CN113614250A - 用于猫科动物微生物组变化的监测和诊断方法 - Google Patents
用于猫科动物微生物组变化的监测和诊断方法 Download PDFInfo
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Abstract
提供了用于评估猫科动物的微生物组的方法。该方法尤其包括检测从猫科动物获得的样品中的一种或多种细菌物种，将所述一种或多种细菌物种与对照数据集相比较，以及确定微生物组年龄。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年1月18日提交的英国专利申请第1900754.1号的优先权，该专利申请的内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本公开内容涉及用于测定猫科动物微生物组的年龄状态并在其中评估动物健康的监测工具和诊断方法的领域。
背景技术
近年来，人们对微生物组及其对健康影响的了解显著增加。微生物组的变化及其与免疫、内分泌和神经系统的相互作用与多种疾病相关，从炎症性肠病[1-3]到癌症[4]以及宿主健康的行为方面[5；6]。
微生物组的建立与免疫系统的发育同时发生，并在肠道生理和调节中发挥作用。肠道微生物群的初步建立是新生儿发育的重要步骤，影响婴儿期的免疫发育和整个生命的健康。因此，在人类和许多哺乳动物中，肠道微生物组发育的早期建立阶段发生了多样性的快速增加[7]。
成年肠道微生物组可以适应群落结构的巨大变化，并且在人类和其他哺乳动物中，它被认为在整个成年生活中相对稳定。这种“成年微生物组”被认为代表了猫的健康肠道微生物组且具有比其他生命阶段更强的恢复力。在生命早期阶段，小猫具有未发育好的肠道屏障，这包括胃肠道微生物组以及组织学和肠道相关免疫功能。因此，小猫和幼年猫更容易出现诸如腹泻和生病等胃肠道疾病。较老的猫和老年猫也更容易出现腹泻和胃肠道并发症，部分原因可能是肠道微生物组的恶化。
鉴于微生物组对健康和幸福的重要性，由于肠道屏障和胃肠道健康随着年龄的增长会发生内在变化，因此找到测定动物的微生物组状态的方法很重要，就微生物组的年龄状态而言，可以考虑这种状态。
发明内容
本公开内容的特征在于允许测定猫科动物的微生物组年龄状态的诊断方法。如实施例中所示的，本文公开的方法可以以高精度实现这一点。
在一方面，本公开内容提供了一种测定猫科动物的微生物组的年龄状态的方法，包括(a)检测从所述猫科动物获得的样品中的一种或多种细菌物种；(b)将所述样品中的所述一种或多种细菌物种与对照数据集相比较；以及(c)确定所述微生物组的年龄状态。这些方法对于评估猫科动物的健康特别有用，因为微生物组的年龄状态与猫科动物的实际年龄之间的差异可以表明其健康状况。例如，成年猫拥有青少年微生物组(juvenilemicrobiome)是不期望的，因为这与低多样性有关，并且与健康状况(例如腹泻易感性)有关。
在另一方面，还提供了一种监测猫科动物的方法，包括通过本公开的方法在至少两个时间点测定猫科动物的微生物组年龄状态的步骤。这在猫科动物正在接受治疗以改变微生物组的情况下特别有用，因为它可以监控治疗的进展。它也可用于监测猫科动物的健康状况，例如，从成年微生物组到较老的微生物组的快速转变可以指示疾病。本公开内容的方法的这一方面还可用于评估猫科动物的微生物组是否随着动物变老而进展。
在一些实施方案中，本公开的方法包括改变微生物组组成的进一步步骤。这可以通过饮食改变或通过食用功能性食物或施用营养品或药物组合物或包含细菌的制剂来实现。这在本公开的方法已经鉴定出与猫科动物的实际年龄不一致的微生物组年龄状态并且因此在动物的实际年龄的背景下猫科动物可能不太健康的情况下特别有用。
在另一方面，本文公开了一种监测已经经历饮食改变和/或已经接受能够改变微生物组组成的补充剂、功能性食物、营养组合物或药物组合物的猫科动物的微生物组的年龄状态的方法，包括通过根据本公开的方法测定微生物组年龄状态。这样的方法允许技术人员确定治疗的成功。在具体的实施方案中，这些方法包括测定治疗前后的微生物组年龄状态，因为这有助于评估治疗的成功。
在另一方面，还提供了一种评估猫科动物的微生物组的年龄状态以确定是否需要干预的方法，包括：(a)对从所述猫科动物获得的样品中的两种或更多种细菌物种进行定量；(b)测定所述细菌物种的相对丰度；(c)将步骤(b)中测定的相对丰度与对照数据集的相对丰度相比较；其中如果步骤(c)的比较表明所述的微生物组的年龄状态与所述猫科动物的实际年龄存在差异，则推荐进行干预。
在另一方面，还提供了一种评估猫科动物的微生物组的年龄状态以确定是否需要干预的方法，包括(a)对从所述猫科动物获得的样品中的两种或更多种细菌物种进行定量；(b)计算多样性指数；(c)将所述多样性指数与对照数据集的多样性指数相比较；其中如果步骤(b)中计算的所述多样性指数小于所述对照数据集中的多样性指数的第5百分位数(5thpercetile)或大于第95百分位数，则推荐进行干预。
在另一方面，还提供了一种评估猫科动物的微生物组的年龄状态以确定是否需要干预的方法，包括(a)对从所述猫科动物获得的样品中的两种或更多种细菌物种进行定量；(b)测定所述细菌物种的相对丰度；(c)通过下式计算香农指数多样性；
香农性指数
其中如果在步骤(c)中计算的多样性在成年猫科动物中小于2.77或大于3.99，在较老的猫科动物中小于2.41或大于3.92，或在老年猫科动物中小于1.65或大于4.17，则推荐进行干预。
如上所述，本公开主题提供了一种测定猫科动物微生物组的年龄状态的方法，包括(a)检测从猫科动物获得的样品中的一种或多种细菌物种；(b)将样品中的一种或多种细菌物种与对照数据集进行比较；以及(c)确定微生物组年龄状态。在要求保护的方法的某些实施方案中，对照数据集包括不同时间或生命阶段的猫科动物微生物组数据。在要求保护的方法的某些实施方案中，对照数据包括来自选自以下的猫科动物的至少两个、至少三个或四个生命阶段的微生物组数据：幼年猫科动物、青年猫科动物、成年猫科动物、较老的猫科动物和老年猫科动物。
在要求保护的方法的某些实施方案中，幼年被定义为至多约1.0岁，青年被定义为大于约1.0岁且至多约4.5岁，成年猫科动物被定义为大于约4.5岁且至多约9.5岁，较老的猫被定义为大于约9.5岁且至多约13.5岁以及老年猫被定义为大于约13.5岁。
在要求保护的方法的某些实施方案中，该方法包括定量一种或多种细菌物种。在要求保护的方法的特定实施方案中，所述细菌物种选自由下述组成的组：索拉杆菌属(Solobacterium)、欧尔森氏菌属(Olsenella)、厌氧螺菌属(Anaerobiospirillum)、布劳特氏菌属(Blautia)、霍尔德曼氏菌属(Holdemanella)、柯林斯氏菌属(Collinsella)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、真杆菌属(Eubacterium)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、小杆菌属(Dialister)、拟杆菌属(Bacteroides)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、阿德勒克罗伊茨菌属(Adlercreutzia)、罕见小球菌属(Subdoligranulum)、梭菌属(Clostridium)、艰难杆菌属(Mogibacterium)、塞利单胞菌属(Sellimonas)、链球菌属(Streptococcus)、罕见小球菌属(Subdoligranulum)以及拉克氏梭状芽胞杆菌属(Lachnoclostridium)，或者来自毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)的细菌物种。在要求保护的方法的特定实施方案中，所述细菌物种选自由下述组成的组：索拉杆菌属的种(Solobacterium sp.)、欧尔森氏菌属的种(Olsenella sp.)、马赛菌-P2300(Marseille-P2300)、产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)、活泼布劳特氏菌(Blautia gnavus)、双形霍尔德曼氏菌(Holdemanella biforme)、罗讷河口柯林斯氏菌(Collinsellabouchesdurhonensis)、双歧杆菌属的种(Bifidobacterium sp.)、短真杆菌(Eubacteriumbrachy)、田中柯林斯氏菌(Collinsella tanakaei)、粪便柯林斯氏菌(Collinsellastercoris)、卵形布劳特氏菌(Blautia obeum)、圆柱状真杆菌(Eubacteriumcylindroides)、溶木聚糖拟杆菌/小杆菌(Dialister/Bacteroides xylanisolvens)、瘤胃乳酸杆菌(Lactobacillus ruminis)、阿德勒克罗伊茨菌属的种(Adlercreutzia sp.)、罕见小球菌属的种(Subdoligranulum sp.)、产气荚膜杆菌(Clostridium perfringens)、马赛艰难杆菌(Mogibacterium massiliense)、塞利单胞菌属的种(Sellimonas sp.)、黄体链球菌(Streptococcus luteciae)、毛螺旋菌属的种(Lachnospiraceae sp.)、变形罕见小球菌(Subdoligranulum variabile)、嗜琥珀酸小杆菌(Dialister succinatiphilus)、拉克氏柔嫩梭菌(Lachnoclostridium[Clostridium]leptum)、拉克氏海莱蒙梭菌(Lachnoclostridium[Clostridium]hylemonae)以及产粪甾醇真杆菌(Eubacteriumcoprostanoligenes)。在要求保护的方法的特定实施方案中，细菌物种具有16S rDNA序列，所述16S rDNA与SEQ ID NO:1-30中任一条的序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％的同一性。
在要求保护的方法的某些实施方案中，所述方法包括检测来自选自由索拉杆菌属、欧尔森氏菌属以及厌氧螺菌属组成的组中的一种或多种的细菌物种。在要求保护的方法的某些实施方案中，所述方法包括检测选自由索拉杆菌属的种、欧尔森氏菌属的种、马赛菌-P2300以及产琥珀酸厌氧螺菌组成的组的一种或多种细菌物种。在要求保护的方法的特定实施方案中，细菌物种具有16S rDNA序列，所述16S rDNA与SEQ ID NO:1-3中任一条的序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％的同一性。
在要求保护的方法的某些实施方案中，该方法进一步包括检测选自由活泼布劳特氏菌、双形霍尔德曼氏菌、罗讷河口柯林斯氏菌(Collinsella bouchesdurhonensis)和阿维桑双歧杆菌(Bifidobacterium avesanii)所组成的组的一种或多种细菌物种。在要求保护的方法的某些实施方案中，其中所述细菌物种具有16S rDNA，所述16S rDNA与SEQ IDNO:4-7中任一条的序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％的同一性。在要求保护的方法的某些实施方案中，所述方法包括检测所有SEQID NO:8-17。在要求保护的方法的某些实施方案中，所述方法包括检测来自索拉杆菌属的细菌物种。在要求保护的方法的特定实施方案中，所述细菌具有16S rDNA，所述16S rDNA与SEQ ID NO:1的序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％的同一性。
在要求保护的方法的某些实施方案中，检测和/或定量至少5种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种或至少30种不同的物种。
在要求保护的方法的某些实施方案中，所述方法包括检测或定量索拉杆菌属的种、欧尔森氏菌属的种、马赛菌-P2300以及产琥珀酸厌氧螺菌。在要求保护的方法的某些实施方案中，所述细菌物种具有16S rDNA，所述16S rDNA与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3中任一条的序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％的同一性。
在要求保护的方法的某些实施方案中，该方法进一步包括检测或定量活泼布劳特氏菌、双形霍尔德曼氏菌、罗讷河口柯林斯氏菌以及阿维桑双歧杆菌。在要求保护的方法的某些实施方案中，所述细菌物种具有16SrDNA，所述16S rDNA与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6以及SEQ ID NO:7中任一条的序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％的同一性。
在要求保护的方法的某些实施方案中，所述方法进一步包括检测或定量真杆菌属的种(Eubacterium sp.)、柯林斯氏菌属的种(Collinsella sp.)、布劳特氏菌属的种(Blautia sp.)、小杆菌/拟杆菌属的种(Dialister/Bacteroides sp.)、乳酸杆菌属的种(Lactobacillus sp.)、阿德勒克罗伊茨菌属的种(Adlercreutzia sp.)、罕见小球菌属(Subdoligranulum)；优选地检测或定量短真杆菌(Eubacterium brachy)、田中柯林斯氏菌(Collinsella tanakaei)、粪便柯林斯氏菌(Collinsella stercoris)、卵形布劳特氏菌(Blautia obeum)、圆柱状真杆菌(Eubacterium cylindroides)、溶木聚糖拟杆菌/小杆菌(Dialister/Bacteroides xylanisolvens)、瘤胃乳酸杆菌(Lactobacillus ruminis)、阿德勒克罗伊茨菌属的种(Adlercreutzia sp.)以及罕见小球菌属的种(Subdoligranulumsp.)。在要求保护的方法的某些实施方案中，所述细菌物种具有16S rDNA，所述16S rDNA与SEQ ID NO:9-18中任一条的序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％的同一性。
在要求保护的方法的某些实施方案中，步骤(b)包括使用偏最小二乘判别分析(partial least squares discriminate analysis)将所述样品中的所述一种或多种细菌物种与对照数据集相关联。
在要求保护的方法的某些实施方案中，所述细菌物种来自选自由以下组成的组的属：索拉杆菌属(Solobacterium)、真杆菌属(Eubacterium)、布劳特氏菌属(Blautia)、拉克氏梭状芽胞杆菌属(Lachnoclostridium)、欧尔森氏菌属(Olsenella)、氨基酸球菌属(Acidaminococcus)、厌氧螺菌属(Anaerobiospirillum)、巨球型菌属(Megasphaera)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、红蝽菌科(Coriobacteriaceae)、链状杆菌属(Catenibacterium)、德兰库尔特菌属(Drancourtella)、塞利单胞菌属(Sellimonas)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、多尔氏菌属(Dorea)、柯林斯氏菌属(Collinsella)、霍尔德曼氏菌属(Holdemanella)、艰难杆菌属(Mogibacterium)以及厌氧杆菌属(Anaerostipes)。在要求保护的方法的特定实施方案中，所述细菌物种选自由下述组成的组：索拉杆菌属的种(Solobacterium sp.)、短真杆菌(Eubacterium brachy)、卵形布劳特氏菌(Blautiaobeum)、拉克氏柔嫩梭菌(Lachnoclostridium[Clostridium]leptum)、拉克氏海莱蒙梭菌(Lachnoclostridium[Clostridium]hylemonae)、欧尔森氏菌属的种(Olsenella sp.)、发酵氨基酸球菌(Acidaminococcus fermentans)、泰门氨基酸球菌(Acidaminococcustimonensis)、产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)、印度巨球型菌(Megasphaera indica)、埃氏巨球形菌(Megasphaera elsdenii)、巨球型菌属的种(Megasphaera sp.)、鸡双歧杆菌(Bifidobacterium gallinarum)、小鸡双歧杆菌(Bifidobacterium pullorum)、世纪双歧杆菌(Bifidobacterium saeculare)、纤细双歧杆菌(Bifidobacterium subtile)、红蝽菌属的种(Coriobacteriaceae sp.)、双歧杆菌属的种(Bifidobacterium sp.)、光冈氏链状杆菌(Catenibacterium mitsuokai)、马赛德兰库尔特菌(Drancourtella massiliense)、肠道塞利单胞菌(Sellimonas intestinalis)、瘤胃球菌属的种(Ruminococcus sp.)、毛螺旋菌属的种(Lachnospiraceae sp.)、多尔氏菌属的种(Dorea sp.)、生产布劳特氏菌(Blautia producta)、红蝽菌属的种(Coriobacteriaceae sp.)、柯林斯氏菌属的种(Collinsella sp.)、双形霍尔德曼氏菌(Holdemanella biforme)、马赛艰难杆菌(Mogibacterium massiliense)、庞大厌氧杆菌(Anaerostipes hadrus)、厌氧杆菌属的种(Anaerostipes sp.)、活泼布劳特氏菌(Blautiagnavus)、粪便/肠道柯林斯氏菌(Collinsella stercoris/intestinalis)、双歧杆菌属的种(Bifidobacterium sp.)以及田中柯林斯氏菌(Collinsella tanakaei)。在要求保护的方法的某些实施方案中所述细菌物种具有16S rDNA，所述16S rDNA与SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ IDNO:38、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:7以及SEQ ID NO:15中任一条的序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％的同一性。在要求保护的方法的某些实施方案中，所述方法包括检测来自索拉杆菌属的细菌物种。在要求保护的方法的某些实施方案中，所述细菌具有16SrDNA，16SrDNA与SEQ ID NO:1的序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％的同一性。
在要求保护的方法的某些实施方案中，检测和/或定量至少5种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种或至少27种不同的分类单元。
在要求保护的方法的某些实施方案中，所述方法包括检测或定量索拉杆菌属的种(Solobacterium sp.)、短真杆菌(Eubacterium brachy)以及卵形布劳特氏菌(Blautiaobeum)。在要求保护的方法的某些实施方案中，所述细菌具有16S rDNA，16S rDNA与SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:8以及SEQ ID NO:11中任一条的序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％的同一性。在要求保护的方法的某些实施方案中，所述方法进一步包括检测或定量拉克氏柔嫩梭菌/拉克氏海莱蒙梭菌(Lachnoclostridium[Clostridium]leptum/Lachnoclostridium[Clostridium]hylemonae)、欧尔森氏菌属的种(Olsenella sp.)、发酵氨基酸球菌/泰门氨基酸球菌(Acidaminococcus fermentans/Acidaminococcus timonensis)以及产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillumsucciniciproducen)。在要求保护的方法的某些实施方案中，所述细菌具有16S rDNA，16SrDNA与SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:31以及SEQ ID NO:3中任一条的序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％的同一性。
在要求保护的方法的某些实施方案中，所述方法进一步包括检测或定量巨球型菌属的种(Megasphaera sp.)、双歧杆菌属的种(Bifidobacterium sp.)、红蝽菌属的种(Coriobacteriaceae sp.)、链状杆菌属的种(Catenibacterium sp.)、德兰库尔特菌属的种(Drancourtella sp.)、塞利单胞菌属的种(Sellimonas sp.)、瘤胃球菌属的种(Ruminococcus sp.)、多尔氏菌属的种(Dorea sp.)、柯林斯氏菌属(Collinsella)、霍尔德曼氏菌属(Holdemanella)、艰难杆菌属(Mogibacterium)以及厌氧杆菌属(Anaerostipes)；优选检测或定量印度巨球型菌(Megasphaera indica)/埃氏巨球形菌(Megasphaeraelsdenii)、巨球型菌属的种(Megasphaera sp.)、鸡双歧杆菌(Bifidobacteriumgallinarum)/小鸡双歧杆菌(Bifidobacterium pullorum)/世纪双歧杆菌(Bifidobacterium saeculare)/纤细双歧杆菌(Bifidobacterium subtile)、红蝽菌属的种(Coriobacteriaceae sp.)、双歧杆菌属的种(Bifidobacterium sp.)、光冈氏链状杆菌(Catenibacterium mitsuokai)、马赛德兰库尔特菌(Drancourtella massiliense)/肠道塞利单胞菌(Sellimonas intestinalis)/瘤胃球菌属的种(Ruminococcus sp.)/毛螺旋菌属的种(Lachnospiraceae sp.)、多尔氏菌属的种(Dorea sp.)、生产布劳特氏菌(Blautiaproducta)、红蝽菌属的种(Coriobacteriaceae sp.)、柯林斯氏菌属(Collinsella sp.)、双形霍尔德曼氏菌(Holdemanella biforme)、马赛艰难杆菌(Mogibacteriummassiliense)、庞大厌氧杆菌(Anaerostipes hadrus)、厌氧杆菌属的种(Anaerostipessp.)、活泼布劳特氏菌(Blautia gnavus)、粪便/肠道柯林斯氏菌(Collinsellastercoris/intestinalis)、双歧杆菌属的种(Bifidobacterium sp.)以及田中柯林斯氏菌(Collinsella tanakaei)。
在可替代的实施方案中，当前公开的主题提供了一种方法，其中将猫科动物的微生物组的年龄状态与其生物学年龄进行比较，并且当存在差异时通知猫科动物的主人。
在可替代的实施方案中，当前公开的主题提供了一种监测猫科动物的方法，包括在至少两个时间点通过任何前述权利要求的方法测定动物的微生物组的年龄状态的步骤。在要求保护的方法的某些实施方案中，两个时间点相隔至少约6个月。
在要求保护的方法的某些实施方案中，所述方法进一步包括通过给予饮食改变、补充剂、功能性食物、营养品或药物组合物来改变所述微生物组的组成。
在可替代的实施方案中，当前公开的主题提供了一种监测已经经历饮食改变和/或已经接受能够改变微生物组组成的补充剂、功能性食物、营养组合物或药物组合物的猫科动物的微生物组的年龄状态的方法，包括通过前述权利要求中任一项的方法测定微生物组的年龄状态。在要求保护的方法的某些实施方案中，微生物组的年龄状态在组合物施用之前和之后测定。在要求保护的方法的某些实施方案中，组合物包含一种或多种细菌。
在可替代的实施方案中，当前公开的主题提供了一种评估猫科动物的微生物组的年龄状态以确定是否需要干预的方法，包括：(a)对从所述猫科动物获得的样品中的两种或更多种细菌物种进行定量；(b)测定所述细菌物种的相对丰度；(c)将步骤(b)中测定的相对丰度与对照数据集的相对丰度相比较；其中如果步骤(c)的比较表明所述的微生物组的年龄状态与所述猫科动物的实际年龄存在差异，则推荐进行干预。
在可替代的实施方案中，当前公开的主题提供了一种评估猫科动物的微生物组的年龄状态以确定是否需要干预的方法，包括(a)对从所述猫科动物获得的样品中的两种或更多种细菌物种进行定量；(b)计算多样性指数；(c)将所述多样性指数与对照数据集的多样性指数相比较；其中如果步骤(b)中计算的所述多样性指数小于所述对照数据集中的多样性指数的第5百分位数或大于第95百分位数，则推荐进行干预。
在要求保护的方法的某些实施例中，所述对照数据集包括来自与所述猫科动物处于相同生命阶段的多个其他猫科动物的细菌物种多样性数据；或同一猫科动物在一个或多个不同时间点的细菌物种多样性数据，优选相隔至少6个月。
在要求保护的方法的某些实施例中，猫科动物是成年的猫科动物、较老的猫科动物或老年的猫科动物。
在可替代的实施方案中，当前公开的主题提供了一种评估猫科动物的微生物组的年龄状态以确定是否需要干预的方法，包括(a)对从所述猫科动物获得的样品中的两种或更多种细菌物种进行定量；(b)测定所述细菌物种的相对丰度；(c)通过公开的公式计算香农指数多样性；其中如果在步骤(c)中计算的多样性在成年猫科动物中小于约2.77或大于约3.99，在较老的猫科动物中小于约2.41或大于约3.92，或在老年猫科动物中小于约1.65或大于约4.17，则推荐进行干预。在要求保护的方法的某些实施方案中，成年猫科动物被定义为大于约4.5岁且至多约9.5岁，较老的猫科动物被定义为大于约9.5岁且至多约13.5岁，以及老年猫科动物被定义为大于约13.5岁。
在要求保护的方法的某些实施方案中，所述干预是饮食改变、补充剂、功能性食物、营养组合物或药物组合物。在要求保护的方法的某些实施方案中，组合物包含一种或多种细菌。
在要求保护的方法的某些实施方案中，通过DNA测序、RNA测序、蛋白质序列同源性或指示细菌物种的其他生物标记来检测或定量所述细菌物种。
在要求保护的方法的某些实施方案中，所述样品是粪便样品或来自胃肠道的样品。在要求保护的方法的某些实施方案中，所述样品是回肠、空肠、十二指肠或结肠样品。
在要求保护的方法的某些实施方案中，猫科动物是猫。
附图说明
图1A：细菌分类单元(OTU)按重要性分数排列，描述将样品分配给适当的猫科动物研究组(成年猫、较老的猫和老年猫)的一致性。
图1B：在预测模型中按重要性顺序排列的猫科动物连续增加的OTU数量的累积灵敏度和正预测值。
图1C：按重要性顺序排列的连续增加的OTU数量的准确度图。
图2A：所有113个OTU和稀有分类单元组的丰度数据的PLS相关性图。样品和OTU描述符已被删除，以便于可视化，并替换为用于定向目的的通用描述符。粪便样品以单独的水平行表示并根据相似性进行聚类，而细菌OTU则由热图中的各个列表示。颜色编码表示相关性程度和方向。
图2B：示例性PLSDA相关图，使用对检测粪便微生物群的生物学年龄最有影响的27个分类单元来对对照猫和测试样品的相对丰度数据进行聚类。在左侧y轴上按分组表示样品(红色，成年的；绿色，较老的和蓝色，老年的)。粪便样品以单独的水平行表示(在右侧的竖直轴上描述)并根据相似性进行聚类，而细菌OTU由热图中的各个列表示。相关图中点的颜色编码表示相关性程度和方向。
图3：按生命阶段分组的成年猫的粪便微生物群的香农多样性(*p＝0.007)。
图4对应于表1.1，表1.1提供了可用于将猫微生物组分配到不同生命阶段(幼年的、青年的、成年的、较老的和老年的)的细菌物种。
图5对应于表1.2，表1.2提供了图4(表1.1)中提供的细菌物种的16S rDNA序列。
图6对应于表1.3，表1.3提供了可用于将猫微生物组分配到不同生命阶段的细菌物种的准确度。
图7对应于表2.1，表2.1提供了可用于将猫微生物组分配到成年、较老的和老年生命阶段的细菌物种。
图8对应于表2.2，表2.2提供了图7(表2.1)中提供的细菌物种的16S rDNA序列。
图9对应于表3.1，表3.1提供了成年猫、较老的猫和老年猫的微生物群中的香农多样性。
具体实施方式
微生物组的年龄状态
本公开内容的方法可用于确认来自猫科动物的微生物组的年龄状态。通过将样品中的细菌物种和任选地其相对丰度与对照数据集进行比较，可以将微生物组分配到特定的“年龄”或“生命阶段(lifestage)”或“生命阶段(life stage)”。通常，对照数据集将代表具有已知微生物组组成和猫科动物年龄多样性范围的猫科动物的微生物组。例如，可以分析来自特定年龄组(幼年的(kitten)、青年的(youth)、成年的(adult)、较老的(senior)、老年的(geriatric))的许多猫科动物的微生物组组成。此外或可替代地，可以在生命阶段内或不同生命阶段中的每隔一段时间从同一猫科动物分析微生物组组成。对所有测试个体的不同年龄组表现出高度特异性的细菌物种然后可以用作对照数据集。对照数据集也可以基于对单个个体的分析，例如在不同的生命阶段。在特定的实施方案中，图4、图6或图7(表1.1、表1.3或表2.1)中所示的数据集用作本公开内容的方法中的对照数据集。
在一些实施方案中，微生物组的年龄状态通过下述来测定：将样品中的微生物组与具有已知微生物组的年龄状态(对照微生物组)的微生物组组成相比较并基于与对照的相似性来确定微生物组的年龄状态。因此，在一些实施方案中，对照数据集可以包括处于不同生命阶段的猫科动物的典型微生物组。在特定的实施方案中，对照数据集包括来自幼年、青年、成年猫科动物、较老的猫科动物和老年猫科动物的微生物组数据。微生物组的年龄状态可以通过识别与猫科动物的微生物组最相似的对照微生物组并将相应的生命阶段分配给猫科动物来确定。这些微生物组数据可以通过上述方法获得。
在一些实施方案中，检测和/或定量一种或几种细菌物种(例如，少于5种、7种、8种、10种、15种、20种、25种、27种或30种)。在特定的实施方案中，分析最少两种细菌物种，因为目前公开的主题已经表明这样的方法具有良好的灵敏度。在其他实施方案中，分析最少7种，或正好7种细菌物种，因为当前公开的主题已表明此类方法在将样品分配到适当的生命阶段方面具有最高准确度。这些通常是允许明确分配到一个(或可能两个)不同生命阶段的细菌。在这些实施方案中，评估的一种或多种细菌物种基于显示这些指示特定生命阶段的数据集。因此，在这些实施方案中，感兴趣物种的检测和基于这些数据的微生物组年龄状态的后续分配构成了将样品中的物种与对照数据集相关联。
当前公开的主题已经发现某些细菌物种高度指示猫科动物微生物组的年龄状态。图4(表1.1)中显示的细菌物种在将样品正确地分配给不同生命阶段(幼年、青年、成年、较老的和老年)的猫方面具有高度一致性。在一些实施方案中，本公开内容的方法因此允许测定成年、较老的或老年猫科动物的微生物组的年龄状态。然后可以评估结果以测定微生物组的年龄状态是否与猫科动物的实际年龄一致。如果没有，可以采取措施改变微生物组的年龄状态，如下所述。在特定的实施方案中，对在本公开内容的方法中分析的细菌物种进行定量。当前公开的主题已经发现肠道和粪便微生物组内不同细菌物种的相对丰度随着猫的年龄增长而变化，如下面的实施例中详细讨论的。因此，微生物组中检测到的细菌物种的组合和丰度可以测定猫/猫科动物中微生物组的年龄状态，如下面的实施例的中详细讨论的。
本公开内容的方法通常通过检测基因序列或其他生物标记来检测和/或定量一种或多种不同的细菌物种，例如一种或多种细菌属和/或一种或多种细菌物种。
除了本文所述的那些技术之外，允许技术人员检测和定量细菌分类单元的技术是本领域公知的。例如，这些包括聚合酶链反应(PCR)和定量16SrDNA扩增子测序、鸟枪法测序、宏基因组测序、Illumina测序和纳米孔测序。在一些实施方案中，细菌物种通过16SrDNA序列的测序来确定。其他方法将包括鸟枪测序以确定特征性全基因组基因序列或其他方法，例如用于检测代谢物的光谱法和用于识别物种的生物标记检测的一系列方法。
在一些实施方案中，细菌物种通过对V4-V6区进行测序来确定，例如使用IlluminaDNA测序技术。这些方法可以使用引物319F：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO:43)和806R：AATGATACGG CGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTAC ACGACGCTCT TCGATCT(SEQ ID NO:44)。
在进一步的实施方案中，细菌物种通过本领域已知的其他方式检测，诸如，例如RNA测序、蛋白质序列同源性或指示细菌物种或细菌功能的其他生物标记。
然后可以使用测序数据来确定样品中不同细菌分类单元的存在或不存在。例如，序列可以以约98％、约99％或100％同一性聚类，并且然后可以评估细菌分类单元(例如，代表总序列超过0.01％或0.05％的丰富的分类单元)的相对比例。用于确定细菌物种和生物标记或细菌或生物标记组合的描述性质以确定它们将样品分配给特定研究组例如年龄范围的能力的合适技术是本领域已知的，并且包括例如逻辑回归分析；偏最小二乘判别分析(partial least squares discriminate analysis，PLSDA)或随机森林分析和其他多变量方法。然后根据它们对特定微生物组的年龄状态的特异性对细菌分类单元或生物标记进行排序。
本领域技术人员将理解，不需要每次执行根据本公开内容的方法时都准备对照数据集。相反，技术人员可以如下所述分析样品，并将结果与数据库比较，所述数据库显示针对动物年龄具有已知健康微生物组的猫科动物的微生物组成，或者与针对动物的生命阶段或年龄的平均组成和多样性比较。
本公开内容的另一种方法是评估猫的微生物组的年龄状态以确定是否需要干预(例如，治疗)的方法，该方法包括(a)对从猫科动物获得的样品中的两种或更多种细菌物种进行定量；(b)测定细菌物种的相对丰度；(c)将步骤(b)中测定的相对丰度与对照数据集的相对丰度相比较；其中如果步骤(c)的比较表明微生物组的年龄状态与猫科动物的实际年龄不同，则建议进行干预(例如治疗)。干预(例如治疗)是一种改变猫科动物微生物组的干预措施，如下面详细讨论的。两种或更多种细菌物种可以包含5种或更多种、10种或更多种、15种或更多种、20种或更多种、25种或更多种或30种或更多种细菌物种。对照数据集可以包括来自与测试的猫科动物(例如成年、较老的或老年)相同生命阶段的多只其他猫科动物的细菌物种多样性数据，例如来自5只或更多、10只或更多、15只或更多、20只或更多、25只或更多、30只或更多、35只或更多、或40只或更多其他猫科动物。
本公开内容的另一种方法是评估猫科动物的微生物组的年龄状态以确定是否需要干预(例如治疗)的方法，包括(a)对从猫科动物获得的样品中的两种或更多种细菌物种进行定量；(b)计算多样性指数；(c)将多样性指数与对照数据集的多样性指数相比较；其中如果在步骤(b)中计算的多样性指数小于对照数据集中的多样性指数的第5百分位数或大于第95百分位数，则推荐进行干预(例如处理)。干预(例如治疗)是一种改变猫科动物的微生物组的干预措施，如下面详细讨论的。两种或更多种细菌物种可以包含5种或更多种、10种或更多种、15种或更多种、20种或更多种、25种或更多种或30种或更多种细菌物种。对照数据集可以包括来自不同生命阶段的多只其他猫科动物的细菌物种的多样性数据，并且在一些实施方案中对照数据集可以包括来自与测试的猫科动物相同的生命阶段(例如成年的、较老的或老年的)，例如来自5只或更多、10只或更多、15只或更多、20只或更多、25只或更多、30只或更多、35只或更多、或40只或更多其他猫科动物的细菌物种的多样性数据。可替代地，对照数据集包括来自相同猫科动物在一个或多个不同时间点，例如2个、3个、4个或5个不同时间点，在一些实施方案中，相隔至少6个、8个、10个或12个月的细菌物种多样性数据。可替代地，对照数据集包括来自同一猫科动物在受伤、疾病或压力之前(诸如由于肠胃不适或旅行)的细菌物种的多样性数据。在某些实施方案中，步骤(b)包括通过下面详述的公式计算香农指数多样性。
本公开内容的另一种方法是评估猫科动物的微生物组的年龄状态以确定是否需要干预(例如治疗)的方法，包括(a)对从猫科动物获得的样品中的两种或更多种细菌物种进行定量；(b)测定所述细菌物种的相对丰度；(c)通过以下公式计算香农指数多样性：
香农性指数
其中如果在步骤(c)中计算的多样性在成年猫科动物中小于约2.77或大于约3.99，在较老的猫科动物中小于约2.41或大于约3.92，或在老年猫科动物中小于约1.65或大于约4.17，则需要干预(例如治疗)。两种或更多种细菌物种可以包含5种或更多种、10种或更多种、15种或更多种、20种或更多种、25种或更多种或30种或更多种细菌物种。干预是一种改变猫科动物微生物组的干预措施，详情如下。
细菌物种
当前公开的主题已经发现某些细菌对于在本公开内容的方法中测定猫的微生物组的年龄状态特别有用。这些包括索拉杆菌属、欧尔森氏菌属以及厌氧螺菌属的细菌。这些属中特别有用的物种包括索拉杆菌属的种、欧尔森氏菌属的种、马赛菌-P2300以及厌氧产琥珀酸。在一些实施方案中，被检测的序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3的序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％的同一性。
上一段中讨论的细菌物种在测定猫科动物的微生物组的年龄状态方面显示出最高的准确度，如图4(表1.1)所示。当前公开的主题进一步表明，当检测到和/或量化更多种类时，准确度增加。因此，在一些实施方案号中，检测和/或量化前一段中提到的所有种类。例如，与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同一性的序列被检测和/或定量。在进一步的实施方案中，除了在前一段中提到的所有物种之外，还检测和/或量化了所有以下物种：活泼布劳特氏菌、双形霍尔德曼氏菌、罗讷河口柯林斯氏菌和阿维桑双歧杆菌。例如，与SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7的序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同一性的序列被检测和/或量化。如图6(表1.3)所示，当这七个物种被检测和/或量化时，在将样品分配到适当的生命阶段时达到了峰值准确度。此外或可选地，本公开的方法还包括分析下文讨论的一种或多种细菌物种和属。
可用于区分成年、较老的和老年微生物组的其他细菌物种包括选自以下属的物种：索拉杆菌属(Solobacterium)、欧尔森氏菌属(Olsenella)、厌氧螺菌属(Anaerobiospirillum)、布劳特氏菌属(Blautia)、霍尔德曼氏菌属(Holdemanella)、柯林斯氏菌属(Collinsella)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、真杆菌属(Eubacterium)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、小杆菌属(Dialister)、拟杆菌属(Bacteroides)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、阿德勒克罗伊茨菌属(Adlercreutzia)、罕见小球菌属(Subdoligranulum)、梭菌属(Clostridium)、艰难杆菌属(Mogibacterium)、塞利单胞菌属(Sellimonas)、链球菌属(Streptococcus)、罕见小球菌属(Subdoligranulum)以及拉克氏梭状芽胞杆菌属(Lachnoclostridium)，或者来自毛螺旋菌科的细菌物种。在一些实施方案中，用于本公开内容的方法中的细菌物种包括索拉杆菌属的种(Solobacterium sp.)、欧尔森氏菌属的种(Olsenella sp.)、马赛菌-P2300(Marseille-P2300)、产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)、活泼布劳特氏菌(Blautia gnavus)、双形霍尔德曼氏菌(Holdemanella biforme)、罗讷河口柯林斯氏菌(Collinsellabouchesdurhonensis)、双歧杆菌属的种(Bifidobacterium sp.)、短真杆菌(Eubacteriumbrachy)、田中柯林斯氏菌(Collinsella tanakaei)、粪便柯林斯氏菌(Collinsellastercoris)、卵形布劳特氏菌(Blautia obeum)、圆柱状真杆菌(Eubacteriumcylindroides)、溶木聚糖拟杆菌/小杆菌(Dialister/Bacteroides xylanisolvens)、瘤胃乳酸杆菌(Lactobacillus ruminis)、阿德勒克罗伊茨菌属的种(Adlercreutzia sp.)、罕见小球菌属的种(Subdoligranulum sp.)、产气荚膜杆菌(Clostridium perfringens)、马赛艰难杆菌(Mogibacterium massiliense)、塞利单胞菌属的种(Sellimonas sp.)、黄体链球菌(Streptococcus luteciae)、毛螺旋菌属的种(Lachnospiraceae sp.)、变形罕见小球菌(Subdoligranulum variabile)、嗜琥珀酸小杆菌(Dialister succinatiphilus)、拉克氏柔嫩梭菌(Lachnoclostridium[Clostridium]leptum)、拉克氏海莱蒙梭菌(Lachnoclostridium[Clostridium]hylemonae)以及产粪甾醇真杆菌(Eubacteriumcoprostanoligenes)。
如上文所讨论和如图6(表1.3)所示的，当检测和/或定量更多细菌物种时，本公开内容的方法的准确度增加。因此，在一些实施方案中，图4中所示的细菌物种中的超过5种、超过6种、超过7种、超过8种、超过10种、超过15种、超过20种、超过25种或全部30种(表1.1)和图5(表1.2)中描述的序列被检测和/或量化。细菌物种可以是在前面的段落中讨论过。例如，在一些实施方案中，该方法检测和/或定量与SEQ ID NO:1-30的任一序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同一性的序列。在特定的实施方案中，本公开的方法检测和/或定量与SEQ ID Nos：1-3、或4-7、或1-7的所有序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同一性的序列。
本公开的主题进一步发现，索拉杆菌属细菌对于测定成年生命各个阶段(成年、较老的和老年)的猫科动物的微生物组的年龄状态特别有用。因此，在某些实施方案中，本文公开的方法包括检测和/或定量与SEQ ID NO:1的序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或具有100％同一性的序列。
当前公开的主题已经发现欧尔森氏菌属和/或厌氧螺菌属的细菌，特别地，欧尔森氏菌属的种、马赛菌-P2300以及产琥珀酸厌氧螺菌特别适用于确定成年生活各个阶段(青年的、成年的、较老的和老年的)的猫科动物的微生物组的年龄状态。因此，在一些实施方案中，本文公开的方法包括检测和/或定量与SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3的序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或具有100％同一性的序列。
其他有用的细菌物种包括真杆菌属的种(Eubacterium sp.)、柯林斯氏菌属的种(Collinsella sp.)、布劳特氏菌属的种(Blautia sp.)、小杆菌/拟杆菌属的种(Dialister/Bacteroides sp.)、乳酸杆菌属的种(Lactobacillus sp.)、阿德勒克罗伊茨菌属的种(Adlercreutzia sp.)、罕见小球菌属(Subdoligranulum sp.)；并且特别是短真杆菌(Eubacterium brachy)、田中柯林斯氏菌(Collinsella tanakaei)、粪便柯林斯氏菌(Collinsella stercoris)、卵形布劳特氏菌(Blautia obeum)、圆柱状真杆菌(Eubacterium cylindroides)、溶木聚糖拟杆菌/小杆菌(Dialister/Bacteroidesxylanisolvens)、瘤胃乳酸杆菌(Lactobacillus ruminis)、阿德勒克罗伊茨菌属的种(Adlercreutzia sp.)以及罕见小球菌属的种(Subdoligranulum sp.)。在一些情况下，该方法还包括检测和/或定量与SEQ ID NO:8-17的序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同一性的序列。
如图6(表1.3)所示，当前公开的主题已经发现，如果检测和/或定量多于一种细菌物种，则特异性增加，其中七个物种达到峰值特异性。因此，在一些实施方案中，检测和/或定量两种或更多种细菌物种(例如，细菌属和/或细菌物种)。随着更多细菌物种被检测和/或定量，该方法的特异性增加。本公开内容的方法可以包括，例如，检测图4(表1.1)中描述的5种或更多种、6种或更多种、7种或更多种、15种或更多种、20种或更多种、或25种或更多种或全部30种细菌物种。在一些实施方案中，该方法可包括检测所有细菌物种，或所有在图4(表1.1)中确认并由图5(表1.2)中的DNA序列描述的细菌属或细菌物种。例如，该方法可以包括检测与SEQ ID NO:1-30的序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同一性的序列。在特定的实施方案中，检测和/或定量了7种或更多，或者特别是正好7种细菌物种，因为目前公开的主题已经表明，此类方法在将样品分配到适当的生命阶段时具有峰值准确度(参见图6(表1.3))。
当检测到的序列与本文鉴定的DNA序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％或100％同一性时，该序列可以来自同一物种或密切相关物种的细菌。例如，在与SEQ ID NO:x的序列具有95％同一性的序列的情况下，该序列将优选源自与获得SEQ ID NO:x的细菌同一科，更优选源自同一属或甚至优选来自同一物种的细菌。例如，在SEQ ID NO:6的情况下，细菌优选柯林斯氏菌属，而且最优选罗讷河口柯林斯氏菌种。
在特定实施方案中，其中将样品中的一种或多种细菌物种与对照数据集相关联的步骤包括使用偏最小二乘判别分析(“PLS-DA实施方案”)、不同细菌物种的检测和/或定量可能很有用(如实施例2所示)。在该实施方案中，有用的属包括索拉杆菌属(Solobacterium)、真杆菌属(Eubacterium)、布劳特氏菌属(Blautia)、拉克氏梭状芽胞杆菌属(Lachnoclostridium)、欧尔森氏菌属(Olsenella)、氨基酸球菌属(Acidaminococcus)、厌氧螺菌属(Anaerobiospirillum)、巨球型菌属(Megasphaera)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、红蝽菌科(Coriobacteriaceae)、链状杆菌属(Catenibacterium)、德兰库尔特菌属(Drancourtella)、塞利单胞菌属(Sellimonas)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、多尔氏菌属(Dorea)、柯林斯氏菌属(Collinsella)、霍尔德曼氏菌属(Holdemanella)、艰难杆菌属(Mogibacterium)以及厌氧杆菌属(Anaerostipes)；以及有用的种包括索拉杆菌属的种(Solobacterium sp.)、短真杆菌(Eubacterium brachy)、卵形布劳特氏菌(Blautia obeum)、拉克氏柔嫩梭菌(Lachnoclostridium[Clostridium]leptum)、拉克氏海莱蒙梭菌(Lachnoclostridium[Clostridium]hylemonae)、欧尔森氏菌属的种(Olsenella sp.)、发酵氨基酸球菌(Acidaminococcus fermentans)、泰门氨基酸球菌(Acidaminococcus timonensis)、产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillumsucciniciproducens)、印度巨球型菌(Megasphaeraindica)、埃氏巨球形菌(Megasphaeraelsdenii)、巨球型菌属的种(Megasphaera sp.)、鸡双歧杆菌(Bifidobacteriumgallinarum)、小鸡双歧杆菌(Bifidobacterium pullorum)、世纪双歧杆菌(Bifidobacterium saeculare)、纤细双歧杆菌(Bifidobacterium subtile)、红蝽菌属的种(Coriobacteriaceae sp.)、双歧杆菌属的种(Bifidobacterium sp.)、光冈氏链状杆菌(Catenibacterium mitsuokai)、马赛德兰库尔特菌(Drancourtella massiliense)、肠道塞利单胞菌(Sellimonas intestinalis)、瘤胃球菌属的种(Ruminococcus sp.)、毛螺旋菌属的种(Lachnospiraceae sp.)、多尔氏菌属(Dorea sp.)、生产布劳特氏菌(Blautiaproducta)、红蝽菌属的种(Coriobacteriaceae sp.)、柯林斯氏菌属(Collinsella sp.)、双形霍尔德曼氏菌(Holdemanella biforme)、马赛艰难杆菌(Mogibacteriummassiliense)、庞大厌氧杆菌(Anaerostipes hadrus)、厌氧杆菌属的种(Anaerostipessp.)、活泼布劳特氏菌(Blautia gnavus)、粪便/肠道柯林斯氏菌(Collinsellastercoris/intestinalis)、双歧杆菌属的种(Bifidobacterium sp.)以及田中柯林斯氏菌(Collinsella tanakaei)。此类方法可涉及检测和/或定量与SEQ ID Nos:1、SEQ ID Nos:8、SEQ ID Nos:11、SEQ ID Nos:29、SEQ ID Nos:2、SEQ ID Nos:31、SEQ ID Nos:3、SEQ IDNos:32、SEQ ID Nos:33、SEQ ID Nos:34、SEQ ID Nos:35、SEQ ID Nos:36、SEQ ID Nos:37、SEQ ID Nos:38、SEQ ID Nos:21、SEQ ID Nos:28、SEQ ID Nos:39、SEQ ID Nos:40、SEQ IDNos:41、SEQ ID Nos:9、SEQ ID Nos:5、SEQ ID Nos:20、SEQ ID Nos:42、SEQ ID Nos:4、SEQID Nos:10、SEQ ID Nos:7以及SEQ ID Nos:15中的任一序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同一性的序列。
PLS-DA实施方案包括检测或定量来自索拉杆菌属的细菌物种，更具体地还有短真杆菌和卵形布劳特氏菌(Blautia obeum)物种，例如通过检测和/或量化细菌物种中与SEQID NO:1的序列以及SEQ ID NO:8和SEQ ID Nos:11的序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同一性的16S rDNA。在进一步的实施方案中，该方法包括检测或定量拉克氏柔嫩梭菌/拉克氏海莱蒙梭菌(Lachnoclostridium[Clostridium]leptum/Lachnoclostridium[Clostridium]hylemonae)、欧尔森氏菌属的种(Olsenella sp.)、发酵氨基酸球菌/泰门氨基酸球菌(Acidaminococcus fermentans/Acidaminococcus timonensis)以及产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillumsucciniciproducen)，例如通过检测和/或定量与SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:3的序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同一性的16S rDNA。在另外的实施方案中，该方法包括检测或定量巨球型菌属的种(Megasphaera sp.)、双歧杆菌属的种(Bifidobacterium sp.)、红蝽菌属的种(Coriobacteriaceae sp.)、链状杆菌属的种(Catenibacterium sp.)、德兰库尔特菌属的种(Drancourtella sp.)、塞利单胞菌属的种(Sellimonas sp.)、瘤胃球菌属的种(Ruminococcus sp.)、多尔氏菌属的种(Dorea sp.)、柯林斯氏菌属(Collinsella)、霍尔德曼氏菌属(Holdemanella)、艰难杆菌属(Mogibacterium)以及厌氧杆菌属(Anaerostipes)；特别是检测或定量印度巨球型菌(Megasphaera indica)/埃氏巨球形菌(Megasphaeraelsdenii)、巨球型菌属的种(Megasphaera sp.)、鸡双歧杆菌(Bifidobacteriumgallinarum)/小鸡双歧杆菌(Bifidobacterium pullorum)/世纪双歧杆菌(Bifidobacterium saeculare)/纤细双歧杆菌(Bifidobacterium subtile)、红蝽菌属的种(Coriobacteriaceae sp.)、双歧杆菌属的种(Bifidobacterium sp.)、光冈氏链状杆菌(Catenibacterium mitsuokai)、马赛德兰库尔特菌(Drancourtella massiliense)/肠道塞利单胞菌(Sellimonas intestinalis)/瘤胃球菌属的种(Ruminococcus sp.)/毛螺旋菌属的种(Lachnospiraceae sp.)、多尔氏菌属的种(Dorea sp.)、生产布劳特氏菌(Blautiaproducta)、红蝽菌属的种(Coriobacteriaceae sp.)、柯林斯氏菌属的种(Collinsellasp.)、双形霍尔德曼氏菌(Holdemanella biforme)、马赛艰难杆菌(Mogibacteriummassiliense)、庞大厌氧杆菌(Anaerostipes hadrus)、厌氧杆菌属的种(Anaerostipessp.)、活泼布劳特氏菌(Blautia gnavus)、粪便/肠道柯林斯氏菌(Collinsellastercoris/intestinalis)、双歧杆菌属的种(Bifidobacterium sp.)以及田中柯林斯氏菌(Collinsella tanakaei)。
猫科动物
本公开内容的方法可用于测定猫科动物的微生物组健康。该属包括猫科动物家族的物种。这些物种包括非洲-亚洲野猫(Felis silvestris ornata)、非洲金猫(Profelisaurata)、安第斯山猫(Leopardus jacobita)、亚洲金猫(Catopuma temminckii)、海湾猫(Catopuma badia)、黑足猫(Felis nigripes)、山猫(Lynx rufus)、婆罗洲云豹(Neofelisdiardi)、加拿大猞猁(Lynx canadensis)、狞猫(Caracal caracal)、猎豹(Acinonyxjubatus)、中国荒漠猫(Felis bieti)、云豹(Neofelis nebulosa)、家猫(Felis catus)、欧亚猞猁(Lynx lynx)、欧洲野猫(Felis silvestris)、渔猫(Prionailurus viverrinus)、扁头豹猫(Prionailurus planiceps)、乔氏虎猫(Leopardus geoffroyi)、伊比利亚猞猁(Lynx pardinus)、西表猫(Prionailurus iriomotensis)、黑美洲豹(Panthera onca)、细腰猫(Herpailurus yagouarundi)、丛林猫(Felis chaus)、南美林虎猫(Leopardusguigna)、豹猫(Prionailurus bengalensis)、金钱豹(Panthera pardus)、狮子(Pantheraleo)、石纹猫(Pardofelis marmorata)、长尾虎猫(Leopardus wiedii)、山狮(Pumaconcolor)、虎猫(Leopardus pardalis)、小斑虎猫(Leopardus tigrinus)、兔狲(Otocolobus manul),南美草原虎猫(Leopardus colocolo)、锈斑猫(Prionailurus,rubiginosus)、沙丘猫(Felis margarita)、薮猫(Leptailurus serval)、雪豹(Unciauncia)和老虎(豹属)。在一些实施方案中，猫科动物是家猫，在本文中称为猫。
此外，在一些实施方案中，猫科动物是健康的。如本文所用，“健康”是指尚未被诊断患有已知会影响微生物组的疾病的猫科动物。此类疾病的实例包括但不限于肠易激综合征、溃疡性结肠炎、克罗恩病和炎症性肠病。在特定的实施方案中，猫科动物不患有生态失调。生态失调是指体内微生物组失衡，这是由于关键细菌(例如双歧杆菌，如长双歧杆菌婴儿亚种(B.Longum subsp.infantis))水平不足或肠道中有害细菌过多所致。检测生态失调的方法是本领域公知的。
本文公开的方法的一个优点是它们允许技术人员在考虑猫科动物的生命阶段的情况下确定猫科动物的微生物组是否健康。
有许多不同品种的猫。下面的表1.0-B中提供了不同生命阶段的概述。
表1.0-B
| 青年的 | 成年的 | 较老的 | 老年的 |
| 1-4年 | 5-9年 | 10-13年 | ≥14年 |
本领域技术人员将理解，以上讨论的年龄范围并不总是严格适用于每只猫科动物。相反，例如，技术人员将能够通过其生理特征将猫科动物分类为特定的生命阶段。
样品
根据本文公开的方法，猫科动物的微生物组组成通过分析从猫科动物采集的样品进行分析。样品可以是粪便样品或取自猫科动物的胃肠腔的样品。粪便样品很方便，因为它们的收集是非侵入性的，并且还允许在一段时间内对个体进行简单的重复采样。然而，其他样品也可用于本文公开的方法中，包括但不限于回肠、空肠、十二指肠样品和结肠样品。
在一些实施方案中，样品是新鲜样品。在其他实施方案中，在用于本公开的方法之前，通过其他方式冷冻或稳定样品，例如添加到保存缓冲液中，或通过使用诸如冷冻干燥的方法脱水。
在公开的方法中使用之前，在一些实施方案中，样品被处理以提取DNA。分离DNA的方法是本领域公知的，例如参考文献[8]中所述。合适的方法包括，如QIAamp强力粪DNA试剂盒(QIAamp Power Faecal DNA kit)(凯杰(Qiagen))。
改变微生物组
在一些实施方案中，本公开内容的方法包括改变微生物组组成的进一步步骤。微生物组的组成可以通过向猫科动物施用能够改变微生物组组成的饮食改变、功能性食物、补充剂或营养组合物或药物组合物来改变。此类功能性食物、营养品、活的生物治疗产品(LBP)和药物组合物在本领域中是众所周知的并且可以包含细菌[9]。它们可以包含选自由双歧杆菌属的种组成的组的单一细菌物种，例如动物双歧杆菌(B.animalis)(例如动物双歧杆菌动物亚种(B.animalis subsp.animalis)或动物双歧杆菌乳酸亚种(B.animalissubsp.lactis))、双歧双歧杆菌(B.bifidum)、短双歧杆菌(B.breve)、长双歧杆菌(B.longum)(如长双歧杆菌婴儿亚种(B.longum subsp.infantis)或长双歧杆菌长亚种(B.longum subsp.longum))、假长双歧杆菌(B.pseudolongum)、青春双歧杆菌(B.adolescentis)、链状双歧杆菌(B.catenulatum)或假链状双歧杆菌(B.pseudocatanulatum)；乳酸杆菌属(Lactobacillus)的单一细菌物种，例如嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、胃窦乳杆菌(L.antri)、短乳杆菌(L.brevis)、干酪乳杆菌(L.casei)、大肠乳杆菌(L.coleohominis)、卷曲乳杆菌(L.crispatus)、弯曲乳杆菌(L.curvatus)、发酵乳杆菌(L.fermentum)、格氏乳杆菌(L.gasseri)、约氏乳杆菌(L.johnsonii)、粘膜乳杆菌(L.mucosae)、戊糖乳杆菌(L.pentosus)、植物乳杆菌(L.plantarum)、罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)、清酒乳杆菌(L.sakei)、唾液乳杆菌(L.salivarius)、副干酪乳杆菌(L.paracasei)、克森乳杆菌(L.kisonensis)、类食品乳杆菌(L.paralimentarius)、佩洛琳乳杆菌(L.Perolens)、蜜粉乳杆菌(L.Apis)、加纳乳杆菌(L.Ghanensis)、糊精乳杆菌(L.Dextrinicus)、深圳乳杆菌(L.Shenzenensis)、哈尔滨乳杆菌(L.Harbinensis)；或片球菌(Pediococcus)的单一细菌物种，例如小片球菌(P.parvulus)、洛丽片球菌(P.lolii)、乳酸片球菌(P.acidilactici)、阿根廷片球菌(P.argentinicus)、克劳森片球菌(P.claussenii)、戊糖片球菌(P.pentosaceus)或斯泰氏片球菌(P.stilesii)或肠球菌(Enterococcus)的类似物种，例如屎肠球菌(Enterococcusfaecium)；或芽孢杆菌属(Bacillus)物种，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、印度芽孢杆菌(B.indicus)或克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)。另外，该方法可以包括这些和其他细菌物种的组合。施用至猫科动物的饮食改变、功能性食物、补充剂、营养组合物或药物组合物的量可以是有效影响微生物组的组成变化的量。
在猫科动物的微生物组的年龄状态与其实际年龄不一致的情况下，可以执行改变微生物组组成的另外的步骤。例如，本公开内容的方法可以揭示成年猫具有代表较老的猫或老年猫的微生物组组成和多样性。如上所述，与成年微生物组相关的特征被认为是最健康的微生物组特征，且因此在这些情况下，较老的猫非常需要改变饮食和/或施用功能性食物、营养品、LBP或药物组合物以将微生物组转变回成年微生物组的组成/状态。
类似地，在其他实施方案中，可能需要改变微生物组，使得微生物组的年龄状态与猫科动物的实际年龄不一致。例如，处于较老的或老年生命阶段的老年猫可以受益于接受饮食改变、功能性食物、营养品、LBP或药物组合物，以将微生物组转变成代表成年猫的的微生物组，特别是如果患有复发性腹泻或其他微生物组相关病症。
本公开内容的方法还可用于评估如上所述的治疗的成功。为此，猫科动物可以接受能够改变微生物组组成的饮食改变、功能性食物、补充剂、LBP、营养品或药物组合物。在通过营养实施治疗后(例如在约1天、2天、5天、1周、2周、3周、1个月、3个月、6个月等之后)，可以使用本公开内容的任何方法评估微生物组的年龄状态。在某些实施方案中，在施用功能性食物、补充剂、LBP、营养品或药物组合物之前和之后测定微生物组的年龄状态。
监测
在一些实施方案中，本文描述的方法执行一次以测定猫科动物的微生物组的年龄状态并比较按时间计算的年龄。本文描述的方法也可以被执行不止一次，例如两次、三次、四次、五次、六次、七次或超过七次。这允许随着时间的推移监测微生物组的年龄状态。例如，若猫科动物正在接受治疗以改变微生物组或处于代表生命阶段之间的转变的年龄以追踪未来进行干预的需要，这可能很有用。第一次执行该方法时，测定微生物组的年龄状态，并在干预诸如饮食改变或施用补充剂、功能性食物、营养品或药物组合物后，重复该方法以评估组合物或干预对微生物组的影响。也可以在猫科动物接受治疗后第一次测定微生物组的年龄状态，然后重复该方法以评估微生物组的年龄状态是否发生变化。
本文所述的方法可重复几天、约1周、约2周、约3周、约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约12个月、约18个月、约24个月、约30个月、约36个月或相隔超过约36个月。
治疗
在一些实施方案中，本公开内容的方法还可涉及用于治疗猫科动物的方法。猫科动物可以具有与其实际年龄不一致的微生物组年龄，如成年猫具有较老的或老年猫的微生物组组成和多样性。在其他实施方案中，本公开内容的方法可以涉及用于治疗猫科动物以改变猫科动物的微生物组的年龄至低于猫科动物的实际年龄的方法。用于治疗的这些方法包括(i)通过根据本文公开的任何方法通过测定微生物组的年龄来鉴定猫科动物需要治疗，和(ii)向猫科动物施用能够改变微生物组的组成的如本文公开的饮食改变、功能性食物、补充剂、营养品或药物组合物。施用给猫科动物的饮食改变、功能性食物、补充剂、营养组合物或药物组合物的量可以是有效影响微生物组组成的改变或改善与具有不健康微生物组状态的猫科动物相关的任何症状的量。任选地，在一些实施方案中，该方法进一步包括在施用饮食改变、功能性食物、补充剂、营养品或药物组合物后测定微生物组年龄以评估治疗的有效性。
概述
除非另有说明，否则本公开内容的实践将采用本领域技术范围内的化学、生物化学、分子生物学、免疫学和药理学的常规方法。这些技术在文献中有充分的解释。参见，例如，参考文献[10-17]等。
提及两个核苷酸序列之间的百分比序列同一性意味着，当比对时，在比较两个序列时核苷酸的百分比是相同的。这种比对和同源性百分比或序列同一性可以使用本领域已知的软件程序来测定，例如在参考文献[18]的第7.7.18节中描述的那些。特定的比对是使用下述测定的：BLAST(基本局部比对搜索工具)算法或Smith-Waterman同源性搜索算法，使用仿射间隙搜索且间隙开放罚分为12，间隙扩展罚分为2，BLOSUM矩阵为62。Smith-Waterman同源搜索算法在参考文献[19]中公开。比对可以在整个参考序列上进行，即它可以在本文公开的序列的100％长度内进行。
定义
本说明书中使用的术语在本领域中、在本发明的上下文中以及在使用每个术语的特定上下文中通常具有它们的普通含义。某些术语在下文或说明书中的其他地方讨论，以在描述本发明的方法和组合物以及如何制备和使用它们时为从业者提供额外的指导。
如本文所用的，当与权利要求和/或说明书中的术语“包括”结合使用时，词汇“一个(a)”或“一个(an)”的使用可以表示“一个”，但也与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或超过一个”的含义一致。更进一步，术语“具有”、“包含”和“包括”是可互换的，并且本领域技术人员认识到这些术语是开放式术语。此外，术语“包括”涵盖“包含”以及“由XXX组成”，例如，“包括”X的组合物可仅由X组成或可包括额外的东西，例如X+Y。
术语“约”或“近似”是指在由本领域技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分取决于如何测量或确定该值，即测量系统。例如，根据本领域的实践，“约”可以表示在3个或超过3个标准偏差内。可替代地，“约”可以表示给定值的最多20％、可替代地最多10％、可替代地最多5％、或者可替代地仍然最多1％的范围。可替代地，特别是对于生物系统或过程，该术语可表示在一个数量级内，可替代地在一个数值的5倍以内，并且可替代地在2倍以内。在某些实施方案中，与数值x相关的术语“约”是可选的并且意味着例如x±10％。
术语“有效治疗”或物质的“有效量”是指足以产生有益或期望结果(包括临床结果)的治疗或物质的量，并且因此，“有效治疗”或“有效量”取决于其应用的上下文。在施用组合物(例如，饮食改变、功能性食物、补充剂、营养组合物或药物组合物)以改变具有不健康微生物组的猫科动物的微生物组组成的情况下，有效量为足以使微生物组的健康状态恢复到健康状态的量，这是根据本文公开的方法之一测定的。在某些实施方案中，如本文所述的有效治疗还可包括以足以减少与不健康微生物组相关的任何症状的量施用治疗。降低可以是约0.01％、约0.1％、约1％、约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约98％或约99％的不健康微生物组的症状的严重程度降低。有效量可以一次或多次施用。此处描述的有效治疗的可能性是治疗有效的概率，即足以改变微生物组，或治疗或改善消化紊乱和/或炎症，以及减轻症状。
如本文所用的，并且如本领域所熟知，“治疗”是用于获得有益的或期望的结果，包括临床结果的方法。出于本主题的目的，有益的或期望的临床结果包括但不限于一种或多种症状的减轻或改善、病症程度的减轻、病症的稳定(即不恶化)状态、预防病症、病症进展的延迟或减缓，和/或疾病状态的改善或缓解。在某些实施方案中，降低可以是约0.01％、约0.1％、约1％、约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约98％或约99％的并发症或症状的严重程度降低。“治疗”还可以意味着与如果未接受治疗的预期生存期相比延长生存期。
“基本上”一词不排除“完全”，例如“基本上不含”Y的组合物可以完全不含Y。必要时，本公开的定义中可以省略“基本上”一词。
除非特别说明，包括多个步骤的过程或方法可以包括在方法开始或结束时的附加步骤，或者可以包括附加的中间步骤。此外，如果合适，可以组合、省略或以替代顺序执行步骤。
本文描述了本公开内容的方法的各种实施方案。可以理解的是，每个实施方案中指定的特征可以与其他指定的特征组合，以提供进一步的实施方案。特别地，在此强调为合适的、典型的或优选的实施方案可以彼此组合(除非它们是相互排斥的)。
实施例
通过参考以下实施例将更好地理解当前公开的主题，该实施例作为本发明的示例提供，而不是作为限制。
概述
在马斯公司(Mars Inc.)的宠物健康和营养中心(PHNC，刘易斯堡，俄亥俄州)对48只年龄在4.7至16.2岁之间的猫进行了粪便微生物群的截面分析。动物被分配到定义为不同生命阶段的3组之一，包括成年(目标年龄范围3-6岁)、较老的(目标年龄范围9.5-12岁)和老年(目标年龄范围14岁以上)猫。小组分配是基于年龄的特定类别，以猫和狗的班菲尔德兽医诊断的循证分析研究结果为指导(Salt和Saito，个体沟通)。所有猫都喂食一致的饮食持续30天时间，在第21、24和28天(+/-2天)收集新鲜粪便样品。
48只猫的组包括20只成年猫(平均年龄5.66岁；8只雄性；12只雌性)、20只较老的猫(平均年龄10.10岁；10只雄性；10只雌性)和8只老年猫(平均年龄14.78岁；3只雄性；5只雌性)。在不同生命阶段的猫的微生物群中观察到一系列具有不同营养特征的细菌物种的差异，表明猫科动物的微生物组随着年龄的增长而发生变化。即使在饮食摄入量保持一致21天后，生命阶段组之间仍观察到超过20％(113个中的25个)的丰富的细菌物种的相对丰度存在显著差异。基于猫科动物粪便中27种细菌物种的相对丰度，鉴定了生命阶段的分子指纹特征。
这些见解提供了衰老的猫科动物微生物组的推定特征，可用于微生物组健康监测工具的开发和在整个生命中维持健康的微生物组的饮食干预。
材料和方法
动物
包括20只成年猫(4.7-6.8岁)、20只较老的猫(8.1-12.5岁)和8只老年猫(12.6-16.2岁)的组被招募到研究中。在研究开始之前，所有动物都接受了兽医健康检查以确定是否适合被招募。根据PHNC的标准做法，猫在任何时候都可以获得新鲜的饮用水，并在整个研究过程中始终如一地训练。在整个研究过程中，所有猫都参与其正常的日常活动，并根据需要接受标准药物治疗。猫熟悉研究人员，并在标准PHNC护理包之后每天至少社交1小时。
饮食
给猫喂食相同的市售全营养饮食(Royal Canin室内7+干猫粮)30天的时间。此外，每天在整个队列中喂食10克RC湿猫粮团，以促进那些有有效兽医处方的猫的药物喂养。在整个研究过程中，以能量水平(平均能量需求；MER)喂养猫以保持健康的身体状况评分(BCS)和体重(+/-5％以内)。每天两次提供两份相等的食物部分(～50％MER)。
数据采集
在研究期间，收集了以下协变量以纳入数据分析，以确定微生物组的差异是否与成年、较老的和老年生命阶段有关。动物住宿细节；每日食物摄入量；每个房间的体重和身体状况评分以及每日和过夜粪便评分。使用WALTHAM 17-分粪便质量量表对粪便进行评分，并记录不良粪便的发生率(超出可接受范围1.5-3.75)。
粪便样品采集、处理和分析
在排便后不超过15分钟收集新鲜粪便样品。收集后，将粪便分成等份并储存在-80摄氏度下，然后使用QIAamp Power Faecal DNA试剂盒(Qiagen)进行DNA提取处理。通过标准紫外分光光度计(nanodrop)DNA定量方法确定每个样品达到的DNA浓度。对单个样品进行PCR扩增，以生成适合在Ilumina MiSeq测序系统上分析的双索引、带条形码的16SrDNA测序库。DNA测序由欧陆坊应用基因组学实验室(欧陆坊基因组学(Eurofins Genomics)；安辛格街(Anzinger Str.)7a；85560艾伯斯贝格；德国)进行。样品在加载前进行量化和汇总，在处理之前确定库池浓度以优化Ilumina通道加载。为序列数据定义了每个样品至少1,000个序列读数质量阈值，使用WALTHAM生物信息学分析管道根据百分比同一性(98.5％)对序列数据进行去噪和聚类。分析所得到的操作分类单元(OTU)数据以确定是否观察到组之间物种的检测(存在/不存在)的或相对丰度存在差异。
统计方法
在从粪便样品中提取DNA并使用DNA寡核苷酸引物(序列(319F：CAAGCAGAAGACGGCATACG AGATGTGACT GGAGTTCAGA CGTGTGCTCT TCCGATCT(SEQ ID NO：43)和806R：AATGATACGG CGACCACCGA GATCTACACT CTTTCCCTAC ACGACGCTCT TCCGATCT(SEQ ID NO:44))进行Ilumina测序后，所得DNA序列以98％的同一性聚类，并且然后评估丰富的物种(代表总序列的>0.001)的相对比例。使用主成分分析(PCA)和t-分布随机邻域嵌入(t-SNE)进行初步探索性分析，以减少数据的维度并直观地表示组。
个体微生物组元素与生命阶段/年龄的评估：
对每个样品计算香农多样性，并使用线性混合效应模型建模，该模型具有年龄组的固定效应和宠物的随机截距。以5％的对照家庭错误率对生命阶段组进行成对比较。
在对细菌OTU(代表单个物种)进行单独建模之前，将稀有OTU组合以创建一个“稀有”组。稀有OTU/组被确定为平均比例小于0.05％且不存在于来自单个年龄组的至少两个样品中的那些。使用具有二项式分布和logit链接函数的广义线性混合效应模型(GLMM)对由单个代表(参考)16SrDNA序列表示的聚类OTU进行单独分析。在模型中，计数和总计数代表使用年龄组作为固定效应的响应变量，并使用狗的随机截距来解释重复测量。使用置换测试对每只宠物的年龄组指标进行置换，在年龄组之间进行所有成对比较。使用多重比较校正保持5％的家庭错误率。
使用线性和广义线性模型分析相关的主要措施，在对每只宠物采取重复措施的情况下具有随机效应。分析是在包含和不包含共同住房作为一个因素的情况下进行的。
总微生物组特征与生命阶段/年龄的分析：
使用监督降维和回归方法、偏最小二乘判别分析(PLS)将主要措施与微生物群数据相关联，并评估样品相似性特征的聚类。
进行随机森林分析以评估基于16S rDNA基因分布和粪便微生物群中的丰度将样品分配给队列的准确性。重要性分数是使用2000个随机森林计算的，每个森林有2000棵树，使用每棵树的默认变量数(变量数的平方根)和排列重要性分数计算。从这2000个随机森林中计算出每个OTU的平均等级，且1在确定适合年龄的样品时是最重要的。通过将随机森林拟合到具有连续更多OTU(按重要性顺序)的数据来计算正预测值和特异性。
使用R版本3.5.1和Ranger库进行分析。
实施例1-一种检测猫粪便微生物组生物学年龄状态的方法
随机森林分析应用于数据集，以评估根据16S rDNA基因分布和粪便微生物群中的丰度将样品分配到队列的准确性。重要性分数是使用2000个随机森林计算的，每个森林有2000棵树，使用每棵树的默认变量数(变量数的平方根)和排列重要性分数计算。从这2000个随机森林中计算出每个OTU的平均等级，其中1在确定适合年龄的样品时是最重要的。通过将随机森林拟合到具有连续更多OTU(按重要性顺序)的数据来计算正预测值和特异性。
代表OTU和细菌物种的细菌基因序列对猫的生命阶段组或年龄有不同的描述(图1A至图1C)，并因此或多或少有助于将样品分配到生产样品的猫的正确生命阶段组的准确性。图1A-1C显示了基于粪便微生物组组成特征的生命阶段组预测中个体OTU位置的变化。
检测到多达30个OTU或细菌物种的组合，能够将样品准确分配到猫的生命阶段/年龄组(图1B、1C和图6(表1.3))。将样品分配到组的准确度最高时为7个OTU或物种，达到97.45％，此后随着添加到预测模型中的物种或OTU数量的增加，准确度在94.9和96.8之间。考虑到猫微生物组中的个体差异，但是这些生物体可能在更广泛的群体中具有额外的效用，并因此被包含在基于粪便微生物组组成特征的生命阶段/年龄预测模型中。
方法
该方法包括通过QIAamp Power Faecal DNA试剂盒(Qiagen)等方法从猫科动物的新鲜粪便样品中提取DNA，随后使用分子生物学技术评估检测率和下面描述的细菌物种(图4和5(表1.1和1.2))组合的丰度。检测到的生物体的组合和丰度允许评估微生物组的生物学年龄状态，并评估在动物粪便中观察到的微生物组成分是否描述了相对于动物实际年龄的未成熟或比预期更老的微生物组。通过诸如16S rRNA/rDNA扩增子、鸟枪法、宏基因组、Illumina、纳米孔或其他DNA/RNA测序技术等技术对从粪便中提取的遗传物质进行DNA提取和DNA/RNA测序后，获得了描述图4(表1.1)中的生物体的序列的相对丰度或与图5(表1.2)中的生物体具有95％同一性DNA序列。
简而言之，从测试样品获得的序列数据被聚类成具有98％-100％同一性的序列组，然后使用来自代表>0.001％总序列的簇的参考序列来1)通过数据库同源物分配分类、基因功能或通过DNA数据库(例如Greengenes或Silva或NCBI非冗余核苷酸序列数据库)的同源性搜索来确定生物标记的性质，以便与数据库中保存的物种的已知DNA序列进行比较或2)与如下图5(表1.2)所示DNA序列比较。
从描述微生物组生物学年龄状态的图6(表1.3)中描述的组合中鉴定的生物体、序列或生物标记的数量和丰度然后用于根据它们最适合的组来描述样品从而为测试猫的微生物组分配生物学年龄状态。
实施例2-检测猫粪便微生物组的生物学年龄状态的另一种方法
通过偏最小二乘判别分析(PLS-DA)对113个个体OTU以及“稀有”组的细菌OTU(物种)检测和相对丰度数据进行分析，以评估取自成年猫、较老的猫和老年猫的队列的样品内的相似性特征数据。在得到的相关图中，样品以基于OTU检测及它们的相对丰度的样品相似性指导的监督方式进行聚类。
多变量监督降维和回归方法检测细菌检测和丰度数据之间的相关性，支持几乎完全按队列分组的样品聚类。分析图显示，来自一只猫(Jazz)的两个老年猫样品与较老的猫的聚类更紧密，而来自个体猫Jwoww和Pouncey的两个成年样品则属于老年猫聚类。尽管PLS聚类具有无监督性质，但样品还是根据生命阶段进行聚类。因此，通过这种方法，类似于随机森林分析，检测到的细菌基因序列被观察到对猫的生命阶段组或年龄的不同描述(图3)。
当在PLS-DA分析中对驱动样品分离最有影响的细菌物种(投影中的变量重要性；VIP分数>1)被用于分析时，同样发现27个细菌物种或OTU的子集可以准确地将样品聚类为生命阶段组(图3)。对子集的分析生成了五个较老的样品和一个成年样品不恰当地聚类到老年组和两个老年样品与来自较老的猫样品聚类的聚类。因此，这27个细菌OTU表明在成年、较老的和老年生命阶段的微生物群中的分离(图7和8(表2.1和2.2))。
方法
一种识别猫粪便微生物组年龄状态的方法是基于对来自猫粪便的相同微生物序列和丰度数据的偏最小二乘判别分析(PLS-DA)以及与来自不同年龄或生命阶段组的猫粪便的对照数据集的比较。该方法可以应用于整个微生物组群落丰度数据或使用如图7(表2.1)所示的子集。可替代地，可以评估用于检测图7(表2.1)中突出显示并由图8(表2.2)中的基因序列描述(或>95％相似)的物种的存在和丰度的其他方法，并同样地与来自不同年龄/生命阶段的猫的对照数据集比较以测定与猫的实际按时间计算的年龄相比微生物组的年龄状态，从而确定实际年龄和微生物组年龄状态之间的一致性。
更详细地说，该方法涉及通过QIAamp Power Faecal DNA试剂盒(Qiagen)等方法从新鲜产生的粪便样品中提取DNA，然后通过16S rDNA扩增子、鸟枪法、宏基因组、Illumina、纳米孔(nanopore)或其他DNA或RNA测序技术等技术对DNA进行测序。在16S rDNA分析的情况中，在从粪便样品提取DNA和使用DNA寡核苷酸引物(序列(319F：CAAGCAGAAGACGGCATACG AGATGTGACT GGAGTTCAGA CGTGTGCTCT TCCGATCT(SEQ ID NO：43)和806R：AATGATACGG CGACCACCGA GATCTACACT CTTTCCCTAC ACGACGCTCT TCCGATCT(SEQ ID NO:44))对V4-V6区进行Illumina测序后，将所得DNA序列以98％的同一性聚类，并且然后评估丰富的物种(代表总序列的>0.001)的相对比例。描述细菌分类单元的其他区域也可以使用。
在任何一种分析方法中，得到的DNA/RNA序列都被聚类到物种(>98％ID)水平。然后将称为操作分类单元(OTU)的聚类分配一个参考序列(即与聚类其余部分最相似的序列)，并将参考序列与下面图8(表2.2)中的序列进行比较，或者基于数据库搜索分配分类，所述数据库搜索使用参考序列查询Greengenes或Silva或NCBI非冗余核苷酸序列数据库。通过数据库搜索指定为图7(表2.1)中描述的物种的那些OTU或具有与图8(表2.2)中的序列具有98％或更高相似性的16S rRNA基因序列的那些OTU被分析以检测描述该OTU的序列与每个样品的总序列相比的相对丰度。可替代地，任何基因序列或生物标记特征或图7(表2.1)中记载的生物的描述都可用于测定与总微生物群落相比的相对丰度。图7(表2.1)和图8(表2.2)中描述的生物的相对丰度数据然后通过偏最小二乘判别分析与来自幼年的、成年的、较老的和老年的生命阶段的对照动物的相同细菌含量进行分析。测试样品微生物组年龄状态的检测是通过与对照样品进行比较来进行，所述对比是基于样品与哪种生命阶段分组聚类(例如，参见图2B)。样品所在的生命阶段/年龄聚类描述了样品的生物学年龄状态，并且然后将其与产生样品的猫的实际按时间计算的年龄进行比较。关键要素在图7和8(表2.1和2.2)中进行了描述，且图2B中给出了支持检测微生物组与对照样品相比的生物年龄的示例分析。该图显示了猫科动物微生物组与生命阶段的分离，表明微生物组的组成随着年龄的增长而改变，且因此样品的生物学年龄状态可以指示微生物组的健康状况和动物的胃肠适应性。
实施例3–一种基于粪便微生物组中细菌多样性来检测猫科动物肠道微生物组的年龄状态的方法
基于OTU/分类单元计数和相对丰度来根据下面显示的等式计算每个样品的香农多样性。香农多样性使用线性混合效应模型进行建模，该模型具有年龄组的固定效应和宠物的随机截距。以5％的对照家族错误率对生命阶段组进行成对比较。
香农性指数
对成年、较老的和老年猫的猫微生物组中香农多样性的评估得出了多样性估计值(图3和图9(表3.1))。与老年猫群(平均年龄14.78岁)相比，观察到成年猫(平均年龄5.66岁)的粪便微生物组的香农多样性存在统计学显著差异。
方法
该方法涉及通过QIAamp Power Faecal DNA试剂盒(Qiagen)等方法从新鲜产生的粪便样品中提取DNA，随后使用分子生物学技术检测存在的16S rDNA或rRNA或其他遗传特征，从而能够确定粪便或其他胃肠道样品中微生物组落的细菌丰度和分类单元或物种丰富度。从新鲜产生的粪便中提取DNA/RNA并通过16S rRNA/16S rDNA扩增子、鸟枪法、宏基因组、Illumina、纳米孔或其他测序技术等技术进行基因序列分析后，将所得序列聚类到物种(>98％ID)水平并且每个物种的相对丰度是针对作为总数比例的单个OTU确定的。然后使用序列或OTU的总数和OTU相对丰度数据来计算多样性，这说明了检测到的物种的丰度和均匀度。可以使用任何多样性计算，例如香农多样性或其他α多样性计算，或者可替代地，可以使用β多样性。香农多样性可以通过以下方法计算：
香农性指数
在使用香农多样性指数或其他α或β多样性评估(包括样品的总OTU数)等函数确定测试样品的微生物组多样性后，可以将多样性与同一生命阶段中健康对照种群的标准化样品(见图9(表3.1))和罹患慢性胃肠道病、IBD、急性或慢性腹泻或其他胃肠道症状的年龄相近的动物进行比较。
微生物组年龄状态的解释是基于在动物生命阶段的背景下，猫粪便中检测到的与对照样品相比的多样性水平，且可以包括来自存储的样品或先前收集的数据的同一只猫在不同年龄的先前分析。在个体内随时间评估的情况下，可以通过例如6个月或每年或在特定事件(例如胃肠不适或旅行)后的间隔定期测试/评估肠道微生物组来监测猫随时间的胃肠健康。然后可以将微生物群多样性的评估结果与之前的结果或之前对个体猫微生物组评估的累积(平均)结果进行比较。
参考文献
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[19]Smith&Waterman(1981)应用数学进展(Adv.Appl.Math.)2:482-489。
***
尽管已经详细描述了本公开的主题及其优点，但应当理解，在不背离所附权利要求书所定义的发明精神和范围的情况下，可以在此进行各种变化、替换和改变。此外，本申请的范围并不预期局限于说明书中描述的工艺、机器、制造、物质组成、手段、方法和步骤的特定实施方式。正如本领域技术人员将很容易从本公开主题的公开内容中理解的那样，根据本公开的主题，可以利用目前存在的或以后将要开发的与本文所述的相应实施方式执行基本相同的功能或实现基本相同结果的工艺、机器、制造、物质组成、手段、方法或步骤。因此，所附权利要求旨在在其范围内包括这样的工艺、机器、制造、物质组成、手段、方法或步骤。
专利、专利申请、出版物、产品说明和协议在本申请中通篇引用，其公开内容在此基于所有目的通过引用全部并入本文。
Claims (55)
1.一种测定猫科动物的微生物组的年龄状态的方法，所述方法包括：
(a)检测从所述猫科动物获得的样品中的一种或多种细菌物种；
(b)将所述样品中的所述一种或多种细菌物种与对照数据集相比较；以及
(c)确定所述微生物组的年龄状态。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述对照数据集包括猫科动物在不同时间或生命阶段的微生物组数据。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述对照数据包括来自猫科动物的至少两个、至少三个或四个生命阶段的微生物组数据，所述猫科动物选自由幼年猫科动物、青年猫科动物、成年猫科动物、较老的猫科动物和老年猫科动物所组成的列表。
4.如权利要求3所述的方法，其中幼年猫科动物被定义为至多1.0岁，青年猫科动物被定义为大于1.0岁且至多4.5岁，成年猫科动物被定义为大于4.5岁且至多9.5岁，较老的猫科动物被定义为大于9.5岁且至多13.5岁以及老年猫科动物被定义为大于13.5岁。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括定量所述一种或多种细菌物种。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细菌物种来自选自由下述组成的组的属：索拉杆菌属(Solobacterium)、欧尔森氏菌属(Olsenella)、厌氧螺菌属(Anaerobiospirillum)、布劳特氏菌属(Blautia)、霍尔德曼氏菌属(Holdemanella)、柯林斯氏菌属(Collinsella)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、真杆菌属(Eubacterium)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、小杆菌属(Dialister)、拟杆菌属(Bacteroides)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、阿德勒克罗伊茨菌属(Adlercreutzia)、罕见小球菌属(Subdoligranulum)、梭菌属(Clostridium)、艰难杆菌属(Mogibacterium)、塞利单胞菌属(Sellimonas)、链球菌属(Streptococcus)、罕见小球菌属(Subdoligranulum)以及拉克氏梭状芽胞杆菌属(Lachnoclostridium)，或者来自毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)的细菌物种。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述细菌物种选自由下述组成的组：索拉杆菌属的种(Solobacterium sp.)、欧尔森氏菌属的种(Olsenella sp.)、马赛菌-P2300(Marseille-P2300)、产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)、活泼布劳特氏菌(Blautia gnavus)、双形霍尔德曼氏菌(Holdemanella biforme)、罗讷河口柯林斯氏菌(Collinsella bouchesdurhonensis)、双歧杆菌属的种(Bifidobacterium sp.)、短真杆菌(Eubacterium brachy)、田中柯林斯氏菌(Collinsella tanakaei)、粪便柯林斯氏菌(Collinsella stercoris)、卵形布劳特氏菌(Blautia obeum)、圆柱状真杆菌(Eubacterium cylindroides)、溶木聚糖拟杆菌/小杆菌(Dialister/Bacteroidesxylanisolvens)、瘤胃乳酸杆菌(Lactobacillus ruminis)、阿德勒克罗伊茨菌属的种(Adlercreutzia sp.)、罕见小球菌属的种(Subdoligranulum sp.)、产气荚膜杆菌(Clostridium perfringens)、马赛艰难杆菌(Mogibacterium massiliense)、塞利单胞菌属的种(Sellimonas sp.)、黄体链球菌(Streptococcus luteciae)、毛螺旋菌属的种(Lachnospiraceae sp.)、变形罕见小球菌(Subdoligranulum variabile)、嗜琥珀酸小杆菌(Dialister succinatiphilus)、拉克氏柔嫩梭菌(Lachnoclostridium[Clostridium]leptum)、拉克氏海莱蒙梭菌(Lachnoclostridium[Clostridium]hylemonae)以及产粪甾醇真杆菌(Eubacterium coprostanoligenes)。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述细菌物种具有16S rDNA，所述16S rDNA与SEQ IDNO:1-30中任一条的序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％的同一性。
9.如权利要求6-8中任一项所述的方法，其中所述方法包括检测来自选自由索拉杆菌属(Solobacterium)、欧尔森氏菌属(Olsenella)以及厌氧螺菌属(Anaerobiospirillum)所组成的组中的一种或多种属的细菌物种。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述方法包括检测选自由索拉杆菌属的种(Solobacterium sp.)、欧尔森氏菌属的种(Olsenella sp.)、马赛菌-P2300(Marseille-P2300)以及产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)所组成的组的一种或多种细菌物种。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述细菌物种具有16S rDNA，所述16S rDNA与SEQID NO:1-3中任一条的序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％的同一性。
12.如权利要求9-11中任一项所述的方法，所述方法还包括检测选自由活泼布劳特氏菌(Blautia gnavus)、双形霍尔德曼氏菌(Holdemanella biforme)、罗讷河口柯林斯氏菌(Collinsella bouchesdurhonensis)和阿维桑双歧杆菌(Bifidobacterium avesanii)所组成的组中的一种或多种细菌物种。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述细菌物种具有16S rDNA，所述16S rDNA与SEQID NO:4-7中任一条的序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％的同一性。
14.如权利要求13的方法，其中所述方法包括检测所有SEQ ID NO:8-17。
15.如权利要求6-14中任一项所述的方法，所述方法包括检测来自索拉杆菌属(Solobacterium)的细菌物种。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述细菌具有16S rDNA，所述16S rDNA与SEQ IDNO:1的序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％的同一性。
17.如权利要求6-16中任一项所述的方法，其中检测和/或定量至少5种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种或至少30种不同的物种。
18.如权利要求15-17中任一项所述的方法，所述方法包括检测或定量索拉杆菌属的种(Solobacterium sp.)、欧尔森氏菌属的种(Olsenella sp.)、马赛菌-P2300(Marseille-P2300)以及产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述细菌物种具有16S rDNA，所述16S rDNA与SEQID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中任一条的序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％的同一性。
20.如权利要求18-19中任一项所述的方法，所述方法还包括检测或定量活泼布劳特氏菌(Blautia gnavus)、双形霍尔德曼氏菌(Holdemanella biforme)、罗讷河口柯林斯氏菌(Collinsella bouchesdurhonensis)以及阿维桑双歧杆菌(Bifidobacterium avesanii)。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述细菌物种具有16S rDNA，所述16S rDNA与SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6以及SEQ ID NO:7中任一条的序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％的同一性。
22.如权利要求6-20中任一项所述的方法，所述方法还包括检测或定量真杆菌属的种(Eubacterium sp.)、柯林斯氏菌属的种(Collinsella sp.)、布劳特氏菌属的种(Blautiasp.)、小杆菌/拟杆菌属的种(Dialister/Bacteroides sp.)、乳酸杆菌属的种(Lactobacillus sp.)、阿德勒克罗伊茨菌属的种(Adlercreutzia sp.)、罕见小球菌属的种(Subdoligranulum sp.)；优选地检测或定量短真杆菌(Eubacterium brachy)、田中柯林斯氏菌(Collinsella tanakaei)、粪便柯林斯氏菌(Collinsella stercoris)、卵形布劳特氏菌(Blautia obeum)、圆柱状真杆菌(Eubacterium cylindroides)、溶木聚糖拟杆菌/小杆菌(Dialister/Bacteroides xylanisolvens)、瘤胃乳酸杆菌(Lactobacillusruminis)、阿德勒克罗伊茨菌属的种(Adlercreutzia sp.)以及罕见小球菌属的种(Subdoligranulum sp.)。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述细菌物种具有16S rDNA，所述16S rDNA与SEQID NO:9-18中任一条的序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％的同一性。
24.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括使用偏最小二乘判别分析将所述样品中的所述一种或多种细菌物种与对照数据集相关联。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述细菌物种来自选自由以下组成的组的属：索拉杆菌属(Solobacterium)、真杆菌属(Eubacterium)、布劳特氏菌属(Blautia)、拉克氏梭状芽胞杆菌属(Lachnoclostridium)、欧尔森氏菌属(Olsenella)、氨基酸球菌属(Acidaminococcus)、厌氧螺菌属(Anaerobiospirillum)、巨球型菌属(Megasphaera)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、红蝽菌科(Coriobacteriaceae)、链状杆菌属(Catenibacterium)、德兰库尔特菌属(Drancourtella)、塞利单胞菌属(Sellimonas)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、多尔氏菌属(Dorea)、柯林斯氏菌属(Collinsella)、霍尔德曼氏菌属(Holdemanella)、艰难杆菌属(Mogibacterium)以及厌氧杆菌属(Anaerostipes)。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述细菌物种选自由下述组成的组：索拉杆菌属的种(Solobacterium sp.)、短真杆菌(Eubacterium brachy)、卵形布劳特氏菌(Blautiaobeum)、拉克氏柔嫩梭菌(Lachnoclostridium[Clostridium]leptum)、拉克氏海莱蒙梭菌(Lachnoclostridium[Clostridium]hylemonae)、欧尔森氏菌属的种(Olsenella sp.)、发酵氨基酸球菌(Acidaminococcus fermentans)、泰门氨基酸球菌(Acidaminococcustimonensis)、产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)、印度巨球型菌(Megasphaera indica)、埃氏巨球形菌(Megasphaera elsdenii)、巨球型菌属的种(Megasphaera sp.)、鸡双歧杆菌(Bifidobacterium gallinarum)、小鸡双歧杆菌(Bifidobacterium pullorum)、世纪双歧杆菌(Bifidobacterium saeculare)、纤细双歧杆菌(Bifidobacterium subtile)、红蝽菌科的种(Coriobacteriaceae sp.)、双歧杆菌属的种(Bifidobacterium sp.)、光冈氏链状杆菌(Catenibacterium mitsuokai)、马赛德兰库尔特菌(Drancourtella massiliense)、肠道塞利单胞菌(Sellimonas intestinalis)、瘤胃球菌属的种(Ruminococcus sp.)、毛螺旋菌属的种(Lachnospiraceae sp.)、多尔氏菌属的种(Dorea sp.)、生产布劳特氏菌(Blautia producta)、红蝽菌属的种(Coriobacteriaceae sp.)、柯林斯氏菌属(Collinsella sp.)、双形霍尔德曼氏菌(Holdemanella biforme)、马赛艰难杆菌(Mogibacterium massiliense)、庞大厌氧杆菌(Anaerostipes hadrus)、厌氧杆菌属的种(Anaerostipes sp.)、活泼布劳特氏菌(Blautiagnavus)、粪便/肠道柯林斯氏菌(Collinsella stercoris/intestinalis)、双歧杆菌属的种(Bifidobacterium sp.)以及田中柯林斯氏菌(Collinsella tanakaei)。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述细菌物种具有16S rDNA，所述16S rDNA与SEQID NO:1、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ IDNO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ IDNO:41、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:7以及SEQ ID NO:15中任一条的序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％的同一性。
28.如权利要求24-27中任一项所述的方法，包括检测来自索拉杆菌属(Solobacterium)的细菌物种。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述细菌具有16S rDNA，所述16S rDNA与SEQ IDNO:1的序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％的同一性。
30.如权利要求24-29中任一项所述的方法，其中检测和/或定量至少5种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种或至少27种不同的分类单元。
31.如权利要求28-30中任一项所述的方法，所述方法包括检测或定量索拉杆菌属的种(Solobacterium sp.)、短真杆菌(Eubacterium brachy)以及卵形布劳特氏菌(Blautiaobeum)。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述细菌具有16S rDNA，所述16S rDNA与SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:8以及SEQ ID NO:11中任一条的序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％的同一性。
33.如权利要求31-32中任一项所述的方法，所述方法还包括检测或定量拉克氏柔嫩梭菌/拉克氏海莱蒙梭菌(Lachnoclostridium[Clostridium]leptum/Lachnoclostridium[Clostridium]hylemonae)、欧尔森氏菌属的种(Olsenella sp.)、发酵氨基酸球菌/泰门氨基酸球菌(Acidaminococcus fermentans/Acidaminococcus timonensis)以及产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducen)。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述细菌物种具有16S rDNA，所述16S rDNA与SEQID NO:29、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:3中任一条的序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％的同一性。
35.如权利要求24-34中任一项所述的方法，所述方法还包括检测或定量巨球型菌属的种(Megasphaera sp.)、双歧杆菌属的种(Bifidobacterium sp.)、红蝽菌属的种(Coriobacteriaceae sp.)、链状杆菌属的种(Catenibacterium sp.)、德兰库尔特菌属的种(Drancourtella sp.)、塞利单胞菌属的种(Sellimonas sp.)、瘤胃球菌属的种(Ruminococcus sp.)、多尔氏菌属的种(Dorea sp.)、柯林斯氏菌属(Collinsella)、霍尔德曼氏菌属(Holdemanella)、艰难杆菌属(Mogibacterium)以及厌氧杆菌属(Anaerostipes)；优选检测或定量印度巨球型菌(Megasphaera indica)/埃氏巨球形菌(Megasphaeraelsdenii)、巨球型菌属的种(Megasphaera sp.)、鸡双歧杆菌(Bifidobacteriumgallinarum)/小鸡双歧杆菌(Bifidobacterium pullorum)/世纪双歧杆菌(Bifidobacterium saeculare)/纤细双歧杆菌(Bifidobacterium subtile)、红蝽菌属的种(Coriobacteriaceae sp.)、双歧杆菌属的种(Bifidobacterium sp.)、光冈氏链状杆菌(Catenibacteriummitsuokai)、马赛德兰库尔特菌(Drancourtella massiliense)/肠道塞利单胞菌(Sellimonas intestinalis)/瘤胃球菌属的种(Ruminococcus sp.)/毛螺旋菌属的种(Lachnospiraceae sp.)、多尔氏菌属的种(Dorea sp.)、生产布劳特氏菌(Blautiaproducta)、红蝽菌属的种(Coriobacteriaceae sp.)、柯林斯氏菌属的种(Collinsellasp.)、双形霍尔德曼氏菌(Holdemanella biforme)、马赛艰难杆菌(Mogibacteriummassiliense)、庞大厌氧杆菌(Anaerostipes hadrus)、厌氧杆菌属的种(Anaerostipessp.)、活泼布劳特氏菌(Blautia gnavus)、粪便/肠道柯林斯氏菌(Collinsellastercoris/intestinalis)、双歧杆菌属的种(Bifidobacterium sp.)以及田中柯林斯氏菌(Collinsella tanakaei)。
36.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述猫科动物的微生物组的年龄状态与其生物学年龄进行比较，并且当存在差异时通知所述猫科动物的主人。
37.一种监测猫科动物的方法，所述方法包括在至少两个时间点通过前述权利要求中任一项所述的方法测定所述动物的微生物组的年龄状态的步骤。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述两个时间点相隔至少6个月。
39.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括通过给予饮食改变、补充剂、功能性食物、营养组合物或药物组合物来改变所述微生物组的组成。
40.一种监测猫科动物的微生物组的年龄状态的方法，所述猫科动物已经经历饮食改变和/或已经接受能够改变微生物组组成的补充剂、功能性食物、营养组合物或药物组合物，包括通过前述权利要求中任一项所述的方法测定所述微生物组的年龄状态。
41.如权利要求40所述的方法，其中在施用所述组合物之前和之后测定所述微生物组的年龄状态。
42.如权利要求39至41中任一项所述的方法，其中所述组合物包含一种或多种细菌。
43.一种评估猫科动物的微生物组的年龄状态以确定是否需要干预的方法，所述方法包括：
(a)对从所述猫科动物获得的样品中的两种或更多种细菌物种进行定量；
(b)测定所述细菌物种的相对丰度；
(c)将步骤(b)中测定的相对丰度与对照数据集的相对丰度相比较；
其中如果步骤(c)的比较表明所述的微生物组的年龄状态与所述猫科动物的实际年龄存在差异，则推荐进行干预。
44.一种评估猫科动物的微生物组的年龄状态以确定是否需要干预的方法，所述方法包括
(a)对从所述猫科动物获得的样品中的两种或更多种细菌物种进行定量；
(b)计算多样性指数；
(c)将所述多样性指数与对照数据集的多样性指数相比较；
其中如果步骤(b)中计算的所述多样性指数小于所述对照数据集中的多样性指数的第5百分位数或大于第95百分位数，则推荐进行干预。
45.如权利要求43或44所述的方法，其中所述对照数据集包括来自与所述猫科动物处于相同生命阶段的多个其他猫科动物的细菌物种多样性数据；或同一猫科动物在一个或多个不同时间点的细菌物种多样性数据，优选相隔至少6个月。
46.如权利要求44所述的方法，其中所述猫科动物是成年的猫科动物、较老的猫科动物或老年猫科动物。
47.如权利要求43-46中任一项所述的方法，其中步骤(c)包括通过下式计算所述细菌物种的香农指数多样性：
香农性指数
48.一种评估猫科动物的微生物组的年龄状态以确定是否需要干预的方法，所述方法包括
(a)对从所述猫科动物获得的样品中的两种或更多种细菌物种进行定量；
(b)测定所述细菌物种的相对丰度；
(c)通过下式计算香农指数多样性；
香农性指数
其中如果在步骤(c)中计算的多样性在成年猫科动物中小于2.77或大于3.99，在较老的猫科动物中小于2.41或大于3.92，或在老年猫科动物中小于1.65或大于4.17，则推荐进行干预。
49.如权利要求43-48所述的方法，其中成年猫科动物被定义为大于4.5岁且至多9.5岁，较老的猫科动物被定义为大于9.5岁且至多13.5岁，以及老年猫科动物被定义为大于13.5岁。
50.如权利要求43-49中任一项所述的方法，其中所述干预是饮食改变、补充剂、功能性食物、营养组合物或药物组合物。
51.如权利要求50所述的方法，其中所述组合物包含一种或多种细菌。
52.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过DNA测序、RNA测序、蛋白质序列同源性或指示细菌物种的其他生物标记来检测或定量所述细菌物种。
53.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品是粪便样品或来自胃肠道的样品。
54.如权利要求53所述的方法，其中所述样品是回肠、空肠、十二指肠或结肠样品。
55.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述猫科动物是猫。
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