CN113604422A - 胰岛素抵抗细胞模型的构建方法及其应用、胰岛素抵抗细胞模型的联合诱导液 - Google Patents

胰岛素抵抗细胞模型的构建方法及其应用、胰岛素抵抗细胞模型的联合诱导液 Download PDF

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Abstract

本申请涉及细胞模型构建技术领域，具体而言，涉及一种胰岛素抵抗细胞模型的构建方法及其应用、胰岛素抵抗细胞模型的联合诱导液。胰岛素抵抗细胞模型的构建方法包括将细胞置于联合诱导液中孵育；联合诱导液包括摩尔浓度为20‑30mM的糖、质量浓度为2‑8ng/mL的促炎细胞因子以及摩尔浓度为0.1‑0.6mM的棕榈酸；摩尔浓度为20‑30mM的糖为摩尔浓度为5‑15mM的果糖以及余下的葡萄糖。本申请的构建方法得到的模型可以出现葡萄糖吸收减少、胰岛素信号通路受损、糖异生增加以及糖原合成减少，并伴随内质网应激、氧化应激、炎症反应和线粒体功能紊乱，可以更真实地模拟高果糖高脂饮食下肥胖人群胰岛素抵抗的发病机制。

Description

胰岛素抵抗细胞模型的构建方法及其应用、胰岛素抵抗细胞 模型的联合诱导液
技术领域
本申请涉及细胞模型构建技术领域，具体而言，涉及一种胰岛素抵抗细胞模型的构建方法及其应用、胰岛素抵抗细胞模型的联合诱导液。
背景技术
以高糖高脂为特征的西方饮食是肥胖的重要诱因。肥胖相关胰岛素抵抗发病机制非常复杂，目前体外胰岛素抵抗细胞模型的建立基本都是单一因素诱导，缺乏多重诱发因素的胰岛素抵抗细胞模型；无法很好地模拟肥胖人群体内胰岛素抵抗发病机制。
发明内容
本申请实施例的目的在于提供一种胰岛素抵抗细胞模型的构建方法及其应用以及一种胰岛素抵抗细胞模型的联合诱导液，其旨在改善现有的胰岛素抵抗细胞模型无法很好地模拟肥胖人群体内胰岛素抵抗发病机制的问题。
本申请的第一方面提供一种胰岛素抵抗细胞模型的构建方法，包括：将细胞置于联合诱导液中孵育。
联合诱导液包括摩尔浓度为20-30mM的糖、质量浓度为2-8ng/mL的促炎细胞因子以及摩尔浓度为0.1-0.6mM的棕榈酸；摩尔浓度为20-30mM的糖为摩尔浓度为5-15mM的果糖以及余下的葡萄糖。
本申请的构建方法得到的胰岛素抵抗细胞模型具有较高的特异性，可以出现葡萄糖吸收减少、胰岛素信号通路受损、糖异生增加以及糖原合成减少等胰岛素抵抗典型特征，并伴随内质网应激、炎症反应、氧化应激和线粒体功能紊乱等胰岛素抵抗的潜在发病机制特征。除去研究葡萄糖吸收、胰岛素信号通路相关蛋白表达水平、糖原合成以及糖异生等胰岛素抵抗典型特征外，还对胰岛素抵抗的潜在发病机制进行模拟，可以更真实地模拟高果糖高脂饮食下肥胖人群胰岛素抵抗的发病机制，为后续营养干预及药物、食品功能因子以及功能食品的筛选研究提供基础。同时，本申请的胰岛素抵抗模型采用较低浓度的诱导剂复配，构建的细胞胰岛素抵抗模型具有更高的灵敏度。
本申请的第二方面提供上述胰岛素抵抗细胞模型的构建方法的获得的胰岛素抵抗细胞模型在筛选药物、食品功能因子或功能食品中的应用。
药物包括治疗二型糖尿病的药物、治疗高血糖的药物以及治疗胰岛素抵抗的药物中的至少一种。
食品功能因子包括改善二型糖尿病的食品功能因子、改善高血糖的食品功能因子以及改善胰岛素抵抗的食品功能因子中的至少一种。
功能食品包括改善二型糖尿病的功能食品、改善高血糖的功能食品以及改善胰岛素抵抗的功能食品中的至少一种。
通过本申请胰岛素抵抗细胞模型的构建方法获得的模型由于可以更真实地模拟高果糖高脂饮食下肥胖人群胰岛素抵抗的发病机制，用于药物筛选时可以更好地保证药物对胰岛素抵抗的治疗效果，用于食品功能因子或功能食品筛选时可以更好地保证食品功能因子或功能食品对胰岛素抵抗的改善效果。
本申请的第三方面提供一种胰岛素抵抗细胞模型的联合诱导液，包括：摩尔浓度为20-30mM的糖、质量浓度为2-8ng/mL的促炎细胞因子以及摩尔浓度为0.1-0.6mM的棕榈酸；摩尔浓度为20-30mM的糖为摩尔浓度为5-15mM的果糖以及余下的葡萄糖。
可选地，促炎细胞因子包括TNF-α、IL-6、IL-1β以及IL-18中的至少一种。
可选地，促炎细胞因子为TNF-α。
可选地，联合诱导液包括摩尔浓度为5mM的果糖、摩尔浓度为20mM的葡萄糖、质量浓度为5ng/mL的TNF-α以及摩尔浓度为0.1mM的棕榈酸。
可选地，联合诱导液还包括含有胎牛血清的无糖培养基。
可选地，培养基包括DMEM培养基、RPMI1640培养基、MEM培养基以及DMEM/F-12培养基中的至少一种。
本申请的胰岛素抵抗细胞模型的联合诱导液具有较高的特异性，用于诱导胰岛素抵抗时可以出现葡萄糖吸收减少、胰岛素信号通路受损、糖异生增加以及糖原合成减少等胰岛素抵抗典型特征，并伴随内质网应激、氧化应激、炎症反应和线粒体功能紊乱等胰岛素抵抗的潜在发病机制特征。本申请的胰岛素抵抗细胞模型的联合诱导液除去可以用于研究葡萄糖吸收、胰岛素信号通路相关蛋白表达水平、糖原合成以及糖异生等胰岛素抵抗典型特征外，还可以用于对胰岛素抵抗的潜在发病机制进行模拟，可以更真实地模拟高果糖高脂饮食下肥胖人群胰岛素抵抗的发病机制，为后续营养干预及药物、食品功能因子以及功能食品的筛选研究提供基础。同时，本申请的胰岛素抵抗模型的联合诱导液采用较低浓度的诱导剂复配，具有更高的灵敏度。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本申请的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1示出了本申请实施例1-2以及对比例1-14的对3T3-L1细胞葡萄糖吸收能力的影响图。
图2示出了本申请实施例1-2以及对比例1-8的对3T3-L1细胞胰岛素信号通路的影响图。
图3示出了本申请实施例1-2以及对比例1-8的对3T3-L1细胞糖异生水平的影响图。
图4示出了本申请实施例1-2以及对比例1-8的对3T3-L1细胞内质网应激的影响图。
图5示出了本申请实施例1-2以及对比例1-8的对3T3-L1细胞炎症通路的影响图。
图6示出了本申请实施例1-2以及对比例1-8的对3T3-L1细胞线粒体功能和氧化应激的影响图。
图7示出了本申请实施例1-2以及对比例1-8的对3T3-L1细胞糖原合成通路的影响图。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本申请实施例的胰岛素抵抗细胞模型的构建方法及其应用、胰岛素抵抗细胞模型的联合诱导液进行具体说明。
在本申请中，单位“mM”是指mmol/L；“μM”是指μmol/L；“nM”是指nmol/L。炎性细胞因子是指一类主要由免疫系统细胞生成的具有许多强大生物学效应的内源性多肽，是一系列可以促进炎症的细胞因子的总称。TNF-α是指肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α)。IL-6是指白细胞介素-6(Interleukin-6)。IL-1β是指白细胞介素-1β(Interleukin-1β)。IL-18是指白细胞介素-18(Interleukin-18)。高糖DMEM培养基是指葡萄糖质量浓度为4.5g/L的DMEM培养基。3T3-L1细胞是指小鼠胚胎成纤维细胞(前脂肪细胞)。IBMX是指3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(3-isobutyl-1-methyl-7H-xanthine)。食品功能因子是指在食品中能够起到调节人体特定生理机能并且不对机体产生不良作用的活性物质。功能食品是指能够改善身体健康状况或降低疾病风险的食品。
本申请提供一种胰岛素抵抗细胞模型的构建方法，包括将细胞置于联合诱导液中孵育。
联合诱导液包括摩尔浓度为20-30mM的糖、质量浓度为2-8ng/mL的促炎细胞因子以及摩尔浓度为0.1-0.6mM的棕榈酸；摩尔浓度为20-30mM的糖为摩尔浓度为5-15mM的果糖以及余下的葡萄糖。
作为示例性地，联合诱导液中果糖和葡萄糖的总摩尔浓度可以为20mM、22mM、25mM、27mM以及30mM等等。联合诱导液中果糖的摩尔浓度可以为5mM、8mM、10mM、12mM以及15mM等等。根据联合诱导液中果糖的浓度选用，联合诱导液中葡萄糖的摩尔浓度可以为10mM、13mM、15mM、18mM以及20mM等等。联合诱导液中促炎细胞因子的质量浓度可以为2ng/mL、3ng/mL、5ng/mL、6ng/mL以及8ng/mL等等。联合诱导液中棕榈酸的摩尔浓度可以为0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM以及0.6mM等等。
在本申请中，葡萄糖的作用在于提供细胞生长所需的能量。果糖用于模拟高果糖摄入，果糖参与诱导胰岛素抵抗、高血糖、脂肪生成、血脂异常、氧化应激以及炎症反应。促炎细胞因子用于模拟脂肪组织的慢性炎症状态、参与调节炎症。棕榈酸用于模拟肥胖人群高脂饮食的血浆状态，从而损伤胰岛素信号通路、降低葡萄糖的摄取、激发炎症反应以及引起氧化应激。果糖、棕榈酸和促炎细胞因子共同作用联合诱导胰岛素抵抗，可以更好地模拟真实体内的细胞胰岛素抵抗机制。
现有技术中，Muscarà等人利用1mM棕榈酸诱导构建细胞胰岛素抵抗模型(Phytotherapy Research.2019；33:1888–1897)，Ormazabal等人利用0.65mM棕榈酸诱导构建细胞胰岛素抵抗模型(Obesity Research&Clinical Practice 14(2020)573–579)；Anusree等人利用10ng/mLTNF-α诱导构建细胞胰岛素抵抗模型(Molecular and CellularEndocrinology 413(2015)120-128)。相比现有技术，本申请的胰岛素抵抗模型采用较低浓度的诱导剂复配，构建的细胞胰岛素抵抗模型具有更高的灵敏度；同时可以更真实地模拟高果糖高脂饮食下肥胖人群胰岛素抵抗的发病机制。
本申请的构建方法得到的胰岛素抵抗细胞模型可以出现葡萄糖吸收减少、胰岛素信号通路受损、糖异生增加以及糖原合成减少等胰岛素抵抗发病机制，并伴随内质网应激、氧化应激、炎症反应和线粒体功能紊乱等胰岛素抵抗的潜在发病机制特征。相比现有技术，本申请除去研究葡萄糖吸收、胰岛素信号通路相关蛋白表达水平、糖原合成以及糖异生等胰岛素抵抗发病机制外，还对胰岛素抵抗的潜在发病机制进行模拟，可以更真实地模拟高果糖高脂饮食下肥胖人群胰岛素抵抗的发病机制，为后续营养干预及药物筛选的研究提供基础，有利于提高药物筛选等的有效性和特异性。同时，本申请的胰岛素抵抗模型采用较低浓度的诱导剂复配，构建的细胞胰岛素抵抗模型具有更高的灵敏度。
在本申请的一些实施例中，促炎细胞因子包括TNF-α、IL-6、IL-1β以及IL-18中的至少一种。可以理解的是，在本申请中促炎细胞因子可以仅包含TNF-α、IL-6、IL-1β以及IL-18中的一种，可以同时包含TNF-α、IL-6、IL-1β以及IL-18中多种或者全部。需要说明的是，在本申请的其他实施例中，促炎细胞因子也可以不限于上述细胞因子，促炎细胞因子也可以包括IL-2(白细胞介素-2，Interleukin-2)、IL-12(白细胞介素-12，Interleukin-12)、IL-17(白细胞介素-17，Interleukin-17)以及IFN-γ(γ-干扰素，Interferonγ)等等。
进一步地，在本申请的一些实施例中，促炎细胞因子为TNF-α。TNF-α可以增加MAPK(丝裂原活化蛋白激酶，Mitogen-Activated Protein Kinase)的激活，随后激活NF-κB(核因子-kB，Nuclear Factor Kappa B)通路，进一步诱导促炎介质的产生，最终损害胰岛素信号通路。TNF-α与果糖、棕榈酸和促炎细胞因子共同作用，可以进一步提高高果糖高脂饮食下肥胖人群胰岛素抵抗的发病机制的模拟真实性，有利于提高药物筛选等的有效性和特异性。
在本申请的一些实施例中，联合诱导液包括摩尔浓度为5mM的果糖、摩尔浓度为20mM的葡萄糖、质量浓度为5ng/mL的TNF-α以及摩尔浓度为0.1mM的棕榈酸。摩尔浓度为5mM的果糖、质量浓度为5ng/mL的TNF-α以及摩尔浓度为0.1mM的棕榈酸联合诱导细胞发生胰岛素抵抗，进一步提高高果糖高脂饮食下肥胖人群胰岛素抵抗的发病机制的模拟真实性，有利于提高药物筛选等的有效性和特异性。
在本申请的一些实施例中，联合诱导液还包括含有胎牛血清的无糖培养基。作为示例性地，胎牛血清在联合诱导液中的体积分数可以10％。需要说明的是，本申请不再对胎牛血清在联合诱导液中的体积分数进行限定。
进一步地，上述培养基包括DMEM(Dulbecco's Modified Eagle'sMedium)培养基、RPMI1640(Roswell Park Memorial Institute1640)培养基、MEM(Minimum EssentialMedium)培养基以及DMEM/F-12(Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient MixtureF-12)培养基中的至少一种。需要说明的是，在本申请的其他实施例中也可以根据实际细胞培养选择相应的培养基。
在本申请的一些实施例中，将细胞置于联合诱导液中孵育中的细胞包括脂肪细胞、肝细胞以及肌细胞中的至少一种。需要说明的，在本申请的其他实施例中，细胞的选用也不限于上述细胞，只要是胰岛素作用靶细胞。
进一步地，将细胞置于联合诱导液中孵育中的细胞选用3T3-L1细胞。将3T3-L1细胞置于联合诱导液中孵育前还包括对3T3-L1细胞进行培养和分化，3T3-L1细胞培养和分化步骤如下：
(1)将3T3-L1细胞置于含有小牛血清的高糖DMEM培养基中培养至细胞呈融合状态后再培养48-72h。作为示例性地，小牛血清在细胞培养体系中的体积分数可以为10％；需要说明的是，本申请不再对胎牛血清在联合诱导液中的体积分数进行限定。细胞培养至融合状态后再培养时间可以为48h、50h、60h、65h以及72h等等。
(2)加入第一分化液培养48-72h。其中，第一分化液包括摩尔浓度为0.4-0.6mM的IBMX、摩尔浓度为0.25-1μM地塞米松、质量浓度为1-10μg/mL胰岛素以及体积分数为10％的胎牛血清的高糖DMEM培养基。作为示例性地，IBMX在第一分化液中的摩尔浓度可以为0.4mM、0.45mM、0.5mM以及0.6mM等等；地塞米松在第一分化液中的摩尔浓度可以为0.25μM、0.3μM、0.5μM、0.7μM以及1μM等等；胰岛素在第一分化液中的质量浓度可以为1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、8μg/mL以及10μg/mL等等；胎牛血清在第一分化液中的体积分数可以为10％；加入第一分化液培养的时间可以为48h、50h、60h、65h以及72h等等。需要说明的是，本申请不再对胎牛血清在第一分化液中的体积分数进行限定。在本实施例中，IBMX的作用是抑制cAMP(环磷酸腺苷)的降解以及转导多种因子的跨膜信号。地塞米松的作用是增加成脂关键基因PPARγ的表达，进而激活许多脂肪细胞关键基因的启动子，如脂肪酸合酶，脂蛋白脂酶，乙酰CoA羧化酶等，促进脂肪细胞分化。胰岛素的作用是促进细胞葡萄糖吸收。
进一步地，第一分化液还包括摩尔浓度为1-2μM的罗格列酮。
作为示例性地，罗格列酮在第一分化液中的摩尔浓度可以为1μM、1.5μM、1.8μM以及2μM等等。罗格列酮的作用是胰岛素增敏剂，是PPARγ的高选择性、强效激动剂。
(3)加入第二分化液培养48-72h。其中，第二分化液包括质量浓度包括1-10μg/mL胰岛素以及含胎牛血清的高糖DMEM培养基。
作为示例性地，胰岛素在第二分化液中的质量浓度可以为1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、8μg/mL以及10μg/mL等等；胎牛血清在第二分化液中的体积分数可以为10％；加入第二分化液培养的时间可以为48h、50h、60h、65h以及72h等等。需要说明的是，本申请不再对胎牛血清在第二分化液中的体积分数进行限定。加入上述配比的胰岛素以及胎牛血清的高糖DMEM培养基具有促进细胞葡萄糖吸收的作用。
(4)更换含胎牛血清的高糖DMEM培养基继续培养48-96h。作为示例性地，胎牛血清在更换培养基后的体系中的体积分数可以为10％。更换含胎牛血清高糖DMEM培养基后继续培养的时间可以为48h、50h、60h、72h以及96h等等。需要说明的是，本申请不再对胎牛血清在更换培养基后的体系中的体积分数进行限定。
在本申请的一些实施例中，将细胞置于联合诱导液中孵育的时间为24-72h。作为示例性地，将细胞置于联合诱导液中孵育的时间可以为24h、36h、48h、54h、60h以及72h等等。进一步地，将细胞置于联合诱导液中孵育的时间为24-48h。
胰岛素抵抗细胞模型包括以葡萄糖吸收减少为特征的胰岛素抵抗模型、以胰岛素信号通路受损为特征的胰岛素抵抗模型、以糖异生蛋白表达升高为特征的胰岛素抵抗模型、以糖原合成减少为特征的胰岛素抵抗模型、以内质网应激为特征的胰岛素抵抗模型、以线粒体功能紊乱为特征的胰岛素抵抗模型、以炎症反应为特征的胰岛素抵抗模型以及以氧化应激为特征的胰岛素抵抗模型以及具有糖异生增加的胰岛素抵抗模型中的至少一种。
本申请还提供一种上述胰岛素抵抗细胞模型的构建方法获得的胰岛素抵抗细胞模型在筛选药物、食品功能因子或功能食品中的应用。其中，药物包括治疗二型糖尿病的药物、治疗高血糖的药物以及治疗胰岛素抵抗的药物中的至少一种；食品功能因子包括改善二型糖尿病的食品功能因子、改善高血糖的食品功能因子以及改善胰岛素抵抗的食品功能因子中的至少一种；功能食品包括改善二型糖尿病的功能食品、改善高血糖的功能食品以及改善胰岛素抵抗的功能食品中的至少一种。需要说明的是，药物可以包括治疗二型糖尿病的药物、治疗高血糖的药物以及治疗胰岛素抵抗的药物中的一种，也可以包括治疗二型糖尿病的药物、治疗高血糖的药物以及治疗胰岛素抵抗的药物中的二种或者全部；同样的，食品功能因子包括改善二型糖尿病的食品功能因子、改善高血糖的食品功能因子以及改善胰岛素抵抗的食品功能因子中的一种，也可以包括改善二型糖尿病的食品功能因子、改善高血糖的食品功能因子以及改善胰岛素抵抗的食品功能因子中的二种或者全部；同样的，功能食品包括改善二型糖尿病的功能食品、改善高血糖的功能食品以及改善胰岛素抵抗的功能食品中的一种，也可以包括改善二型糖尿病的功能食品、改善高血糖的功能食品以及改善胰岛素抵抗的功能食品中的二种或者全部。
通过本申请胰岛素抵抗细胞模型的构建方法的获得的模型由于可以更真实地模拟高果糖高脂饮食下肥胖人群胰岛素抵抗的发病机制，用于药物筛选时可以更好地保证药物对胰岛素抵抗的治疗效果，用于食品功能因子或功能食品筛选时可以更好地保证食品功能因子或功能食品对胰岛素抵抗的改善效果。
本申请还提供一种胰岛素抵抗细胞模型的联合诱导液，包括：摩尔浓度为20-30mM的糖、质量浓度为2-8ng/mL的促炎细胞因子以及摩尔浓度为0.1-0.6mM的棕榈酸；摩尔浓度为20-30mM的糖为摩尔浓度为5-15mM的果糖以及余下的葡萄糖。
在本申请的一些实施例中，促炎细胞因子包括TNF-α、IL-6、IL-1β以及IL-18中的至少一种。
在本申请的一些实施例中，促炎细胞因子为TNF-α。
在本申请的一些实施例中，联合诱导液包括摩尔浓度为5mM的果糖、摩尔浓度为20mM的葡萄糖、质量浓度为5ng/mL的TNF-α以及摩尔浓度为0.1mM的棕榈酸。
在本申请的一些实施例中，联合诱导液还包括含有胎牛血清的无糖培养基。
在本申请的一些实施例中，培养基包括DMEM培养基、RPMI1640培养基、MEM培养基以及DMEM/F-12培养基中的至少一种。
本实施例提供的胰岛素抵抗细胞模型的联合诱导液至少具有以下优点：
本申请的胰岛素抵抗细胞模型的联合诱导液，用于诱导胰岛素抵抗时可以出现葡萄糖吸收减少、胰岛素信号通路受损、糖异生增加以及糖原合成减少等胰岛素抵抗典型特征，并伴随内质网应激、氧化应激、炎症反应和线粒体功能紊乱等胰岛素抵抗的潜在发病机制特征。相比现有技术，本申请的胰岛素抵抗细胞模型的联合诱导液采用较低浓度的诱导剂复配，具有较高的灵敏度和特异性；本申请的胰岛素抵抗细胞模型的联合诱导液除去可以用于研究葡萄糖吸收、胰岛素信号通路相关蛋白表达水平、糖原合成以及糖异生等胰岛素抵抗典型特征外，还可以用于对胰岛素抵抗的潜在发病机制进行模拟，可以更真实地模拟高果糖高脂饮食下肥胖人群胰岛素抵抗的发病机制，为后续营养干预及药物、食品功能因子以及功能食品的筛选研究提供基础。
以下结合实施例对本申请的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种胰岛素抵抗细胞模型的构建方法以及一种胰岛素抵抗细胞模型的联合诱导液。
3T3-L1细胞的培养：
将3T3-L1细胞置于含体积分数为10％小牛血清的高糖DMEM(葡萄糖质量浓度为4.5g/L)培养基中培养至细胞呈融合状态48h后；加入第一分化液培养48h后再加入第二分化液培养48h，更换含体积分数为10％胎牛血清高糖DMEM培养基继续培养48h得到分化好的3T3-L1细胞。
其中，第一分化液包括摩尔浓度为0.5mM的IBMX、摩尔浓度为1μM地塞米松、质量浓度为10μg/mL胰岛素以及体积分数为10％的胎牛血清的高糖DMEM培养基；第二分化液包括质量浓度包括10μg/mL胰岛素以及体积分数为10％的胎牛血清的高糖DMEM培养基。
联合诱导液的配置：将果糖、葡萄糖、TNF-α、棕榈酸以及胎牛血清混合于DMEM培养基中。其中，果糖的摩尔浓度为5mM，葡萄糖的摩尔浓度为20mM，TNF-α的质量浓度为5ng/mL，棕榈酸的摩尔浓度为0.1mM，胎牛血清的体积分数为10％。
将分化好的3T3-L1细胞置于配置好的联合诱导液中孵育24h，完成造模。
实施例2-4以及对比例1-14
实施例2-4以及对比例1-14分别提供了一种胰岛素抵抗细胞模型的构建方法以及一种胰岛素抵抗细胞模型的联合诱导液。请参阅实施例1，实施例2-4以及对比例1-14与实施例1的孵育时间、联合诱导液中果糖、葡萄糖、TNF-α以及棕榈酸的浓度不同，详见表1。
表1
Figure BDA0003203837480000131
Figure BDA0003203837480000141
试验例1
对实施例1-2以及对比例1-14提供的一种胰岛素抵抗细胞模型的构建方法构建得到的细胞模型进行葡萄糖吸收能力验证。验证方法如下：向构建得到的细胞模型中加入终摩尔浓度10nM胰岛素和终摩尔浓度为100μM的2-NBDG(2-(N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-氨基)-2-脱氧葡萄糖)避光孵育细胞20min，利用流式细胞仪检测2-NBDG的荧光强度。试验结果如图1所示。
从图1可以看出，经过24h孵育后的实施例1和经过48h孵育后的实施例2均可以显著降低细胞葡萄糖吸收(p<0.05)，说明本申请构建的胰岛素抵抗细胞模型可以有效地诱导细胞发生以葡萄糖吸收减少为特征的，胰岛素抵抗。
进一步地，实施例1-2的细胞葡萄糖吸收降低效果明显优于对比例1-8，说明本申请的多因素联合诱导相比单因素诱导可以有效地引起细胞发生以葡萄糖吸收减少为特征的胰岛素抵抗。进一步地，实施例1-2的细胞葡萄糖吸收降低效果明显优于对比例9-14，说明本申请的浓度配比可以有效地引起细胞发生以葡萄糖吸收减少为特征的胰岛素抵抗。
试验例2
对实施例1-2以及对比例1-8提供的一种胰岛素抵抗细胞模型的构建方法构建得到的细胞模型进行胰岛素信号通路以及糖异生水平验证，验证方法采用Western blot法。试验结果如图2和图3所示。图2A是指孵育时间为24h的Akt磷酸化结果图；图2B是指孵育时间为48h的Akt磷酸化结果图。图3A是指孵育时间为24h的PEPCK表达结果图；图3B是指孵育时间为48h的PEPCK表达结果图。图2和图3中β-actin是指肌动蛋白，p-Akt是指磷酸化Akt，p-Akt/Akt是指Akt蛋白磷酸化水平，PEPCK/β-actin是指PEPCK蛋白表达水平。
从图2可以看出，经过24h孵育后的实施例1和经过48h孵育后的实施例2均可以显著降低Akt磷酸化(p<0.01)。说明本申请构建的胰岛素抵抗细胞模型可以有效地诱导细胞发生以胰岛素信号通路受损为特征的胰岛素抵抗。
从图3可以看出，经过24h孵育后的实施例1和经过48h孵育后的实施例2均可以极显著升高糖异生关键蛋白PEPCK(磷酸烯醇式丙酮酸碳羧化酶，Phosphoenolpyruvatecarboxykinase)表达(p<0.01)。说明本申请构建的胰岛素抵抗细胞模型可以有效地诱导细胞发生以糖异生蛋白表达升高为特征的胰岛素抵抗。
进一步地，实施例1-2的Akt磷酸化降低和PEPCK升高效果均优于对比例1-8，说明本申请的多因素联合诱导相比单因素诱导可以有效地引起细胞发生以胰岛素信号通路受损和糖异生蛋白表达升高为特征的胰岛素抵抗。
试验例3
对实施例1-2以及对比例1-8提供的一种胰岛素抵抗细胞模型的构建方法构建得到的细胞模型进行内质网应激的验证。验证方法采用Western blot法。试验结果如图4所示。图4A是指孵育时间为24h的GRP78表达结果图；图4B是指孵育时间为48h的GRP78表达结果图；图4中β-actin是指肌动蛋白，GRP78/β-actin是指GRP78蛋白表达水平。
从图4可以看出，经过24h孵育后的实施例1可以显著升高内质网应激标志蛋白GRP78(葡萄糖调节蛋白78，78-kD glucose-regulated protein)表达水平(p<0.05)，经过48h孵育后的实施例2可以显著升高GRP78蛋白表达水平(p<0.01)，说明本申请构建的胰岛素抵抗细胞模型可以有效地诱导细胞发生以内质网应激为特征的胰岛素抵抗。
进一步地，实施例1和实施例2的GRP78表达水平优于对比例1-8，说明本申请的多因素联合诱导相比单因素诱导可以有效地引起细胞发生以内质网应激为特征的胰岛素抵抗。
试验例4
对实施例1-2以及对比例1-8提供的一种胰岛素抵抗细胞模型的构建方法构建得到的细胞模型进行炎症反应验证。验证方法采用Western blot法。试验结果如图5所示。图5A是指孵育时间为24h的NF-κB p65磷酸化结果图；图5B是指孵育时间为48h的NF-κB p65磷酸化结果图。图5中p65是指非磷酸化NF-κB p65亚基，p-p65是指磷酸化NF-κB p65亚基，p-p65/p65是指磷酸化NF-κB p65表达水平。
从图5可以看出，经过24h孵育后的实施例1可以显著增加NF-κB p65(NuclearFactor Kappa B subunit p65，核因子-kB p65亚基)磷酸化(p<0.05)，经过48h孵育后的实施例2可以显著增加NF-κBp65磷酸化(p<0.01)，说明本申请构建的胰岛素抵抗细胞模型可以有效地诱导细胞发生以炎症反应为特征的起胰岛素抵抗。
进一步地，实施例1-2的NF-κB p65磷酸化增加效果优于对比例1-8，说明本申请的多因素联合诱导相比单因素诱导可以有效地引起细胞发生以炎症反应为特征的胰岛素抵抗。
试验例5
对实施例1-2以及对比例1-8提供的一种胰岛素抵抗细胞模型的构建方法构建得到的细胞模型进行线粒体功能紊乱和氧化应激验证。采用Rhod-2(细胞可渗透钙离子荧光探针，CAS号：145037-81-6)和cellROX Deep Red荧光探针分别检测线粒体Ca2+和细胞ROS(活性氧，reactive oxygen species)水平。试验结果如图6所示。图6A是线粒体Ca2+结果图；图6B是细胞ROS结果图。
从图6可以看出，经过24h孵育后的实施例1和经过48h孵育后的实施例2可以显著引起线粒体Ca2+过载和细胞ROS水平升高(p<0.01)，说明本申请构建的胰岛素抵抗细胞模型可以有效地诱导细胞发生以线粒体功能紊乱和氧化应激为特征的胰岛素抵抗。
进一步地，实施例1和实施例2的线粒体Ca2+过载和细胞ROS水平升高均效果优于对比例1-8，说明本申请的多因素联合诱导相比单因素诱导可以有效地引起细胞发生以线粒体功能紊乱和氧化应激为特征的胰岛素抵抗。
试验例6
对实施例1-2以及对比例1-8提供的一种胰岛素抵抗细胞模型的构建方法构建得到的细胞模型进行糖原合成水平验证。验证方法采用Western blot法。试验结果如图7所示。图7A是指孵育时间为24h的GSK-3β(糖原合成酶激酶，Glycogen synthase kinase 3β)磷酸化结果图；图7B是指孵育时间为48h的GSK-3β磷酸化结果图。图7中GSK-3β是指非磷酸化GSK-3β，p-GSK-3β是指磷酸化GSK-3β，p-GSK-3β/GSK-3β是指磷酸化GSK-3β表达水平。
从图7可以看出，经过24h孵育后的实施例1和经过48h孵育后的实施例2均可以显著降低GSK-3β磷酸化(p<0.01)，说明本申请构建的胰岛素抵抗细胞模型可以有效地诱导细胞发生以糖原合成减少为特征的起胰岛素抵抗。
进一步地，实施例1-2的GSK-3β磷酸化增加效果优于对比例1-8，说明本申请的多因素联合诱导相比单因素诱导可以有效地引起细胞发生以糖原合成减少为特征的胰岛素抵抗。以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种胰岛素抵抗细胞模型的构建方法，其特征在于，包括：将细胞置于联合诱导液中孵育；
所述联合诱导液包括摩尔浓度为20-30mM的糖、质量浓度为2-8ng/mL的促炎细胞因子以及摩尔浓度为0.1-0.6mM的棕榈酸；
所述摩尔浓度为20-30mM的糖为摩尔浓度为5-15mM的果糖以及余下的葡萄糖。
2.根据权利要求1所述的胰岛素抵抗细胞模型的构建方法，其特征在于，所述促炎细胞因子包括TNF-α、IL-6、IL-1β以及IL-18中的至少一种；
可选地，所述促炎细胞因子为TNF-α。
3.根据权利要求1所述的胰岛素抵抗细胞模型的构建方法，其特征在于，所述联合诱导液包括摩尔浓度为5mM的果糖、摩尔浓度为20mM的葡萄糖、质量浓度为5ng/mL的TNF-α以及摩尔浓度为0.1mM的棕榈酸。
4.根据权利要求3所述的胰岛素抵抗细胞模型的构建方法，其特征在于，所述联合诱导液还包括含有胎牛血清的无糖培养基；
可选地，所述培养基包括DMEM培养基、RPMI1640培养基、MEM培养基以及DMEM/F-12培养基中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的胰岛素抵抗细胞模型的构建方法，其特征在于，所述细胞包括脂肪细胞、肝细胞以及肌细胞中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的胰岛素抵抗细胞模型的构建方法，其特征在于，所述细胞为3T3-L1细胞；
可选地，将所述3T3-L1细胞置于联合诱导液中孵育前还包括对所述3T3-L1细胞进行培养和分化；
所述对所述3T3-L1细胞进行培养和分化步骤包括：将所述3T3-L1细胞置于含小牛血清的高糖DMEM培养基中培养至细胞呈融合状态48-72h后；加入第一分化液培养48-72h；加入第二分化液培养48-72h之后，更换含胎牛血清的高糖DMEM培养基继续培养48-96h；
其中，所述第一分化液包括摩尔浓度为0.4-0.6mM的IBMX、摩尔浓度为0.25-1μM地塞米松、质量浓度为1-10μg/mL胰岛素以及含有胎牛血清的高糖DMEM培养基；
所述第二分化液包括质量浓度包括1-10μg/mL胰岛素以及含有胎牛血清的高糖DMEM培养基；
可选地，所述第一分化液还包括摩尔浓度为1-2μM的罗格列酮。
7.根据权利要求1所述的胰岛素抵抗细胞模型的构建方法，其特征在于，所述孵育的时间为24-72h；
可选地，所述孵育的时间为24-48h。
8.根据权利要求1-7任一项所述的胰岛素抵抗细胞模型的构建方法，其特征在于，所述胰岛素抵抗细胞模型包括以葡萄糖吸收减少为特征的胰岛素抵抗模型、以胰岛素信号通路受损为特征的胰岛素抵抗模型、以糖异生蛋白表达升高为特征的胰岛素抵抗模型、以糖原合成减少为特征的胰岛素抵抗模型、以内质网应激为特征的胰岛素抵抗模型、以线粒体功能紊乱为特征的胰岛素抵抗模型、以炎症反应为特征的胰岛素抵抗模型以及以氧化应激为特征的胰岛素抵抗模型中的至少一种。
9.一种如权利要求1-8任一项所述的胰岛素抵抗细胞模型的构建方法获得的胰岛素抵抗细胞模型在筛选药物、食品功能因子或功能食品中的应用；
所述药物包括治疗二型糖尿病的药物、治疗高血糖的药物以及治疗胰岛素抵抗的药物中的至少一种；
所述食品功能因子包括改善二型糖尿病的食品功能因子、改善高血糖的食品功能因子以及改善胰岛素抵抗的食品功能因子中的至少一种；
所述功能食品包括改善二型糖尿病的功能食品、改善高血糖的功能食品以及改善胰岛素抵抗的功能食品中的至少一种。
10.一种胰岛素抵抗细胞模型的联合诱导液，其特征在于，包括：摩尔浓度为20-30mM的糖、质量浓度为2-8ng/mL的促炎细胞因子以及摩尔浓度为0.1-0.6mM的棕榈酸；所述摩尔浓度为20-30mM的糖为摩尔浓度为5-15mM的果糖以及余下的葡萄糖；
可选地，所述促炎细胞因子包括TNF-α、IL-6、IL-1β以及IL-18中的至少一种；
可选地，所述促炎细胞因子为TNF-α；
可选地，所述联合诱导液包括摩尔浓度为5mM的果糖、摩尔浓度为20mM的葡萄糖、质量浓度为5ng/mL的TNF-α以及摩尔浓度为0.1mM的棕榈酸；
可选地，所述联合诱导液还包括含有胎牛血清的无糖培养基；
可选地，所述培养基包括DMEM培养基、RPMI1640培养基、MEM培养基以及DMEM/F-12培养基中的至少一种。
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ZHAO L等: "Fructose and glucose combined with free fatty acids induce metabolic disorders in HepG2 cell: A new model to study the impacts of high-fructose/sucrose and high-fat diets in vitro", 《MOL NUTR FOOD RES》, vol. 60, no. 4, 13 January 2016 (2016-01-13), pages 909 - 921, XP055593738, DOI: 10.1002/mnfr.201500635 *
刘璐等: "肿瘤坏死因子-α诱导脂肪细胞胰岛素抵抗模型的建立及评价指标", 《天津中医药》 *
刘璐等: "肿瘤坏死因子-α诱导脂肪细胞胰岛素抵抗模型的建立及评价指标", 《天津中医药》, vol. 35, no. 11, 12 November 2018 (2018-11-12), pages 848 - 853 *
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