CN113631170A

CN113631170A - 用于治疗囊性纤维化的组合物和方法

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Publication number: CN113631170A
Application number: CN202080024511.0A
Authority: CN
Inventors: 克里斯汀·贝尔; 奥诺弗里奥·拉塞尔瓦; 史蒂文·莫林斯基; 伊法特·奥伦; 奥芙拉·阿维佐-巴查德; 埃弗拉特·厄泽里-加莱
Original assignee: Hospital for Sick Children HSC; Sprisens Co ltd
Current assignee: Hospital for Sick Children HSC; Sprisens Co ltd; Splisense Ltd
Priority date: 2019-03-28
Filing date: 2020-03-29
Publication date: 2021-11-09
Also published as: CA3129959A1; MX2021011747A; IL286738A; EP3946371A1; US20220040219A1; BR112021019160A2; EP3946371A4; WO2020194321A1; AU2020245332A1

Abstract

本发明涉及一种用于治疗囊性纤维化(CF)的方法，所述方法使用能诱导囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)前体mRNA的外显子23的跳读的剪接调节剂，诸如反义寡核苷酸。还提供了包含剪接调节剂的组合物和药盒及其产生方法。

Description

用于治疗囊性纤维化的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年3月28日提交的题为“COMPOSITIONS AND METHODS FORTREATING CYSTIC FIBROSIS”的美国临时专利申请第62/825,302号的优先权的权益，该申请的内容通过引用以其整体并入本文。

发明领域

本发明属于反义寡核苷酸和反义寡核苷酸的治疗用途的领域。

背景

囊性纤维化(CF)是常见的由CFTR基因突变引起的严重常染色体隐性疾病。CFTR基因编码负责上皮细胞中氯离子运输的氯离子通道。CF的主要表现在肺部，多于90％的死亡率与呼吸系统疾病相关。呼吸道疾病与气道上皮的CFTR功能不足相关。

截至今天，全世界已经鉴定了大约2000个不同的破坏CFTR功能的突变，根据它们对CFTR功能的作用分组为五种不同的类别。类别I包括导致非功能性CFTR的突变(大的缺失和终止密码子突变)。类别II突变(包括常见的ΔF508)导致CFTR蛋白被细胞质量控制机制识别并随后降解的异常折叠，导致顶端细胞膜处缺乏成熟的CFTR蛋白。类别III突变导致全长CFTR蛋白被掺入到细胞膜中，但具有有缺陷的调控，使得CFTR功能不存在。这三种类别通常导致经典CF表型伴随胰腺功能不全，尽管肺部疾病的严重程度差异很大。导致缺陷的氯化物电导的CFTR突变被分组为类别IV。类别V突变涉及转录失调，导致其他方面正常的CFTR的量减少。后两种类别通常与较温和的表型和胰腺功能充足(pancreatic sufficiency)相关。具体地，由类别IV突变产生的CFTR插入质膜，但由于氯离子渗透和开放通道概率降低，表现出降低的单通道氯离子电导。

近年来，分子和细胞生物学的基础知识有助于开发针对特定CF突变/突变类别的疗法。目前批准的疗法包括校正CFTR蛋白加工中的缺陷(校正剂：VX-809/鲁马卡托(Lumacaftor)、VX-661/替扎卡托(Tezacaftor)和VX-445/elexacaftor)，氯通道功能(增效剂：VX-770/Kalydeco)和二者的组合。然而，对于携带对可用疗法没有响应的其他突变(诸如终止突变、错义突变等)的患者，不存在可用的疗法。

反义寡核苷酸(AO或ASO)施用是用于治疗遗传紊乱最有前途的治疗方法之一。AO是短的合成分子，可以与预测参与前体mRNA剪接的基序退火。该方法基于剪接交换。期望与选择的位点结合的AO掩蔽靶区，并且促进正常剪接或实现选择的外显子的特异性排除或包含。AO对其靶是高度特异性的，并且不影响细胞中的任何其他序列。通常使用若干类型的化学修饰的AO分子，包括：2’-O-甲基-硫代磷酸酯(2OMP)、磷酸二酰胺吗啉寡聚物(PMO)、肽核酸(PNA)、2-甲氧基乙基硫代磷酸酯(MOE)、约束乙基(cET)、配体缀合反义(LICA)和交替锁核酸(LNA)。

AO修饰维持了它们的稳定，改善了它们的靶亲和力，并且提供了良好的药代动力学特性和生物稳定性。

ASO作为治疗剂的潜力在若干人类遗传疾病中得到了证明。其中之一是脊髓性肌萎缩症(SMA)，其中运动神经元存活2(survival motor neuron 2，SMN2)基因中包含外显子7导致了完全功能性蛋白。基于对患有严重SMA的新生小鼠幼崽的研究中的有希望的结果，由Bieng和Ionis开发的基于ASO的药物

(nusinersen)获得了FDA的批准，该批准是基于患有婴儿期发作的SMA的患者的3期临床试验的成功完成，这显示SMA婴儿的运动功能里程碑中的显著改善。

概述

本发明涉及包含寡核苷酸的组合物及其使用方法，所述寡核苷酸能够与CFTR前体mRNA结合，从而调节剪接并恢复或增强CFTR基因产物的功能。因此，本发明鉴定了CFTR前体mRNA内被靶向用于调节CFTR前体mRNA的剪接级联而被靶向的序列。如本发明显示的，从CFTR前体mRNA中排除外显子产生功能性CFTR蛋白，其由否则异常的CFTR等位基因以足够的水平产生。

本发明部分地基于这样的发现，即人工“反义”寡核苷酸(ASO)分子能够靶向并结合CFTR基因的前体mRNA分子处的预定序列，并且这种结合能够调节前体mRNA分子剪接为成熟mRNA，随后该成熟mRNA以足够的水平翻译为功能性CFTR蛋白。CFTR前体mRNA分子内的靶是那些被发现通过影响其自身剪接而直接参与剪接的靶。本发明还部分地基于令人惊讶的发现，即从CFTR成熟蛋白中排除外显子赋予其部分功能性。

此外，本发明部分地基于令人惊讶的发现，即与位于CFTR前体mRNA的外显子(例如，外显子23)中的突变互补，而与外显子-内含子接头元件(例如剪接供体、剪接受体等)不互补的ASO，诱导实质上外显子排除(即跳读)。

根据第一方面，提供了一种用于治疗有相应需要的受试者的囊性纤维化(CF)的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的合成反义寡核苷酸(ASO)，其中ASO诱导囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)前体mRNA的外显子23的跳读，从而治疗受试者的CF，并且其中ASO靶向位于CFTR前体mRNA的外显子23中的CF赋予突变。

根据另一方面，提供了一种组合物，所述组合物包含ASO，所述ASO包含与CFTR前体mRNA具有至少80％的互补性的14个至25个碱基，并且其特征在于诱导CFTR前体mRNA的外显子23的跳读，其中剪接活性通过靶向位于CFTR前体mRNA的外显子23中的CF赋予突变来诱导。

根据另一方面，提供了一种药盒，所述药盒包含：(a)至少一种ASO；以及以下中的至少一项：(b)至少一种CFTR调节剂(modifier)；或者(c)至少一种CF药物，其中ASO选自由SEQ ID No.:4-11组成的组，并且其中CFTR调节剂选自由以下组成的组：CFTR增效剂、CFTR校正剂、翻译通读剂和CFTR扩增剂(amplifier)。

根据另一方面，提供了一种用于产生适于治疗CF的化合物的方法，所述方法包括：获得与位于CFTR前体mRNA的外显子23中的CF赋予突变结合的化合物，测定在获得的化合物存在的情况下CFTR前体mRNA的外显子23的跳读，并且选择诱导从CFTR前体mRNA中排除外显子23的至少一种化合物，从而产生适于治疗CF的化合物。

在一些实施方案中，方法还包括向受试者施用治疗有效量的一种或更多种CFTR调节剂。

在一些实施方案中，CFTR调节剂增加CFTR门打开的持续时间、通过CFTR门的氯化物流量、CFTR蛋白的正确折叠、锚定至细胞膜的CFTR的数量或其任何组合。

在一些实施方案中，CFTR调节剂选自由以下组成的组：增效剂、校正剂和扩增剂。

在一些实施方案中，CFTR调节剂是伊伐卡托(ivacaftor)、鲁马卡托、替扎卡托、elexacaftor、VX-659、VX-152或VX-440或其任何组合。

在一些实施方案中，ASO包含选自由以下组成的组的主链：磷酸-核糖主链、磷酸-脱氧核糖主链、硫代磷酸酯-脱氧核糖主链、2’-O-甲基-硫代磷酸酯主链、磷酸二酰胺吗啉代主链、肽核酸主链、2-甲氧基乙基硫代磷酸酯主链、交替锁核酸主链、硫代磷酸酯主链、N3’-P5’氨基磷酸酯、2’-脱氧-2’-氟代-β-d-阿拉伯核酸、环己烯核酸主链核酸、三环-DNA(tcDNA)核酸主链及其组合。

在一些实施方案中，ASO包含14个至25个碱基。

在一些实施方案中，ASO包含17个至22个碱基。

在一些实施方案中，ASO与以下具有至少75％的互补性：(a)由SEQ ID NO:1组成的序列；(b)由SEQ ID NO:16组成的序列；或者二者。

在一些实施方案中，ASO与由SEQ ID NO:2组成的序列具有至少75％的互补性。

在一些实施方案中，ASO与SEQ ID NO:1、与SEQ ID NO:16或与SEQ ID NO:2具有至少80％的互补性。

在一些实施方案中，ASO与由SEQ ID NO:3组成的序列具有至少80％的互补性。

在一些实施方案中，与SEQ ID NO:1-3和SEQ ID NO:16中的任一项相比，ASO包含至多3个错配碱基。

在一些实施方案中，3个错配碱基中的至多一个错配碱基位于距离ASO的5’引发末端不多于3个碱基处。

在一些实施方案中，3个错配碱基中的至多一个错配碱基位于距离ASO的3’引发末端不多于3个碱基处。

在一些实施方案中，ASO包含与位于SEQ ID NO:1的位置429、SEQ ID NO:2的位置229或SEQ ID NO:3的位置129处的腺嘌呤互补的尿嘧啶。

在一些实施方案中，ASO在尿嘧啶上游包含3个至16个核苷酸。

在一些实施方案中，ASO包含：GCUUUCCUUCACUGUUGC(SEQ ID NO:4)；CUUUCCUUCACUGUUGCA(SEQ ID NO:5)；CUUUCCUUCACUGUUGCAAA(SEQ ID NO:6)；GGCUUUCCUUCACUGUUG(SEQ ID NO:7)；AAGGCUUUCCUUCACUGU(SEQ ID NO:8)；CCAAAGGCUUUCCUUCACUG(SEQ ID NO:9)；CAAAGGCUUUCCUUCACU(SEQ ID NO:10)；或UCCUUCACUGUUGCAAAGU(SEQ ID NO:11)。

在一些实施方案中，受试者包含选自由以下组成的组的一个或更多个突变：W1282X、G1244E、T1246I、3876delA、3878delG、S1251N、L1254X、S1255P、S1255X、3905insT、D1270N、R1283M、Q1291R，其中所述X表示翻译终止。

在一些实施方案中，突变是W1282X，其中X表示翻译终止。

在一些实施方案中，治疗包括改善CF选自由以下组成的组的至少一个临床参数：肺功能、首次肺恶化的时间、体重变化、身高变化、体重指数(BMI)变化、汗液氯化物浓度变化、肺恶化的次数和/或持续时间、肺恶化的住院总天数以及对用于窦肺体征或症状的抗生素疗法的需要。

在一些实施方案中，ASO包含与位于以下的任一项处的腺嘌呤互补的尿嘧啶：所述SEQ ID NO:1的位置429、所述SEQ ID NO:2的位置229或所述SEQ ID NO:3的位置129。

在一些实施方案中，ASO在尿嘧啶上游包含4个至18个核苷酸。

在一些实施方案中，ASO包含化学修饰的主链。

在一些实施方案中，化学修饰的主链包括：磷酸-核糖主链、磷酸-脱氧核糖主链、硫代磷酸酯-脱氧核糖主链、2’-O-甲基-硫代磷酸酯主链、磷酸二酰胺吗啉代主链、肽核酸主链、2-甲氧基乙基硫代磷酸酯主链、交替锁核酸主链、硫代磷酸酯主链、N3’-P5’氨基磷酸酯、2’-脱氧-2’-氟代-β-d-阿拉伯核酸、环己烯核酸主链核酸、三环-DNA(tcDNA)核酸主链及其组合。

在一些实施方案中，组合物还包含药学上可接受的载体。

在一些实施方案中，组合物用于在诱导CFTR前体mRNA的外显子23的跳读中使用。

在一些实施方案中，组合物是吸入组合物。

在一些实施方案中，组合物用于在治疗CF中使用。

在一些实施方案中，CF药物是抗生素药物、支气管扩张剂、皮质类固醇或其任何组合。

在一些实施方案中，化合物是ASO。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和/或科学术语具有与由本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文描述的那些方法和材料相似或等价的方法和材料可用于本发明的实施方案的实践或测试，以下描述了示例性方法和/或材料。在冲突的情况下，将以专利说明书、包括定义为准。另外，材料、方法和实例仅是说明性的，并且并不意图是必然限制性的。

本发明的可适用性的另外的实施方案和全部范围将从下文给出的详细描述变得明显。然而，应当理解，详细描述和具体实例，虽然指示本发明的优选的实施方案，但仅通过说明性方式给出，因为在本发明的精神和范围内的各种变化和修改从该详细描述对本领域技术人员将是明显的。

附图简述

图1A-图1B是显示使用膜电位敏感的

染料测量的用CFTR del Ex23瞬时转染的HEK 293细胞中CFTR功能的图。基线测量5min后，将CFTR通过佛司可林(forskolin，FSK)(10μM)和VX-770(1μM)激活。然后添加CFTR抑制剂(CFTRinh-172，10μM)以使CFTR失活。

图2A-图2B是显示合成反义寡核苷酸(ASO)诱导在CFTR前体mRNA的外显子23上的跳读的凝胶电泳的显微照片(2A)和图(2B)。

图3A-图3B是显微照片和垂直柱状图。(3A)显示ASO作用(例如，外显子23跳读)在用SMG1抑制剂抑制无义介导的衰变(NMD)下非常显著的凝胶电泳分析。(3B)显示细胞在0.3μg SMG1(一种NMD抑制剂)存在的情况下的孵育增加mRNA水平的图。

图4是使用抗CFTR抗体(上图)或抗钙连蛋白抗体(作为对照；下图)的蛋白质印迹分析的显微照片。在16HBEge W1282X中，CFTR蛋白是不可检测的，而在外显子23上的跳读导致成熟(和缺失的)CFTR蛋白的产生。

详细描述

根据一些实施方案，提供了一种用于治疗受试者的囊性纤维化(CF)的方法。在一些实施方案中，方法包括向受试者施用治疗有效量的剪接调节剂，其中剪接调节剂诱导囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)前体mRNA的外显子23的跳读，从而治疗受试者的CF。

在一些实施方案中，CFTR调节剂增加CFTR门打开的持续时间、通过CFTR门的氯化物流量、CFTR蛋白的正确折叠、锚定至细胞膜的CFTR的数量或其任何组合。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

在一些实施方案中，调剂剂选自：增效剂、校正剂和扩增剂。

如本文使用的，术语“增效剂”是指增加有缺陷的CFTR将打开并因此允许氯离子通过通道孔的可能性的任何剂。

如本文使用的，术语“校正剂”是指有助于CFTR通道正确折叠以便实现其运输至细胞膜的任何剂。

如本文使用的，术语“扩增剂”是指诱导细胞增加其CFTR蛋白产生速率或产量从而导致CFTR蛋白量增加的任何剂。

在一些实施方案中，调节剂选自伊伐卡托、鲁马卡托、替扎卡托、elexacaftor、VX-659、VX-152或VX-440。

在一些实施方案中，调节剂是伊伐卡托、鲁马卡托、替扎卡托、elexacaftor、VX-659、VX-152或VX-440或其任何组合。

反义寡核苷酸

在一些实施方案中，方法包括施用剪接调节剂，该调节剂是合成反义寡核苷酸(ASO)。

在一些实施方案中，ASO是化学修饰的。在一些实施方案中，化学修饰是对ASO的主链的修饰。在一些实施方案中，化学修饰是对ASO的糖的修饰。在一些实施方案中，化学修饰是对ASO的核碱基的修饰。在一些实施方案中，化学修饰增加细胞中ASO的稳定性。在一些实施方案中，化学修饰增加ASO在体内的稳定性。在一些实施方案中，化学修饰增加ASO调节剪接的能力。在一些实施方案中，化学修饰增加ASO诱导外显子23跳读的能力。在一些实施方案中，化学修饰增加ASO的半衰期。在一些实施方案中，化学修饰抑制聚合酶从ASO的3’末端延伸。在一些实施方案中，化学修饰抑制聚合酶对ASO的识别。在一些实施方案中，化学修饰抑制双链触发的降解。在一些实施方案中，化学修饰的ASO在结合CFTR前体mRNA时不触发核酸双链降解。在一些实施方案中，化学修饰抑制RISC介导的降解。在一些实施方案中，化学修饰抑制RISC介导的降解或任何平行的核酸降解途径。

在一些实施方案中，ASO没有标记部分。在一些实施方案中，ASO不被标记。在一些实施方案中，ASO不发射可检测到的信号或不包含能够被识别以便实现核酸检测的部分(例如，地高辛和荧光标记的抗DIG抗体)。在一些实施方案中，可检测到的信号包括在体内或体外提供化合物例如多核苷酸的检测的染料或发射能量。在一些实施方案中，可检测到的信号包括：荧光信号、彩色信号或放射性信号。

在一些实施方案中，ASO没有放射性核碱基；地高辛、链霉抗生物素蛋白、生物素、荧光团、半抗原标记物、CLICK标记物、胺标记物或硫醇标记物。

在一些实施方案中，化学修饰选自：磷酸-核糖主链、磷酸-脱氧核糖主链、硫代磷酸酯-脱氧核糖主链、2’-O-甲基-硫代磷酸酯主链、磷酸二酰胺吗啉代主链、肽核酸主链、2-甲氧基乙基硫代磷酸酯主链、交替锁核酸主链、硫代磷酸酯主链、N3’-P5’氨基磷酸酯、2’-脱氧-2’-氟代-β-d-阿拉伯核酸、环己烯核酸主链核酸、三环-DNA(tcDNA)核酸主链及其组合。

在一些实施方案中，ASO包含至少14个碱基、至少15个碱基、至少16个碱基、至少17个碱基、至少18个碱基、至少19个碱基、至少20个碱基、至少21个碱基、至少22个碱基、至少23个碱基、至少24个碱基或至少25个碱基，或其间的任何值和范围。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

在一些实施方案中，ASO包含14个至25个碱基、14个至24个碱基、14个至23个碱基、14个至22个碱基、14个至21个碱基、14个至20个碱基、14个至19个碱基或14个至18个碱基或14个至17个碱基。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。在一些实施方案中，ASO包含17个至22个碱基。

在一些实施方案中，ASO与包含以下或由以下组成的序列互补：

在一些实施方案中，ASO与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:2中的任一项具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％或其间的任何值和范围的互补性。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。在一些实施方案中，ASO与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:2中的任一项具有70％-80％、75％-85％、80％-90％、85％-95％、90％-99％或95％-100％的互补性。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

术语“互补”是指多核苷酸彼此形成碱基对的能力。碱基对通常由反平行多核苷酸链中核苷酸单元之间的氢键形成。互补的多核苷酸链可以以Watson-Crick方式(例如，A对T、A对U、C对G)或以允许形成双链体的任何其他方式碱基配对。如本领域技术人员知道，在使用RNA而不是DNA时，尿嘧啶而不是胸腺嘧啶是被认为与腺苷互补的碱基。然而，在本发明的上下文中表示U时，除非另有说明，否则暗示了取代T的能力。

在一些实施方案中，与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:2中的任一项相比，ASO包含错配碱基。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:2中的任一项相比，ASO包含至少一个、至少两个或至少3个或其间的任何值和范围的错配碱基。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:16和SEQ ID NO:2中的任一项相比，ASO包含一个至两个、一个至三个、两个至三个错配碱基。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

在一些实施方案中，与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:2中的任一项相比，ASO包含至多一个、至多两个、至多三个、至多四个或至多五个或其间的任何值和范围的错配碱基。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:2中的任一项相比，ASO包含一个至两个、一个至三个、一个至四个、一个至五个、两个至三个、两个至四个、两个至五个、三个至四个、三个至五个或四个至五个错配碱基。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

在一些实施方案中，ASO包含至多一个错配碱基，其中错配碱基位于距离ASO的5’引发末端不多于1个、2个、3个或4个或其间的任何值和范围的碱基处。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。在一些实施方案中，ASO包含至多一个错配碱基，其中错配碱基位于距离ASO的5’引发末端不多于1个、2个或3个或其间的任何值和范围的碱基处。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。在一些实施方案中，ASO包含至多一个错配碱基，其中错配碱基位于距离ASO的5’引发末端不多于1个或2个或其间的任何值和范围的碱基处。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

在一些实施方案中，ASO包含至多一个错配碱基，其中错配碱基位于距离所述ASO的3’引发末端不多于1个、2个、3个或4个或其间的任何值和范围的碱基处。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。在一些实施方案中，ASO包含至多一个错配碱基，其中错配碱基位于距离所述ASO的3’引发末端不多于1个、2个或3个或其间的任何值和范围的碱基处。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。在一些实施方案中，ASO包含至多一个错配碱基，其中错配碱基位于距离所述ASO的3’引发末端不多于1个或2个或其间的任何值和范围的碱基处。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

在一些实施方案中，ASO与SEQ ID NO:3具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％或其间的任何值和范围的互补性。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。在一些实施方案中，ASO与SEQ ID NO:3具有70％-80％、75％-85％、80％-90％、85％-95％、90％-99％或95％-100％的互补性。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

在一些实施方案中，ASO包含与位于SEQ ID NO:1的位置429处的腺嘌呤互补的尿嘧啶。

在一些实施方案中，ASO包含与位于SEQ ID NO:2的位置229处的腺嘌呤互补的尿嘧啶。

在一些实施方案中，ASO包含与位于SEQ ID NO:3的位置129处的腺嘌呤互补的尿嘧啶。

在一些实施方案中，ASO在与位于SEQ ID NO:1的位置429、SEQ ID NO:2的位置229或SEQ ID NO:3的位置129处的腺嘌呤互补的尿嘧啶上游包含至少4个碱基、至少5个碱基、至少6个碱基、至少7个碱基、至少8个碱基、至少9个碱基、至少10个碱基、至少11个碱基、至少12个碱基、至少13个碱基、至少14个碱基、至少15个碱基、至少16个碱基、至少17个碱基或至少18个碱基或其间的任何值和范围的碱基。在一些实施方案中，ASO在与位于SEQ ID NO:1的位置429、SEQ ID NO:2的位置229或所述SEQ ID NO:3的位置129处的腺嘌呤互补的尿嘧啶上游包含4个至18个碱基、4个至16个碱基、4个至15个碱基、5个至17个碱基、5个至13个碱基、8个至18个碱基、7个至13个碱基、9个至13个碱基、6个至12个碱基、10个至14个碱基或12个至18个碱基。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

在一些实施方案中，ASO与CFTR前体mRNA(登录号NM_000492)互补。在一些实施方案中，前体mRNA是野生型前体mRNA。在一些实施方案中，前体mRNA是突变的前体mRNA。在一些实施方案中，CFTR前体mRNA包括以下任一项：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:16。在一些实施方案中，ASO与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQID NO:16中的任一项互补。

在一些实施方案中，ASO对CFTR前体mRNA是特异性的。如本文使用的，术语“特异性”既指碱基对特异性，并且也指基因特异性。在一些实施方案中，ASO对CFTR基因是特异性的。在一些实施方案中，ASO对CFTR中的剪接沉默基序是特异性的。在一些实施方案中，ASO对CFTR中的剪接沉默序列是特异性的。在一些实施方案中，ASO对CFTR的剪接沉默区是特异性的。在一些实施方案中，剪接沉默是CFTR外显子23的剪接沉默。

在一些实施方案中，ASO以完全互补性结合CFTR前体mRNA。在一些实施方案中，ASO除了以完全互补性结合CFTR之外不结合任何基因。在一些实施方案中，ASO除了以大于70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的互补性结合CFTR之外不结合任何基因。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。在一些实施方案中，ASO除了以大于90％的互补性结合CFTR之外不结合任何基因。在一些实施方案中，ASO以完全互补性结合以下任一项：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:16。在一些实施方案中，ASO除了以完全互补性结合以下任一项之外不结合任何序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:16。在一些实施方案中，ASO除了以大于70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的互补性结合以下任一项之外不结合任何序列：SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:16。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。在一些实施方案中，ASO除了以大于90％的互补性结合以下任一项之外不结合任何序列：SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:16。在一些实施方案中，ASO除了CFTR内的之外不以完全互补性与细胞基因组中的任何地方结合。在一些实施方案中，ASO除了CFTR内的之外不以大于70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的互补性与细胞基因组中的任何地方结合。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，哺乳动物是人类。

在一些实施方案中，ASO调节CFTR的表达。在一些实施方案中，ASO调节CFTR的剪接。在一些实施方案中，ASO调节CFTR的外显子23的剪接。在一些实施方案中，ASO不引起脱靶作用。在一些实施方案中，脱靶是除CFTR之外的靶。在一些实施方案中，脱靶是除了CFTR的外显子23的剪接之外的靶。在一些实施方案中，ASO不实质上或显著调节除了CFTR之外的基因的表达。在一些实施方案中，ASO不实质上或显著调节除了CFTR之外的基因的剪接。在一些实施方案中，ASO不实质上或显著调节除了CFTR的外显子23之外的外显子的剪接。在一些实施方案中，表达的实质调节是至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％的表达变化。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。在一些实施方案中，表达的实质调节是至少20％的表达变化。

在一些实施方案中，ASO与外显子-内含子接头互补。在一些实施方案中，外显子是CFTR前体mRNA的外显子23。如本文使用的，包含外显子23的一部分或全部的外显子-内含子接头可以被称为外显子23-内含子接头。在一些实施方案中，外显子23-内含子接头包含外显子23的5’引发末端。在一些实施方案中，外显子23-内含子接头包含外显子23的3’引发末端。在一些实施方案中，外显子23-内含子接头包含外显子23的完整序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:2中的任一项包含外显子23-内含子接头或由外显子23-内含子接头组成。

在一些实施方案中，ASO与CFTR前体mRNA的外显子23-内含子接头至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％或其间的任何值和范围互补。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。在一些实施方案中，ASO与CFTR前体mRNA的外显子23-内含子接头70％-85％、80％-90％、85％-95％、90％-99％或95％-100％互补。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

在一些实施方案中，ASO与位于SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:16中任一项的位置275-325或SEQ ID NO:2的位置75-125处的序列至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％或其间的任何值和范围互补。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。在一些实施方案中，ASO与位于SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:16中任一项的位置275-325或SEQ ID NO:2的位置75-125处的序列70％-85％、80％-90％、85％-99％或95％-100％互补。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

在一些实施方案中，ASO与位于SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:16中任一项的位置435-485或SEQ ID NO:2的位置235-285处的序列至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％或其间的任何值和范围互补。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。在一些实施方案中，ASO与位于SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:16中任一项的位置435-485或SEQ ID NO:2的位置235-285处的序列70％-85％、80％-90％、85％-99％或95％-100％互补。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

在一些实施方案中，与位于SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:16中任一项的位置275-325或SEQ ID NO:2的位置75-125处的序列互补的ASO包含以下任一项或由以下任一项组成：CAAGAGGCCCACCUAUAAG(SEQ ID NO:12)或CCACCUAUAAGGUAAAAGUG(SEQ ID NO:13)。

在一些实施方案中，与位于SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:16中任一项的位置435-485或SEQ ID NO:2的位置235-285处的序列互补的ASO包含以下或由以下组成：CCUUUUGCUCACCUGUGGU(SEQ ID NO:14)或CUCACCUGUGGUAUCACU(SEQ ID NO:15)。

在一些实施方案中，如本文公开的ASO靶向以下、与以下互补、诱导以下或其任何组合：由CFTR基因的突变等位基因转录的CFTR前体mRNA的外显子23的跳读。在一些实施方案中，如本文公开的ASO不靶向以下、不与以下互补、不诱导以下或其任何组合：由CFTR基因的野生型等位基因转录的CFTR前体mRNA的外显子23的跳读。在一些实施方案中，与CFTR基因的野生型等位基因相比，如本文公开的ASO至少2倍更有效地、至少3倍更有效地、至少5倍更有效地、至少7倍更有效地、至少10倍更有效地、至少20倍更有效地、至少50倍更有效地或至少100倍更有效地或其间的任何值和范围靶向以下、与以下互补、诱导以下或其任何组合：由CFTR基因的突变等位基因转录的CFTR前体mRNA的外显子23的跳读。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。在一些实施方案中，与CFTR基因的野生型等位基因相比，如本文公开的ASO 2-10倍更有效地、3-50倍更有效地、5-100倍更有效地、7-20倍更有效地、2-40倍更有效地、2-25倍更有效地、50-150倍更有效地或2-100倍更有效地靶向以下、与以下互补、诱导以下或其任何组合：由CFTR基因的突变等位基因转录的CFTR前体mRNA的外显子23的跳读。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

在一些实施方案中，本发明的ASO与CFTR基因的突变等位基因完全互补。如本文使用的，术语“完全互补”是指100％杂交，意指突变的CFTR等位基因和ASO代表彼此反向和互补的核酸序列形式，这对分子生物学领域的普通技术人员来说是明显的。在一些实施方案中，本发明的ASO与CFTR基因的野生型等位基因部分地互补。如本文使用，术语“部分地”是指低于100％的任何值或范围。在一些实施方案中，本发明的ASO和野生型CFTR等位基因代表彼此相差至少一个核苷酸(例如，包含至少一个错配核苷酸)的反向和互补的核酸序列形式。

在一些实施方案中，本发明的ASO及其使用方法提供了从CFTR前体mRNA中排除突变的外显子23，而野生型外显子23在CFTR前体mRNA中被保留、保持包括、未被排除或其任何等同形式。

在一些实施方案中，本发明的ASO及其使用方法提供了从CFTR前体mRNA中排除仅突变的外显子23，而野生型，例如，未突变的外显子23从野生型CFTR前体mRNA中被保留、保持包括、未被排除或其任何等同形式。

在一些实施方案中，ASO包含SEQ ID No:4-30中任一项的活性片段。

如本文使用的，术语“活性片段”是指与ASO全核苷酸序列的连续部分100％相同的片段，条件是：原始ASO核苷酸序列的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％或其间的任何值和范围的活性被保留。每种可能性代表本发明的单独实施方案。

在一些实施方案中，突变是CF赋予突变。如本文使用的，术语“CF赋予突变”是指在携带或包含该突变的受试者中诱导、促进、关联或传播囊性纤维化疾病的发展或与之相关的症状的任何突变。

在一些实施方案中，突变在CFTR编码基因的外显子23中。

在一些实施方案中，受试者包含突变。在一些实施方案中，受试者包含错义突变。在一些实施方案中，受试者包括无义突变。在一些实施方案中，受试者包含CFTR编码基因、由其编码的前体mRNA或其蛋白产物中的取代突变。在一些实施方案中，受试者包含选自以下的一个或更多个突变：W1282X、G1244E、T1246I、3876delA、3878delG、S1251N、L1254X、S1255P、S1255X、3905insT、D1270N、R1283M、Q1291R，其中所述X表示翻译终止。在一些实施方案中，受试者包含野生型(即，未突变的)外显子24。在一些实施方案中，受试者包含至少一个存在于CFTR基因或由其转录的mRNA中的CF诱导突变，其中该突变不存在于外显子24中，不影响外显子24包含或从成熟mRNA排除或二者。在一些实施方案中，受试者包含野生型外显子24和至少一个存在于CFTR基因或由其转录的mRNA中的CF诱导突变，其中该突变不存在于外显子24中，不影响外显子24包含或从成熟mRNA排除或二者。

在一些实施方案中，受试者对于一个或更多个前述突变是纯合的。在一些实施方案中，受试者对于一个或更多个前述突变是杂合的。在一些实施方案中，根据本发明的方法治疗的受试者包含以下或特征在于以下：具有野生型全长且完全功能性的由野生型等位基因编码的CFTR蛋白和由使用本发明的ASO排除了外显子23的前体mRNA编码的有害CFTR蛋白的混合物。在一些实施方案中，本发明的ASO不降低受试者中野生型全长和完全功能性CFTR蛋白的水平，例如，对于如上文公开的突变是杂合的。

在一些实施方案中，受试者对于另外的一个或更多个突变也是杂合的，其中另外的一个或更多个突变位于除了外显子23之外的外显子中的CFTR前体mRNA中。在一些实施方案中，受试者对于本文公开的一个或更多个CF赋予突变是纯合的或杂合的，例如，N1303K，并且对于位于除了外显子23之外的CFTR前体mRNA的任何外显子中的另外一个或更多个突变也是杂合的。

在一些实施方案中，如本文使用的“突变”是指赋予部分或完全非功能性的CFTR蛋白的任何核苷酸取代或修饰。在一些实施方案中，如本文使用的“突变”是指在携带或包含该突变的受试者中诱导或导致“囊性纤维化表型”的核苷酸取代或修饰。

在一些实施方案中，修饰包括插入、缺失、倒位或其组合，只要该修饰在携带或包含该修饰的受试者中导致囊性纤维化表型。

如本文使用的，术语“囊性纤维化表型”包括与囊性纤维化关联的任何症状或表现。用于诊断囊性纤维化和/或与之相关的症状的方法是常见的，并且对本领域普通技术人员来说是明显的。

在一些实施方案中，受试者包含CFTR蛋白中被翻译终止密码子取代的色氨酸。在一些实施方案中，受试者包含CFTR蛋白的位置1282中的取代。在一些实施方案中，受试者包含CFTR蛋白中的W1282X取代，其中X表示翻译终止。

在一些实施方案中，受试者罹患囊性纤维化。

在一些实施方案中，方法涉及改善受试者中CF选自以下的至少一个临床参数：肺功能、首次肺恶化的时间、体重变化、身高变化、体重指数(BMI)变化、汗液氯化物浓度变化、肺恶化的次数和/或持续时间、肺恶化的住院总天数或对用于窦肺体征或症状的抗生素疗法的需要。

如本文使用的，术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”疾病、紊乱或状况包括其至少一种症状的缓解、其严重程度的降低或其进展的抑制。治疗不一定意味着疾病、紊乱或状况完全治愈。为了有效治疗，本文中有用的组合物仅需要降低疾病、紊乱或状况的严重程度，降低与之相关的症状的严重程度或提供患者或受试者的生活质量的改善。

如本文使用的，术语“状况”包括与正常状态的解剖和生理偏离，这构成对活体动物或其一部分的正常状态的损害，中断或改变身体功能的表现。

如本文使用的，术语“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”是指期望疗法的任何受试者，特别是哺乳动物受试者，例如，人类。

组合物

根据一些实施方案，提供了一种组合物，所述组合物包含ASO，所述ASO包含与CFTR前体mRNA具有至少85％互补性的14个至25个碱基，并且其特征在于诱导所述CFTR前体mRNA的外显子23的剪接活性。

在一些实施方案中，组合物还包含药学上可接受的载体。

如本文使用的术语“药学上可接受的载体”是指本领域已知的任何标准药物载体，诸如无菌溶液、片剂、包衣片剂和胶囊。通常，这样的载体包含赋形剂，诸如淀粉、牛乳、糖、某些类型的粘土、明胶、硬脂酸或其盐、硬脂酸镁或硬脂酸钙、滑石、植物脂肪或油、树胶、乙二醇或其他已知的赋形剂。这样的载体还可以包括风味和颜色添加剂或其他成分。药学上可接受的载体的实例包括但不限于以下：水、盐水、缓冲液、惰性无毒固体(例如，甘露醇、滑石)。包含这样的载体的组合物通过熟知的常规方法配制。根据预期的施用方式和预期的用途，组合物可以呈固体、半固体的形式或液体剂型，诸如，例如，粉末、颗粒(granule)、晶体、液体、悬浮液、脂质体、纳米颗粒、纳米乳剂、糊剂、乳膏、药膏(salve)等，并且可以呈适于相对精确剂量施用的单位剂型。

在一些实施方案中，药物组合物被配制用于口服施用。在一些实施方案中，药物组合物被配制用于鼻施用。在一些实施方案中，药物组合物被配制用于通过吸入施用。在一些实施方案中，药物组合物被配制用于腹部施用。在一些实施方案中，药物组合物被配制用于皮下施用。在一些实施方案中，药物组合物被配制用于腹膜内施用。在一些实施方案中，药物组合物被配制用于静脉内施用。

在一些实施方案中，药物组合物被配制用于全身施用。在一些实施方案中，药物组合物被配制用于向受试者施用。在一些实施方案中，受试者是人类受试者。本领域技术人员应当理解，预期向受试者施用的药物组合物不应具有脱靶作用，即除了预期的治疗作用之外的作用。在一些实施方案中，药物组合物对除了CFTR之外的基因没有实质作用。在一些实施方案中，药物组合物对除了CFTR的外显子23之外的外显子的剪接没有实质作用。在一些实施方案中，实质作用是具有表型结果的作用。在一些实施方案中，实质作用是有害作用。在一些实施方案中，有害是相对于受试者的健康和/或安宁(wellbeing)。

在一些实施方案中，组合物通过吸入施用。在一些实施方案中，组合物是吸入组合物。在一些实施方案中，组合物是药物组合物。

作为长期已知且研究充分的疾病，某些药物和剂是治疗囊性纤维化患者领域已知的。将根据本发明的合成多核苷酸分子与一种或更多种这些药物一起施用可以有益于获得显著的治疗结果。

在一些实施方案中，组合物还包含至少一种另外的抗囊性纤维化剂(即CF药物)。在一些实施方案中，另外的抗囊性纤维化剂选自：CFTR剪接调节剂(例如，如本文公开和描述的ASO)、翻译通读剂、上皮钠通道(sodium epithelial channel，ENaC)抑制剂、CFTR扩增剂、CFTR增效剂或CFTR校正剂。在一些实施方案中，CFTR剪接调节剂具有诱导或促进外显子24从成熟CFTRmRNA中排除的能力；翻译通读剂选自3-[5-(2-氟苯基)-1,2,4-噁二唑-3-基]苯甲酸(Ataluren)或ELX-02；ENaC抑制剂选自：VX-371(P-1037)或IONIS-ENAC-2.5Rx；CFTR扩增剂是PTI-428；CFTR增效剂选自：N-(2,4-二叔丁基-5-羟基苯基)-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-甲酰胺(伊伐卡托)、QBW251、PTI-808或VX-561(氘代伊伐卡托)；CFTR增效剂是N-(2,4-二叔丁基-5-羟基苯基)-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-甲酰胺(伊伐卡托)；或者CFTR校正剂选自：3-{6-{[1-(2,2-二氟代-1,3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)环丙烷羰基]氨基}-3-甲基吡啶-2-基}苯甲酸(鲁马卡托)、1-(2,2-二氟代-1,3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-～{N}-{1-[(2～{R})-2,3-二羟基丙基]-6-氟代-2-(1-羟基-2-甲基丙烷-2-基)吲哚-5-基]环丙烷-1-甲酰胺(替扎卡托)、VX-659、VX-445、VX-152和VX-440、GLPG2222、FDL169或PTI-801。

在一些实施方案中，药物组合物包含本发明的合成ASO。在一些实施方案中，组合物以以下的量包含ASO：至少1nM、至少2.5nM、至少10nM或其间的任何值和范围。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。在一些实施方案中，组合物以以下的量包含ASO：2.5nM至10nM、1nM至100nM、1nM至0.5μM或1nM至1μM。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

在一些实施方案中，如上文公开和描述的ASO或包含其的药物组合物被用于调节从具有突变的外显子23的CFTR基因转录的CFTR前体mRNA的剪接。

如本文使用的短语“剪接的调节”是指影响由CFTR天然前体mRNA产生的任何RNA或mRNA变体的水平的变化。例如，调节可能意指例如引起异常CFTR mRNA水平的增加或减少、引起正常全长CFTR mRNA水平的增加或减少、引起异常CFTR RNA或包含错义密码子的mRNA水平的增加或减少和/或引起异常CFTR RNA或包含过早终止密码子(非有义密码子)的mRNA水平的增加或减少。因此明显的是，某些CFTR剪接变体之间比率的任何变化也被认为是剪接调节的结果。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。在某些实施方案中，调节意指减少异常CFTR mRNA的水平。在一些实施方案中，异常CFTR mRNA包含突变的外显子23。在一些实施方案中，调节意指减少包含突变的外显子23的异常CFTR mRNA的水平。在一些实施方案中，调节意指减少包含W1282X突变的异常CFTR mRNA的水平，其中X表示翻译终止。

在某些实施方案中，用途是用于降低包含突变的外显子23的mRNA分子的水平。在一些实施方案中，用途是用于降低包含以下中列出的核苷酸序列的mRNA分子的水平：SEQID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3。在一些实施方案中，用途是用于增加缺乏外显子23的CFTR mRNA的水平。在一些实施方案中，用途是用于增加缺乏SEQ ID NO:3的CFTR mRNA的水平。在一些实施方案中，用途是用于校正或改善通过CFTR通道的氯化物转运。在一些实施方案中，用途是用于增加功能性CFTR蛋白的产生。在一些实施方案中，用途是用于增加CFTR门打开的持续时间。在一些实施方案中，用途是用于增加通过CFTR门的氯化物流量。在一些实施方案中，用途是用于增加CFTR蛋白的正确折叠。在一些实施方案中，用途是用于增加锚定至细胞膜的CFTR的数量。

在一些实施方案中，如上文公开和如描述的ASO或包含其的药物组合物在用于改善囊性纤维化的至少一个临床参数的方法中使用。在一些实施方案中，如上文公开和如描述的ASO或包含其的药物组合物用于在治疗CF中使用。

药盒

在一种实施方案中，本发明提供了组合制剂。在一种实施方案中，“组合制剂”特别定义了“成套部件(kit of parts)”，其意义在于，如以上定义的组合伴侣可以独立给药或通过使用不同的固定组合与不同量的组合伴侣一起给药，即同时、并发(concurrently)、单独或顺序给药。然后，在一些实施方案中，成套部件中的部件可以例如同时施用，或按时间顺序交错施用，即在不同的时间点并且对于成套部件中的任何部件具有相同或不同的时间间隔。在一些实施方案中，组合伴侣总量的比率可以在组合制剂中施用。

在一些实施方案中，本发明的药盒包含：至少一种ASO；和以下的至少一种：至少一种CFTR调节剂；或至少一种CF药物，其中ASO选自SEQ ID No.:4-15，并且其中CFTR调节剂选自：CFTR增效剂、CFTR校正剂和CFTR扩增剂。

CF药物，诸如抗生素、支气管扩张剂和皮质类固醇的类型和剂量，对于本领域普通技术人员来说将是明显的。CF药物诸如抗生素的非限制性实例包括，但不限于，邻氯青霉素(cloxacillin)、双氯青霉素、头孢菌素、甲氧苄啶、磺胺甲噁唑、红霉素、阿莫西林、克拉维酸、氨苄青霉素、四环素、利奈唑胺、妥布霉素或氨曲南赖氨酸、氟喹诺酮、庆大霉素和具有抗假单胞菌(antipseudomonal)活性的单环内酰胺。

在一些实施方案中，以上公开的药盒的组分是无菌的。如本文使用的，术语“无菌的”是指没有生物污染物的状态。任何灭菌方法都是适用的，并且对于本领域普通技术人员来说将是明显的。

在一些实施方案中，药盒的组分被包装在容器内。

在一些实施方案中，容器由选自由以下组成的组的材料制成：薄壁薄膜或塑料(透明或不透明)、基于纸板的、箔、刚性塑料、金属(例如铝)、玻璃等。

在一些实施方案中，如以下描述的，包装药盒的内容物，以允许储存组分直到需要它们。

在一些实施方案中，药盒的一些或所有组分可以包装在合适的包装中以维持无菌性。

在一些实施方案中，药盒的组分储存在主药盒容纳元件内的单独容器，例如盒或类似结构中，可以是或可以不是密封容器，例如以进一步维持药盒的一些或所有组分的无菌性。

在一些实施方案中，使用说明可以记录在合适的记录介质或基底上。例如，使用说明可以印刷在诸如纸或塑料等基底上。

在一些实施方案中，使用说明可以作为包装说明书存在于药盒中，存在于药盒或其组分的容器的标签(即，与包装或子包装相关的标签)中等。在其他实施方案中，使用说明作为存在于合适的计算机可读存储介质，例如，CD-ROM、磁盘等上的电子存储数据文件存在。在其他实施方案中，实际的使用说明不存在于药盒中，但是提供了用于例如通过互联网从远程来源获得使用说明的手段。该实施方案的一个实例是包括Web站点的药盒，在该Web站点上可以查看使用说明和/或从该Web站点可以下载使用说明。与使用说明一样，用于获得使用说明的这种手段被记录在合适的基底上。

产生方法

根据一些实施方案，提供了一种用于产生适于治疗CF的化合物的方法。

在一些实施方案中，该方法包括获得与CFTR前体mRNA的外显子23结合的化合物。在一些实施方案中，该方法包括测定在获得的化合物存在的情况下CFTR前体mRNA的外显子23的跳读。在一些实施方案中，该方法包括选择诱导从所述CFTR前体mRNA中排除外显子23的至少一种化合物。

在一些实施方案中，该方法包括获得与CFTR前体mRNA的外显子23结合的化合物，测定在获得的化合物存在的情况下CFTR前体mRNA的外显子23的跳读，并且选择诱导从CFTR前体mRNA中排除外显子23的至少一种化合物，从而产生适于治疗CF的化合物。

在一些实施方案中，化合物是ASO。在一些实施方案中，ASO是如本文公开和如描述的ASO。

测定外显子跳读的方法是常见的。这样的方法的非限制性实例包括，但不限于，PCR、qPCR、基因测序、RNA印迹、点印迹、原位杂交或其他，所有这些对于本领域普通技术人员来说将是明显的。

在讨论中，除非另有说明，否则诸如“实质上”和“关于”等的修饰本发明实施方案的一个特征或更多个特征的条件或关系特征的形容词应理解为意指该条件或特征被限定在该实施方案预期应用的操作所能接受的公差内。除非另有说明，否则说明书和权利要求书中的词语“或”被认为是包含性的“或”，而不是排他性的“或”，并且表示它所结合的项目中的至少一项或任何组合。

应当理解，如以上和本文别处使用的术语“一(a)”和“一(an)”是指列举的组分中的“一种或更多种”。除非另有具体说明，否则本领域普通技术人员将会清楚，单数的使用包括复数。因此，术语“一(a)”、“一(an)”和“至少一(at least one)”在本申请中可互换使用。

为了更好地理解本教导并且决不限制本教导的范围的目的，除非另有说明，否则说明书和权利要求书中使用的所有表示数量、百分比或比例的数字以及其他数值都应理解为在所有情况下都由术语“约”修饰。因此，除非相反地指出，在以下本说明书和所附权利要求书中所列出的数值参数是可以取决于试图获得的期望特性而变化的近似值。至少，每个数值参数至少应该根据报告的有效数字的数量和通过应用通常的约数技术来解释。

在本申请的说明书和权利要求书中，每个动词“包含(comprise)”、“包括(include)”和“具有(have)”及其词形变化用于表示动词的一个宾语或更多个宾语不一定是动词的一个主语或更多个主语的组分、元件或部分的完整列表。

如本文使用的其他术语意在由它们在本领域中熟知的含义来定义。

除非特别说明或从上下文中明显的，否则如本文使用的，术语“或”被理解为包含性的。

在整个本说明书和权利要求书中，词语“包含(comprise)”或诸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”的变化形式表示包括任何列举的整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组。

如本文使用的，如在整个说明书和权利要求书中使用的，术语“基本上由...组成(consists essentially of)”或诸如“基本上由......组成(consist essentially of)”或“基本上由......组成(consisting essentially of)”的变化形式，表示包括任何列举的整数或整数组，以及任选的包括不实质上改变指定方法、结构或组成的基本或新颖特性的任何列举的整数或整数组。

如本文使用的，术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包含(containing)”、“具有(having)”等可以意指“包括(includes)”、“包括(including)”等；“基本上由......组成(consisting essentially of)”或“基本上包括(consistsessentially)”同样地具有归于美国专利法的含义，并且术语是开放式的，允许比被叙述的特征更多的特征的存在，只要被叙述的基本或新颖特征不被比叙述的特征更多的特征的存在改变，但不包括现有技术的实施方案。在一种实施方案中，术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“具有(having)”可与“包括(consisting)”互换。

在研究并非意在限制的以下实施例之后，本发明的另外的目的、优势、及新特征对本领域普通技术人员将变得明显。另外，如上文描写的以及以下权利要求部分要求保护的本发明的各个实施方案和各个方面中的每一个在以下实施例中均找到实验性支持。

应理解的是，为了清楚而在单独的实施方案的上下文中描述的本发明的某些特征，也可以在单个实施方案中以组合来提供。相反，本发明的为了简洁而在单个实施方案的上下文中描述的各种特征，也可以单独地或以任何合适的子组合或适当地在本发明的任何其他描述的实施方案中提供。在各种实施方案的上下文中描述的某些特征并不被认为是那些实施方案的必需特征，除非实施方案无那些元素则不起作用。

实施例

通常，本文使用的命名法以及在本发明中使用的实验室程序包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。这样的技术在文献中被详尽地解释。参见，例如，“MolecularCloning:A laboratory Manual”Sambrook等人，(1989)；“Current Protocols inMolecular Biology”卷I-III Ausubel,R.M.，编著(1994)；Ausubel等人，“CurrentProtocols in Molecular Biology”,John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal,“A Practical Guide to Molecular Cloning”,John Wiley&Sons,New York(1988)；Watson等人，“Recombinant DNA”,Scientific American Books,New York；Birren等人(编著)“Genome Analysis:A Laboratory Manual Series”,卷1-4,Cold SpringHarbor Laboratory Press,New York(1998)；如美国专利第4,666,828号；第4,683,202号；第4,801,531号；第5,192,659号和第5,272,057号中列出的方法；“Cell Biology:ALaboratory Handbook”,卷I-III Cellis,J.E.,编著(1994)；“Culture of Animal Cells-A Manual of Basic Technique”，Freshney,Wiley-Liss，N.Y.(1994),第三版；“CurrentProtocols in Immunology”卷I-III Coligan J.E.,编著(1994)；Stites等人(编著),“Basic and Clinical Immunology”(第8版),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994)；Mishell和Shiigi(编著),“Strategies for Protein Purification andCharacterization–A Laboratory Course Manual”CSHL Press(1996)；“MonoclonalAntibodies:Methods and Protocols”.Vincent Ossipow,Nicolas Fischer.HumanaPress(2014)；“Monoclonal Antibodies:Methods and Protocols”.MaherAlbitar.Springer Science&Business Media(2007)，所有文献都通过引用并入本文。遍布此文档提供了其他一般参考文件。

材料和方法

细胞转染

将HEK细胞用携带具有完全从其缺失的外显子23的CFTR转录物(CFTR del Ex23)的构建体瞬时转染。根据lipofectamine 2000试剂方案，使用Lipofectamine 2000转染试剂(Invitrogen)，使用以下Lipofectamine量进行转染：96孔–0.15μl，6孔–3μl，10mm板–15μl。

使用膜电位测定研究CFTR功能

将使用CFTR del Ex23构建体转染的HEK细胞在96孔(黑色，平底；corning)板中生长。转染后48小时，将CFTR通道功能如先前描述的(Molinski等人，2015)使用FLIPR膜电位测定进行分析。简言之，将细胞装载蓝色膜电位染料(Molecular Devices)，该染料可以检测跨膜电位的变化。然后，在荧光板阅读器(BioTek Synergy H1)中读取板的基线水平，随后是使用cAMP激动剂佛司可林(10μM；Sigma)的CFTR刺激，DMSO媒介物被用作阴性对照。CFTR介导的质膜去极化被检测为荧光的增加，并且超极化(或复极化)被检测为荧光的减少。为了终止功能测定，将CFTR抑制剂CFTRinh-172(10μM；Cystic Fibrosis FoundationTherapeutics)添加至每个孔中。将跨膜电位的变化针对激活前的值进行归一化。

16HBEge W1282X系统研究

为了分析ASO诱导在突变W1282X存在的情况下在外显子23上跳读的能力，本发明人使用在CFFT实验室开发的细胞系统，16HBEge W1282X。该细胞系统基于永生化支气管上皮细胞系，该细胞系具有包含所有外显子和内含子序列(16HBE14o-)的内源WT CFTR(Cozens等人)。将16HBE14o-使用基于CRISPR的基因编辑进行遗传工程化，以建立对CFTRW1282X突变纯合的等基因细胞系(16HBEge W1282X)(Valley等人)。

转染

根据lipofectamine 2000试剂方案，使用Lipofecatmine 2000转染试剂(Invitrogen)将每种ASO转染到16HBEge W1282X细胞中。在每个实验中，分析不同ASO与用对照ASO处理的细胞相比的作用。

RNA提取

转染后二十四(24)小时，使用RNeasy Mini试剂盒(QIAGEN)提取总RNA。RNA浓度使用nanodrop确定。互补DNA(cDNA)合成使用高容量cDNA逆转录试剂盒(AppliedBiosystems)进行。cDNA通过PCR来分析。

正确和异常剪接的CFTR转录物的定量检测(qPCR)

将实时PCR在QuantStudi 3实时PCR系统中使用

快速高级主混合物(Applied Biosystems)与对包括外显子23的转录物或没有外显子23的转录物特异性的TaqMan探针进行。将表达水平针对GUSb的转录物水平进行归一化。对每个样品进行技术重复分析。使用双ΔCt分析进行分析。

确定这两个转录物之间的比率(PCR)

PCR使用Platinum^TM SuperFi^TM Green PCR主混合物12359-10(Invitrogen)进行。然后，将PCR产物在琼脂糖凝胶上分离，用于检测正确和异常剪接的转录物。将凝胶暴露于UV光下进行可视化，并且记录PCR产物。

通过蛋白质印迹的CFTR蛋白分析

为了蛋白分析，将16HBEge W1282X细胞用10nM指定的ASO转染。转染后二十四(24)h，使用RIPA缓冲液提取蛋白，并且用CFTR抗体通过免疫印迹进行分析。使用六(6)％聚丙烯酰胺凝胶用于蛋白分离。将凝胶转移至硝酸纤维素膜上，并且抗体杂交和化学发光根据标准程序进行。本分析中使用的一级抗体是小鼠抗CFTR 596(Cystic Fibrosis FoundationTherapeutics)和兔抗钙连蛋白(Sigma)。使用辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗兔和抗小鼠二级抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories)。

实施例1

缺乏外显子23的CFTR在功能上与WT CFTR相当

FLIPR^TM(荧光成像板阅读器)是一种功能系统，该功能系统允许通过荧光指示物测量膜电位的变化。在通过加入佛司可林(FSK)实现CFTR的激活并且通过加入CFTR特异性抑制剂(inh-172)验证CFTR通道的特异性时，可以使用FLIPR测试CFTR的激活水平。

发现缺乏外显子23的CFTR蛋白具有残留活性(图1A)。添加增效剂(VX-770)增加通道激活(WT的35％；图1B)。此外，校正剂(VX-809)和增效剂(VX-770)的添加显著增强通道活性(WT的52％；图1B)。因此，外显子23的诱导性跳读(导致CFTR mRNA缺乏该外显子)提供了在功能上显著增加的CFTR蛋白，并且因此，可以用于治疗CF。

实施例2

靶向W1282X突变位点的ASO诱导外显子23跳读

发现与突变的W1282X编码序列互补的ASO有效诱导外显子23跳读(图2)。发现在用SMG1抑制剂抑制NMD的情况下，这种作用是非常显著的(图3A)。携带W1282X突变的细胞没有表现出CFTR蛋白和/或活性。相比之下，与突变的外显子23特异性互补的ASO的引入诱导该外显子的排除，并且导致成熟和缺失的CFTR蛋白的显著产生水平(图4)。

虽然已经具体描述了本发明，但是本领域技术人员将理解，可以进行许多变化和修改。因此，本发明不应被解释为限于具体描述的实施方案，并且通过参考随后的权利要求书，本发明的范围和概念将更容易理解。

序列表

<110> 斯普莱森斯有限公司

儿童医院

<120> 用于治疗囊性纤维化的组合物和方法

<130> SPL-P-002-PCT

<150> US 62/825,302

<151> 2019-03-28

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 756

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

caaaaugggc auuuucaauc uuuuugucau uaguaaaggu cagugauaaa ggaagucugc 60

aucagggguc caauuccuua uggccaguuu cucuauucug uuccaagguu guuugucucc 120

auauaucaac auuggucagg auugaaagug ugcaacaagg uuugaaugaa uaagugaaaa 180

ucuuccacug gugacaggau aaaauauucc aaugguuuuu auugaaguac aauacugaau 240

uauguuuaug gcaugguacc uauaugucac agaagugauc ccaucacuuu uaccuuauag 300

gugggccucu ugggaagaac uggaucaggg aagaguacuu uguuaucagc uuuuuugaga 360

cuacugaaca cugaaggaga aauccagauc gauggugugu cuugggauuc aauaacuuug 420

caacagugaa ggaaagccuu uggagugaua ccacagguga gcaaaaggac uuagccagaa 480

aaaaggcaac uaaauuauau uuuuuacugc uauuugauac uuguacucaa gaaauucaua 540

uuacucugca aaauauauuu guuaugcauu gcugucuuuu uucuccagug caguuuucuc 600

auaggcagaa aagaugucuc uaaaaguuug gaauucucaa auucugguua uugaaauguu 660

cauagcuuug auaguguuuu ucagaagacc aaauuuacag ugggagccuu gggcuuuugu 720

uuuuuaacag cucuuuuuug uuccugcuuc aguggc 756

<210> 2

<211> 356

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

aaaauauucc aaugguuuuu auugaaguac aauacugaau uauguuuaug gcaugguacc 60

uauaugucac agaagugauc ccaucacuuu uaccuuauag gugggccucu ugggaagaac 120

uggaucaggg aagaguacuu uguuaucagc uuuuuugaga cuacugaaca cugaaggaga 180

aauccagauc gauggugugu cuugggauuc aauaacuuug caacagugga ggaaagccuu 240

uggagugaua ccacagguga gcaaaaggac uuagccagaa aaaaggcaac uaaauuauau 300

uuuuuacugc uauuugauac uuguacucaa gaaauucaua uuacucugca aaauau 356

<210> 3

<211> 156

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

gugggccucu ugggaagaac uggaucaggg aagaguacuu uguuaucagc uuuuuugaga 60

cuacugaaca cugaaggaga aauccagauc gauggugugu cuugggauuc aauaacuuug 120

caacagugaa ggaaagccuu uggagugaua ccacag 156

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的

<400> 4

gcuuuccuuc acuguugc 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的

<400> 5

cuuuccuuca cuguugca 18

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的

<400> 6

cuuuccuuca cuguugcaaa 20

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的

<400> 7

ggcuuuccuu cacuguug 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的

<400> 8

aaggcuuucc uucacugu 18

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的

<400> 9

ccaaaggcuu uccuucacug 20

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的

<400> 10

caaaggcuuu ccuucacu 18

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的

<400> 11

uccuucacug uugcaaagu 19

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的

<400> 12

caagaggccc accuauaag 19

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的

<400> 13

ccaccuauaa gguaaaagug 20

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的

<400> 14

ccuuuugcuc accuguggu 19

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的

<400> 15

cucaccugug guaucacu 18

<210> 16

<211> 756

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 16

caaaaugggc auuuucaauc uuuuugucau uaguaaaggu cagugauaaa ggaagucugc 60

aucagggguc caauuccuua uggccaguuu cucuauucug uuccaagguu guuugucucc 120

auauaucaac auuggucagg auugaaagug ugcaacaagg uuugaaugaa uaagugaaaa 180

ucuuccacug gugacaggau aaaauauucc aaugguuuuu auugaaguac aauacugaau 240

uauguuuaug gcaugguacc uauaugucac agaagugauc ccaucacuuu uaccuuauag 300

gugggccucu ugggaagaac uggaucaggg aagaguacuu uguuaucagc uuuuuugaga 360

cuacugaaca cugaaggaga aauccagauc gauggugugu cuugggauuc aauaacuuug 420

caacagugua ggaaagccuu uggagugaua ccacagguga gcaaaaggac uuagccagaa 480

aaaaggcaac uaaauuauau uuuuuacugc uauuugauac uuguacucaa gaaauucaua 540

uuacucugca aaauauauuu guuaugcauu gcugucuuuu uucuccagug caguuuucuc 600

auaggcagaa aagaugucuc uaaaaguuug gaauucucaa auucugguua uugaaauguu 660

cauagcuuug auaguguuuu ucagaagacc aaauuuacag ugggagccuu gggcuuuugu 720

uuuuuaacag cucuuuuuug uuccugcuuc aguggc 756

Claims

1.一种用于治疗有相应需要的受试者的囊性纤维化(CF)的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的合成反义寡核苷酸(ASO)，其中所述ASO诱导囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)前体mRNA的外显子23的跳读，从而治疗所述受试者的CF，并且其中所述ASO靶向位于所述CFTR前体mRNA的外显子23中的CF赋予突变。

2.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括向所述受试者施用治疗有效量的一种或更多种CFTR调节剂。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述CFTR调节剂增加CFTR门打开的持续时间、通过所述CFTR门的氯化物流量、CFTR蛋白的正确折叠、锚定至细胞膜的CFTR的数量或其任何组合。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述CFTR调节剂选自由以下组成的组：增效剂、校正剂和扩增剂。

5.根据权利要求2至4中任一项所述的方法，其中所述CFTR调节剂是伊伐卡托、鲁马卡托、替扎卡托、elexacaftor、VX-659、VX-152或VX-440或其任何组合。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述ASO包含选自由以下组成的组的主链：磷酸-核糖主链、磷酸-脱氧核糖主链、硫代磷酸酯-脱氧核糖主链、2’-O-甲基-硫代磷酸酯主链、磷酸二酰胺吗啉代主链、肽核酸主链、2-甲氧基乙基硫代磷酸酯主链、交替锁核酸主链、硫代磷酸酯主链、N3’-P5’氨基磷酸酯、2’-脱氧-2’-氟代-β-d-阿拉伯核酸、环己烯核酸主链核酸、三环-DNA(tcDNA)核酸主链及其组合。

7.根据权利要求1或6中任一项所述的方法，其中所述ASO包含14个至25个碱基。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述ASO包含17个至22个碱基。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述ASO与以下各项具有至少75％的互补性：

a.由以下组成的序列：CAAAAUGGGCAUUUUCAAUCUUUUUGUCAUUAGUAAAGGUCAGUGAUAAAGGAAGUCUGCAUCAGGGGUCCAAUUCCUUAUGGCCAGUUUCUCUAUUCUGUUCCAAGGUUGUUUGUCUCCAUAUAUCAACAUUGGUCAGGAUUGAAAGUGUGCAACAAGGUUUGAAUGAAUAAGUGAAAAUCUUCCACUGGUGACAGGAUAAAAUAUUCCAAUGGUUUUUAUUGAAGUACAAUACUGAAUUAUGUUUAUGGCAUGGUACCUAUAUGUCACAGAAGUGAUCCCAUCACUUUUACCUUAUAGGUGGGCCUCUUGGGAAGAACUGGAUCAGGGAAGAGUACUUUGUUAUCAGCUUUUUUGAGACUACUGAACACUGAAGGAGAAAUCCAGAUCGAUGGUGUGUCUUGGGAUUCAAUAACUUUGCAACAGUGAAGGAAAGCCUUUGGAGUGAUACCACAGGUGAGCAAAAGGACUUAGCCAGAAAAAAGGCAACUAAAUUAUAUUUUUUACUGCUAUUUGAUACUUGUACUCAAGAAAUUCAUAUUACUCUGCAAAAUAUAUUUGUUAUGCAUUGCUGUCUUUUUUCUCCAGUGCAGUUUUCUCAUAGGCAGAAAAGAUGUCUCUAAAAGUUUGGAAUUCUCAAAUUCUGGUUAUUGAAAUGUUCAUAGCUUUGAUAGUGUUUUUCAGAAGACCAAAUUUACAGUGGGAGCCUUGGGCUUUUGUUUUUUAACAGCUCUUUUUUGUUCCUGCUUCAGUGGC(SEQ ID NO：1)；

b.由以下组成的序列：CAAAAUGGGCAUUUUCAAUCUUUUUGUCAUUAGUAAAGGUCAGUGAUAAAGGAAGUCUGCAUCAGGGGUCCAAUUCCUUAUGGCCAGUUUCUCUAUUCUGUUCCAAGGUUGUUUGUCUCCAUAUAUCAACAUUGGUCAGGAUUGAAAGUGUGCAACAAGGUUUGAAUGAAUAAGUGAAAAUCUUCCACUGGUGACAGGAUAAAAUAUUCCAAUGGUUUUUAUUGAAGUACAAUACUGAAUUAUGUUUAUGGCAUGGUACCUAUAUGUCACAGAAGUGAUCCCAUCACUUUUACCUUAUAGGUGGGCCUCUUGGGAAGAACUGGAUCAGGGAAGAGUACUUUGUUAUCAGCUUUUUUGAGACUACUGAACACUGAAGGAGAAAUCCAGAUCGAUGGUGUGUCUUGGGAUUCAAUAACUUUGCAACAGUGUAGGAAAGCCUUUGGAGUGAUACCACAGGUGAGCAAAAGGACUUAGCCAGAAAAAAGGCAACUAAAUUAUAUUUUUUACUGCUAUUUGAUACUUGUACUCAAGAAAUUCAUAUUACUCUGCAAAAUAUAUUUGUUAUGCAUUGCUGUCUUUUUUCUCCAGUGCAGUUUUCUCAUAGGCAGAAAAGAUGUCUCUAAAAGUUUGGAAUUCUCAAAUUCUGGUUAUUGAAAUGUUCAUAGCUUUGAUAGUGUUUUUCAGAAGACCAAAUUUACAGUGGGAGCCUUGGGCUUUUGUUUUUUAACAGCUCUUUUUUGUUCCUGCUUCAGUGGC(SEQ ID NO：16)，或者二者。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述ASO与由以下组成的序列具有至少75％的互补性：AAAAUAUUCCAAUGGUUUUUAUUGAAGUACAAUACUGAAUUAUGUUUAUGGCAUGGUACCUAUAUGUCACAGAAGUGAUCCCAUCACUUUUACCUUAUAGGUGGGCCUCUUGGGAAGAACUGGAUCAGGGAAGAGUACUUUGUUAUCAGCUUUUUUGAGACUACUGAACACUGAAGGAGAAAUCCAGAUCGAUGGUGUGUCUUGGGAUUCAAUAACUUUGCAACAGUGGAGGAAAGCCUUUGGAGUGAUACCACAGGUGAGCAAAAGGACUUAGCCAGAAAAAAGGCAACUAAAUUAUAUUUUUUACUGCUAUUUGAUACUUGUACUCAAGAAAUUCAUAUUACUCUGCAAAAUAU(SEQ IDNO：2)。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述ASO与所述SEQ ID NO：1、与所述SEQ ID NO：16或与所述SEQ ID NO：2具有至少80％的互补性。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述ASO与由以下组成的序列具有至少80％的互补性：GUGGGCCUCUUGGGAAGAACUGGAUCAGGGAAGAGUACUUUGUUAUCAGCUUUUUUGAGACUACUGAACACUGAAGGAGAAAUCCAGAUCGAUGGUGUGUCUUGGGAUUCAAUAACUUUGCAACAGUGAAGGAAAGCCUUUGGAGUGAUACCACAG(SEQ ID NO：3)。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中与SEQ ID No.：1-3和SEQ ID No.：16中任一项相比，所述ASO包含至多3个错配碱基。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述3个错配碱基中的至多一个错配碱基位于距离所述ASO的5’引发末端不多于3个碱基处。

15.根据权利要求13所述的方法，其中所述3个错配碱基中的至多一个错配碱基位于距离所述ASO的3’引发末端不多于3个碱基处。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述ASO包含与位于所述SEQ IDNO：1的位置429、所述SEQ ID NO：2的位置229或所述SEQ ID NO：3的位置129处的腺嘌呤互补的尿嘧啶。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述ASO在所述尿嘧啶上游包含3个至16个核苷酸。

18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述ASO包含：GCUUUCCUUCACUGUUGC(SEQ ID NO：4)；CUUUCCUUCACUGUUGCA(SEQ ID NO：5)；CUUUCCUUCACUGUUGCAAA(SEQ ID NO：6)；GGCUUUCCUUCACUGUUG(SEQ ID NO：7)；AAGGCUUUCCUUCACUGU(SEQ ID NO：8)；CCAAAGGCUUUCCUUCACUG(SEQ ID NO：9)；CAAAGGCUUUCCUUCACU(SEQ ID NO：10)；或UCCUUCACUGUUGCAAAGU(SEQ ID NO：11)。

19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述受试者包含选自由以下组成的组的一个或更多个突变：W1282X、G1244E、T1246I、3876de1A、3878de1G、S1251N、L1254X、S1255P、S1255X、3905insT、D1270N、R1283M、Q1291R，其中所述X表示翻译终止。

20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述突变是W1282X，其中所述X表示翻译终止。

21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述治疗包括改善CF选自由以下组成的组的至少一个临床参数：肺功能、首次肺恶化的时间、体重变化、身高变化、体重指数(BMI)变化、汗液氯化物浓度变化、肺恶化的次数和/或持续时间、肺恶化的住院总天数以及对用于窦肺体征或症状的抗生素疗法的需要。

22.一种组合物，所述组合物包含ASO，所述ASO包含与CFTR前体mRNA具有至少80％的互补性的14个至25个碱基，并且其特征在于诱导所述CFTR前体mRNA的外显子23的跳读，其中所述剪接活性通过靶向位于所述CFTR前体mRNA的外显子23中的CF赋予突变来诱导。

23.根据权利要求22所述的组合物，其中所述ASO包含17个至22个碱基。

24.根据权利要求22或23所述的组合物，其中所述ASO包含与位于以下的任一项处的腺嘌呤互补的尿嘧啶：所述SEQ ID NO:1的位置429、所述SEQ ID NO:2的位置229或所述SEQID NO:3的位置129。

25.根据权利要求22至24中任一项所述的组合物，其中所述ASO在所述尿嘧啶上游包含4个至18个核苷酸。

26.根据权利要求22至25中任一项所述的组合物，其中所述ASO包含：GCUUUCCUUCACUGUUGC(SEQ ID NO:4)；CUUUCCUUCACUGUUGCA(SEQ ID NO:5)；CUUUCCUUCACUGUUGCAAA(SEQ ID NO:6)；GGCUUUCCUUCACUGUUG(SEQ ID NO:7)；AAGGCUUUCCUUCACUGU(SEQ ID NO:8)；CCAAAGGCUUUCCUUCACUG(SEQ ID NO:9)；CAAAGGCUUUCCUUCACU(SEQ ID NO:10)；或UCCUUCACUGUUGCAAAGU(SEQ ID NO:11)。

27.根据权利要求22至26中任一项所述的组合物，其中所述ASO包含化学修饰的主链。

28.根据权利要求27所述的组合物，其中所述化学修饰的主链包括：磷酸-核糖主链、磷酸-脱氧核糖主链、硫代磷酸酯-脱氧核糖主链、2’-O-甲基-硫代磷酸酯主链、磷酸二酰胺吗啉代主链、肽核酸主链、2-甲氧基乙基硫代磷酸酯主链、交替锁核酸主链、硫代磷酸酯主链、N3’-P5’氨基磷酸酯、2’-脱氧-2’-氟代-β-d-阿拉伯核酸、环己烯核酸主链核酸、三环-DNA(tcDNA)核酸主链及其组合。

29.根据权利要求22至28中任一项所述的组合物，所述组合物还包含药学上可接受的载体。

30.根据权利要求22至29中任一项所述的组合物，所述组合物用于在诱导所述CFTR前体mRNA的外显子23的跳读中使用。

31.根据权利要求22至30中任一项所述的组合物，所述组合物是吸入组合物。

32.根据权利要求22至31中任一项所述的组合物，所述组合物用于在治疗CF中使用。

33.一种药盒，所述药盒包含：

a.至少一种ASO；

以及以下中的至少一项：

b.至少一种CFTR调节剂；或者

c.至少一种CF药物，

其中所述ASO选自由SEQ ID No.:4-11组成的组，并且其中所述CFTR调节剂选自由以下组成的组：CFTR增效剂、CFTR校正剂、翻译通读剂和CFTR扩增剂。

34.根据权利要求33所述的药盒，其中所述CFTR调节剂是伊伐卡托、鲁马卡托、替扎卡托、elexacaftor、VX-659、VX-152或VX-440或其任何组合。

35.根据权利要求33或34所述的药盒，其中所述CF药物是抗生素药物、支气管扩张剂、皮质类固醇或其任何组合。

36.一种用于产生适于治疗CF的化合物的方法，所述方法包括：获得与位于CFTR前体mRNA的外显子23中的CF赋予突变结合的化合物，测定在所述获得的化合物存在的情况下的所述CFTR前体mRNA的外显子23的跳读，并且选择诱导从所述CFTR前体mRNA中排除外显子23的至少一种化合物，从而产生适于治疗CF的化合物。

37.根据权利要求36所述的方法，其中所述化合物是ASO。