CN113604524A - 一种位点特异性标记rna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种位点特异性标记RNA的方法,涉及RNA合成和标记领域,包括设计并制备RNA先导链;设计并制备DNA双链模板;位点特异性标记RNA;向固-液混合相反应体系中加入含修饰的或普通的核苷酸(NTPs),在RNA先导链的3’端进行转录延伸,实现精确位点标记。本发明通过形成固-液相转录延伸复合物,延伸RNA先导链的3’‑端,在固‑液相转录延伸过程中进行位点特异性标记。本发明可标记的RNA长度不受限制,可用于短链和长链RNA的标记,灵活标记RNA的指定位点:可标记位点的碱基类型不受限制;可标记单碱基重复片段中某一个或某几个位点;标记的位点不受复杂高级结构的局限,可以位于单链或双链区域。
Description
技术领域
本发明涉及RNA合成和标记领域,尤其涉及一种位点特异性标记RNA的方法。
背景技术
RNA在生命活动中承担至关重要的信息传递和生物学调控功能,位点特异性标记RNA有着广泛的应用,例如在活细胞内实时观测RNA,增加RNA的稳定性,提高RNA药物和疫苗的有效性。
固相化学合成法是目前普遍合成及标记RNA的手段,但是这种方法的主要局限是合成RNA的长度不超过100碱基(nt)。2015年Nature报道的PLOR(Position-selectivelabeling of RNA,位点特异性标记RNA)方法通过限制核苷三磷酸(NTPs),精确控制RNA聚合酶的转录进程,实现在转录过程中对RNA链的位点特异性标记。然而,该方法无法实现对RNA序列中连续多个相同碱基中的某个或某些位点进行精确位点标记,而且,采用该方法标记长链RNA(>100nt)靠近3’-端的位点效率不高,一般低于10%。
到目前为止,尚未有位点特异性标记长链RNA(>100nt)的方法能够:1.标记位点的碱基类型不受限制,对A、C、G、U四种碱基均可标记;2.可对单碱基重复区域中的精确位点进行标记;3.标记位点不受RNA折叠后结构的限制。
因此,本领域的技术人员致力于开发一种可标记位点的碱基类型不受限制、可标记单碱基重复片段中某一个或某几个位点、标记的位点不受复杂高级结构的局限的位点特异性标记RNA方法。
发明内容
鉴于现有技术的上述缺陷,本发明所要解决的技术问题是一种位点特异性标记RNA的手段,该方法实现了灵活标记RNA的指定位点:可标记位点的碱基类型不受限制;可标记单碱基重复片段中某一个或某几个位点;标记的位点不受复杂高级结构的局限,可以位于单链或双链区域。以此解决现有技术中尚未有普遍适用于长链RNA位点特异性标记的难题。
为实现上述目的,本发明提供了一种位点特异性标记RNA的方法,包括以下步骤:
步骤1、设计并制备RNA先导链;选取目标RNA的5’端到标记位点之前的序列作为RNA先导链的序列,通过体外转录法、PLOR等方法合成RNA先导链;
步骤2、设计并制备DNA双链模板,DNA双链模板为包括两端碱基互补配对区域和中间碱基非互补配对区域的双链DNA;碱基非配对区域称为“空泡”区域;DNA双链包括两条链,分别为编码链和非编码链;编码链和非编码链在除“空泡”区域之外的区域里均为碱基互补配对;编码链的“空泡”区域与步骤1获得的RNA先导链的3’端通过碱基互补配对;非编码链的5’端标记生物素,将DNA双链模板固定在链霉亲和素附着的琼脂小球上,得到小球固定的DNA双链;
步骤3、位点特异性标记RNA:步骤1获得的RNA先导链、步骤2获得的小球固定的DNA双链以及RNA聚合酶在反应管中孵育,使三者在30~37℃下,形成稳定的“RNA聚合酶-DNA模板-RNA先导链”三元复合物,形成固-液混合相反应体系;
步骤4、向步骤3获得的固-液混合相反应体系中加入含修饰的或普通的NTPs,NTPs在RNA先导链的3’端进行转录延伸,实现精确位点标记。
进一步地,上述步骤1还包括:对于具有复杂结构的RNA先导链,设计短链DNA,将具有复杂结构的RNA先导链与短链DNA链杂交。
进一步地,上述步骤1还包括:通过软件预测具有复杂结构的RNA先导链的结构,根据预测到的结构设计短链DNA的序列,通过杂交破坏具有复杂结构的RNA先导链的折叠,释放具有复杂结构的RNA先导链的3’端,具有复杂结构的RNA先导链的3’端碱基数大于4nt。
进一步地,RNA先导链的种类包括:i.天然无修饰RNA链;ii.DNA链辅助折叠的RNA链;iii.带有修饰基团的RNA链。
进一步地,编码链和非编码链在使用前需要先进行杂交和固定。
进一步地,杂交和固定的方法为:等量编码链和非编码链在40mM Tris-HCl,6mMMgSO4溶液中95℃加热5min,室温冷却;1nmole的DNA双链与20uL 50%的琼脂糖小球在40mMTris-HCl,6mM MgSO4中孵育1h;采用固液相分离法滤除未被固定的DNA后,加入40mM Tris-HCl,6mM MgSO4重悬小球固定的DNA双链,4℃储存备用。
进一步地,上述步骤4还包括:将NTPs分成多次加入,精确控制在固-液混合相反应体系中转录延长RNA先导链的进程,并将修饰基团引入到RNA的指定位点上,确保RNA的延长分多步骤、可控地进行。
进一步地,上述步骤4还包括:根据标记位点的需要,在某一次或某几次加入的NTPs中含有带修饰基团的NTPs,将其合成入RNA中;引入的修饰基团包括:荧光基团、化学活性官能团、天然修饰、重原子、旋转标签。
进一步地,上述步骤4中NTPs加入反应体系的次序和种类由DNA模板链的序列决定;除最后一次之外,每次加入的NTPs种类不超过3种。
进一步地,上述方法还包括采用紫外、荧光凝胶电泳法和HPLC对合成的荧光修饰的RNA或者标记的RNA产物进行检测和纯化;荧光修饰的RNA和标记的RNA产物中RNA的长度为小于、等于或者大于100个碱基。
进一步地,DNA模板通过与固定相结合进行固定。
进一步地,往固-液相转录复合物中加入NTPs,延长RNA先导链。
进一步地,加入的RNA先导序列可为:天然RNA;功能化修饰的RNA链;通过与DNA链杂交改变其自身折叠的RNA链。
在本发明的较佳实施方式中,详细说明在长链RNA重复碱基区域进行精确位点标记的过程;
在本发明的另一较佳实施方式中,详细说明位点特异性标记具有复杂结构RNA先导链的长链RNA的过程。
本发明涉及合成和标记RNA,具体涉及通过DNA链杂交改变RNA先导链的折叠,在固-液相转录反应中,通过控制NTPs的加入来精确控制RNA先导链的延伸,特别地,在此过程中对RNA进行位点特异性标记。应用本发明的技术方案,通过形成固-液相转录延伸复合物,延伸RNA先导链的3’-端,在固-液相转录延伸过程中进行位点特异性标记。本发明可标记的RNA长度不受限制,可用于短链和长链RNA的标记,可广泛用于RNA的基础研究和药物、疫苗的研发中。具体技术效果如下:
本发明可以标记RNA链中的碱基类型不受限制,即可以将修饰基团引入到组成RNA的四种常见碱基:A、C、G、U中;
本发明突破PLOR方法中单碱基重复片段中单个或某几个碱基无法标记的局限,可实现标记连续相同碱基序列中某一个或者某几个;
本发明可标记的位点不受RNA自身折叠后结构的限制;
本发明可将修饰基团通过共价键引入到RNA的指定位点上。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明,以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是本发明的一个较佳实施例1中位点特异性标记长链RNA的示意图;
图2是本发明实施例1中采用紫外和荧光凝胶电泳法检测合成的带有荧光修饰的RNA;
图3是本发明实施例1中采用高效液相色谱法(HPLC)检测合成的荧光修饰的RNA;
图4为本发明实施例2中位点特异性标记具有复杂结构RNA先导链的RNA的示意图;
图5为本发明实施例2中采用紫外和荧光凝胶电泳法检测合成的带有多个修饰基团的RNA。
具体实施方式
以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例,使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现,本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
本发明使用的仪器,试剂和材料等,如果未经特殊说明,均为正规商业可购买途径。
实施例1
该实例在RNA重复碱基区域进行精确位点标记,具体地,对长链RNA中连续的UUU序列的中间位点进行荧光标记,采用荧光凝胶电泳法和HPLC法对标记产物进行检测和纯化。先设计RNA先导链,如图1所示,根据RNA先导链和目标RNA的序列设计和合成DNA双链模板,然后将RNA先导链、小球固定的DNA双链以及RNA聚合酶在反应管中孵育,使三者在30~37℃下,形成稳定的“RNA聚合酶-DNA模板-RNA先导链”三元复合物,用修饰的UTP位点特异性标记长链RNA,得到RNA中连续的UUU序列的中间位点荧光标记的RNA。具体过程如下:
1.设计RNA先导链:根据目标RNA中需要引入修饰基团的位置,选取目标RNA的5’端到标记位点之前的序列作为RNA先导链的序列。通过体外转录法合成RNA先导链。具体方法如下:
DNA(0.1-1μM),T7 RNA聚合酶(0.01-0.1g/L),4mM NTPs,体外转录试剂(26mMHEPES,20-28mM MgCl2,1mM DTT,pH 8.0)在37℃中反应2~4小时。随后对产物进行纯化:采用超滤管对转录的RNA先导链进行浓缩,用8-15%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对RNA先导链进行分离纯化。在253nm的紫外光下,切胶并回收条带。研碎胶块后加入50mM NaAc,2mMEDTA,在4℃浸泡数小时。取上清,离心并进行溶剂置换不少于三次。最后,分光光度计检测其在260nm紫外波长下的吸光度并计算浓度,-20℃储存备用。
2.根据RNA先导链和目标RNA的序列设计DNA双链模板。其中DNA模板中的两条链(编码链和非编码链)在除“空泡”之外的区域里均为碱基互补配对。编码链的“空泡”区域与RNA先导链的3’端通过碱基互补配对。非编码链的5’端标记生物素,可固定在链霉亲和素附着的琼脂小球上。
需要特别说明的是,编码链和非编码链在使用前需要先进行杂交、固定:两条链等量在40mM Tris-HCl,6mM MgSO4溶液中95℃加热5min,室温冷却。1nmole DNA双链与20uL50%的链霉亲和素附着的琼脂糖小球在40mM Tris-HCl,6mM MgSO4中孵育1hr。采用固液相分离法滤除未被固定的DNA后,加入40mM Tris-HCl,6mM MgSO4重悬DNA-小球,4℃储存备用。
3.位点特异性标记长链RNA:RNA先导链、小球固定的DNA双链以及RNA聚合酶在反应管中孵育,使三者在30~37℃下,形成稳定的“RNA聚合酶-DNA模板-RNA先导链”三元复合物,过滤后,分批次向固-液混合相反应体系中加入含修饰的或普通的NTPs,在RNA先导链的3’-端进行转录延伸,实现精确位点标记。具体地,RNA先导链的3’-端与DNA模板的“空泡”区域形成碱基互补配对,招募RNA聚合酶形成转录复合物。过滤后,加入修饰的UTP,即Cy3修饰的UTP(Cy3-UTP),在20~37℃下轻摇5~30分钟,滤除反应液、清洗固定相。然后加入ATP、CTP、GTP、UTP四种NTPs,在20~37℃下轻摇5~30分钟完成全长RNA的合成。生产的RNA在中间的“U”上含有荧光团。
4.采用紫外和荧光凝胶电泳法检测合成的荧光修饰的RNA。如图2所示,在10%变性聚丙烯酰胺胶,253nm紫外和550nm荧光波长激发下,均能观察到样品条带。
5.采用HPLC检测合成的荧光修饰的RNA。具体地,HPLC检测中,使用C8反相色谱柱,液相使用缓冲液分成A相和B相,A相成分:100mM TEAA,总体积250mL;B相成分:100mM TEAA,150mL ACN,总体积200mL。液相分离程序:10%B相(90%A相),10min;10%-50%B相,30min;10%B相,20min;如图3所示,Cy3-标记的RNA能在550nm的荧光激发下,检测特征吸收峰。
实施例2
本实施例中RNA先导链形式更加多样化,具体为:1.RNA先导链具有复杂结构.2.RNA先导链带有修饰。则将具有复杂结构的RNA先导链与DNA链杂交,使RNA的3’端与DNA模板的“空泡”区域形成碱基互补配对。
本实施例中的RNA先导链自身带有修饰,并通过DNA链辅助折叠后,提高RNA先导链与DNA模板配对的效率,合成在多个位点上含有修饰基团的RNA。如图4所示,图中上部分表示固相DNA模板、RNA聚合酶与RNA先导链无法形成转录复合物,原因在于RNA先导链自身折叠形成复杂结构,其3’-端形成分子内碱基配对,导致RNA先导链无法与DNA模板、RNA聚合酶形成三相转录复合物;图中下部分表示,将具有复杂结构的自身带有修饰的RNA先导链与短链DNA杂交,改变RNA先导链的折叠,使得其3’-端(>4nt)不再形成分子内碱基配对,而位于单链中,则RNA的3’端与DNA模板的“空泡”区域形成碱基互补配对,与RNA聚合酶形成转录复合物;分多次加入荧光团修饰或普通的NTPs,在RNA先导链延伸过程中的指定位点上引入Cy3荧光团标记的NTP,合成多位点荧光标记的RNA。具体过程如下:
1.合成带有功能性修饰基团的RNA先导链。具体地,本发明是采用PLOR方法来合成荧光团Cy5-修饰的RNA先导链。
2.由于RNA先导链自身折叠形成复杂结构,其3’-端形成分子内碱基配对,导致RNA先导链无法与DNA模板、RNA聚合酶形成三相转录复合物。
3.设计短链DNA,可与RNA先导链杂交,并改变RNA先导链的折叠,使得其3’-端(>4nt)不再形成分子内碱基配对,而位于单链中。具体地,RNA先导链的结构可通过软件,比如Mfold进行预测。根据预测结果设计DNA杂交链的序列,通过杂交破坏RNA的折叠,释放RNA先导链3’端(>4nt)。
4.杂交后的RNA先导链可以与固相DNA模板的“空泡”区域进行碱基配对,并能与RNA聚合酶形成转录复合物。
5.根据RNA先导链和目标RNA的序列设计DNA模板:具体与实施例1中步骤2相同;
6.多位点特异性标记RNA:将Cy5标记的RNA先导链分别与DNA模板-小球以及RNA聚合酶形成的转录复合物中,分多次加入荧光团修饰或普通的NTPs,在RNA先导链延伸过程中的指定位点上引入Cy3荧光团标记的NTP,合成多位点荧光标记的RNA。
7.样品纯化与回收。采用紫外、荧光凝胶电泳法和HPLC法对标记的RNA产物进行检测和纯化。具体地,DNA短链杂交的RNA产物可以通过尿素变性胶分离。具体地,加入3倍体积的8M尿素于生成的RNA产物中,震荡混匀后于90℃加热5min,加热后将样品立即上样于10%尿素变性聚丙烯酰胺胶的上样孔进行分离,如图5所示,550nm显示荧光团1,650nm显示荧光团2,此外还有550nm和650nm都显色度荧光团重叠部分,根据紫外、荧光(荧光激发波长分别为550nm和650nm)凝胶电泳条带,切取并回收产物(一次回收),回收步骤与实施例1中步骤1中RNA先导链回收步骤相同。一次回收产物再次通过HPLC检测合成的发色基团并收集对应保留时间的荧光产物,具体与实施例1中步骤5相同,即完成二次回收,-20℃保存备用。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解,本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此,凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案,皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种位点特异性标记RNA的方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
步骤1、设计并制备RNA先导链;选取目标RNA的5’端到标记位点之前的序列作为所述RNA先导链的序列,通过包括体外转录法、位点特异性标记RNA即PLOR法合成所述RNA先导链;
步骤2、设计并制备DNA双链模板,所述DNA双链模板为包括两端碱基互补配对区域和中间碱基非互补配对区域的双链DNA;所述碱基非配对区域称为“空泡”区域;所述DNA双链包括两条链,分别为编码链和非编码链;所述编码链和所述非编码链在除所述“空泡”区域之外的区域里均为碱基互补配对;所述编码链的所述“空泡”区域与步骤1获得的RNA先导链的3’端通过碱基互补配对;所述非编码链的5’端标记生物素,将所述DNA双链模板固定在链霉亲和素附着的琼脂小球上,得到小球固定的DNA双链;
步骤3、位点特异性标记RNA:步骤1获得的RNA先导链、步骤2获得的小球固定的DNA双链以及RNA聚合酶在反应管中孵育,使三者在30~37℃下,形成稳定的“RNA聚合酶-DNA模板-RNA先导链”三元复合物,形成固-液混合相反应体系;
步骤4、向步骤3获得的固-液混合相反应体系中加入含修饰的或普通的NTPs,所述NTPs在所述RNA先导链的3’端进行转录延伸,实现精确位点标记。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤1还包括:对于具有复杂结构的所述RNA先导链,设计短链DNA,将所述具有复杂结构的所述RNA先导链与所述短链DNA链杂交。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤1还包括:通过软件预测所述具有复杂结构的所述RNA先导链的结构,根据预测到的所述结构设计所述短链DNA的序列,通过杂交破坏所述具有复杂结构的所述RNA先导链的折叠,释放所述具有复杂结构的所述RNA先导链的3’端,所述具有复杂结构的所述RNA先导链的3’端碱基数大于4nt。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述RNA先导链的种类包括:i.天然无修饰RNA链;ii.DNA链辅助折叠的RNA链;iii.带有修饰基团的RNA链。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述编码链和所述非编码链在使用前需要先进行杂交和固定。
6.如权利要求5所述的方法,其特征在于,所述杂交和固定的方法为:等量所述编码链和所述非编码链在40mM Tris-HCl,6mM MgSO4溶液中95℃加热5min,室温冷却;1nmole的所述DNA双链与20uL 50%的所述琼脂糖小球在所述40mM Tris-HCl,6mM MgSO4中孵育;采用固液相分离法滤除未被固定的所述DNA后,加入所述40mM Tris-HCl,所述6mM MgSO4重悬所述小球固定的DNA双链,4℃储存备用。
7.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤4还包括:将所述NTPs分成多次加入,精确控制在所述固-液混合相反应体系中转录延长所述RNA先导链的进程,并将所述修饰基团引入到所述RNA的指定位点上。
8.如权利要求7所述的方法,其特征在于,所述步骤4还包括:根据标记位点的需要,在某一次或某几次加入的所述NTPs中含有带修饰基团的所述NTPs,将其合成入所述RNA中;引入的所述修饰基团包括:荧光基团、化学活性官能团、天然修饰、重原子、旋转标签。
9.如权利要求7所述的方法,其特征在于,所述步骤4中所述NTPs加入反应体系的次序和种类由所述DNA模板的序列决定;除最后一次之外,每次加入的所述NTPs种类不超过3种。
10.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述方法还包括采用紫外、荧光凝胶电泳法和HPLC对合成的荧光修饰的所述RNA和标记的所述RNA产物进行检测和纯化;所述荧光修饰的所述RNA和标记的所述RNA产物中所述RNA的长度为小于、等于或者大于100个碱基。
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