燃大鼠中在电刺激之前45min，以5、10或50mg/kg的剂量腹膜内注射。简单来说，在上一次5期癫痫发作后当天即第1天，大鼠接受第一剂SYN-PN(5mg/kg)，并在45分钟后刺激。在D2和D5，在没有SYN-PN注射的情况下对它们进行刺激，以评估5mg/kg剂量的残留效果。在D6，它们接受第二剂SYN-PN(10mg/kg)，并在45分钟后刺激。然后在D7和D8对它们进行刺激，以评估10mg/kg剂量的残留效果。在D9，大鼠接受第三剂SYN-PN(50mg/kg)并在45分钟后刺激。然后在D10和D11对它们进行刺激，以评估50mg/kg剂量的残留效果。最后，它们1)从D12至D15以5mg/kg的剂量每日接受SYN-PN药剂，并在D16刺激；2)从D19至D22以10mg/kg的剂量每日接受SYN-PN药剂，并在D23刺激；并且3)从D26至D29以20mg/kg的剂量每日接受SYN-PN药剂，并在D30刺激。然后停止治疗。然而，为了评估这一系列治疗的效果的持久性，在以20mg/kg的剂量最后一次治疗后7、15、42和56天，继续对大鼠进行刺激。
2.结果
在D0天之前，所有纳入的大鼠(n＝15)发生至少5次连续的5期癫痫发作。在观察大鼠总群体时(图13A)，它们在D0发生4期(n＝1)或5期(n＝14)癫痫发作。
在D1时，所有大鼠在被刺激之前45min接受5mg/kg的SYN-PN，并且平均癫痫发作严重程度降低19.0±7.9％。有趣的是，在D2时癫痫发作严重程度的平均降低维持在-23.1±8.1％，因此达到显著(p＝0.019)。这种暂时效果在D5失去。下一天即D6，大鼠接受更高剂量的SYN-PN(10mg/kg)，并且在45分钟后引发的癫痫发作的严重程度与D0时没有显著差异。然而，在这种剂量下也观察到延迟效果：第二天和第三天，与D0相比所述降低变得显著(p<0.001)，最多达到-39.4±11.1％。在D9时将SYN-PN剂量提高到50mg/kg，加强了D10时癫痫发作严重程度的降低，与D0相比达到-54.4±9.4％(p<0.001)，但与D8相比不显著。最后，从D12至D14停止刺激，同时维持所测试的SYN-PN的最低每日剂量(5mg/kg)，随后在D16癫痫发作严重程度保持在最低水平(与D0相比-42.0±9.2％；p<0.001)。
SYN-PN给药影响的个体检查揭示了3组大鼠：响应于5mg/kg(8/15；图13B)、10mg/kg(3/15；图13C)或50mg/kg(4/15；图13D)的大鼠。
对于响应于5mg/kg剂量的大鼠来说(图13B)，在给药当天观察到癫痫发作严重程度的降低(与D0相比-36.4±11.7％；p<0.001)；然而，最大的降低在10mg/kg剂量后2天观察到(与D0相比-62.3±12.7％；p<0.001)。引人注目的是，从D12至D14停止刺激并同时维持5mg/kg SYN-PN的每日剂量，随后在D16观察到癫痫发作严重程度的甚至更大的降低(与D0相比-87.0±13.0％；p<0.001)，其中7/8的大鼠保持在0期，1/8的大鼠回到5期。
对于响应于10mg/kg剂量的大鼠来说(图13C)，所述降低的强度更加可变，导致观察到的效果与D0没有显著差异。然而，在将SYN-PN剂量降低到5mg/kg共4天后，即使在D16也维持了严重程度的降低。
对于响应于50mg/kg剂量的大鼠来说(图13D)，所述降低的强度也过于可变而不能观察到与D0相比的显著效果。然而，在将SYN-PN剂量降低到5mg/kg共4天后，癫痫发作降低仅仅是暂时的并在D16丧失。
在以任何剂量给药SYN-PN后，在所有情况下均观察到对癫痫发作严重程度的最大影响延迟24至48小时。当在遵照所测试每种剂量的三组大鼠中比较该最大效果时，由最小剂量产生的严重程度降低并没有被更高的剂量放大(图14)。
在测试了5mg/kg的每日剂量连续4天(D12至D15)的效果后(图13)，使用相同的给药方案测试了10mg/kg、然后是20mg/kg的剂量的效果。最后，当治疗停止时，我们检查了对癫痫发作不出现或癫痫发作严重程度的保护效果是否维持，并且如果维持的话，它是否是长期持续的效果。图19示出了3组大鼠中的每一组在最后一剂50mg/kg时观察到的效果(黑色条)，然后是4次5mg/kg的每日剂量后，然后是4次10mg/kg的每日剂量后和4次20mg/kg的每日剂量后观察到的效果(阴影条)，最后是治疗停止7、15、42和56天后的癫痫发作严重程度(点状条)。紧靠x-轴下方也列出了在所指示的疗程中没有癫痫发作的大鼠的数目。
对于从第一次给药起对5mg/kg的剂量有响应的大鼠组来说，将每日剂量从5提高到10、然后提高到20mg/kg，不改变平均癫痫发作严重程度。
然而，有趣的是注意到与10mg/kg的剂量(4/8)相比，在5mg/kg的剂量下没有癫痫发作的大鼠的数目更大(7/8)。10mg/kg下的这种更加温和的效果可能通过下述事实来解释：当测试5mg/kg的每日剂量时，4/8的大鼠仍处于50mg/kg的剂量的保护作用之下。事实上，在高剂量(20mg/kg)下，在对50mg/kg有响应的大鼠组中注意到，在停止治疗后针对癫痫发作的保护作用可以持续长达15天(图19)。
在3个动物组中的一部分大鼠中观察到这种癫痫发作的明显不存在。但甚至更加显著的结果是在停止治疗后15天，在显著比例的大鼠中不存在癫痫发作(7/15大鼠)。
因此，在大鼠的显著群体中SYN-PN表现为一种改善疾病的药物，使大鼠即使在停止治疗几乎两个月后也不出现癫痫发作。

Claims (11)

1.一种式(IIA)的化合物及其可药用盐：
R5-NH-CH2-CH(R7)-PO3 2-(IIA)，
其中：
R5表示包含2至30个碳原子的饱和或不饱和的脂肪酰基或其含氧衍生物之一；所述脂肪酰基选自：丙酸，丁酸，戊酸，辛酸，癸酸，月桂酸，肉豆蔻酸，硬脂酸，花生酸，山嵛酸，木蜡酸，肉豆蔻烯酸，棕榈烯酸，油酸，异油酸，亚油酸，α-亚油酸，花生四烯酸，二十碳五烯酸，芥酸和二十二碳六烯酸；所述含氧衍生物选自消退素、maresin、神经保护素和神经前列烷；并且
R7表示氢或(C1-C6)烷基。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中：
R5表示包含2至30个碳原子的饱和或不饱和的脂肪酰基，其是二十二碳六烯酸；并且
R7表示氢。
3.根据权利要求1所述的化合物，其中R5表示包含2至30个碳原子的饱和或不饱和的脂肪酰基，其选自：癸酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸。
4.一种药物组合物，其包含至少一种根据权利要求1所述的化合物和可接受的药物赋形剂。
5.根据权利要求4所述的药物组合物在制备用于预防和/或治疗选自炎性疾病或与认知障碍相关的疾病的疾病的药物中的用途。
6.根据权利要求5所述的用途，其中所述炎性疾病是中枢神经系统的炎性疾病、消化道的炎性疾病、炎性关节疾病或视网膜的炎性疾病。
7.根据权利要求4所述的药物组合物在制备用于预防和/或治疗选自癫痫、创伤性脑损伤、阿兹海默氏病、帕金森氏病、多发性硬化症、克罗恩病、肠综合征、痴呆症和亨廷顿氏病的疾病的药物中的用途。
8.根据权利要求4所述的药物组合物在制备用于在脑损伤和/或创伤性脑损伤和/或神经炎性疾病和/或神经变性疾病中防止认知减退或恢复改变的认知功能的药物中的用途。
9.根据权利要求5所述的用途，其中所述药物组合物通过口服途径给药。
10.根据权利要求7所述的用途，其中所述药物组合物通过口服途径给药。
11.根据权利要求8所述的用途，其中所述药物组合物通过口服途径给药。
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