CN113621370A - 铪掺杂荧光碳点及其制备方法与应用 - Google Patents

铪掺杂荧光碳点及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种铪掺杂荧光碳点及其制备方法与应用，属于荧光碳点技术领域。本发明的荧光碳点的制备方法为：先将摩尔比为3:9:(1‑2)的柠檬酸、硫脲和氯化铪溶于水中，超声至分散均匀，得到混合溶液；然后将混合溶液在180℃加热0.5‑1.5h，冷却至室温，得到浅棕色固体；最后将浅棕色固体溶于去离子水中，离心后，将所得上清液在去离子水中透析，冷冻干燥，得到铪掺杂荧光碳点。该荧光碳点不仅稳定性好、生物相容性好、水溶性好、光学性质好，而且具备显著的计算机断层扫描成像性能和优秀的肿瘤蓄积能力，铪掺杂荧光碳点能够实现生物体内的快速和长期成像，利于并通过肾脏代谢排出体外。

Description

铪掺杂荧光碳点及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于荧光碳点技术领域，具体涉及一种铪掺杂荧光碳点及其制备方法与应用。
背景技术
在过去的几十年中，包括荧光成像(FI)、X射线计算机断层扫描(CT)、光声成像(PI)和磁共振成像(MRI)在内的医学成像技术已经成为疾病诊断和监控最普遍的技术。遗憾的是，单一的医学成像技术并不能满足所有的医学诊断的要求。众所周知，FI具有高灵敏度，低成本和操作简便的特点，因此对早期非侵入性诊断具有良好的效果，但由于激发光源难以穿透深层组织，因此在临床应用中受到限制。另一方面，尽管CT具有诸如高空间分辨率之类的固有优点，但它仍具有灵敏度低的缺陷。在此基础上，通过FI和CT的双模式成像技术以提高诊断的准确性和敏感性非常值得科研人员的关注。
现有技术中，已经开发了基于有机染料和纳米晶体的双模式FI/CT探针。然而，它们中的一些具有低水溶性、差的稳定性、高毒性以及繁琐的合成程序，成为临床诊断的主要绊脚石。
荧光碳点(CDs)相比于其他探针具有许多优势，例如独特的光学性能，高稳定性，良好的生物相容性和水溶性。这些独特的功能使CDs可以用作多功能纳米平台，在生物成像，传感和癌症治疗中具有潜在的应用。研究表明，杂原子掺杂可以有效地调整CDs的内在特性，以用于其生物医学应用。例如，制备了Gd/Yb掺杂的CDs，用于异种移植肿瘤的MRI/CT/FI的多模式成像。锰掺杂的CDs用于MRI/FI成像引导的光动力疗法。与原位癌相比，这些CDs主要对皮下肿瘤模型进行成像。此外，所报道的位于肿瘤部位的CDs都是经过较长时间才能从体内清除。因此，开发具有快速肿瘤蓄积和肾脏清除的显影剂，在临床上具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种铪掺杂荧光碳点及其制备方法与应用，该荧光碳点不仅具有良好的稳定性、优良的生物相容性好、高水溶性和独特的光学性质，而且具备显著的计算机断层扫描成像和荧光成像功能，以及优异的肿瘤靶向蓄积能力。铪掺杂荧光碳点能够在1min内实现肿瘤的快速成像。与临床使用的碘造影剂相比，铪掺杂荧光碳点在体内停留时间更长，便于对病灶部位进行重点观察，获取病灶重要信息。此外，铪掺杂荧光碳点能够通过肾脏代谢排出体外，有效地降低对生物体的毒副作用。
本发明提供一种铪掺杂荧光碳点，该荧光碳点以摩尔比为3:9:(1-2)的柠檬酸(CA)、硫脲(TU)和氯化铪(HfCl4)为原料，通过热解法制备而成。
优选的是，所述柠檬酸、硫脲和氯化铪的摩尔比为3:9:1。
本发明还提供上述铪掺杂荧光碳点的制备方法：
步骤一、按摩尔比将柠檬酸、硫脲和氯化铪溶解于水中，得到混合溶液；
步骤二、将混合溶液在180℃加热0.5-1.5h，冷却至室温，得到浅棕色固体；
步骤三、将浅棕色固体溶于去离子水中，离心后，将所得上清液在去离子水中透析，冷冻干燥，得到铪掺杂荧光碳点。
优选的是，所述步骤一中，通过超声10min以上将柠檬酸、硫脲和氯化铪溶解于水中。
优选的是，所述步骤二中，加热时间为1h。
优选的是，所述步骤三中，以10000rpm离心5min以上。
优选的是，所述步骤三中，透析袋的截留分子量为3.5KDa，用去离子水透析24h以上。
优选的是，所述步骤三中，-60℃干燥24h以上。
本发明还提供上述铪掺杂荧光碳点在制备造影剂中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明的铪掺杂荧光碳点具有良好的生物相容性，优异的水溶性和高稳定性。
本发明的铪掺杂荧光碳点具有良好的光学行为和出色的CT成像能力，可以实现FI和CT双模式成像。
本发明的铪掺杂荧光碳点可以靶向蓄积于肿瘤部位，用作肿瘤造影剂，实现肿瘤靶向的FI/CT成像。与其它纳米材料相比，铪掺杂荧光碳点能通过肾脏快速排出体外，减少在体内的残留，降低了毒副作用；与临床CT造影剂碘海醇相比，本发明的铪掺杂荧光碳点在原位肝癌中表现出更出色的CT显影能力，更长的成像时间和肿瘤靶向能力。
本发明的铪掺杂荧光碳点的制备方法为一锅热解方法，操作简单，适用于大规模生产。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明实施例1的HfCDs的透射电子显微镜(TEM)图像；
图2为本发明实施例1的HfCDs的粒径分布；
图3为本发明实施例1的HfCDs的高分辨率透射电子显微镜(HR-TEM)图像；
图4为图3中区域A的局部放大图；
图5为图3中区域B的局部放大图；
图6为本发明实施例1的HfCDs的能量色散X射线(EDX)光谱；
图7为本发明实施例1的HfCDs的X射线粉末衍射(XRD)图谱；
图8为本发明实施例1的HfCDs在200-800nm范围内的紫外-可见吸收(UV/vis)光谱；
图9为本发明实施例1的HfCDs在不同激发波长下的光致发光(PL)光谱；
图10中，a、b、c分别为本发明实施例1的HfCDs在365nm、400nm和500nm的激发下的照片；
图11为本发明实施例1的HfCDs在室温下存放30天后的光致发光光谱(在360nm处激发)；
图12为本发明实施例1的HfCDs的荧光衰减曲线；
图13为本发明实施例1的HfCDs和对比例1的CDs的热重分析(TGA)曲线；
图14为本发明实施例1的HfCDs和对比例1的CDs的傅立叶变换红外(FTIR)光谱。
图15为本发明实施例1的HfCDs的全扫描X射线光电子(XPS)光谱；
图16为图15中C1s的高分辨率光谱；
图17为图15中N1s的高分辨率光谱；
图18为图15中O1s的高分辨率光谱；
图19为图15中S2p的高分辨率光谱；
图20为图15中Hf 4f7/2的Hf的高分辨率光谱；
图21为用不同浓度的本发明实施例1的HfCDs在37℃下孵育24h的HeLa和L929细胞的存活率。
图22为HeLa细胞与不同浓度(100、200和500μg/mL)的本发明实施例1的HfCDs在37℃下孵育6h，在488nm和555nm激发下的激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)图像；
图23为用ImageJ软件定量分析图22的荧光强度；
图24为100μg/mL的本发明实施例1的HfCDs与HeLa细胞在37℃孵育不同时间，在488nm和555nm激发下激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)图像；
图25为用ImageJ软件定量分析图24的荧光强度；
图26为瘤内注射本发明实施例1的HfCDs后随时间推移H22荷瘤小鼠体内荧光成像；
图27为定量分析图27的肿瘤部位的平均荧光信号随时间的变化；
图28中，分别为本发明实施例1的HfCDs中铪浓度以及碘海醇中碘的浓度分别为3.6mM、7.2mM、14.5mM、29.0mM和58.0mM的体外CT图像；
图29为本发明实施例1的HfCDs或碘海醇的水溶液的CT值与铪或碘的浓度的关系；
图30为静脉注射本发明实施例1的HfCDs后，H22原位肝脏荷瘤小鼠的体内CT图像，a)为轴向表面，b)为冠状面，c)为CT成像的3D重建；
图31为静脉注射本发明实施例1的HfCDs后，在不同时间收集的小鼠的主要器官(肿瘤、肝和膀胱)的CT值；
图32为静脉注射碘海醇后，H22原位肝脏荷瘤小鼠的体内CT图像，a)为冠状面，b)为轴向表面，c)为CT成像的3D重建；
图33为静脉注射碘海醇后，在不同时间收集的小鼠的主要器官(肿瘤、肝和膀胱)的CT值；
图34为静脉注射本发明实施例1的HfCDs后的不同时间间隔下，小鼠的离体主要器官的a)明场，b)FI和c)CT图像；
图35为静脉注射本发明实施例1的HfCDs后不同时间点(1、10、30、60min)收集的小鼠的主要器官的CT值；
图36为静脉注射本发明实施例1的HfCDs后不同时间点(1、10、30、60min)收集的小鼠的主要器官的FI强度的定量分析；
图37为注射不同剂量(0.2mg/g，0.4mg/g和0.8mg/g)的本发明实施例1的HfCDs的健康小鼠的体重；
图38中，a)和b)分别为7d和14d处理后，对照组和不同剂量实验组小鼠的血清生化分析；
图39中，a)和b)分别为7d和14d处理后，对照组和不同剂量实验组小鼠的血液学数据；
图40中，分别为0.8mg/g剂量的尾静脉给药14天后，小鼠主要器官(心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏)的H&E染色；
图41为不同浓度的本发明实施例1的HfCDs的溶血实验。
具体实施方式
为了进一步了解本发明，下面结合具体实施方式对本发明的优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点而不是对本发明专利要求的限制。
本发明提供一种铪掺杂荧光碳点，该荧光碳点以摩尔比为3:9:(1-2)的柠檬酸、硫脲和氯化铪为原料，通过热解法制备而成。
本发明还提供上述铪掺杂荧光碳点的制备方法：
步骤一、将摩尔比为3:9:(1-2)的柠檬酸、硫脲和氯化铪溶解于水中，得到混合溶液；
步骤二、将混合溶液在180℃加热0.5-1.5h，优选1h，冷却至室温，得到浅棕色固体；
步骤三、将浅棕色固体溶于去离子水中，离心后，将所得上清液在去离子水中透析，冷冻干燥，得到铪掺杂荧光碳点。
上述技术方案，步骤一中，通常通过超声的方式将柠檬酸、硫脲和氯化铪溶解于水中，时间通常在10min以上。
上述技术方案，步骤三中，离心至分层即可，优选在10000rpm离心5min以上。
上述技术方案，步骤三中，采用透析袋透析，透析袋的截留分子量为3.5KDa，优选用水透析24h以上。
上述技术方案，步骤三中，-60℃干燥24h以上。
本发明还提供上述铪掺杂荧光碳点作为显影剂的应用。应用方法没有特殊要求，参照现有荧光碳点类造影剂的应用方法即可。
实施例1
步骤一、将摩尔比为3:9:1的柠檬酸、硫脲和氯化铪溶于5mL水中，超声10min分散均匀，得到混合溶液；
步骤二、将混合溶液置于圆底烧瓶中，用油浴将混合溶液在180℃加热1h，冷却至室温，得到浅棕色固体；
步骤三、将浅棕色固体溶于去离子水中，以10000rpm离心5min后，将所得上清液在去离子水中透析24h以除去小分子(透析袋的截留分子量为3.5KDa)，冷冻干燥，得到铪掺杂荧光碳点，记作HfCDs。
对比例1
步骤一、将摩尔比为1:3的柠檬酸和硫脲溶于5mL水中，超声10min分散均匀，得到混合溶液；
步骤二、将混合溶液置于圆底烧瓶中，用油浴将混合溶液在180℃加热1h，冷却至室温，得到浅棕色固体；
步骤三、将浅棕色固体溶于去离子水中，以10000rpm离心5min后，将所得上清液在去离子水中透析24h以除去小分子(透析袋的截留分子量为3.5KDa)，冷冻干燥，得到荧光碳点，记作CDs。
对实施例1得到的HfCDs和对比例1得到的CDs的性能进行检测。
使用Shimadzu UV-2450PC UV-vis分光光度计获得紫外可见吸收光谱。荧光强度测试是在PerkinElmer LS-55分光光度计上进行的。通过在以100kV的加速电压操作的JEOLJEM-1011电子显微镜上进行的透射电子显微镜来测量HfCDs的形态。在4000至500cm-1的Bruker Vertex 70光谱仪上记录傅立叶变换红外光谱。X射线光电子能谱是在ThermoScientific ESCALAB 250 Multitechnique表面分析仪上获得的。使用Zeiss LSM 700(瑞士苏黎世)拍摄共聚焦激光扫描显微镜图像。Dulbecco的改良Eagle培养基，RPMI-1640培养基和胎牛血清均购自Sigma-Aldrich。通过酶标仪(BioTek，EXL808)在490nm下测量MTT测定。Maestro 500FL检测了体内光学成像。通过临床CT成像系统Activation 16isx-031CT，TOSHIB测量CT成像。HeLa(人类宫颈癌)和L929(小鼠成纤维)细胞系在含有10％(v:v)热灭活胎牛血清(FBS，GIBCO)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM，GIBCO)中培养。在37℃，5％CO2的加湿培养箱中培养细胞，每天更换培养基一次。由吉林大学实验动物中心(中国长春)提供雌性昆明(KM)小鼠(年龄约4-6周；体重约30g)。所有小鼠均维持在所需条件下，并在整个实验过程中自由进食食物和S-8水。通过向小鼠的原位肝，原位子宫颈和右下肢注射H22肝细胞癌细胞(1×106)，建立小鼠肝癌异种移植肿瘤模型。
1.1HfCDs的形态和粒子大小
图1为实施例1的HfCDs的透射电子显微镜图像，图2为实施例1的HfCDs的粒径分布，从图1-2可以看出，本发明的HfCDs具有良好的单分散性，平均直径为3.73nm。图3为实施例1的HfCDs的高分辨率透射电子显微镜图像(图中，每个圆圈表示一个HfCDs纳米颗粒)，图4为图3中区域A的局部放大图，图5为图3中区域B的局部放大图。从图3可以看出，本发明的HfCDs大多数具有晶格结构。从图4-5可以看出，HfCDs显示了清晰的晶格条纹，晶格条纹间距值分别为0.28nm和0.32nm，分别对应于石墨晶体的(020)和(002)晶面。图6为实施例1的HfCDs的能量色散X射线光谱(EDX)，从图6可以看出，铪确实成功掺入HfCDs中。图7为实施例1的HfCDs的X射线粉末衍射(XRD)图谱，从图7可以看出，在26°处显示一个典型峰，对应于石墨烯的(002)晶面，这与HR-TEM一致，进一步证实了HfCDs具有高结晶石墨结构。
1.2HfCDs的光学性质
图8为实施例1的HfCDs在200-800nm范围内的紫外-可见吸收光谱；从图8可以看出，HfCDs的吸收光谱在240nm和332nm处有两个吸收峰，这分别归因于C＝C键的π-π*跃迁和C＝O键的n-π*跃迁。图9为实施例1的HfCDs在不同激发波长下的光致发光光谱，图10中，a、b、c分别为HfCDs在365nm、400nm和500nm的激发下的照片。从图9-10可以看出，HfCDs显示了显著的激发依赖性行为，在365nm、400nm和500nm的激发下，HfCDs可以分别发出蓝色、绿色和红色的光，即HfCDs具有多色发光的特性。图11为实施例1的HfCDs30天后的光致发光光谱(在360nm处激发)。从图11可以看出，HfCDs的PL强度在30天后几乎保持恒定，表明HfCDs具有优异的光稳定性。另外，通过仪器测量得出绝对荧光量子产率为18.4％。图12为实施例1的HfCDs的发光衰减曲线。如图12所示，HfCDs发光衰减曲线为双指数，通过指数拟合生成的参数(指前因子A1＝0.34，A2＝0.67；弛豫时间τ1＝3.04ns，τ2＝10.13ns)，计算平均衰减时间为9.18ns。以上结果表明，HfCDs具有良好的荧光性能，可用于荧光成像。
1.3HfCDs和CDs的热稳定性
图13为实施例1的HfCDs和对比例1的CDs的热重分析曲线。从图13可以看出，对于CDs，在200℃时失重率为9.5％，当温度达到500℃时，失重率为53.5％，最终，在800℃时，失重率达到70.5％；对于HfCDs，在200℃时，失重率为11.1％，在500℃时，失重为39.5％，在800℃时，失重率为46.2％，即HfCDs比CDs具有更高的热稳定性。也能够基于此数据推断出，HfCDs中铪的含量为24.3wt％。表1为实施例1的HfCDs的电感耦合等离子体质谱图，测定的铪含量为25.8wt％，基本与TGA的含量一致。
表1实施例1的HfCDs的电感耦合等离子体质谱数据(ICP-MS)
单位 ppm
HfCDs总质量 3000.0
Hf含量平均值 776.0
1.4HfCDs和CDs的官能团分析
图14为实施例1的HfCDs和对比例1的CDs的傅立叶变换红外光谱。从图14可以看出，HfCDs和CDs的表面上有许多官能团：N-H(3421cm-1)，-OH(3204cm-1)，C＝O(1633cm-1)，C-N(1370cm-1)，C-O(1078cm-1)和C-S(701cm-1)，＝C-H(961cm-1)和C-H(863cm-1)。除此之外，在HfCDs的傅立叶变换红外光谱中，可以在618cm-1处观察到Hf-O的振动带。图15为实施例1的HfCDs的全扫描X射线光电子光谱，图16为C1s的高分辨率光谱，图17为N1s的高分辨率光谱，图18为O1s的高分辨率光谱，图19为S 2p的高分辨率光谱，图20为Hf 4f7/2的Hf的高分辨率光谱。从图15-20可以看出，在全扫描X射线光电子光谱中有Hf 4f7/2(15.4eV)，S 2p(162.1eV)，C 1s(283.4eV)，N 1s(400.7eV)和O1s(532.7eV)的五个主要峰HfCDs(图15)。C1s的高分辨率光谱(图16)可以分为C-C/C＝C(284.5eV)，C-N/C-O(285.8eV)和C＝O/C＝N(288.4eV)的三个峰。N 1s的高分辨率光谱(图17)被解卷积为399.8eV(C-N)和401.0eV(N-H)的两个峰。O 1s的高分辨率光谱(图18)可以拟合成两个峰，分别位于531.2eV(C-O)和533.0eV(C＝O)。位于163.3eV的S 2p峰对应于C-S(图19)。Hf 4f7/2的Hf结合能(HfO2，16.9eV；Ntv Ox，它是本征氧化物，18.6eV)(图20)。XPS的结果与FTIR的结果一致。
1.5HfCDs的生物相容性
使用标准的噻唑蓝溴化四氮唑(MTT)比色法对HfCDs在15.6至1000μg/mL的不同浓度下进行了体外毒性试验。简而言之，将以对数生长期收获的HeLa/L929细胞分别以2×103个细胞/孔的初始密度接种在96孔板中，并在37℃的100μL的DMEM中于5％CO2环境中孵育过夜。除去孵育培养基后，将用细胞培养基稀释至所需浓度的HfCDs(100μL)分散液添加到细胞孔中。用无药物处理的细胞作为对照。孵育24h后，添加浓度为5mg/mL的20μLMTT的PBS溶液，并将其在37℃下再孵育4h。小心除去培养基上清液后，向每个孔中加入150μL二甲基亚砜(DMSO)，以溶解形成的蓝紫色结晶甲臜晶体。最后，将板摇动3min，并通过酶标仪在490nm处定量紫色产物的吸光度。
图21为用不同浓度的HfCDs在37℃下孵育24h的HeLa/L929细胞的存活率。从图21可以看出，即使以最大浓度1000μg/mL孵育24h后，仍有超过95％的HeLa细胞存活，表明HfCDs具有出色的细胞相容性。这种低细胞毒性为HfCDs的生物医学应用点奠定了坚实的基础。
1.6HfCDs的体外荧光成像能力
通过使用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)研究HfCDs的细胞摄取。将HeLa细胞以每孔2×105个细胞的密度接种在6孔板中(每个孔中放入干净的盖玻片)，并粘附24h。然后，将培养基替换为用新鲜培养基稀释至最终浓度分别为100μg/mL、200μg/mL和500μg/mL的HfCDs。之后，将细胞在37℃下孵育6h。随后，除去上清液，并用PBS(pH＝7.4)温和洗涤细胞3次，用4％多聚甲醛(1mL/孔)固定15min，并用冷PBS洗涤三次。通过CLSM观察细胞成像效果。
图22为HeLa细胞与不同浓度(100、200和500μg/mL)的HfCDs在37℃下孵育6h，在488nm和555nm激发下的激光扫描共聚焦显微镜图像。图23为用ImageJ软件定量分析荧光强度。从图22和图23可以看出，对于各种浓度和激发波长的处理，均未观察到明显的荧光差异。
图24为100μg/mL的HfCDs与HeLa细胞在37℃孵育2h、4h和6h后，在488nm和555nm激发下激光扫描共聚焦显微镜图像。图25为用ImageJ软件定量分析荧光强度。从图24和图25可以看出，HeLa细胞的荧光强度随着孵育时间的增加而增强，表明HfCDs的内吞作用具有时间依赖性。
通过Maestro 500光学成像系统，用HfCDs对肝癌22(H22)荷瘤小鼠进行体内荧光成像。结果如图26所示，当将HfCDs(3mg/mL，0.2mL)瘤内注射到小鼠中时，在肿瘤部位检测到强荧光信号，然后随时间减弱。即使注射72h后仍能观察到微弱的荧光信号。图27是不同时间内，肿瘤部位的平均荧光信号的定量分析。结果表明HfCDs可以在肿瘤部位长期积累，HfCDs有望应用于生物成像。
1.7HfCDs的X射线衰减能力
使用商用造影剂(碘海醇)作为对照研究了HfCDs的X射线衰减能力。结果如图28和图29所示，CT值(霍恩斯菲尔德单位，HU)随着HfCDs或碘海醇中铪或碘的浓度的增加而线性增加，而且，CT值与不同铪浓度之间线性关系的斜率(7.21HUmM-1)高于临床碘海醇(5.07HUmM-1)的斜率值，表明HfCDs具有更高的对比性能，是一种优异CT成像造影剂。
1.8HfCDs作为体内CT造影剂的潜在用途
通过尾静脉将HfCDs注射到H22原位肝脏荷瘤小鼠中(Hf的浓度为60mM，0.3mL)。对H22原位肝脏荷瘤小鼠进行体内CT图像(黑色和灰色虚线圆圈分别表示肿瘤和膀胱的位置)。结果如图30和图31所示，在静脉注射HfCDs的瞬间(1min)就可以观察到明显的对比度增强。给药后1min，肿瘤区域的HU值从114.0HU(0min)增加至296.0HU，而在给药后30min则增加至251.0HU，分别提高了159.6％和120.2％。HfCDs在肿瘤中的高积累可归因于增强的通透性和保留(EPR)效应。肿瘤中的信号在60min(110HU)时消失。另一方面，在膀胱中也观察到对比度增强，膀胱的CT值从注射1min时的109HU增加到注射30min时的715HU。相比之下，肝脏中的信号较弱(115HU)，表明HfCDs可以随时间通过膀胱排出。作为对照实验，将碘海醇通过尾静脉注射入H22荷瘤小鼠体内(碘浓度为1.1×103mM，0.3mL)。结果如图32和图33所示，注射碘海醇1min后，在肿瘤中几乎没有发现CT信号，而在膀胱中检测到了优异的CT信号(728HU)。10min后，肿瘤，肝和膀胱中的信号都非常微弱，表明碘海醇几乎完全被代谢。以上结果证明，注射后HfCDs可以立即进入小鼠的血液循环，并在肿瘤部位蓄积，以实现长期体内CT成像。此外，HfCDs可以通过膀胱快速清除。因此，体外和体内结果证明，HfCDs可以用作FI/CT成像的纳米探针。
1.9HfCDs的生物分布和HfCDs的代谢情况
在静脉给药后的不同时间间隔(1min、10min、30min和60min)处死小鼠，观察主要器官(心脏，肝脏，脾脏，肺和肾脏)和肿瘤，以研究HfCDs的生物分布和代谢情况。图34分别代表主要器官和肿瘤的离体明场、FI和CT成像，包括心脏，肝脏，脾，肺，肾脏和肿瘤，用虚线圆圈标出了肝脏中的肿瘤部位。从图34可以看出，在第1min和10min时，肿瘤部位的FI和CT信号要比主要器官的FI和CT信号强得多，这进一步证明HfCDs可以有效地定位肿瘤区域。注射后30min，尽管FI和CT信号均变弱，但肿瘤中的信号仍比其他器官强。随着时间的流逝，60min时，可在肝肿瘤部位观察到微弱的FI和CT信号，表明HfCDs已被代谢。在图35和图36中，分别量化了不同时间主要器官和肝脏肿瘤的信号强度(CT和FI)。这些结果与体内成像完全吻合。可以得出结论，HfCDs具有高效的肿瘤靶向能力和卓越的FI/CT成像功能。
2.0HfCDs的安全性
将二十四只健康的KM小鼠随机分为四组。所有小鼠均在标准动物饲养条件下饲养(12h光照/黑暗周期，室温22℃)。将HfCDs样品分散在生理盐水中，然后超声处理5min，然后通过尾静脉将HfCDs溶液注射到每只小鼠中。三个实验组分别以0.2mg/g，0.4mg/g和0.8mg/g的剂量给药。对照组仅注射生理盐水(0.3mL)。注射后每两天记录一次小鼠的体重。同时，在注射7天和14天后分别收集全血和血清。用生化自动分析仪进行血液常规检查和血清生化分析。将最大剂量(0.8mg/g)的HfCDs注射14天后，处死这些小鼠。收集器官(心脏，肝脏，脾脏，肺和肾脏)，固定在4％甲醛中，然后包埋在石蜡中，切片，并用苏木精和曙红将切片染色(H&E)。将染色后的切片固定在载玻片上，并在光学显微镜下观察。
不同剂量(0.2mg/g，0.4mg/g和0.8mg/g)的HfCDs对各组小鼠体重的影响没有显著差异，这意味着HfCDs对小鼠的健康没有明显影响(图37)。此外，我们还对四组小鼠在不同时期的肝功能，肾功能和血液常规进行了检测。图38中，a)和b)分别显示了第7天和第14天的血清生化分析。图39中，a)和b)分别显示了第7天和第14天的全血指标。结果表明，所有参数均在正常范围内波动，表明HfCDs具有良好的生物安全性。此外，在第14天对五个主要器官(心脏，肝脏，脾脏，肺，肾脏)进行了苏木精曙红(H&E)染色分析，结果如图40所示，与对照组相比，甚至注射剂量达到很高时(0.8mg/g)，仍未观察到明显的组织异常，表明HfCDs具有良好的生物安全性。
2.1HfCDs的血液相容性
通过溶血实验研究了HfCDs在小鼠血液中的血液相容性。将新鲜的小鼠血液用磷酸盐缓冲溶液(PBS)稀释至2％体积的悬浮液，然后将稀释的2％的小鼠血液悬浮液(2mL)与PBS(2mL)混合作为阴性对照组。稀释的2％的小鼠血液悬浮液(2mL)与超纯水(2mL)混合，作为阳性对照组。将不同质量的HfCDs溶解在PBS中以制备浓度分别为62.5、125、250、500和1000μg/mL的溶液。将每种浓度的溶液(2mL)与2％的小鼠血液悬浮液(2mL)混合作为实验组。每个样品在37℃下静置2h，以1000rpm离心5min后，进行观察。
如图41所示，将PBS中2％的小鼠血液悬浮液用作阴性对照组(第1号)，而超纯水中2％的小鼠血液悬浮液用作阳性对照组(第7号)。2％的小鼠血液悬浮液与不同浓度(62.5、125.0、250.0、500.0、1000.0μg/mL)的HfCDs的混合物分别称为2-6，结果证实，即使HfCDs的浓度高达1000μg/mL，HfCDs样品也不会发生溶血，这证明HfCDs具有良好的血液相容性。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (9)

1.铪掺杂荧光碳点，其特征在于，该荧光碳点以摩尔比为3:9:(1-2)的柠檬酸、硫脲和氯化铪为原料，通过热解法制备而成。
2.根据权利要求1所述的铪掺杂荧光碳点，其特征在于，所述柠檬酸、硫脲和氯化铪的摩尔比为3:9:1。
3.权利要求1或2所述的铪掺杂荧光碳点的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、按摩尔比将柠檬酸、硫脲和氯化铪溶解于水中，得到混合溶液；
步骤二、将混合溶液在180℃加热0.5-1.5h，冷却至室温，得到浅棕色固体；
步骤三、将浅棕色固体溶于去离子水中，离心后，将所得上清液在去离子水中透析，冷冻干燥，得到铪掺杂荧光碳点。
4.根据权利要求3所述的铪掺杂荧光碳点的制备方法，其特征在于，所述步骤一中，通过超声10min以上将柠檬酸、硫脲和氯化铪溶解于水中。
5.根据权利要求3所述的铪掺杂荧光碳点的制备方法，其特征在于，所述步骤二中，加热时间为1h。
6.根据权利要求3所述的铪掺杂荧光碳点的制备方法，其特征在于，所述步骤三中，以10000rpm离心5min以上。
7.根据权利要求3所述的铪掺杂荧光碳点的制备方法，其特征在于，所述步骤三中，透析袋的截留分子量为3.5KDa，用去离子水透析24h以上。
8.根据权利要求3所述的铪掺杂荧光碳点的制备方法，其特征在于，所述步骤三中，-60℃干燥24h以上。
9.权利要求1-8任何一项所述的铪掺杂荧光碳点在制备造影剂中的应用。
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