CN113597308A - 包含甲苯哒唑和强或中等cyp1a2抑制剂的药物组合 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包含甲苯哒唑和强或中等细胞色素P₄₅₀₁A₂(CYP₁A₂)抑制剂的药物组合物，所述抑制剂优选氟伏沙明、噻苯达唑或呋喃茶碱。

Description

包含甲苯哒唑和强或中等CYP1A2抑制剂的药物组合

发明领域

本发明涉及包含苯并咪唑类化合物甲苯哒唑和强或中等细胞色素P4501A2同工酶(CYP1A2)抑制剂的药物组合。

发明背景

苯并咪唑类化合物代表一类具有药理活性的化合物，已知其对与治疗多种疾病相关的生物靶标具有活性。已知苯并咪唑类，如甲苯哒唑、诺考达唑、苯菌灵、多菌灵、奥苯达唑(奥芬达唑)、阿苯达唑、利苯达唑(阿苯达唑亚砜)、噻苯达唑、芬苯达唑、三氯苯达唑和氟苯达唑具有抗寄生虫作用，包括抗蠕虫和抗原生动物活性并作为微管抑制剂。这些微管抑制苯并咪唑类在动物细胞以及寄生虫中具有活性。还发现苯并咪唑类化合物具有与所有类型的癌症/肿瘤和其他增殖性疾病相关的额外作用机制。

如所述的，甲苯哒唑是一种苯并咪唑类化合物。甲苯哒唑(IUPAC名称：N-(6-苯甲酰-1H-苯并咪唑-2-基)氨基甲酸甲酯)已通过包括肿瘤细胞在内的哺乳动物细胞以及寄生虫中的微管抑制显示出具有有效的抗增殖活性。它还具有额外的作用机制和抗真菌活性。已经对甲苯哒唑及其药用特性进行了各种研究。

Dayan，Acta Tropica.，2003，86，141是对阿苯达唑、甲苯哒唑和吡喹酮的药代动力学和毒性的综述。

Dawson等，British Journal of Clinical Pharmacology，1982，14，453涉及甲苯哒唑在人体内的药代动力学和生物利用度。

Dawson等，British Journal of Clinical Pharmacology，1985，19，79涉及示踪剂量的[3H]-甲苯哒唑在人体内的药代动力学和生物利用度。

Cowan等，Intemational Journal for Parasitology：Drugs and DrugResistance，2016，6，159，涉及多形螺旋线虫(Heligmosomoidespolygyrus)和鼠鞭虫(Trichuris muris)在体外和体内暴露于阿苯达唑、阿苯达唑亚砜、甲苯哒唑和双羟萘酸甲嘧烯酚以阐明药物进入这些胃肠道线虫的途径。

WO2016/127168涉及用于治疗和预防肿瘤的甲苯哒唑多晶型物。

Luder等，European Journal of Clinical Pharmacology，1986，31，443涉及用高口服剂量的甲苯哒唑治疗包虫病。

Pawluk等，Clinical Pharmacokinetics，2015，54，371是与驱虫药阿苯达唑和甲苯哒唑的药代动力学药物-药物相互作用的综述。

Bekhti等，British Journal of Clinical Pharmacology，1987，24，390考虑了西咪替丁如何增加血清甲苯哒唑浓度。

Murray等，Xenobiotica，2001，31，135涉及甲基黄嘌呤的在体外对人CYP1A2活性的抑制：8-苯基茶碱的有效竞争性抑制。

赫尔辛基大学临床药理学系Karjalainen的2008年的学术论文涉及在体外和人体中CYP1A2介导的药物代谢的抑制。

Zhou等，Drug Metabolism Reviews，2009，41，89涉及人细胞色素P450(CYP)酶的多态性及其临床影响。

Braithwaite等，European Journal of Clinical Pharmacology，1982，22，161，涉及高剂量甲苯哒唑在接受囊性包虫病治疗的患者中的临床药代动力学。

Luder等，European Journal of Clinical Pharmacology，1986，31，443，涉及使用高剂量的甲苯哒唑治疗包虫病。

El-Khouly等，Frontiers in Oncology，2017，7，1涉及弥漫性内源性脑桥胶质瘤中的有效药物递送和甲苯哒唑的理化特性。

Joffe等，Frontiers in Microbiology，2017，8，535涉及甲苯哒唑针对新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)的抗真菌作用。

甲苯哒唑的低全身生物利用度限制了针对增殖性疾病(包括不同类型的癌症)以及针对寄生虫的临床治疗的发展。特别是，认为甲苯哒唑主要是生物利用度不足，因为通过胃肠道的吸收太差(随后吸收的甲苯哒唑在肝脏中首过代谢)，以致不适用于需要治疗浓度的活性药物甲苯哒唑的全身分布的治疗，例如增殖性疾病，包括不同的癌症以及许多寄生虫和真菌疾病。

发明概述

现在已经发现了通过与强或中等CYP1A2抑制剂联合给药改善了苯并咪唑类化合物甲苯哒唑的全身生物利用度。

因此，在第一个方面中，本发明提供了包含甲苯哒唑或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、N-氧化物、前药或活性代谢产物和强或中等细胞色素P450 1A2同工酶(CYP1A2)抑制剂的药物组合物。

在一些实施方案中，CYP1A2抑制剂是呋喃茶碱、环丙沙星、依诺沙星、氟伏沙明、扎鲁司特、8-苯基茶碱、甲氧沙林、噻苯达唑或美西律，或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、N-氧化物、前药或活性代谢产物。

在第二个方面中，本发明提供了包含甲苯哒唑和强或中等CYP1A2抑制剂的产品，用于通过疗法治疗人或动物受试者的方法中同时(simultaneous)、伴随(concurrent)、分开或按序使用。在第二个方面的一些实施方案中，该产品可以是第一个方面的药物组合物。

在第三个方面中，本发明提供了包含甲苯哒唑或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、N-氧化物、前药或活性代谢产物和强或中等CYP1A2抑制剂的药物组合物，用于通过疗法治疗人或动物受试者的方法中。

在第四个方面中，本发明提供了甲苯哒唑或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、N-氧化物、前药或活性代谢产物，用于通过疗法治疗人或动物受试者的方法中，该治疗方法包括同时、伴随、分开或按序给药强或中等CYP1A2抑制剂。

在第五个方面中，本发明提供了强或中等CYP1A2抑制剂，用于通过疗法治疗人或动物受试者的方法中，该治疗方法包括同时、伴随、分开或按序给药包含甲苯哒唑的药物组合物。

在第六个方面中，本发明提供了甲苯哒唑或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、N-氧化物、前药或活性代谢产物和强或中等CYP1A2抑制剂在制造用于通过疗法治疗人或动物受试者的药物中的用途。

在第七个方面中，本发明提供了甲苯哒唑或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、N-氧化物、前药或活性代谢产物在制造用于通过疗法治疗人或动物受试者的药物中的用途，所述疗法通过同时、伴随、分开或按序给药强或中等CYP1A2抑制剂。

在第八个方面中，本发明提供了强或中等CYP1A2抑制剂在制造用于通过疗法治疗人或动物受试者的药物中的用途，所述疗法通过同时、伴随、分开或按序给药甲苯哒唑或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、N-氧化物、前药或活性代谢产物。

在第九个方面中，本发明提供了通过疗法治疗人或动物受试者的方法，所述疗法包括同时、伴随、分开或按序给药甲苯哒唑或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、N-氧化物、前药或活性代谢产物和强或中等CYP1A2抑制剂。

此外，现在已经发现了胃肠道吸收差可能不是限制甲苯哒唑全身生物利用度的主要因素，而有限的全身生物利用度可能是由于CYP1A2代谢所致。本发明的第一至第九个方面通过将甲苯哒唑与强或中等CYP1A2抑制剂组合而能够提高甲苯哒唑的全身生物利用度。因此，本发明提供了一种能够全身暴露于具有抗增殖活性(包括抗癌活性、抗寄生虫活性和抗真菌活性)的甲苯哒唑的方法。

附图简述

图1显示了实施例3的在存在CYP1A2重组P450同工酶的情况下，甲苯哒唑的稳定性。

图2显示了实施例4的在不存在CYP1A2抑制剂的情况下，甲苯哒唑在人肝脏微粒体中的稳定性。

图3至5显示了实施例4的在存在3μM、10μM和30μM呋喃茶碱(强CYP1A2抑制剂)的情况下，甲苯哒唑在人肝脏微粒体中的稳定性。

图6至8显示了实施例4的在存在30μM、100μM和300μM西咪替丁(弱CYP1A2抑制剂)的情况下，甲苯哒唑在人肝脏微粒体中的稳定性。

图9显示了实施例5的在不存在CYP1A2抑制剂的情况下，甲苯哒唑在人肝细胞中的稳定性。

图10至12显示了实施例5的在存在3μM、10μM和30μM呋喃茶碱(强CYP1A2抑制剂)的情况下，甲苯哒唑在人肝细胞中的稳定性。

图13至15显示了实施例5的在存在30μM、100μM和300μM西咪替丁(弱CYP1A2抑制剂)的情况下，甲苯哒唑在人肝细胞中的稳定性。

图16显示了实施例6的在不存在CYP1A2抑制剂的情况下，甲苯哒唑在人肝细胞中的稳定性。

图17至19显示了实施例6的在存在10μM、30μM和100μM噻苯达唑(中等CYP1A2抑制剂)的情况下，甲苯哒唑在人肝细胞中的稳定性。

图20至22显示了实施例6的在存在10μM、30μM和100μM西咪替丁(弱CYP1A2抑制剂)的情况下，甲苯哒唑在人肝细胞中的稳定性。

图23显示了实施例7的在不存在CYP1A2抑制剂的情况下，甲苯哒唑在人肝细胞中的稳定性。

图24至27显示了实施例7的在存在10μM、30μM、100μM和300μM氟伏沙明(强CYP1A2抑制剂)的情况下，甲苯哒唑在人肝细胞中的稳定性。

图28至31显示了实施例7的在存在10μM、30μM、100μM和300μM美西律(中等CYP1A2抑制剂)的情况下，甲苯哒唑在人肝细胞中的稳定性。

图32和33显示了实施例9的8个成神经细胞瘤和13个肉瘤细胞系的甲苯哒唑浓度-反应曲线。

图34和35显示了实施例10的6个卵巢癌细胞系和6个肾癌细胞系的甲苯哒唑浓度-反应曲线。

发明详述

下面更详细地描述了本发明的某些特征。在以下描述中，本发明的第一至第九个方面通常统称为本发明的组合。

在以下描述中，本发明组合的术语“一种活性成分”或“多种活性成分”是指甲苯哒唑和强或中等CYP1A2抑制剂。

本发明组合的活性成分可以含有不对称或手性中心，并因此以不同的立体异构形式存在。除非另有说明，否则活性成分的所有立体异构形式，包括但不限于，非对映异构体、对映异构体和阻转异构体，及其混合物，如外消旋混合物，都旨在构成本发明组合的一部分。除非另有说明，含有一个或多个手性中心的活性成分可以以对映异构或非对映异构纯的形式，或以异构体混合物的形式使用。如果活性成分通过名称(例如INN或药物商品名)提及，并且如果该名称在制药领域通常被认为是指一种特定的非对映异构体、对映异构体或阻转异构体，则所提及的活性成分通常是指特定的非对映异构体、对映异构体或阻转异构体。

本发明组合的活性成分可以以不同的互变异构形式存在，且除非另有说明，否则所有这些形式都包含在本发明的范围内。术语“互变异构体”或“互变异构形式”是指不同能量的结构异构体，其可通过低能垒相互转化。例如，质子互变异构体(也称为质子转移互变异构体)包括通过质子迁移的互变，如酮-烯醇互变异构。价互变异构体包括通过重组一些键合电子而发生的互变。

固态的本发明组合的活性成分可以以不同的无定形或结晶形式(例如多晶型)存在，且除非另有说明，否则所有这些形式都包括在本发明的范围内。

如本文使用的，活性成分的药学上可接受的盐是指活性成分的盐，其可通过将活性成分与对于给药于人或动物受试者是可接受的碱或酸结合来制备。

如本文使用的，活性成分的药学上可接受的溶剂化物是指包含活性成分和对于给药于人或动物受试者是可接受的溶剂分子的固态复合物。活性成分可以溶解在溶剂中形成溶液，或可以悬浮在溶剂中形成悬浮液。溶液或悬浮液可以用作药物。

如本文使用的，活性成分的药学上可接受的水合物是指其中溶剂为水的溶剂化物。

如本文使用的，活性成分的药学上可接受的N-氧化物是指活性成分的氧化物，未氧化状态的该活性成分包括碱性胺或亚胺。

如本文使用的，活性成分的药学上可接受的前药是指给药于人或动物患者时在体内可以转化成活性成分的药学上可接受的物质。活性成分的前药可以通过用前-部分(pro-moiety)遮掩活性成分部分来形成。前药更详细地描述于Pro-drugs as Novel DeliverySystems，Vol.14，ACS Symposium Series(T.Higuchi和W.Stella)和BioreversibleCarriers in Drug Design，Pergamon Press，1987(编辑E.B.Roche，AmericanPharmaceutical Association)。

如本文使用的，药学上可接受的活性代谢产物是指将成分给药于人或动物受试者时在体内形成的并且具有所需药理活性的药学上可接受的物质。

如本文使用的，术语“苯并咪唑类化合物”是指包含苯并咪唑部分的药理活性化合物。本发明组合的甲苯哒唑通常具有抗增殖活性，包括抗癌活性和/或抗寄生虫活性和/或抗真菌活性。

将甲苯哒唑，包括其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、N-氧化物、前药和活性代谢产物，用于本发明的组合中。

使用重组人P450酶、人肝脏微粒体研究和人肝细胞研究，现在已经表明了甲苯哒唑被CYP1A2代谢。“被CYP1A2代谢”表示CYP1A2至少部分负责甲苯哒唑在体内的代谢。

在本发明组合的一些实施方案中，甲苯哒唑通过包括但不限于以下的一个或多个机制而具有活性：

-微管抑制

-细胞增殖的抑制

-血管生成的抑制

-TRAF2-和NCK-相互作用激酶(TNIK)的抑制

-干扰血管表皮生长因子受体2(VEGFR2)

-诱导凋亡

-金属蛋白酶的抑制

-对BCR-ALL激酶的活性

-对BRAF激酶的活性

-Hedgehog信号传导途径抑制

-诱导单核细胞样细胞的促炎(M1)表型

-抗真菌活性，包括抗隐球菌活性

例如，在Doudican等，Anticancer Drugs，2013，24，181；Nygren等，Acta Oncol，203，52，427；Pantziarka等，Ecancermedicalscience，2014，8，485；Tan等，ScientificReports，2016，6，33534；Blom等，Immunopharmacol Immunotoxicol，2017，39，199；De Witt等，Mol Med，2017，23，50；和Popovic等，Tropical Journal of PharmaceuticalResearch，2017，16，2555中，提出了一些可能的机制。

在本发明组合的一些实施方案中，甲苯哒唑在细胞活力测定中具有1μM或更低的对抗神经母细胞瘤、肉瘤、肾癌或卵巢癌衍生细胞系的IC₅₀。

甲苯哒唑在世界范围内被批准用作广谱胃肠道驱虫药已超过四十年(例如在美国自1974年开始和在英国自1977年开始)，其原始商品名为

(Janssen Inc.)。

甲苯哒唑有效地抑制增殖细胞，如使用各种肿瘤细胞系所证明的。甲苯哒唑的长期作用机制是通过动物包括哺乳动物细胞微管蛋白、蠕虫和原生动物微管蛋白的结合的微管抑制。

甲苯哒唑的抗寄生虫作用是由于其作为微管破坏剂的作用，可防止微管蛋白聚合，从而导致寄生虫死亡。微管蛋白对细胞分裂至关重要，且因此是几种广泛使用的化疗药物的癌症靶点，所述化疗药物包括紫杉醇、秋水仙碱和长春新碱。甲苯哒唑对微管蛋白聚合的抑制已在例如体外胶质母细胞瘤模型和黑素瘤模型中得到证实。后一项工作表明了对微管破坏的细胞凋亡反应是由Bcl-2磷酸化介导的。对黑素瘤的后续工作证实了这一结果，并且还表明了甲苯哒唑降低了X-连锁细胞凋亡抑制剂(XIAP)的水平。

其他提出的甲苯哒唑的作用机制包括TRAF2-和NCK-相互作用激酶(TNIK)抑制、通过干扰血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)的抗血管生成活性和金属蛋白酶活性的抑制。

甲苯哒唑似乎通过p53依赖性和非依赖性途径有效。例如，在肺癌细胞系中，发现甲苯哒唑治疗导致翻译后p53稳定以及p21和MDM2的下游表达。在p53缺失的肺癌细胞中，暴露于甲苯哒唑会导致细胞色素c积累、胱天蛋白酶-9和胱天蛋白酶-8的激活以及PARP和胱天蛋白酶原-3的裂解。这种p53状态的非依赖性在黑素瘤细胞的分析中也很明显，其中野生型和突变p53细胞系对甲苯哒唑都敏感。

甲苯哒唑已经显示出对人肺癌异种移植模型具有抗血管生成作用。

发现了甲苯哒唑与几种蛋白质激酶，包括BCR-ABL和BRAF相互作用。甲苯哒唑的诊断特异性活性的分析显示出在NCI60小组中80％的结肠癌细胞系中具有活性。随后测试了另外三个结肠癌细胞系和三个具有非恶性表型的细胞模型，证实了甲苯哒唑的选择性结肠癌活性。

根据下文实施例中报道的研究，甲苯哒唑现在也已显示出在多种神经母细胞瘤、肉瘤、卵巢肿瘤、肾肿瘤(包括表达P-gp的多重耐药性细胞系)中具有有效的体外抗癌活性。

然而，甲苯哒唑的全身生物利用度在受试者中是低的和/或可变的，观察到高的甲苯哒唑浓度患者间和患者内的可变性，并且直到现在，还不可能有效地开发甲苯哒唑作为临床有效的抗癌药物或作为治疗增殖性非癌症疾病的药物或作为有效治疗或更有效治疗全身性抗寄生虫病的药物，或作为抗真菌治疗。

甲苯哒唑可商购或可通过已知方法或通过与已知方法类似的方法制备。例如，甲苯哒唑可从商业供应商，包括

获得。

如下文所述的，已经发现了甲苯哒唑具有高被动渗透性，不是P-糖蛋白(P-gp)底物，不是乳腺癌耐药蛋白(BCRP)底物，也不是有机阴离子转运多肽1B1(OATP1B1)底物或有机阴离子转运多肽1B3(OATP1B3)底物。

本发明人现在已经令人惊讶地发现了甲苯哒唑被CYP1A2广泛代谢，且其在人肝脏微粒体和人肝细胞中的代谢受到中等和强CYP1A2抑制剂的显著抑制。

对于本发明，用苯并哒唑化合物，利苯达唑(阿苯达唑亚砜)进行了额外的研究。令人惊讶地，本发明人发现了如下文实施例8中所示的，与甲苯哒唑不同，苯并咪唑类化合物利苯达唑没有被CYP1A2同工型广泛代谢(与甲苯哒唑不同)，并且使用特异性/选择性和强CYP1A2抑制剂呋喃茶碱观察到存在零至仅中等的内在清除的抑制，与呋喃茶碱对甲苯哒唑的内在清除的强(>80％)CYP1A2抑制形成鲜明对比，如下文概括的。

CYP1A2抑制剂

以下更详细地描述本发明组合的CYP1A2抑制剂。以下描述适用于本发明的第一个至第九个方面中每一个的CYP1A2抑制剂。

CYP1A2抑制剂是中等CYP1A1抑制剂或强CYP1A2抑制剂。在一些实施方案中，CYP1A2抑制剂是中等CYP1A2抑制剂。在一些实施方案中，CYP1A2抑制剂是强CYP1A2抑制剂。优选，CYP1A2抑制剂是强CYP1A2抑制剂。

在现在进行的和下文概括的研究中，测试的所有中等或强CYP1A2抑制剂在离体人肝细胞中均显示出中等或强的甲苯哒唑代谢抑制。

如本文使用的，中等CYP1A2抑制剂是能够在这个CYP1A2代谢途径中实现50％至≤80％的甲苯哒唑(下文现在确立为CYP1A2底物)的离体人肝细胞中的内在清除(CL_int)抑制且预计在这个CYP1A2代谢途径中甲苯哒唑体内曲线下面积(AUC)将会提高两倍或更多且低于五倍的物质。其他敏感指数CYP1A2底物包括，例如，咖啡因、茶碱和替扎尼定。中等CYP1A2抑制剂的实例包括噻苯达唑、美西律和甲氧沙林。

美西律和噻苯达唑现在已作为中等CYP1A2抑制剂用于人肝细胞离体研究中。如下文所示，美西律和噻苯达唑是甲苯哒唑代谢的中等至强的CYP1A2抑制剂，在所进行的研究中证实甲苯哒唑是这些CYP1A2抑制剂的敏感底物。

根据药物标签，美西律是一种CYP1A2抑制剂。

噻苯达唑已被批准用于人用驱虫药，目前用作兽用(动物用)驱虫药。噻苯达唑在体内显示出抗肿瘤活性，并具有血管破坏特性(Cha等，Nat Med，2012，18，1754)。噻苯达唑对CYP1A2抑制的抑制常数(Ki)值为1.54μM，且对CYP1A2抑制的IC50值为0.83μM(Bapiro，Eur J Clin Pharmacol.，2005，61，755；Thelingwani等，Drug Metab Dispos.，2009，37，1286)。

如本文使用的，强CYP1A2抑制剂是能够在这个CYP1A2代谢途径中实现≥80％的甲苯哒唑(下文确立为CYP1A2底物)的离体人肝细胞中的内在清除(CL_int)抑制且预计在这个CYP1A2代谢途径中甲苯哒唑体内AUC将会提高五倍或更多的物质。

其他敏感指数CYP1A2底物包括咖啡因、茶碱和替扎尼定。强CYP1A2抑制剂的实例包括黄嘌呤衍生物，如呋喃茶碱和8-苯基茶碱，以及环丙沙星、依诺沙星、氟伏沙明、扎鲁司特。

呋喃茶碱和氟伏沙明现在已作为强CYP1A2抑制剂用于人肝细胞离体研究。如下文所示的，呋喃茶碱和氟伏沙明是甲苯哒唑代谢的强CYP1A2抑制剂，在所进行的研究中证实甲苯哒唑是这些CYP1A2抑制剂的敏感底物。

呋喃茶碱现已被用作离体人肝细胞和人肝脏微粒体中甲苯哒唑代谢的强CYP1A2抑制剂，使用弱CYP1A2抑制剂西咪替丁作为比较剂。

呋喃茶碱是一种CYP1A2抑制的非竞争性抑制剂，在人肝脏微粒体中对非那西丁-O-脱乙基酶活性的CYP1A2抑制的IC50值为0.027μM和0.07μM(Sesardic等，BristishJournal of Clinical P，1990，219，6；Obach等，Drug Metabolism and Disposition，2007，35，246)。呋喃茶碱已显示出是CYP1A2的选择性时间依赖性抑制剂。

氟伏沙明现在也被用作离体人肝细胞中甲苯哒唑代谢的强CYP1A2抑制剂。氟伏沙明先前已使用人肝脏微粒体显示出有效抑制CYP1A2非那西丁O-脱乙基化，其对CYP1A2抑制的IC50值为0.035μM和0.029μM，Ki为0.011μM(Obach等，Drug Metabolism andDisposition，2006，34，246和Karjalainen等，Basic&Clinical Pharmacology&Toxicology，2008，103，157)。根据药物标签，氟伏沙明在体外和体内是一种强CYP1A2抑制剂。

任何化合物，其能够在这个CYP1A2代谢途径中实现≥50％(例如，≥80％)的甲苯哒唑(下文确立为CYP1A2底物)的离体人肝细胞中的内在清除(CL_int)抑制且预计在这个CYP1A2代谢途径中甲苯哒唑的体内AUC将会提高2倍或更多(例如，5倍或更多)，被认为是强或中等CYP1A2抑制剂并可以用于本发明的组合中。强或中等CYP1A2抑制剂可以例如是已知具有强或中等CYP1A2抑制活性的化合物。然而，本发明的组合不限于此并且强或中等CYP1A2抑制剂可以是目前未知是强或中等CYP1A2抑制剂的已知物质，或其是强或中等CYP1A2抑制剂的新化合物。

在由United States Food and Drug Administration(US FDA)出版的DrugInteractions&Labelling-Drug Development and Drug Interactions:Table ofSubstrates,Inhibitors and Inducers，和由European Medicines Agency(EMA)出版的Guideline CPMP/EWP/560/95/Rev.1Corr.2,Committee for Human Medicinal Products(CHMP)中讨论了中等和强CYP1A2抑制剂。

在由United States Food and Drug Administration(US FDA)出版的DrugInteractions&Labelling-Drug Development and Drug Interactions:Table ofSubstrates,Inhibitors and Inducers中，美西律被归类为CYP1A2的中等临床抑制剂，氟伏沙明被归类为CYP1A2的强临床抑制剂，呋喃茶碱被归类为CYP1A2的选择性时间依赖性抑制剂。

如本文使用的，弱CYP1A2抑制剂是能够在这个CYP1A2代谢途径中实现≤50％的甲苯哒唑(下文建立为CYP1A2底物)的离体人肝细胞中的内在清除(CL_int)抑制且预计在这个CYP1A2代谢途径中甲苯哒唑的体内AUC血浆值将会提高少于2倍。根据上述强、中等和弱CYP1A2抑制剂的定义，本发明组合中的强或中等CYP1A2抑制剂不是弱CYP1A2抑制剂，或其盐、溶剂化物、水合物、N-氧化物、前药或活性代谢产物。

弱CYP1A2抑制剂包括西咪替丁，并在由United States Food and DrugAdministration(US FDA)出版的Drug Interactions&Labelling-Drug Development andDrug Interactions:Table of Substrates,Inhibitors and Inducers，和由EuropeanMedicines Agency(EMA)出版的Guideline CPMP/EWP/560/95/Rev.1Corr.2,Committeefor Human Medicinal Products(CHMP)中有讨论。

西咪替丁被归类为CYP1A2的弱抑制剂，并已用于下文概述的比较离体人肝细胞研究中，作为已经测试过的中等和强CYP1A2抑制剂的比较/参考弱CYP1A2抑制剂。

如下文所示的，西咪替丁对甲苯哒唑代谢的CYP1A2抑制，与所有测试的中等和强CYP1A2抑制剂相比，在离体人肝细胞中不会发生至任何显著程度(即弱抑制)，如提供的新数据所示的。

可用于本发明组合中的强或中等CYP1A2抑制剂包括但不限于黄嘌呤衍生物，如呋喃茶碱和8-苯基茶碱、环丙沙星、依诺沙星、氟伏沙明、扎鲁司特、甲氧沙林和美西律，及其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、N-氧化物、前药或活性代谢产物。

优选的CYP1A2抑制剂是强CYP1A2抑制剂，包括呋喃茶碱、氟伏沙明、噻苯达唑(下文显示为甲苯哒唑代谢的强抑制剂)、8-苯基茶碱、环丙沙星、依诺沙星和扎鲁司特，及其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、N-氧化物、前药或活性代谢产物。

呋喃茶碱是本发明组合中优选的CYP1A2抑制剂。

呋喃茶碱是20世纪80年代中期临床开发的甲基黄嘌呤衍生物，其最初旨在开发用于治疗呼吸系统疾病。呋喃茶碱是一种有效的时间依赖性CYP1A2抑制剂。根据下文实施例中报道的人肝细胞和人肝脏微粒体离体研究中，观察到强的浓度相关抑制，根据如上定义的强CYP1A2抑制剂的定义，现在已表明呋喃茶碱是甲苯哒唑代谢的强抑制剂。

在本发明的组合中，噻苯达唑也是优选的CYP1A2抑制剂。

根据如上定义的强CYP1A2抑制剂的定义，基于下文实施例中报道的研究，现已表明噻苯达唑是甲苯哒唑代谢的强抑制剂。此外，与甲苯哒唑一样，噻苯达唑是一种苯并咪唑药物，具有抗增殖作用，包括抗癌活性和抗寄生虫活性。因此，可以用本发明的甲苯哒唑-噻苯达唑组合观察到潜在的药效学(抗肿瘤和/或抗增殖功效)以及药代动力学(甲苯哒唑代谢的CYP1A2抑制)协同作用。

在本发明的组合中，氟伏沙明也是优选的CYP1A2抑制剂。

根据如上定义的强CYP1A2抑制剂的定义，基于下文实施例中报道的研究，现已表明氟伏沙明为甲苯哒唑代谢的强抑制剂。此外，氟伏沙明通过破坏肌动蛋白聚合导致胶质母细胞瘤的迁移和侵袭的抑制，从而显示出抗胶质母细胞瘤的抗肿瘤活性(Hayashi等，Scientific Reports，2016，6，23372)。正如针对甲苯哒唑已经讨论过的，甲苯哒唑对微管蛋白聚合的抑制已在体外胶质母细胞瘤模型中得到证实。因此，可以用本发明的甲苯哒唑-氟伏沙明组合观察到潜在的药效学(抗肿瘤和/或抗增殖功效)以及药代动力学(甲苯哒唑代谢的CYP1A2抑制)协同作用。

强或中等CYP1A2抑制剂可商购或可通过已知方法或通过与已知方法类似的方法制备。例如，呋喃茶碱、噻苯达唑和氟伏沙明可从商业供应商包括

获得。

治疗方法

下文更详细地讨论了通过治疗人或动物受试者的治疗方法。如本文使用的，术语“一种治疗方法”或“多种治疗方法”是指通过本发明第二个至第九个方面中的每一个的人或动物受试者的疗法进行的治疗。以下描述适用于本发明第二个至第九方面中的每一个的治疗方法。

通过将甲苯哒唑与强或中等CYP1A2抑制剂组合，本发明的组合可以提高甲苯哒唑的全身生物利用度。本发明的组合还可以通过降低个体受试者之间和基于受试者内部的甲苯哒唑的全身生物利用度的可变性来提高甲苯哒唑的全身生物利用度的可预测性并因此提高甲苯哒唑的功效/治疗活性。

因此，口服给药后甲苯哒唑可能比以前认为的更好地从胃肠道吸收，并且甲苯哒唑的全身利用度低，如在人中所见，可能是由于代谢(特别是在首过肝脏代谢过程中通过CYP1A2代谢)比以前想象的要大得多。因此，甲苯哒唑的全身生物利用度可以通过与强或中等CYP1A2抑制剂一起给药来提高。通过使用中等或强CYP1A2抑制剂而不是使用弱CYP1A2抑制剂来抑制甲苯哒唑的代谢，预期会减少甲苯哒唑全身治疗浓度的受试者(患者)内和受试者间可变性(如上所述，例如，Dayan，Acta Tropica.，2003，86，141)。暴露于饮食和环境化合物，包括例如香烟烟雾和诱导CYP1A2的口服避孕类固醇，可能会发生受试者内变化(Zhou等，2009年)。

本发明的组合可用于使甲苯哒唑能够全身性地实现所需的作用机制。因此，在一些实施方案中，所述治疗方法可以全身性地包括一种或多种机制，包括但不限于以下的：

-微管抑制

-细胞增殖的抑制

-血管生成的抑制

-TRAF2-和NCK-相互作用激酶(TNIK)的抑制

-干扰血管表皮生长因子受体2(VEGFR2)

-诱导凋亡

-金属蛋白酶的抑制

-对BCR-ALL激酶的活性

-对BRAF激酶的活性

-Hedgehog信号传导途径抑制

-诱导单核细胞样细胞的促炎(M1)表型

-抗真菌活性，包括抗隐球菌活性

在一些实施方案中，所述治疗方法可以是治疗通过作用于甲苯哒唑对其具有活性的生物靶标而易于改善的疾病的方法。通过作用于甲苯哒唑对其具有活性的生物靶标而易于改善的疾病包括但不限于血液学癌症、包括癌症和非癌症疾病的实体瘤、炎性疾病、纤维性疾病、痛风、肝硬化、硬皮病、银屑病、子宫内膜异位症和寄生虫病，包括蠕虫病(线虫、绦虫、吸虫)，例如钩虫病、棘球蚴病、蛔虫病、蛲虫病和旋毛虫病，以及棘头虫病和原生动物病，例如疟原虫属某些种、非洲锥虫、克氏锥虫、利什曼原虫属某些种、贾第鞭毛虫属某些种、阴道毛滴虫、溶组织内阿米巴、脑胞内原虫属某些种、卡氏棘阿米巴、双肠细胞虫和真菌病，例如新型隐球菌。

在一些实施方案中，癌症或非癌症肿瘤疾病可以选自支气管肿瘤、中枢神经系统癌症、中枢神经系统胚胎肿瘤、癌、急性髓系白血病(AML)、类癌瘤、阑尾癌、星形细胞瘤、脊索瘤、非典型畸胎瘤/横纹肌瘤、肉瘤、膀胱癌、甲状腺癌、原发性中枢神经系统系统(CNS)淋巴瘤、颅外生殖细胞肿瘤、食道癌、AIDS相关癌症、肝细胞(肝)癌、阴茎癌、胸膜肺母细胞瘤、胆囊癌、横纹肌肉瘤、华氏巨球蛋白血症、唾液腺癌、中枢神经系统生殖细胞肿瘤、浆细胞肿瘤、唇和口腔癌、睾丸癌、肝外胆管癌、导管原位癌(DCIS)、鼻咽癌、鼻腔和鼻窦癌、骨癌、乳腺癌、神经胶质瘤、毛细胞白血病、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、口腔癌、室管膜瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、妊娠滋养细胞疾病、眼癌、卡波西肉瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、胃的(胃)癌、胃肠道间质瘤(GIST)、乳头状瘤病、小肠癌、脑和脊髓肿瘤、华氏巨球蛋白血症、胰腺癌、咽癌、口咽癌、副神经节瘤、非黑素瘤皮肤癌、骨髓增生异常/骨髓增殖性肿瘤、鳞状细胞癌、恶性纤维组织细胞瘤、黑素瘤、Sézary综合征、默克尔细胞癌、垂体瘤、骨和骨肉瘤的恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、甲状旁腺癌、皮肤癌、蕈样真菌病、生殖细胞癌瘤、输卵管癌、眼内黑素瘤、白血病、胰腺神经内分泌肿瘤(胰岛细胞肿瘤)、子宫内膜癌、淋巴瘤、前列腺癌、肾盂和输尿管癌、骨肉瘤(骨癌)、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、基细胞癌、喉癌、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、阴道癌、鳞状颈癌、多发性骨髓瘤、涉及NUT基因的中线束癌、头颈癌、心脏癌病、眼内(眼)癌、肾细胞(肾)癌、骨恶性纤维组织细胞瘤、肝癌、直肠癌、结肠癌、恶性间皮瘤、低度恶性潜在肿瘤、口腔癌、软组织肉瘤、下咽癌、维尔姆斯肿瘤、上皮癌、尤文肉瘤家族肿瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)、视网膜母细胞瘤、霍奇金淋巴瘤、脑肿瘤、上皮神经母细胞瘤、胚胎性肿瘤、宫颈癌、慢性骨髓增殖性肿瘤、胰腺神经内分泌肿瘤、输尿管和肾盂癌、肛门癌、尿道癌、脑干癌、外阴癌、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、子宫肉瘤、胃(胃的)癌、脑干胶质瘤、多发性内分泌肿瘤综合征、骨髓增生异常综合征、颅咽管瘤、小细胞肺癌、唇和口腔癌、皮肤T细胞淋巴瘤、神经母细胞瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、乳腺癌、胃肠道类癌、鼻旁窦和鼻腔癌、嗜铬细胞瘤、隐匿性原发性转移性鳞状颈癌、男性乳腺癌、肾(肾的)癌、肺癌、胰岛细胞肿瘤、肝外胆管癌、子宫内膜癌、慢性骨髓增生性肿瘤、肾盂和输尿管移行细胞癌、胸腺瘤和胸腺癌、喉癌、尤文肉瘤、慢性粒细胞白血病(CML)、结直肠癌、结肠癌、心脏肿的(心脏)淋巴瘤、Burkit淋巴瘤、未知原发癌、肾上腺皮质癌、肾上腺皮质腺癌、肾上腺皮质腺瘤、中枢神经系统非典型畸胎瘤/横纹肌瘤、儿童癌症、非霍奇金淋巴瘤或和表达P-gp的多重耐药性肿瘤。在一些实施方案中，癌症可以是肉瘤、卵巢癌、肾(肾的)癌、黑素瘤、结直肠癌、结肠癌、肾上腺皮质癌、肾上腺皮质腺癌、肾上腺皮质腺瘤、表达P-gp的多重耐药性肿瘤、神经母细胞瘤、非癌症疾病、炎性疾病、纤维性化疾病、痛风、肝硬化、硬皮病、牛皮癣、子宫内膜异位症和寄生虫病，包括蠕虫病(线虫、绦虫、吸虫)，例如钩虫病、棘球蚴病、蛔虫病、蛲虫病和旋毛虫病、棘头虫病和原生动物病，例如疟原虫属某些种、非洲锥虫、克氏锥虫、利什曼原虫属某些种、贾第鞭毛虫属某些种、阴道毛滴虫、溶组织内阿米巴、脑胞内原虫属某些种、卡氏棘阿米巴、双肠细胞虫和真菌病，例如新型隐球菌。

在一些实施方案中，所述治疗方法的受试者可以是人。人可以是成人。人可以是其中CYP1A2同工酶是有活性的儿童，即使尚未达到成人的活性水平。世界卫生组织(WHO/CDS/CPE/PVC/2002.4，2002)指出甲苯哒唑的代谢和分解代谢在10至24个月大的儿童中达到成人的活性水平。因此，在一些实施方案中，人受试者可以是10个月或更大(例如24个月或更大)的儿童。在一些实施方案中，人受试者可以是具有CYP1A2活性证据的小于10个月的儿童。

在一些实施方案中，所述治疗方法的受试者可以是非人动物，例如，哺乳动物或鸟类。非人动物通常是其中表达CYP1A2的动物。其中表达CYP1A2的动物包括小鼠、大鼠、鹌鹑、兔子、鸡、猫、狗、羊、猪、牛、马和猴子，表明CYP1A2表达在动物物种中广泛保守。

本发明的组合可以以各种剂型给药，例如，口服，如以片剂、胶囊、糖衣或薄膜衣片剂、液体溶液或悬浮液，或肠胃外给药，例如肌内、静脉内或皮下。因此可以通过注射、输注或通过吸入或雾化给予所述组合。该组合优选通过口服给药。

本发明的组合优选用于(例如，适用于)口服给药。

本发明组合中的每种活性成分的剂量取决于各种因素，包括患者的年龄、体重和状况以及给药途径。日剂量可以在很宽的范围内变化，并将根据每种特定情况下的个体需求进行调整。然而，通常，将化合物单独给药于成人时，每种给药途径采用的剂量为0.0001至650mg/kg或0.001至650mg/kg，最常见的范围为0.001至75mg/kg、0.01至75mg/kg或0.001至10mg/kg体重。例如，将化合物单独给药于成人时，每种给药途径采用的剂量可以是0.05至25mg/kg或0.01至1mg/kg。例如，可以每天给予这样的剂量1至5次。对于静脉内注射，合适的日剂量为0.0001至50mg/kg体重、0.0001至10mg/kg体重或0.0001至1mg/kg体重。优选，对于静脉内注射，合适的日剂量为0.01至50mg/kg体重或优选0.05至25mg/kg体重。日剂量可以作为单一剂量或根据分开的剂量方案给药。单位剂量形式(如片剂或胶囊)通常将含有1-500mg或1-250mg的活性成分。例如，本发明组合的任一活性成分可以以1-1500mg、1-1000mg、1-500mg或100-250mg之间的剂量一天一次、一天两次或三次给药于人患者。非人动物的剂量可根据上文对人剂量的描述进行计算。

本发明组合中的强或中等CYP1A2抑制剂的剂量通常是为实现甲苯哒唑代谢的令人满意的抑制所需的最低剂量。本发明组合中的强或中等CYP1A2抑制剂的剂量通常低于如果CYP1A2抑制剂作为除CYP1A2抑制之外的用于治疗靶标的单一活性成分给药时所使用的剂量。以通常低于如果强或中等CYP1A2抑制剂作为单一活性成分给药的水平给药强或中等CYP1A2抑制剂的能力可以有利地减少由强或中等CYP1A2抑制剂引起的副作用。然而，在某些情况下，CYP1A2抑制剂(例如氟伏沙明或噻苯达唑)可能具有治疗活性(例如抗癌活性)，需要更高的剂量来实现额外的治疗活性，超越实现令人满意的甲苯哒唑代谢的CYP1A2抑制所需的剂量。在这种情况下，CYP1A2抑制剂的剂量可以增加到高于仅用于CYP1A2抑制所需的治疗水平。

本发明的药物组合物可以进一步包含药学上可接受的辅助剂、稀释剂或载体。选择和制备合适的药物制剂的常规程序描述于，例如Pharmaceuticals-The Science ofDosage Form Designs，M.E.Aulton，Churchill Livingstone，1988。

根据给药方式，所述药物组合物将优选包含0.05至99％w/w(重量百分比)，更优选0.05至80％w/w，还更优选0.10至70％w/w，且甚至更优选为0.10至50％w/w组合重量的活性成分，所有重量百分比均基于总组合物。本发明还提供了一种制备本发明的药物组合物的方法，该方法包括将上述活性成分与药学上可接受的辅助剂、稀释剂或载体混合。

本发明的组合可以以各种剂型给药。因此，它们可以口服给药，例如作为片剂、锭剂、含片、水性或油性悬浮液、溶液、可分散粉剂或颗粒剂。本发明的组合也可以肠胃外给药，无论是皮下、静脉内、肌内、胸骨内、经皮、通过输注技术还是通过吸入或雾化。该组合也可以作为栓剂给药。本发明的药物组合物的固体口服形式可以与活性化合物一起含有稀释剂，例如乳糖、右旋糖、蔗糖、纤维素、玉米淀粉或马铃薯淀粉；润滑剂，例如二氧化硅、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁或硬脂酸钙和/或聚乙二醇；粘合剂；例如淀粉、阿拉伯树胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮；分解剂，例如淀粉、海藻酸、海藻酸盐或羟基乙酸淀粉钠；泡腾混合物；染料；甜味剂；润湿剂，如卵磷脂、聚山梨醇酯、十二烷基硫酸盐；以及通常用于药物制剂中的无毒和无药理学活性物质。此类药物制剂可以以已知方式制造，例如，通过混合、制粒、压片、包糖衣或薄膜包衣工艺。用于口服给药的分散液可以是溶液、糖浆、乳液和悬浮液。所述糖浆可以含有例如蔗糖或蔗糖与甘油和/或甘露醇和/或山梨糖醇作为载体。

悬浮液和乳液可以含有例如天然树胶、琼脂、海藻酸钠、果胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、丙二醇或聚乙烯醇作为载体。用于肌内注射的悬浮液或溶液可以与活性化合物一起含有药学上可接受的载体，例如无菌水、橄榄油、油酸乙酯、甘醇类，例如丙二醇，且如果需要，还可含有适量的盐酸利多卡因。其他合适的用于悬浮液的载体包括无菌水、羟丙基-β-环糊精、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、聚山梨醇酯80、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、气雾剂AOT(即1,2-双(2-乙基己氧羰基)乙磺酸钠)、D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯、普朗尼克F127和/或captisol(即磺丁基醚-β-环糊精)。

例如，本发明的化合物可以配制成在载体中的水悬浮液或水溶液，该载体含有一种或多种以下浓度的赋形剂，如：

(i)0.5％w/v羟丙基甲基纤维素(HPMC)；

(ii)0.67％w/v聚丙烯吡咯烷酮(PVP)/0.33％w/v气雾剂AOT(即1,2-双(2-乙基己氧羰基)乙磺酸钠；

(iii)1％w/v普朗尼克F127；

(iv)30％w/v丙二醇；

(v)40％w/v羟丙基-β-环糊精；

(vi)40％w/vβ-环糊精；

(vii)40％w/v甲基-β-环糊精；

(viii)40％w/v captisol(即磺丁基醚-β-环糊精)。

(ix)0.5％w/v聚山梨醇酯80；和

(x)10％w/v聚乙二醇(PEG)

(xi)20％w/v D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯。

所述载体可以通过本领域技术人员已知的标准程序制备。例如，载体(i)至(xi)中的每一种可通过将所需量的赋形剂称重到合适的容器中，加入最终体积的约80％的水并磁力或机械搅拌直至形成溶液来制备。然后用水将载体补足体积。所述组合的活性成分的水悬浮液可以通过将所需量的每种活性成分称重到合适的容器中，加入所需体积100％的载体并磁力或机械搅拌来制备。注射或输注用溶液可以含有例如无菌水作为载体，或者优选它们可以是无菌、水性、等渗盐水溶液的形式。

本发明的某些实施方案

下面更详细地描述本发明的某些实施方案。除非另有说明，否则以下描述的实施方案适用于本发明的第一个至第九个方面中的每一个。

所述药物组合物包含甲苯哒唑或其药物学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、N-氧化物、前药或活性代谢产物和强或中等CYP1A2抑制剂。

在一些实施方案中：

-强或中等CYP1A2抑制剂是呋喃茶碱、噻苯达唑、氟伏沙明、8-苯基茶碱、环丙沙星、依诺沙星或扎鲁司特，或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、N-氧化物、前药或活性代谢产物。

在一些实施方案中：

-在细胞活力测定中，甲苯哒唑具有1μM或更低的针对神经母细胞瘤、肉瘤、肾癌或卵巢癌衍生的细胞系的IC₅₀；和

-强或中等CYP1A2抑制剂是呋喃茶碱或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、N-氧化物、前药或活性代谢产物。

在一些实施方案中：

-强或中等CYP1A2抑制剂是呋喃茶碱或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、N-氧化物、前药或活性代谢产物。

在一些实施方案中：

-强或中等CYP1A2抑制剂是噻苯达唑或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、N-氧化物、前药或活性代谢产物。

在一些实施方案中：

-强或中等CYP1A2抑制剂是氟伏沙明或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、N-氧化物、前药或活性代谢产物。

在一些实施方案中：

-强或中等CYP1A2抑制剂是呋喃茶碱。

在一些实施方案中：

-强或中等CYP1A2抑制剂是噻苯达唑。

在一些实施方案中：

-强或中等CYP1A2抑制剂是氟伏沙明。

在本发明的第二个至第九个方面的一些实施方案中：

-强或中等CYP1A2抑制剂是呋喃茶碱、噻苯达唑、8-苯基茶碱、环丙沙星、依诺沙星、氟伏沙明或扎鲁司特，或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、N-氧化物、前药或活性代谢产物；和

-所述治疗方法是治疗选自以下的疾病的方法：肉瘤、卵巢癌、肾癌、黑素瘤、结肠癌、肺癌、脑癌、肾上腺皮质癌、肾上腺皮质腺癌、肾上腺皮质腺瘤、表达P-gp的多重耐药性肿瘤、神经母细胞瘤、实体瘤疾病(包括癌症和非癌症疾病)、血液学癌症、炎性疾病、纤维性疾病、痛风、肝硬化、硬皮病、银屑病、子宫内膜异位症、寄生虫病，例如蠕虫病(线虫、绦虫、吸虫)，例如钩虫病、棘球蚴病、蛔虫病和蛲虫病，以及棘头虫病和任何原生动物疾病，例如疟原虫属某些种、非洲锥虫、克氏锥虫、利什曼原虫属某些种、贾第鞭毛虫属某些种、阴道毛滴虫、溶组织内阿米巴、脑胞内原虫属某些种、卡氏棘阿米巴、双肠细胞虫和任何真菌病，例如新型隐球菌。

在本发明的第二个至第九个方面的一些实施方案中：

-所述治疗方法是治疗选自以下的疾病的方法：肉瘤、卵巢癌、肾(肾的)癌、黑素瘤、结直肠癌、结肠癌、肺癌、脑癌、肾上腺皮质癌、肾上腺皮质腺癌、肾上腺皮质腺瘤、表达P-gp的多重耐药性肿瘤、神经母细胞瘤、实体瘤疾病(包括癌症和非癌症疾病)、血液学癌症、炎性疾病、纤维性疾病、痛风、肝硬化、硬皮病、银屑病、子宫内膜异位症、寄生虫病，例如蠕虫病(线虫、绦虫、吸虫)，例如钩虫病、棘球蚴病、蛔虫病和蛲虫病，以及棘头虫病和任何原生动物疾病，例如疟原虫属某些种、非洲锥虫、克氏锥虫、利什曼原虫属某些种、贾第鞭毛虫属某些种、阴道毛滴虫、溶组织内阿米巴、脑胞内原虫属某些种、卡氏棘阿米巴、双肠细胞虫和任何真菌病，例如新型隐球菌。

在本发明的第二个至第九个方面的一些实施方案中：

-强或中等CYP1A2抑制剂是呋喃茶碱、噻苯达唑或氟伏沙明；和

-治疗方法是治疗选自以下的疾病的方法：肉瘤、卵巢癌、肾(肾的)癌、黑素瘤、结直肠癌、结肠癌、肺癌、脑癌、肾上腺皮质癌、肾上腺皮质腺癌、肾上腺皮质腺瘤、表达P-gp的多重耐药性肿瘤、神经母细胞瘤、实体瘤疾病(包括癌症和非癌症疾病)、血液学癌症、炎性疾病、纤维性疾病、痛风、肝硬化、硬皮病、银屑病、子宫内膜异位症、钩虫病、棘球蚴病、蛔虫病、蛲虫病、棘头虫病、疟原虫属某些种、非洲锥虫、克氏锥虫、利什曼原虫属某些种、贾第鞭毛虫属某些种、阴道毛滴虫、溶组织内阿米巴、脑胞内原虫属某些种、卡氏棘阿米巴和双肠细胞虫。

在本发明的第二个至第九个方面的一些实施方案中：

-强或中等CYP1A2抑制剂是呋喃茶碱、氟伏沙明或噻苯达唑；和

-所述治疗方法是治疗选自以下的疾病的方法：肉瘤、卵巢癌、肾(肾的)癌、黑素瘤、结肠癌、肺癌、脑癌、肾上腺皮质癌、肾上腺皮质腺癌、肾上腺皮质腺瘤、表达P-gp的多重耐药性肿瘤和神经母细胞瘤。

在本发明的第二个至第九个方面的一些实施方案中：

-强或中等CYP1A2抑制剂是呋喃茶碱、噻苯达唑或氟伏沙明；和

-所述治疗方法是治疗选自以下的疾病的方法：实体瘤疾病(包括癌症和非癌症疾病)、血液学癌症、炎性疾病、纤维化疾病、痛风、肝硬化、硬皮病、银屑病和子宫内膜异位症。

在本发明的第二个至第九个方面的一些实施方案中：

-强或中等CYP1A2抑制剂是呋喃茶碱、噻苯达唑或氟伏沙明；和

-所述治疗方法是治疗选自以下的疾病的方法：钩虫病、棘球蚴病、蛔虫病、蛲虫病、棘头虫病、疟原虫属某些种、非洲锥虫、克氏锥虫、利什曼原虫属某些种、贾第鞭毛虫属某些种、阴道毛滴虫、溶组织内阿米巴、脑胞内原虫属某些种、卡氏棘阿米巴和双肠细胞虫，以及任何真菌病，例如新型隐球菌。

实施例

实施例1：研究甲苯哒唑是否是极化的Caco-2细胞单层中人外排转运蛋白P-gp和BCRP的底物

这个研究的目的是评估甲苯哒唑在极化的Caco-2细胞单层中作为人外排转运蛋白P-gp和BCRP底物的潜力。将测试化合物(在不存在和存在参考抑制剂的情况下为10μM)与极化的细胞单层孵育120min。通过LC-MS/MS来定量测试化合物的双向表观渗透率并用于确定流出比。

从与测试化合物一起运行的孵育测定在不存在和存在参考抑制剂的情况下的阳性对照底物的流出比，并证实了体外测试系统能够检测转运的底物。对于P-gp底物评估，在不存在(ER＝52.2)和存在(ER＝1.48)参考抑制剂的情况下获得的塔里洛尔的流出比证实了体外测试系统能够检测P-gp的底物。

计算的塔里洛尔、阿替洛尔和普萘洛尔的平均％回收值是可接受的。甲苯哒唑计算的平均％回收值范围为55.7至75.1％，表明不存在非特异性结合的重大问题。在不存在抑制剂的情况下，甲苯哒唑计算的平均％回收值A-B为55.7％，但无论整个研究中的回收如何，A-B Papp值都是一致的，这为结果的解释提供了信心。

甲苯哒唑的平均测定的A-B和B-A P_app值(cm/s×10^-6)分别为25.4和29.8，产生了1.17的流出比(表1)。在P-gp参考抑制剂维拉帕米存在的情况下，计算的流出比为1.16。这些结果证实了甲苯哒唑不是人P-gp转运蛋白的底物。

表1：在不存在和存在P gp参考抑制剂维拉帕米的情况下，测试化合物穿过Caco-2细胞单层的双向表观渗透性

对于BCRP底物评估，在不存在(ER＝128)和存在(ER＝1.96)参考抑制剂的情况下获得的3-硫酸雌酮的流出比证实了体外测试系统能够检测BCRP的底物。

计算的3-硫酸雌酮、阿替洛尔和普萘洛尔的平均％回收值是可接受的。甲苯哒唑计算的平均％回收值范围为52.0至75.7％，表明不存在非特异性结合的重大问题。在不存在抑制剂的情况下，甲苯哒唑计算的平均％回收值A-B为52.0％，但无论整个研究中的回收如何，A-B P_app值都是一致的，这为结果的解释提供了信心。

甲苯哒唑的平均A-B和B-A P_app值(cm/s×10^-6)分别为23.5和29.0，产生了1.23的流出比(表2)。在BCRP参考抑制剂烟曲霉震颤素C存在下，计算的流出率为1.25。这些结果证实了甲苯哒唑不是人BCRP转运蛋白的底物。表2：在不存在和存在BCRP参考抑制剂烟曲霉震颤素C(FTC)的情况下，测试化合物穿过Caco-2细胞单层的双向表观渗透性

在本研究中使用的体外细胞测试系统的测定条件下，甲苯哒唑具有高被动渗透性，并且已被确定不是P-gp或BCRP的底物。

这些数据表明，与先前在某些情况下所认为的相反，甲苯哒唑的口服吸收可能高于假设。正如在人中所见，甲苯哒唑的全身生物利用度降低可能是由于代谢程度比以前认为的要大得多。

实施例2：研究甲苯哒唑是否在瞬时转染的HEK293细胞中是人SLC转运蛋白OATP1B1和OATP1B3的底物

本研究的目的是评估甲苯哒唑在转染的HEK293细胞中作为人SLC转运蛋白(OATP1B1和OATP1B3)底物的潜力。将测试化合物(1和10μM)与表达SLC转运蛋白的HEK293细胞和对照(空载体)HEK293细胞孵育2min。通过LC-MS/MS定量测试化合物的吸收并用于确定吸收比。

从与测试化合物一起运行的孵育测定了阳性对照底物的吸收比并证实了体外测试系统能够检测转运的底物。针对[3H]-雌二醇17β-D-葡萄糖醛酸苷获得的吸收比证实了体外测试系统能够检测OATP1B1的底物。计算的1μM和10μM甲苯哒唑的吸收比分别为0.9和0.9，证实了甲苯哒唑不是人OATP1B1转运蛋白的底物(表3)。

针对[3H]-雌二醇17β-D-葡萄糖醛酸苷获得的吸收比证实了体外测试系统能够检测OATP1B3的底物。计算的1μM和10μM甲苯哒唑的吸收比分别为1.1和1.1，证实了甲苯哒唑不是人OATP1B3转运蛋白的底物(表4)。

表3：甲苯哒唑在OATP1B1和空载体(对照)转染的HEK293细胞中的吸收率

表4：甲苯哒唑在OATP1B3和空载体(对照)转染的HEK293细胞中的吸收率

在本研究中利用的体外转染细胞测试系统的当前测定条件下，甲苯哒唑已被确定不是OATP1B1或OATP1B3的底物。

OATP1B1是一种专门在肝细胞窦侧上表达的吸收转运蛋白，且负责药物的肝脏吸收。OATP1B3是一种专门在小叶中心肝细胞的正弦(基底外侧)侧上表达的吸收转运蛋白。它与OATP1B1一起负责某些药物的肝脏吸收。

实施例3：使用重组酶研究测试化合物甲苯哒唑的细胞色素P450反应表型分型

这个研究的目的是确定测试化合物甲苯哒唑在CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4重组细胞色素P450酶存在下的稳定性。

在加入NADPH(终浓度1mM)来启动反应之前，将用于每个P450同工型的Bactosomes^TM、0.1M磷酸盐缓冲液pH7.4和测试化合物(最终底物浓度5μM)在37℃下预孵育。还使用对照Bactosomes^TM(不存在P450酶)进行孵育以显示任何非酶促降解。包括已知被每个P450同工型特异性代谢的对照化合物。对每种测试化合物单独进行所有孵育。将每个化合物与每个同工型孵育0、5、15、30和45min，并使用LC-MS/MS进行分析。对照化合物在测定中表现如预期。甲苯哒唑的结果见表5，且对于CYP1A2，特别呈现于图1中。

甲苯哒唑在CYP1A2和CYP2C19重组酶存在下的半衰期分别为13.3min和93.0min。在CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2D6或CYP3A4重组酶存在的情况下，很少或没有甲苯哒唑的周转半衰期((t_1/2)>135min，化合物剩余％>87.5％)。

表5：针对甲苯哒唑的细胞色素P450反应表型分型数据

甲苯哒唑在CYP1A2重组P450同工型存在下的稳定性显示于图1中。

总之，甲苯哒唑通过CYP1A2的重组酶代谢，且在较小程度上通过CYP2C19代谢，但不是通过CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2D6或CYP3A4(半衰期值>135min)。

实施例4：在不存在和存在抑制剂西咪替丁和呋喃茶碱的情况下，研究测试化合物甲苯哒唑在人肝脏微粒体中的稳定性

这个研究的目的是确定和比较评估甲苯哒唑在不存在抑制剂和存在抑制剂西咪替丁(30、100和300μM)或呋喃茶碱(3、10和30μM)的情况下在人肝脏微粒体中的稳定性。

对于代谢稳定性研究，在加入NADPH以启动反应之前，将人肝脏微粒体(最终蛋白质浓度0.5mg/mL)、0.1M磷酸盐缓冲液pH7.4和甲苯哒唑或非那西丁(最终底物浓度1μM)在37℃下预孵育(终浓度1mM)。对于每个测试的化合物都包括负辅因子对照孵育，其中添加了0.1M磷酸盐缓冲液pH7.4，而不是NADPH(减去NADPH)。每个测试化合物孵育0、5、15、30和45min。对照(减去NADPH)仅孵育45min。使用LC-MS/MS针对甲苯哒唑或非那西丁分析了样品。

在不存在抑制剂的情况下，甲苯哒唑在人肝脏微粒体中的内在清除(CL_int)值为22.2μL/min/mg蛋白质。

非那西丁是一种CYP1A2探测底物，在没有抑制剂的情况下，人肝脏微粒体中的内在清除值为22.4μL/min/mg蛋白质。

对于通过化学抑制剂(呋喃茶碱和西咪替丁)的细胞色素P450反应表型分型，在加入NADPH(最终浓度1mM)以启动反应之前，将人肝脏微粒体(最终蛋白质浓度0.5mg/mL)、特异性抑制剂(最终甲醇浓度0.08％)、0.1M磷酸盐缓冲液pH7.4和甲苯哒唑或非那西丁(最终底物浓度1μM)在37℃下预孵育。将测试化合物(甲苯哒唑或CYP1A2底物，非那西丁)在没有抑制剂和存在每种特定抑制剂浓度的情况下孵育。对于每个测试的化合物包括了负辅因子对照孵育，其中添加了0.1M磷酸盐缓冲液pH7.4，替代了辅因子(减去NADPH)。特异性抑制剂是西咪替丁(pan P450抑制剂，终浓度为30、100和300μM)和呋喃茶碱(CYP1A2的时间依赖性抑制剂，终浓度为3、10和30μM)。每个测试化合物孵育0、5、15、30和45min。对照(减去NADPH)仅孵育45min。使用LC-MS/MS针对甲苯哒唑或非那西丁分析了样品。

甲苯哒唑清除在西咪替丁存在下呈现出轻微但仍是剂量依赖性降低，在30、100和300μM西咪替丁存在下，内在清除值分别为18.0、17.8和15.0μL/min/mg蛋白质。

非那西丁清除在西咪替丁存在下呈现出轻微但仍是剂量依赖性降低，在30、100和300μM西咪替丁存在下，内在清除值分别为21.2、17.6和13.9μL/min/mg蛋白质。

甲苯哒唑清除在呋喃茶碱存在下呈现出明显的剂量依赖性降低，在3、10和30μM呋喃茶碱存在下，内在清除值分别为2.84、0.232和0.336μL/min/mg蛋白质。

非那西丁清除在呋喃茶碱存在下呈现出剂量依赖性降低，在3、10和30μM呋喃茶碱存在下，内在清除值分别为3.49、2.58和2.71μL/min/mg蛋白质。

这个研究的结果概括于表6和图2至8中。

表6：针对甲苯哒唑和对照化合物非那西丁的反应表型分型(使用化学抑制剂西咪替丁和呋喃茶碱)数据

总之，在强CYP1A2抑制剂呋喃茶碱的存在下，甲苯哒唑在人肝脏微粒体中的清除降低(96倍(99％的内在清除抑制))。在西咪替丁存在下，甲苯哒唑在人肝脏微粒体中的清除降低的程度要小得多(1.5倍(32％的内在清除抑制))。

实施例5：研究测试化合物甲苯哒唑在不存在和存在抑制剂西咪替丁和呋喃茶碱的情况下在人冷冻保存的肝细胞中的稳定性

这个研究的目的是研究测试化合物甲苯哒唑在不存在抑制剂和存在西咪替丁(30、100或300μM)或呋喃茶碱(3、10或30μM)下，在人冷冻保存的肝细胞的存在下的稳定性。

对于肝细胞稳定性研究，在加入冷冻保存的肝细胞悬浮液以启动反应之前，将补充了2mM L-谷氨酰胺和25mM HEPES的Williams E培养基与测试化合物(最终底物浓度1μM；最终DMSO浓度0.25％)在37℃下预孵育(在补充了2mM L-谷氨酰胺和25mM HEPES的Williams E培养基中的最终细胞密度为0.5×10⁶活细胞/mL)。最终孵育体积为500μL。每个物种包括两种对照化合物，以及适当的载体对照。

通过在适当的时间点(0、5、10、20、40和60min)将50μL孵育液转移到100μL含有内标的乙腈中停止反应。终止平板在4℃下以2500rpm离心30min来沉淀蛋白质。使用LC-MS/MS针对甲苯哒唑或乙氧基香豆素分析了样品。

在人冷冻保存的肝细胞存在下，甲苯哒唑的内在清除值为19.1μL/min/10⁶个细胞。

对于在抑制剂存在情况下的肝细胞稳定性研究，在加入冷冻保存的肝细胞悬浮液以启动反应之前，将补充了2mM L-谷氨酰胺和25mM HEPES的Williams E培养基、测试化合物(最终底物浓度1μM；最终DMSO浓度0.25％)和选定的CYP抑制剂(最终甲醇浓度0.08％)在37℃下预孵育(在补充了2mM L-谷氨酰胺和25mM HEPES的Williams E培养基中的最终细胞密度为0.5×10⁶活细胞/mL)。最终孵育体积为500μL。测试化合物在不存在抑制剂和存在西咪替丁(pan P450抑制剂，最终浓度为30、100和300μM)和呋喃茶碱(CYP1A2的特异性抑制剂，最终浓度为3、10和30μM)的情况下孵育。

包括用于CYP1A2的阳性对照化合物乙氧基香豆素。阳性对照化合物在没有抑制剂和存在每种需要的抑制剂的情况下进行孵育。通过在适当的时间点(0、5、10、20、40和60min)将50μL孵育液转移到100μL含有内标的乙腈中停止反应。终止平板在4℃下以2500rpm离心30min来沉淀蛋白质。使用LC-MS/MS针对甲苯哒唑或乙氧基香豆素分析了样品。

在测定中包括了两种对照化合物，并且如果这些化合物的值不在规定的范围内，则拒绝结果并重复实验。

在不存在抑制剂的情况下，在存在人冷冻保存的肝细胞的情况下，甲苯哒唑产生了13.3μL/min/10⁶个细胞的内在清除值。

使用30、100和300μM西咪替丁，在存在人冷冻保存的肝细胞的情况下，甲苯哒唑分别产生了13.2、14.7和9.98μL/min/10⁶个细胞的内在清除值。

使用3、10和30μM呋喃茶碱，在存在人冷冻保存的肝细胞的情况下，甲苯哒唑分别产生了3.47、2.43和1.47μL/min/10⁶个细胞的内在清除值。

表7：针对甲苯哒唑和对照化合物的肝细胞稳定性(不存在化学抑制剂)数据

总之，冷冻保存的人肝细胞对甲苯哒唑的代谢在CYP1A2抑制剂呋喃茶碱的存在下显著降低(9.1倍(内在清除的89％抑制))，而在西咪替丁的存在下降低的程度要小得多(1.3倍(内在清除的25％抑制))。与没有任何抑制剂的情况下的104分钟相比，甲苯哒唑的半衰期在西咪替丁存在下长达139分钟，而在呋喃茶碱存在下长达941分钟。

实施例6：研究测试化合物甲苯哒唑在不存在和存在抑制剂西咪替丁和噻苯达唑的情况下在人冷冻保存的肝细胞中的稳定性

这个研究的目的是为了确定测试化合物甲苯哒唑在不存在和存在西咪替丁(30、100和300μM)和噻苯达唑(10、30和100μM)的情况下在存在人冷冻保存的肝细胞的情况下的稳定性。

在不存在和存在30、100和300μM西咪替丁和10、30和100μM噻苯达唑的情况下，将甲苯哒唑(1μM)与冷冻保存的人肝细胞孵育60分钟，并在所需的时间点取样。通过LC-MS/MS分析了每个时间点剩余的测试化合物的量。还将合适的对照化合物与乙氧基香豆素一起孵育，乙氧基香豆素在不存在和存在西咪替丁和噻苯达唑的情况下孵育。

在肝细胞稳定性研究中，在加入冷冻保存的肝细胞悬浮液以启动反应之前，将补充了2mM L-谷氨酰胺和25mM HEPES的Williams E培养基、测试化合物(最终底物浓度1μM；最终DMSO浓度0.25％)和在合适的情况下选定的抑制剂(30、100和300μM西咪替丁或10、30和100μM噻苯达唑，最终甲醇浓度0.08％)在37℃下预孵育(在补充了2mM L-谷氨酰胺和25mM HEPES的Williams E培养基中的最终细胞密度为0.5×10⁶活细胞/mL)。最终孵育体积为500μL。包括两种对照化合物，连同合适的载体对照一起。包括了用于CYP1A2的阳性对照化合物乙氧基香豆素。在没有抑制剂和存在每种抑制剂的情况下孵育了阳性对照化合物。通过在适当的时间点(0、5、10、20、40和60min)将50μL孵育液转移到100μL含有内标的乙腈中停止反应。终止平板在4℃下以2500rpm离心30min来沉淀蛋白质。

在测定中包括了两种对照化合物，并且如果这些化合物的值都不在规定的范围(在适用的情况下)内，则拒绝结果并重复实验。

阳性对照化合物在测定中的行为如预期的并且所有内在清除值在适用情况下的可接受范围内。

通过来自人的冷冻保存的肝细胞代谢甲苯哒唑。在人冷冻保存的肝细胞中，在不存在抑制剂的情况下，甲苯哒唑产生了15.0±0.658μL/min/10⁶细胞的内在清除值。

在人冷冻保存的肝细胞中，在存在30、100和300μM西咪替丁的情况下，甲苯哒唑分别产生了12.2±0.697、12.1±1.98和12.3±1.37μL/min/10⁶细胞的内在清除值，在存在10、30和100μM噻苯达唑的情况下，甲苯哒唑分别产生了2.33±0.764、3.90±0.375和-2.80±1.50μL/min/10⁶细胞的内在清除值。结果显示于表8和表9以及图16至22中。

表8：针对乙氧基香豆素(阳性对照)和对照化合物的肝细胞稳定性数据

n＝用于拟合曲线的时间点的数量；SE＝曲线拟合的标准误差

a排除了40和60分钟时间点。

表9：针对甲苯哒唑的肝细胞稳定性数据

n＝用于拟合曲线的时间点的数量；SE＝曲线拟合的标准误差

总之，甲苯哒唑的代谢在存在CYP1A2抑制剂噻苯达唑(6.4倍(内在清除的84％抑制))的情况下显著降低，在存在西咪替丁的情况下降低至更低程度(1.2倍(内在清除的19％抑制))。甲苯哒唑的半衰期在西咪替丁的存在下长达115分钟，在噻苯达唑的存在下长达596分钟，相比之下，在没有任何抑制剂的情况下为92.4分钟。

实施例7：研究测试化合物甲苯哒唑在不存在和存在抑制剂西咪替丁、氟伏沙明或美西律的情况下在人冷冻保存的肝细胞中的稳定性

这个研究的目的是确定测试化合物甲苯哒唑在不存在和存在选定的抑制剂(西咪替丁、氟伏沙明或美西律)的情况下在存在人冷冻保存的肝细胞的情况下的稳定性。

在不存在和存在选定的抑制剂(西咪替丁、氟伏沙明或美西律)的情况下，将甲苯哒唑(1μM)与人冷冻保存的肝细胞孵育60min，并在所需的时间点取样。通过LC-MS/MS分析了每个时间点剩余的测试化合物的量。还孵育了合适的对照化合物。

阳性对照化合物在测定中的行为如预期的并且所有内在清除值都在适用情况下的可接受范围内。

通过冷冻保存的人肝细胞代谢甲苯哒唑。甲苯哒唑的代谢在西咪替丁的存在下没有降低。在最初的实验中，在30μM氟伏沙明和10μM美西律下甲苯哒唑的代谢分别降低2.3倍和2.7倍。在10至300μM的浓度下，使用冷冻保存的人肝细胞进行的进一步的验证实验显示出在氟伏沙明(如在10μM下看到的高达20.2倍)和美西律(如在30μM下看到的高达7.8倍)的存在下代谢显著降低。甲苯哒唑的半衰期在氟伏沙明的存在下长达1840分钟，而在美西律的存在下长达713分钟，与此相比，在没有任何抑制剂下为91.4分钟。

在这些肝细胞稳定性研究中，在加入冷冻保存的肝细胞的悬浮液(在补充了2mML-谷氨酰胺和25mM HEPES的Williams E培养基中的最终细胞密度为0.5×10⁶活细胞/mL)以启动反应之前，将补充了2mM L-谷氨酰胺和25mM HEPES的Williams E培养基、测试化合物(最终底物浓度1μM；最终DMSO浓度0.25％)和在合适的情况下选定的抑制剂(最终甲醇浓度0.08％)在37℃下预孵育。最终孵育体积为500μL。包括了合适的对照化合物，连同合适的载体对照一起。抑制剂和浓度的详细内容显示于以下的表10中。

表10：人肝细胞的抑制剂和浓度条件

通过在适当的时间点(0、5、10、20、40和60min)将50μL孵育液转移到100μL含有内标的乙腈中停止反应。终止平板在4℃下以2500rpm离心30min来沉淀蛋白质。

在测定中包括了两种对照化合物，并且如果这些化合物的值不在规定的范围(在适用的情况下)内，则拒绝结果并重复实验。

在初步研究中，阳性对照化合物在测定中的行为如预期的并且所有内在清除值都在适用情况下的可接受范围内。在人冷冻保存的肝细胞中，在不存在抑制剂的情况下，甲苯哒唑产生了12.1±0.601μL/min/10⁶细胞的内在清除值。

在人冷冻保存的肝细胞中，在30、100和300μM西咪替丁的情况下，甲苯哒唑分别产生了24.8±1.82、18.0±1.19和24.8±2.36μL/min/10⁶细胞的内在清除值，在存在3、10和30μM氟伏沙明的情况下，甲苯哒唑分别产生了8.14±1.53、10.8±2.32和5.37±1.75μL/min/10⁶细胞的内在清除值和在存在10、30和100μM美西律的情况下，甲苯哒唑分别产生了4.53±1.46、10.5±1.65和11.6±1.04μL/min/10⁶细胞的内在清除值。结果显示于表11中。

表11：初步研究：针对使用和未用抑制剂的甲苯哒唑的人肝细胞稳定性

n＝用于拟合曲线的时间点的数量；SE＝曲线拟合的标准误差

在验证研究中，阳性对照化合物在测定中的行为如预期的并且所有内在清除值都在适用情况下的可接受范围内。在人冷冻保存的肝细胞中，在不存在抑制剂的情况下，甲苯哒唑产生了15.2±3.84μL/min/10⁶细胞的内在清除值。

在人冷冻保存的肝细胞中，在存在10、30、100和300μM氟伏沙明的情况下，甲苯哒唑分别产生了0.751±2.16、4.91±1.93、-1.99±4.70和6.16±1.70μL/min/10⁶细胞的内在清除值和在存在10、30、100和300μM美西律的情况下，甲苯哒唑分别产生了10.2±0.458、1.94±0.917、4.37±1.28和2.08±1.80μL/min/10⁶细胞的内在清除值。结果显示于表12和图23至31中。

表12：验证研究：针对使用和未用抑制剂的甲苯哒唑的人肝细胞稳定性

n＝用于拟合曲线的时间点的数量；SE＝曲线拟合的标准误差

在冷冻保存的人肝细胞中，在西咪替丁的存在下，甲苯哒唑的代谢没有降低。在10至300μM的浓度下，使用冷冻保存的人肝细胞的验证实验显示出在氟伏沙明(在10μM下看到高达20.2倍(内在清除的95％抑制))和美西律(在30μM下看到高达7.8倍(内在清除的87％抑制))的存在下代谢显著降低。甲苯哒唑的半衰期在氟伏沙明的存在下长达1840分钟和在美西律的存在下长达713分钟，与此相比，在没有任何抑制剂的情况下为91.4分钟。

实施例8：研究测试化合物利苯达唑(阿苯达唑亚砜)在不存在和存在抑制剂西咪替丁和呋喃茶碱的情况下在人微粒体中的稳定性，以及利苯达唑的细胞色素反应表型分型

本研究的目的是确定测试化合物利苯达唑(阿苯达唑亚砜)在存在和不存在抑制剂西咪替丁和呋喃茶碱情况下，在人肝脏微粒体存在下的稳定性，并确定利苯达唑在存在重组酶CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4情况下的稳定性。

为了优化代谢稳定性条件，将利苯达唑与人肝脏微粒体(1μM，0.5mg/mL和0.1μM，1mg/mL)和NADPH孵育45min，并在所需的时间点取样。通过LC MS/MS分析了每个时间点剩余的测试化合物的量。还进行了不存在NADPH的孵育以评估非CYP介导的稳定性。还孵育了适当的对照化合物。

对于优化方法，阳性对照化合物在测定中表现如预期，所有内在清除值都在可接受的范围内。

以1μM和0.5mg/mL蛋白质测试时，利苯达唑的内在清除值为4.39±2.77μL/min/mg蛋白质。以0.1μM和1mg/mL蛋白质测试时，利苯达唑的内在清除值为6.63±1.84μL/min/mg蛋白质。

优化后，在加入测试化合物(最终的利苯达唑底物浓度为0.1μM；最终DMSO浓度为0.25％)以启动反应之前，将人肝脏微粒体(最终蛋白质浓度1mg/mL)、0.1M磷酸盐缓冲液pH7.4和NADPH(最终浓度为1mM)在37℃下预孵育。对于每种测试的化合物都包括负辅因子对照孵育，其中添加了0.1M磷酸盐缓冲液pH7.4，替代了NADPH(减去NADPH)。在不存在抑制剂和存在西咪替丁(30、100或300μM)或呋喃茶碱(3、10或30μM)的情况下进行孵育。包括对照化合物(非那西丁)(如上所述在未用和使用抑制剂的情况下孵育)。对每种测试化合物单独进行所有孵育。每次孵育进行0、5、15、30和45min。对照(减去NADPH)仅孵育45min。通过在适当的时间点以1:3的比例将孵育液转移到乙腈中来停止反应。终止平板在4℃下以3,000rpm离心20min以沉淀蛋白质。通过LC MS/MS分析了每个时间点剩余的测试化合物的量。

评估了相关对照化合物，确保内在清除值落入指定的范围内。阳性对照化合物在测定中的行为如预期的。

在不存在抑制剂的情况下，利苯达唑产生了2.83±1.76μL/min/mg蛋白质的内在清除值。

在存在30、100和300μM西咪替丁的情况下，利苯达唑分别产生了3.15±1.24、3.43±1.56和3.54±1.09μL/min/mg蛋白质的内在清除值。

在存在3、10和30μM呋喃茶碱的情况下，利苯达唑分别产生了1.27±2.47、4.31±2.48和2.92±1.75μL/min/mg蛋白质的内在清除值。

表13：微粒体代谢稳定性利苯达唑数据(抑制剂方法)

对于反应表型分型测定，在加入NADPH(终浓度1mM)来启动反应之前，将Bactosomes^TM、0.1M磷酸盐缓冲液pH7.4和测试化合物(最终利苯达唑底物浓度1μM；最终DMSO浓度0.25％)在37℃下预孵育。还使用对照Bactosomes^TM(不存在P450酶)进行了孵育以显示任何非酶促降解。包括已知被每个P450同工型特异性代谢的对照化合物。对每种测试化合物单独进行所有孵育。将每个化合物与每个同工型孵育0、5、15、30和45min。在合适的时间点，通过将等分孵育液转移至淬灭溶剂以1:3的比例来停止反应。终止平板在4℃下以3,000rpm离心20min以沉淀蛋白质。通过LC MS/MS分析了每个时间点剩余的测试化合物的量。

阳性对照化合物在测定中表现如预期，且所有内在清除值都在可接受的范围内。在存在CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4重组酶的情况下，利苯达唑分别产生了240±38.1、272±160、618±650、465±273和489±682min的半衰期值。利苯达唑没有被CYP2B6或CYP2C8重组酶代谢。

表14：反应表型分型利苯达唑数据

同工型	t1/2(min)	SE t<sub>1/2</sub>(min)	n
				1A2	240	38.1	5
2B6	-1760	5720	5
				2C8	-423	90.0	5
2C9	272	160	5
				2C19	618	650	5
2D6	465	273	5
				3A4	489	682	5

n＝用于拟合曲线的时间点的数量；SE＝曲线拟合的标准误差

综上所述，利苯达唑在人肝脏微粒体中的转化率较低，并且在添加特定抑制剂(西咪替丁和呋喃茶碱)后几乎没有观察到效果；因此，CYP1A2对利苯达唑代谢的贡献尚无定论。利苯达唑在重组酶中表现出低周转；因此，特定CYP同工型对利苯达唑代谢的贡献尚无定论，尽管有一些证据表明CYP1A2的周转有限(45min保留85％，并考虑到240±38.1的半衰期值)。

实施例9：使用神经母细胞瘤和肉瘤衍生的细胞系对体外抗癌活性进行二维单层筛选

17种化合物，包括甲苯哒唑(批号no.MKCC1885，Sigma-Aldrich，100％纯)，通过使用2D单层分析在一组8个选定的神经母细胞瘤(NBXF)和13个选定的肉瘤(SXF)衍生的细胞系中进行了体外测试。在10个以半对数增量至100μM的浓度下测试了化合物，并将细胞处理72小时。使用CellTiter-

细胞活力测定评估化合物的功效。抗肿瘤活性表示为绝对和相对IC₅₀和IC₇₀值，通过非线性回归分析来计算。

结果显示于表15和16以及图32和33中。通过分别呈现0.28和0.291μM的相对和绝对几何平均IC₅₀值，甲苯哒唑显示出在所有测试的细胞系中的最高效力。

表15甲苯哒唑针对8个神经母细胞瘤(NBXF)和13个肉瘤(SXF)细胞系的IC₅₀和IC₇₀值(μM)

表16针对8个神经母细胞瘤和13个肉瘤细胞系的每个甲苯哒唑测试浓度(μM)下的测试/对照值(％)

NBXF神经母细胞瘤；SXFE Ewing肉瘤；SXFO骨肉瘤；SXFS软组织肉瘤

实施例10：测试甲苯哒唑针对12个细胞系(6个卵巢和6个肾脏)，包括表达P-gp的、多重耐药的OVXF 899L和RXF 486L PDX衍生的细胞系

使用2D单层测定，在一组12个卵巢和肾癌的肿瘤细胞系中体外测试了甲苯哒唑。在这个研究中，使用了PDX衍生的细胞系和公众可获得的卵巢癌(n＝6，OVXF1023L、OVXF899L、A2780、OVCAR-3、OVCAR-5、SK-OV-3)和肾癌(n＝6，RXF1183L、RXF1220L、RXF1781L、RXF 2282L、RXF 486L、786-O)的细胞系。OVXF 899L和RXF 486L是韧达P-gp的多重耐药性细胞系。

在10个以半对数增量至3.2μM的浓度下测试了甲苯哒唑，并将细胞处理72小时。使用CellTiter-

细胞活力测定评估化合物的功效。抗肿瘤活性表示为绝对和相对IC50/70值，通过4-参数非线性曲线拟合来计算。针对甲苯哒唑的结果显示于表17至18以及图34和35中。

通过显示0.587μM(0.941μM)的平均几何相对(绝对)IC₅₀值，甲苯哒唑显然非常活跃。

甲苯哒唑针对卵巢癌细胞系A2780(rel.IC₅₀＝0.178μM)和肾癌细胞系RXF486L(0.248μM)的活性最强。除了相对低的IC₅₀值，对于两个细胞系，在这些情况下，浓度-效应曲线的底部平台低于T/C＝20％。

关于表达P-gp的多重耐药性细胞系OVXF 899L和RXF 486L，甲苯哒唑似乎不是P-gp外排泵的底物。两个细胞系都对甲苯哒唑敏感，RXF 486L表现出高于平均的敏感性。

表17甲苯哒唑针对6个卵巢癌(OXXF)细胞系和6个肾癌(RXF)细胞系的IC₅₀和IC₇₀值(μM)

表18针对6个卵巢癌(OXXF)细胞系和6个肾癌(RXF)细胞系的每个甲苯哒唑测试浓度(μM)下的测试/对照值(％)

已经参考各种实施方案描述了本发明。然而，本发明的范围不限于此，而是由以下权利要求限定，并适当考虑等价物。

Claims (12)

1.一种药物组合物，其包含甲苯哒唑或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、N-氧化物、前药或活性代谢物和强或中等细胞色素P450 1A2同工酶(CYP1A2)抑制剂。

2.根据权利要求1的药物组合物，其中CYP1A2抑制剂是呋喃茶碱、环丙沙星、依诺沙星、氟伏沙明、扎鲁司特、8-苯基茶碱、甲氧沙林、噻苯达唑或美西律，或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、N-氧化物、前药或活性代谢产物。

3.根据权利要求2的药物组合物，其中CYP1A2抑制剂是氟伏沙明、噻苯达唑、呋喃茶碱，或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、N-氧化物、前药或活性代谢产物。

4.根据权利要求1至3任一项的药物组合物，用于通过疗法治疗人或动物受试者的方法中。

5.甲苯哒唑或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、N-氧化物、前药或活性代谢产物，用于通过疗法治疗人或动物受试者的方法中，该治疗方法包括同时、伴随、分开或按序给药强或中等CYP1A2抑制剂。

6.根据权利要求5使用的甲苯哒唑或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、N-氧化物、前药或活性代谢产物，其中强或中等CYP1A2抑制剂如权利要求2至3任一项中所定义的。

7.根据权利要求4使用的组合物，或根据权利要求5或6使用的甲苯哒唑或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、N-氧化物、前药或活性代谢产物，其中所述方法是通过全身暴露于具有抗增殖活性和/或抗寄生虫活性和/或抗真菌活性的化合物易于改善的疾病的治疗方法。

8.根据权利要求4使用的组合物，或根据权利要求5或6使用的甲苯哒唑或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、N-氧化物、前药或活性代谢产物，其中所述方法是通过以下一种或多种易于改善的疾病的治疗方法：

-微管抑制

-细胞增殖的抑制

-血管生成的抑制

-TRAF2-和NCK-相互作用激酶(TNIK)的抑制

-干扰血管表皮生长因子受体2(VEGFR2)

-诱导凋亡

-金属蛋白酶的抑制

-对BCR-ALL激酶的活性

-对BRAF激酶的活性

-Hedgehog信号传导途径抑制

-诱导单核细胞样细胞的促炎(M1)表型

-抗真菌活性，包括抗隐球菌活性

9.根据权利要求4使用的组合物，或根据权利要求5或6使用的甲苯哒唑或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、N-氧化物、前药或活性代谢产物，其中所述方法是治疗癌症、非癌增殖性疾病、全身性寄生虫病或真菌病的方法。

10.根据权利要求9使用的组合物，其中所述方法是治疗癌症或非癌症肿瘤疾病的方法，所述疾病优选选自支气管肿瘤、中枢神经系统癌症、中枢神经系统胚胎肿瘤、癌、急性髓系白血病(AML)、类癌瘤、阑尾癌、星形细胞瘤、脊索瘤、非典型畸胎瘤/横纹肌瘤、肉瘤、膀胱癌、甲状腺癌、原发性中枢神经系统系统(CNS)淋巴瘤、颅外生殖细胞肿瘤、食道癌、AIDS相关癌症、肝细胞(肝)癌、阴茎癌、胸膜肺母细胞瘤、胆囊癌、横纹肌肉瘤、华氏巨球蛋白血症、唾液腺癌、中枢神经系统生殖细胞肿瘤、浆细胞肿瘤、唇和口腔癌、睾丸癌、肝外胆管癌、导管原位癌(DCIS)、鼻咽癌、鼻腔和鼻窦癌、骨癌、乳腺癌、神经胶质瘤、毛细胞白血病、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、口腔癌、室管膜瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、妊娠滋养细胞疾病、眼癌、卡波西肉瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、胃癌、胃肠道间质瘤(GIST)、乳头状瘤病、小肠癌、脑和脊髓肿瘤、华氏巨球蛋白血症、胰腺癌、咽癌、口咽癌、副神经节瘤、非黑素瘤皮肤癌、骨髓增生异常/骨髓增殖性肿瘤、鳞状细胞癌、恶性纤维组织细胞瘤、黑素瘤、Sézary综合征、默克尔细胞癌、垂体瘤、骨和骨肉瘤的恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、甲状旁腺癌、皮肤癌、蕈样真菌病、生殖细胞瘤、输卵管癌、眼内黑素瘤、白血病、胰腺神经内分泌肿瘤(胰岛细胞肿瘤)、子宫内膜癌、淋巴瘤、前列腺癌、肾盂和输尿管癌、骨肉瘤(骨癌)、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、基细胞癌、喉癌、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、阴道癌、鳞状颈癌、多发性骨髓瘤、涉及NUT基因的中线束癌、头颈癌、心脏癌、眼内(眼)癌、肾细胞(肾)癌、骨恶性纤维组织细胞瘤、肝癌、直肠癌、结肠癌、恶性间皮瘤、低度恶性潜在肿瘤、口腔癌、软组织肉瘤、下咽癌、维尔姆斯肿瘤、上皮癌、尤文肉瘤家族肿瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)、视网膜母细胞瘤、霍奇金淋巴瘤、脑肿瘤、上皮神经母细胞瘤、胚胎性肿瘤、宫颈癌、慢性骨髓增殖性肿瘤、胰腺神经内分泌肿瘤、输尿管和肾盂癌、肛门癌、尿道癌、脑干癌、外阴癌、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、子宫肉瘤、胃癌、脑干胶质瘤、多发性内分泌肿瘤综合征、骨髓增生异常综合征、颅咽管瘤、小细胞肺癌、唇和口腔癌、皮肤T细胞淋巴瘤、神经母细胞瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、乳腺癌、胃肠道类癌、鼻旁窦和鼻腔癌、嗜铬细胞瘤、隐匿性原发性转移性鳞状颈癌、男性乳腺癌、肾癌、肺癌、胰岛细胞肿瘤、肝外胆管癌、子宫内膜癌、慢性骨髓增生性肿瘤、肾盂和输尿管移行细胞癌、胸腺瘤和胸腺癌、喉癌、尤文肉瘤、慢性粒细胞白血病(CML)、结直肠癌、结肠癌、心脏肿瘤、Burkit淋巴瘤、未知原发癌、中枢神经系统非典型畸胎瘤/横纹肌瘤、儿童癌症和非霍奇金淋巴瘤、肾上腺皮质癌、肾上腺皮质腺癌、肾上腺皮质腺瘤或表达P-gp的多重耐药性肿瘤，更优选选自肉瘤、卵巢癌、肾癌、黑素瘤、结直肠癌、结肠癌、肺癌、脑癌、肾上腺皮质腺癌、肾上腺皮质癌、肾上腺皮质腺瘤、表达P-gp的多重耐药性肿瘤和神经母细胞瘤。

11.根据权利要求9使用的组合物，其中所述方法是非癌增殖性疾病的治疗方法，所述疾病优选实体瘤疾病(包括癌症和非癌症疾病)、血液学癌症、炎性疾病、纤维性疾病、痛风、肝硬化、硬皮病、银屑病或子宫内膜异位症。

12.根据权利要求9使用的组合物，其中所述方法是真菌病或全身性寄生虫病的治疗方法，所述疾病优选选自蠕虫病和原生动物病，更优选选自钩虫病、棘球蚴病、蛔虫病和蛲虫病、棘头虫病、疟原虫属某些种、非洲锥虫、克氏锥虫、利什曼原虫属某些种、贾第鞭毛虫属某些种、阴道毛滴虫、溶组织内阿米巴、脑胞内原虫属某些种、卡氏棘阿米巴和双肠细胞虫。

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