CN113616795B - Pp2a激动剂防治由正常衰老或pp2a活性或表达降低所导致的精神障碍 - Google Patents

Pp2a激动剂防治由正常衰老或pp2a活性或表达降低所导致的精神障碍 Download PDF

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Abstract

本发明涉及PP2A激动剂防治由正常衰老或PP2A活性或表达降低所导致的精神障碍。本发明发现MPH对于老年斑马鱼、老年小鼠和ppp2r2cm/m突变斑马鱼的精神障碍具有治疗作用，可以消除其DNA损伤和衰老的神经细胞，并提高PP2A活性，进一步发现PP2A激动剂可改善ppp2r2cm/m斑马鱼、老年斑马鱼和老年小鼠的精神障碍，消除其DNA损伤和衰老的神经细胞。基于此，提供了MPH及PP2A激动剂在制备防治因正常年龄增长或PP2A活性或降低所导致的精神障碍药物中的用途。

Description

PP2A激动剂防治由正常衰老或PP2A活性或表达降低所导致的 精神障碍
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，涉及PP2A激动剂防治由正常衰老或PP2A活性或表达降低所导致的精神障碍。
背景技术
蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)是一种丝/苏氨酸磷酸酶，底物广泛，大多涉及转录因子和蛋白激酶，参与了多项细胞生物学功能，可在能量代谢、DNA损伤与修复、蛋白质翻译、细胞周期调控和信号转导等方面发挥重要作用。以往研究表明，PP2A具有肿瘤抑制效应；参与调控糖、脂代谢，PP2A功能异常会导致糖尿病、肥胖等的发生，同时冠状动脉粥样硬化也与PP2A的异常变异有关；参与了视网膜病变及心肌病等继发性病理过程。
此外，专利文献CN101478977A公开了阿尔茨海默病(AD)脑中tau蛋白的异常超磷酸化部分是由于PP2A活性下调所致，因此能提高PP2A活性，特别是能提高PP2A的ABC同工型活性的制剂将具有临床用途，可治疗或预防神经变性疾病的发展。专利文献CN103893182A，公开了SET蛋白小分子抑制剂可通过抑制SET蛋白与PP2A之间的相互作用，提高细胞中PP2A的活性，降低与PP2A相互作用的蛋白激酶的磷酸化水平，促进细胞凋亡，改变细胞周期而发挥相应的生物学作用，治疗SET蛋白表达异常的炎症、神经退化性疾病、恶性肿瘤及自身免疫性疾病等。吉林大学硕士论文“Src通过PP2A促进损伤神经元突起生长和生长锥形成的实验研究”公开了抑制PP2A活性促进了损伤神经元突起生长和生长锥形成。期刊论文“陆文惠,屈秋民,曹红梅.锂对慢性铝暴露大鼠脑内CDK5和PP2A表达的影响[J].西安交通大学学报(医学版),2010,031(004):463-466.”公开了正常组、慢性铝暴露锂治疗组和非治疗组大鼠皮层及海马PP2A含量无明显差异。
总的来说，目前PP2A与神经和精神疾病方面的关系并不明确，且未见PP2A激动剂在防治由正常衰老或PP2A活性或表达降低所导致的精神障碍方面的报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供PP2A激动剂防治由正常衰老或PP2A活性或表达降低所导致的精神障碍方面的用途。
第一方面，本发明提供了PP2A激动剂在制备防治正常衰老引起的精神障碍的药物中的应用。
作为一个优选例，所述精神障碍选自认知障碍、情感障碍和行为障碍，所述精神障碍的表型为对外界反应能力变弱、对新事物探索能力变弱、易激惹、焦虑、抑郁、社交能力下降、认知功能减退、学习能力下降或记忆能力下降。
作为另一优选例，所述PP2A激动剂为MPH、DT-061或FTY720。
第二方面，本发明提供了PP2A激动剂在制备防治因PP2A活性和/或表达降低导致的精神障碍的药物中的应用。
作为一个优选例，所述精神障碍选自认知障碍、情感障碍和/或行为障碍。
更优选地，所述精神障碍的表型为对外界反应能力变弱、对新事物探索能力变弱、易激惹、焦虑、抑郁、社交能力下降、认知功能减退、学习能力下降或记忆能力下降。
作为另一优选例，所述因PP2A活性和/或表达降低导致的精神障碍为多动症、双向情感障碍、精神分裂症或抑郁焦虑。
作为另一优选例，所述PP2A激动剂为MPH、DT-061或FTY720。
第三方面，本发明提供了PP2A激动剂在制备减少DNA损伤、清除衰老细胞、溶解衰老细胞或抑制细胞衰老的实验试剂中的应用。
第四方面，本发明提供了PP2A活性和/或表达量作为生物标志物用于制备诊断年龄相关的精神障碍的试剂或试剂盒。
作为一个优选例，所述年龄相关的精神障碍为正常衰老引起的精神障碍。
更优选地，所述精神障碍为与年龄增长密切相关的精神障碍，选自老年性焦虑、老年抑郁、老年多动症和老年双向情感障碍。
第五方面，本发明提供了一种防治有需要的受试者因正常衰老或因PP2A活性和/或表达降低导致的精神障碍的方法，包括向所述受试者投与蛋白磷酸酶2A(PP2A)的激动剂的步骤。
本文中，所述“精神障碍”是认知、情感、行为和意志等精神活动不同程度障碍的总称。本领域知晓，所述“认知”包括三个过程：感觉和知觉、记忆和注意、思维过程。所述“感觉和知觉”指利用眼、耳、鼻、舌及皮肤来了解周围事物以认识世界，这一过程是大脑对外界客观事物存在的感知，也就是把外界的事物反映到大脑的结果。所述“记忆和注意”中的“记忆”，指将既往感知过的事物在脑子里保留下来，“注意”指人的精神活动对一定事物的指向。所述“思维过程”指大脑通过运用过去的经验对感觉反映到大脑的信息进行分析、综合、判断从而得出结论的过程。所述“情感”是指人们对待任何一种事物的态度和外部表情。所述“行为和意志”，指的是人们为了达到一定目的而采取行动的心理过程。正常情况下，精神活动的三个方面“认知”、“情感”、“行为和意志”是相互协调而又步调统一的，并且与外界环境是相符合的。而当存在精神障碍的情况下，则表现出“认知”、“情感”和“行为和意志”三者的不协调，或者是“认知”、“情感”或“行为和意志”方面与外界环境的不符。
本文中，关于所述的“正常衰老引起的精神障碍”指影响健康衰老的精神症状，WHO认为，衰老在生物学层面上是各种分子和细胞损伤的逐渐累积导致生理储备的逐渐减少，各种能力普遍下降，导致许多疾病的风险增加。但这些变化既不是线性的，也不是在人群中一成不变的，它们是与年龄有着散在的相互关联。例如，尽管一些70岁以上的老人可能拥有健康的身体、良好的精神状态而享受生活，但绝大多数人是逐渐虚弱，需要各种辅助支持以满足他们的基本需要。WHO提出精神状态变化(或障碍)包括：应对能力变化；行为改变；记忆丧失；攻击性；抑郁、焦虑和冷漠；睡眠困难；错觉和幻觉；重复行为；行走和迷路；判断的变化。在老年人群中，上述一种或多种症状的出现提示老年人的精神或心理状况的下降。但这种精神状态变化(或障碍)有别于β-淀粉样蛋白(Aβ)沉积和tau缠结造成的阿尔茨海默病(AD)。
本文中，所述“PP2A激动剂”指直接或间接作用于PP2A并使之激活，产生生理反应的化合物。
本文中，MPH英文全称为Methlphenidate,又名哌醋甲酯。DT-061是一种已知的PP2A激动剂，又简写为SMAP。FTY720是一种已知的PP2A激动剂，即芬戈莫德。
本发明优点在于：
1、本发明发现MPH对于老年斑马鱼、老年小鼠和ppp2r2cm/m斑马鱼的精神障碍具有治疗作用，可以消除其DNA损伤(DDR)和衰老的神经细胞，因此MPH可用于制备防治因正常年龄增长或PP2A活性降低所导致的精神障碍的药物。
2、本发明发现MPH提高了老年斑马鱼、老年小鼠和ppp2r2cm/m斑马鱼的PP2A活性，是一种PP2A激动剂。
3、本发明还发现PP2A激动剂可改善ppp2r2cm/m斑马鱼、老年斑马鱼和老年小鼠的精神障碍，消除其DNA损伤(DDR)和衰老的神经细胞，因此PP2A激动剂可用于制备防治因正常年龄增长或PP2A活性降低所导致的精神障碍的药物。
附图说明
图1：使用CRISPR-Cas9系统显示斑马鱼ppp2r2c基因突变的示意图。黄色和红色框分别显示目标外显子和结构域。红色虚线显示ppp2r2c中的4-核苷酸缺失。黑色三角形显示了用于扩增ppp2r2c mRNA的PCR引物的位置。
图2：对ppp2r2c基因不同位置处的引物ppp2r2c-p1，ppp2r2c-p2和ppp2r2c-p3(包括(图1)中所示的ppp2r2c突变区域之前和之后)进行RT-qPCR分析，PP2A的其他调节亚基基因(ppp2r2a，ppp2r2b，ppp2r2d)进行RT-qPCR分析和成年野生型和纯合型ppp2r2c突变体鱼脑中的ppp2r5c进行RT-qPCR分析，表明该模型ppp2r2c的mRNA表达水平特异性下降，模型构建成功(n＝3个独立的生物样本；非配对双侧t检验)。
图3：实验设计。对WT和ppp2r2cm/m(6月龄)鱼行为测试，使用或不使用MPH治疗3天。
图4：光刺激试验的实验方案与光刺激试验中记录和分析参数。a为光刺激试验的实验方案；b为30秒光照期间成鱼运动活动的代表图；c为在30秒光照期间突发状态持续时间的量化(每组n＝9)。
图5：a为在5分钟试验期间，有或没有MPH治疗3天的WT和ppp2r2cm/m(6月龄)镜检试验中的代表性运动轨迹(灰线)。b为5分钟间隔内镜子攻击次数的量化(WT-vehicle、WT-MPH和ppp2r2cm/m-vehicle，n＝9；ppp2r2cm/m-MPH，n＝8)。
图6：a为在旷场试验的30分钟试验期间，使用或不使用MPH治疗3天，WT和ppp2r2cm /m(6月龄)的代表性运动轨迹(灰线)，其中正方形表示中心区域。b为成鱼在中心区停留的累积时间(ppp2r2cm/m-vehicle，n＝7；WT-vehicle和WT-MPH，n＝8；ppp2r2cm/m-MPH，n＝9)。数据为平均值±SEM，*P<0.05，**P<0.01，n.s.，不显著；双向方差分析。
图7：使用不同精神治疗药物进行的光刺激、镜像攻击和旷场试验。
图8：对成年ppp2r2cm/m斑马鱼脑进行为期3天的PP2A磷酸酶测定(n＝3个独立的生物样品，每个样品包含两个脑)。
图9：a为有无DT-061、FTY720和MPH+DT-061处理的WT和ppp2r2cm/m(6月龄)在30秒光照期间的运动活性代表图。b为30秒照明期间突发状态持续时间的量化(WT，n＝9；WT-DT-061、ppp2r2cm/m-vehicle和ppp2r2cm/m-DT-061，n＝6，WT-FTY-720和ppp2r2cm/m-FTY-720，n＝10；WT-MPH+DT-061和ppp2r2cm/m-MPH+DT-061，n＝11)。
图10：a为在5分钟试验期间，有或没有DT-061、FTY720和MPH+DT-061治疗3天的情况下，对WT和ppp2r2cm/m(6月龄)进行镜像攻击试验的代表性运动轨迹(灰线)。b为5分钟间隔内镜子攻击次数的量化(WT-vehicle，n＝9；WT-DT-061、ppp2r2cm/m-vehicle和ppp2r2cm /m-DT-061，n＝6，WT-FTY-720和ppp2r2cm/m-FTY-720，n＝10；ppp2r2cm/m-MPH+DT-061，n＝11；WT-MPH+DT-061，n＝12)。
图11：a为旷场试验30分钟试验期间，在有或没有DT-061、FTY720和MPH+DT-061处理3天的情况下，WT和ppp2r2cm/m(6月龄)的代表性运动轨迹(灰线)。方框显示中心区域。b为成鱼在中心区域内停留的累积时间(WT-DT-061、ppp2r2cm/m-vehicle和ppp2r2cm/m-DT-061，n＝9；WT-vehicle，n＝10；WT-FTY-720和ppp2r2cm/m-FTY-720，n＝11，WT-MPH+DT-061和ppp2r2cm/m-MPH+DT-061，n＝6)。c为成鱼平均速度(WT-DT-061、ppp2r2cm/m-vehicle和ppp2r2cm/m-DT-061，n＝9；WT-vehicle，n＝10；WT-FTY-720和ppp2r2cm/m-FTY-720，n＝11，WT-MPH+DT-061和ppp2r2cm/m-MPH+DT-061，n＝6)。d为成鱼的总游泳距离(WT-DT-061、ppp2r2cm/m-vehicle和ppp2r2cm/m-DT-061，n＝9；WT-vehicle，n＝10；WT-FTY-720和ppp2r2cm/m-FTY-720，n＝11，WT-MPH+DT-061和ppp2r2cm/m-MPH+DT-061，n＝6)。
图12：免疫荧光法检测经或不经DT-061、FTY720和MPH+DT-061治疗3天的WT和ppp2r2cm/m(6月大)的OT中的NeuN(绿色)和γH2AX(红色)(比例尺，5μm)。量化神经元(NeuN+)和非神经元(NeuN)的γH2AX阳性百分比(阳性值表示细胞核中至少有5个γH2AX病灶的细胞核数量/细胞核总数量，n＝6/组；*表示NeuN+组的统计差异，#表示NeuN-组的统计差异)。
图13：经或不经DT-061、FTY720和MPH+DT-061处理3天的WT和ppp2r2cm/m(6个月大)的OT中SA-β-gal与NeuN(绿色)免疫荧光共染色的代表性图像(比例尺，15μm)。箭头指向SA-β-gal+神经细胞。神经元SA-β-gal阳性神经元(NeuN+)和非神经元(NeuN)百分率的测定(n＝6/组；*表示NeuN+组的统计差异，#表示NeuN-组的统计差异)。数据为平均数±标准差，*P<0.05，**P<0.01，#P<0.05，##P<0.01，双因素方差分析。
图14：对6月(成鱼)和22月鱼(老年鱼)行为测试的实验设计，使用或不使用MPH或DT-061治疗3天。
图15：光刺激试验中记录和分析参数。a为30秒开灯期间的移动活动代表图。b为在30秒的灯光开启期间，对突发状态持续时间进行量化(6m，n＝8；22m，n＝15；22m MPH，n＝11；22m-DT-061，n＝9；单因素方差分析)。
图16：a为5分钟试验期间，成鱼镜像攻击试验中的代表性运动轨迹(灰线)。b为5分钟间隔内镜像攻击次数的量化(6m，n＝14；22m，n＝15；22m-DT-061，n＝12；单因素方差分析)。
图17：a为在30分钟的旷场试验中的代表性的运动轨迹(灰线)。方框显示中心区域。b为成鱼在中心区域内的累计停留时间(3m，n＝18，22m，n＝11；22m MPH，n＝10；22m-DT-061，n＝9；单因素方差分析)。
图18：a为用或不用MPH或DT-061处理3天的22个月大的鱼的脑中Neun(绿色)和γH2AX(红色)共染色的代表性共焦图像(比例尺，5μm)。b为γH2AX阳性核的定量(正值表明至少有5个γH2AX病灶)(WT-vehicle，n＝4；WT-MPH，n＝7；WT-DT-061，n＝3；非配对双侧t检验)。
图19：a为用或不用MPH或DT-061处理3天的22个月龄WT鱼的SA-β-gal染色的代表性图像(比例尺，15μm)。b为SA-β-gal阳性细胞百分比的定量(WT-vehicle和WT-MPH，n＝6；WT-DT-061，n＝4；单因素方差分析)。
图20：用MPH或DT-061处理老年鱼后的PP2A磷酸酶测定(n＝3个独立的生物样品，每组含有两个大脑；单因素方差分析)。数据以平均数±标准差表示，*P<0.05，**P<0.01。
图21：3月龄和14月龄小鼠经MPH治疗后的行为学实验设计。
图22：明暗转换试验中明室和暗室之间的转换次数(n＝5，3m；n＝8，14m；n＝8，14m-MPH；单因素方差分析)。
图23：Morris水迷宫实验的最长潜伏期。
图24：小鼠Morris水迷宫实验中跨越平台的频率。
图25：Morris水迷宫测试中正确象限的时间花费(3m，n＝4；14m，n＝4；14m-MPH，n＝5；单因素方差分析)。
图26：a为与3个月大的小鼠相比，14个月大的小鼠用MPH或vehicle治疗后，其大脑额叶和颞叶中Neun(绿色)和γH2AX(红色)共染色的代表性共焦图像(比例尺，25μm)。b为3m、14m和14m-MPH额叶或颞叶γH2AX阳性核的定量(3m，n＝6；14m，n＝3；14m-MPH，n＝3；非配对双侧t检验)。
图27：a为与3月龄小鼠相比，14月龄WT小鼠经MPH处理或不经MPH处理后大脑额叶和颞叶SA-β-gal染色的代表性图像(比例尺，25μm)。b为SA-β-gal染色阳性细胞百分比的定量(n＝3/组；非配对双侧t检验)。
图28：小鼠大脑额叶和颞叶的PP2A磷酸酶测定(3m，n＝5；14m，n＝8；14m-MPH，n＝8；非配对双侧t检验)。数据以平均数±标准差表示，*P<0.05，**P<0.01。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1
一、实验方法
1、所有药物溶液均使用PBS(MPH 1.08mg/kg、丙戊酸钠300mg/kg、阿立哌唑0.6mg/kg、齐拉西酮1.6mg/kg、DT061和FTY720 5mg/kg)新鲜制备。给予斑马鱼在药物溶液中浸泡3天的食物，并在第4天进行行为分析。14和3月龄C57B6/J小鼠均在上海交通大学医学院瑞金医院动物设施中生产和饲养。该方案得到了动物实验伦理委员会的批准。14月龄和3月龄的C57B6/J小鼠均灌胃给予MPH(12.3mg/kg/d)共14天。
2、CRISPR-Cas9突变斑马鱼的产生。利用CRISPR-Cas9系统产生ppp2r2c突变斑马鱼，其中利用ZiFiT Targeter软件(http://zifit.partners.org/ZiFiT)设计了靶向ppp2r2c第9外显子(sgRNA：5′-GGGCAGAGATACC-3′(SEQ ID NO:1))和cdkn1a/p21第2外显子(sgRNA：5′-GGTAATGGGCCGACTAGG-3′(SEQ ID NO:2))的导向RNA。F0代培育至3个月大，与野生斑马鱼进行异交，以获得潜在的F1 indel突变。对从F1斑马鱼尾部分离的基因组DNA进行PCR扩增和测序，以鉴定ppp2r2c突变体(用于基因分型的引物：fwd 5′-CaggcAgtgttGaagat-3′(SEQ ID NO:3)；rev 5′-GTGCTGAGAGGCCACTAA-3′(SEQ ID NO:4))和p21突变体(用于基因分型的引物：fwd 5′-TCTGTGATTGTGTG-3′(SEQ ID NO:5)；rev 5′-GAGTGCACATCGTTC-3′(SEQ ID NO:6))。
3、脑切片免疫荧光成像。斑马鱼组织在4℃分离并用4％PFA固定过夜，然后用30％蔗糖脱水过夜。将组织包埋在OCT中，并在5分钟时切片。冷冻切片和载玻片在4％PFA中固定30分钟，然后在室温下用0.5％Triton X-100、2％FBS在1×PBS中渗透和封闭1小时。在4℃下过夜进行与一级抗体的杂交，然后在PBS中用0.1％吐温-20洗涤三次。与相应二级抗体(Invitrogen)的杂交在37℃下进行至少2小时。最后，将切片与1×DAPI在室温下孵育5分钟。使用共焦激光扫描显微镜(SP8；莱卡)拍照。
4、PP2A磷酸酶测定。将从斑马鱼大脑、小鼠额叶和颞叶制备的匀浆置于20mM咪唑-HCl、2mM EDTA、2mM EGTA、pH 7.0和抑肽酶、亮肽和胃蛋白酶抑制剂各10μg/mL、1mM苯甲脒中，和1mM苯甲基磺酰氟，并通过添加1％NP-40进行溶解。然后根据制造商的说明，使用PP2A免疫沉淀磷酸酶分析试剂盒(微孔)进行分析。在微量滴定板读取器(BioTAK)中测量650nm(A650)波长处的吸光度。
5、斑马鱼行为分析。
将一条成年鱼放置在一个标准的交配池(21×10×7.5厘米)中，该交配池含有深度为6厘米的系统水，并让其适应15分钟，然后转移到一个自动观察和视频跟踪系统(ZebraLab；Viewpoint Life Sciences)。
光刺激试验：将一条成年鱼置于黑暗中，让其适应15分钟。然后打开灯30秒，并使用ZebraLab量化软件模块记录活动。量化测试的重点是斑马鱼的活动，它代表了斑马鱼在水箱中的全部移动量及其频率。该软件可以自动记录斑马鱼的位置，并将以前的位置与新位置进行比较。改变的像素被视为活动。我们使用野生型鱼类获得两个阈值(突发阈值为100，冻结值为20)。突发阈值指示95％移动的像素变化低于该值。冻结值表示当鱼停止移动时，像素变化低于该值。如果移动表面的值高于突发阈值，则活动将记录为突发活动，软件将自动记录活动的持续时间。
镜像攻击测试：将一面镜子放在水箱末端外，并使用ZebraLab跟踪软件模块连续5分钟监控鱼的攻击行为。
旷场试验：连续监测斑马鱼活动30分钟，使用视频跟踪软件(记录和分析在中心区域花费的时间(占总面积的30％)。
6、SA-β-gal染色。采用衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒(Beyotime)进行。按照制造商的说明进行分析。图像是用蔡司A2显微镜拍摄的。
7、小鼠行为测定。
莫里斯水迷宫实验：莫里斯水迷宫实验在直径分别为120cm和10cm的蓝色圆形水池和平台上进行。圆形区域分为4个象限和一个平台区域。水池周围悬挂着4张不同形状的纸。实验总共花了6天。在最初的5天里，将平台固定在一个固定的位置，然后将老鼠放在水池中，让它们的头从每个象限朝向墙壁。通过上海鑫软信息技术有限公司的软件记录小鼠进入平台的潜伏期、距离，作为小鼠学习能力的判断。第6天，移除平台后重复该程序。记录小鼠穿过平台区域的频率、在正确象限的时间以及与平台位置的平均距离，作为对其记忆的判断。
光/暗转换实验：我们使用了一种仪器，该仪器由一个发光、顶部开放、不透明的有机玻璃盒(25×25×30厘米)和一个黑色、顶部封闭、不透明的有机玻璃盒(20×20×30厘米)连接而成。将动物放在照明箱中，通过一个连接门(12×5cm)自由地从灯光移动到暗室5分钟。灯箱由台灯照亮。如果四只爪子都在灯箱中，则认为老鼠在灯箱中。收集光室和暗室之间的转换次数。
二、实验结果
1、精神行为异常斑马鱼模型构建(图1、图2)。
图1：使用CRISPR-Cas9系统显示斑马鱼ppp2r2c基因突变的示意图。黄色和红色框分别显示目标外显子和结构域。红色虚线显示ppp2r2c中的4-核苷酸缺失。黑色三角形显示了用于扩增ppp2r2c mRNA的PCR引物的位置。
图2：对ppp2r2c基因不同位置处的引物ppp2r2c-p1，ppp2r2c-p2和ppp2r2c-p3(包括(图1)中所示的ppp2r2c突变区域之前和之后)进行RT-qPCR分析，PP2A的其他调节亚基基因(ppp2r2a，ppp2r2b，ppp2r2d)进行RT-qPCR分析和成年野生型和纯合型ppp2r2c突变体鱼脑中的ppp2r5c进行RT-qPCR分析，表明该模型ppp2r2c的mRNA表达水平特异性下降，模型构建成功(n＝3个独立的生物样本；非配对双侧t检验)。
2、MPH可以逆转ppp2r2cm/m模型表现出的异常精神行为(图3、图4、图5、图6、图7)。
图3：实验设计。对WT和ppp2r2cm/m(6月龄)鱼行为测试，使用或不使用MPH治疗3天。
图4：光刺激试验的实验方案与光刺激试验中记录和分析参数。a为光刺激试验的实验方案；b为30秒光照期间成鱼运动活动的代表图；c为在30秒光照期间突发状态持续时间的量化(每组n＝9)。
图5：a为在5分钟试验期间，有或没有MPH治疗3天的WT和ppp2r2cm/m(6月龄)镜检试验中的代表性运动轨迹(灰线)。b为5分钟间隔内镜子攻击次数的量化(WT-vehicle、WT-MPH和ppp2r2cm/m-vehicle，n＝9；ppp2r2cm/m-MPH，n＝8)。
图6：a为在旷场试验的30分钟试验期间，使用或不使用MPH治疗3天，WT和ppp2r2cm /m(6月龄)的代表性运动轨迹(灰线)，其中正方形表示中心区域。b为成鱼在中心区停留的累积时间(ppp2r2cm/m-vehicle，n＝7；WT-vehicle和WT-MPH，n＝8；ppp2r2cm/m-MPH，n＝9)。数据为平均值±SEM，*P<0.05，**P<0.01，n.s.，不显著；双向方差分析。
图7：使用不同精神治疗药物进行的光刺激、镜像攻击和旷场试验。
3、PP2A激动剂改善ppp2r2cm/m行为障碍，恢复PP2A活性，消除DNA损伤(DDR)和衰老的神经细胞(图8、图9、图10、图11、图12、图13)。
图8：对成年ppp2r2cm/m斑马鱼脑进行为期3天的PP2A磷酸酶测定(n＝3个独立的生物样品，每个样品包含两个脑)。
图9：a为有无DT-061、FTY720和MPH+DT-061处理的WT和ppp2r2cm/m(6月龄)在30秒光照期间的运动活性代表图。b为30秒照明期间突发状态持续时间的量化(WT，n＝9；WT-DT-061、ppp2r2cm/m-vehicle和ppp2r2cm/m-DT-061，n＝6；WT-FTY-720和ppp2r2cm/m-FTY-720，n＝10；WT-MPH+DT-061和ppp2r2cm/m-MPH+DT-061，n＝11)。
图10：a为在5分钟试验期间，有或没有DT-061、FTY720和MPH+DT-061治疗3天的情况下，对WT和ppp2r2cm/m(6月龄)进行镜像攻击试验的代表性运动轨迹(灰线)。b为5分钟间隔内镜子攻击次数的量化(WT-vehicle，n＝9；WT-DT-061、ppp2r2cm/m-vehicle和ppp2r2cm /m-DT-061，n＝6；WT-FTY-720和ppp2r2cm/m-FTY-720，n＝10；ppp2r2cm/m-MPH+DT-061，n＝11；WT-MPH+DT-061，n＝12)。
图11：a为旷场试验30分钟试验期间，在有或没有DT-061、FTY720和MPH+DT-061处理3天的情况下，WT和ppp2r2cm/m(6月龄)的代表性运动轨迹(灰线)。方框显示中心区域。b为成鱼在中心区域内停留的累积时间(WT-DT-061、ppp2r2cm/m-vehicle和ppp2r2cm/m-DT-061，n＝9；WT-vehicle，n＝10；WT-FTY-720和ppp2r2cm/m-FTY-720，n＝11，WT-MPH+DT-061和ppp2r2cm/m-MPH+DT-061，n＝6)。c为成鱼平均速度(WT-DT-061、ppp2r2cm/m-vehicle和ppp2r2cm/m-DT-061，n＝9；WT-vehicle，n＝10；WT-FTY-720和ppp2r2cm/m-FTY-720，n＝11，WT-MPH+DT-061和ppp2r2cm/m-MPH+DT-061，n＝6)。d为成鱼的总游泳距离(WT-DT-061、ppp2r2cm/m-vehicle和ppp2r2cm/m-DT-061，n＝9；WT-vehicle，n＝10；WT-FTY-720和ppp2r2cm/m-FTY-720，n＝11，WT-MPH+DT-061和ppp2r2cm/m-MPH+DT-061，n＝6)。
图12：免疫荧光法检测经或不经DT-061、FTY720和MPH+DT-061治疗3天的WT和ppp2r2cm/m(6月大)的OT中的NeuN(绿色)和γH2AX(红色)(比例尺，5μm)。量化神经元(NeuN+)和非神经元(NeuN)的γH2AX阳性百分比(阳性值表示细胞核中至少有5个γH2AX病灶的细胞核数量/细胞核总数量，n＝6/组；*表示NeuN+组的统计差异，#表示NeuN-组的统计差异)。
图13：经或不经DT-061、FTY720和MPH+DT-061处理3天的WT和ppp2r2cm/m(6个月大)的OT中SA-β-gal与NeuN(绿色)免疫荧光共染色的代表性图像(比例尺，15μm)。箭头指向SA-β-gal+神经细胞。神经元SA-β-gal阳性神经元(NeuN+)和非神经元(NeuN)百分率的测定(n＝6/组；*表示NeuN+组的统计差异，#表示NeuN-组的统计差异)。数据为平均数±标准差，*P<0.05，**P<0.01，#P<0.05，##P<0.01，双因素方差分析。
4、MPH改善了年老鱼的行为障碍，恢复PP2A活性，消除DDR和衰老的神经细胞(图14、图15、图16、图17、图18、图19、图20)。
图14：对6月(成鱼)和22月鱼(老年鱼)行为测试的实验设计，使用或不使用MPH或DT-061治疗3天。
图15：光刺激试验中记录和分析参数。a为30秒开灯期间的移动活动代表图。b为在30秒的灯光开启期间，对突发状态持续时间进行量化(6m，n＝8；22m，n＝15；22m MPH，n＝11；22m-DT-061，n＝9；单因素方差分析)。
图16：a为5分钟试验期间，成鱼镜像攻击试验中的代表性运动轨迹(灰线)。b为5分钟间隔内镜像攻击次数的量化(6m，n＝14；22m，n＝15；22m-DT-061，n＝12；单因素方差分析)。
图17：a为在30分钟的旷场试验中的代表性的运动轨迹(灰线)。方框显示中心区域。b为成鱼在中心区域内的累计停留时间(3m，n＝18，22m，n＝11；22m MPH，n＝10；22m-DT-061，n＝9；单因素方差分析)。
图18：a为用或不用MPH或DT-061处理3天的22个月大的鱼的脑中Neun(绿色)和γH2AX(红色)共染色的代表性共焦图像(比例尺，5μm)。b为γH2AX阳性核的定量(正值表明至少有5个γH2AX病灶)(WT-vehicle，n＝4；WT-MPH，n＝7；WT-DT-061，n＝3；非配对双侧t检验)。
图19：a为用或不用MPH或DT-061处理3天的22个月龄WT鱼的SA-β-gal染色的代表性图像(比例尺，15μm)。b为SA-β-gal阳性细胞百分比的定量(WT-vehicle和WT-MPH，n＝6；WT-DT-061，n＝4；单因素方差分析)。
图20：用MPH或DT-061处理老年鱼后的PP2A磷酸酶测定(n＝3个独立的生物样品，每组含有两个大脑；单因素方差分析)。数据以平均数±标准差表示，*P<0.05，**P<0.01。
5、MPH能改善老年小鼠的行为障碍，恢复PP2A活性，清除DDR和衰老的神经细胞(图21、图22、图23、图24、图25、图26、图27、图28)。
图21：3月龄和14月龄小鼠经MPH治疗后的行为学实验设计。
图22：明暗转换试验中明室和暗室之间的转换次数(n＝5，3m；n＝8，14m；n＝8，14m-MPH；单因素方差分析)。
图23：Morris水迷宫实验的最长潜伏期。
图24：小鼠Morris水迷宫实验中跨越平台的频率。
图25：Morris水迷宫测试中正确象限的时间花费(3m，n＝4；14m，n＝4；14m-MPH，n＝5；单因素方差分析)。
图26：a为与3个月大的小鼠相比，14个月大的小鼠用MPH或vehicle治疗后，其大脑额叶和颞叶中Neun(绿色)和γH2AX(红色)共染色的代表性共焦图像(比例尺，25μm)。b为3m、14m和14m-MPH额叶或颞叶γH2AX阳性核的定量(3m，n＝6；14m，n＝3；14m-MPH，n＝3；非配对双侧t检验)。
图27：a为与3月龄小鼠相比，14月龄WT小鼠经MPH处理或不经MPH处理后大脑额叶和颞叶SA-β-gal染色的代表性图像(比例尺，25μm)。b为SA-β-gal染色阳性细胞百分比的定量(n＝3/组；非配对双侧t检验)。
图28：小鼠大脑额叶和颞叶的PP2A磷酸酶测定(3m，n＝5；14m，n＝8；14m-MPH，n＝8；非配对双侧t检验)。数据以平均数±标准差表示，*P<0.05，**P<0.01。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海交通大学医学院附属瑞金医院
<120> PP2A激动剂防治由正常衰老或PP2A活性或表达降低所导致的精神障碍
<130> /
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gggcagagat acc 13
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggtaatgggc cgactagg 18
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
caggcagtgt tgaagat 17
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gtgctgagag gccactaa 18
<210> 5
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tctgtgattg tgtg 14
<210> 6
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gagtgcacat cgttc 15

Claims (2)

1.DT-061在制备治疗在情感性精神障碍、精神分裂症药物中的应用，所述的情感性精神障碍为抑郁症、焦虑症、双向情感障碍。
2.MPH在制备治疗额颞叶痴呆药物中的应用。
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