CN113588968A - Ndsev中il-6作为用于诊断和/或治疗蛛网膜下腔出血症的标志物 - Google Patents
Ndsev中il-6作为用于诊断和/或治疗蛛网膜下腔出血症的标志物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了脑源性小囊泡中(NDSEV)IL‑6作为用于诊断和/或治疗蛛网膜下腔出血症的标志物，NDSEV中IL‑6作为用于诊断和/或治疗蛛网膜下腔出血症的标志物。用于检测所述的NDSEV中IL‑6的抗体在制备诊断蛛网膜下腔出血症的试剂盒的应用。本发明的试验证明：与正常人相比，aSAH患者血浆NDSEV中IL‑6水平有明显的差异。高水平的NDSEV IL‑6与患者的严重程度及预后呈正相关。这些结果表明在aSAH患者体内出现高水平的的神经炎症级联反应。NDSEV中IL‑6可能是预测aSAH患者疾病进展的潜在生物标志物，在未来可能用于评估该疾病的预后。
Description
技术领域
本发明涉及NDSEV中IL-6作为用于诊断和/或治疗蛛网膜下腔出血症的标志物。
背景技术
动脉瘤性蛛网膜下腔出血(aSAH)通常由动脉瘤破裂引起，是一种死亡率和致残率较高的疾病，可以发生在任何年龄阶段，占中风总发病率的5-7％。其中一个主要决定预后的关键因素是初始出血量，可导致早期脑损伤(EBI)和早期脑血管痉挛，并且与迟发性脑缺血有关(DCI)。最近，越来越多的研究人员发现，SAH后的早期脑损伤可能是影响SAH患者预后的主要因素。因此，在SAH发生后的早期阶段，明确其发生的病理生理机制尤为重要，包括微血管充盈缺损、离子稳态破坏、神经炎症和微血管狭窄等一系列变化。此外，需要一种可靠、早期、经济和无创的方法来为此类患者进行筛查，以改善aSAH患者的预后。
现在越来越多的研究聚集在小细胞外囊泡(sEV)，其是一种脂质膜小泡，可以自由穿过血脑屏障，可用于细胞间的长距离通讯，促进蛋白质、脂质和核酸的转移，以便蛋白质的表达。同时，脑细胞释放小细胞外囊泡可穿过血脑屏障，并能在外周血液循环中检测到。同样，内皮细胞和外周细胞也能够向外周循环中分泌sEV。因此，就可以从外周血样品中富集细胞外囊泡用于检测各种蛋白质、脂类和核酸等。最后，这些外周循环中的细胞外囊泡可作为反映SAH患者病理变化进程的潜在理想生物标志物。有相关临床研究检测了外周中细胞外囊泡作为脑缺血的生物标记物的含量，包括功能蛋白和各种核酸等，但是未发现可反映SAH患者病理变化进程的潜在理想生物标志物
综上所述，如何研发一种动脉瘤性蛛网膜下腔出血疾病的诊断或治疗的标志物，是亟待解决的技术问题。
发明内容
为此，本发明提供一种NDSEV中IL-6作为用于诊断和/或治疗蛛网膜下腔出血症的标志物。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供NDSEV中IL-6作为用于诊断和/或治疗蛛网膜下腔出血症的标志物。
本发明的一个实施例中，所述NDSEV来源于血浆。
本发明的一个实施例中，所述血浆的分离过程为：
将待测血液在抽取后2小时内用EDTA抗凝管进行血浆分离，4℃条件下，500转/min离心10min，然后将上层清液转移到EP管中，3000转/min离心10min，得到血浆。
本发明的一个实施例中，所述NDSEV提取过程为：
使用小囊泡提取试剂盒提取SEV，将400μL沉淀缓冲液B加入1ml血浆样品中，4℃下混合60min，然后室温条件下以10,000g继续离心30min，然后通过除去上清液来收获SEV，将SEV重悬于100μL重悬缓冲液中，通过用小鼠抗人CD171生物素化抗体免疫吸附富集来收集总NDSEV，加入预处理的protein A琼脂糖珠使目的抗体与protein A琼脂糖珠偶连，免疫沉淀反应后将琼脂糖珠离心至管底，弃上清，琼脂糖珠用含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂混合物的1％Triton X-100裂解缓冲液裂解得到含有CD171蛋白的NDSEV。
用于检测上述所述的NDSEV中IL-6的抗体在制备诊断蛛网膜下腔出血症的试剂盒的应用，也属于本发明的保护范围。
本发明的一个实施例中，所述试剂盒用于提供在患有或有风险形成蛛网膜下腔出血症的患者中诊断蛛网膜下腔出血症，预测形成蛛网膜下腔出血症的风险，或预测蛛网膜下腔出血症的结果。
本发明的一个实施例中，所述抗体用于测定样品中所述NDSEV中IL-6的表达水平。
本发明的一个实施例中，所述NDSEV中IL-6的表达水平是患者的NDSEV中IL-6的表达水平与健康对照人的NDSEV中IL-6表达水平为参照。
有大量证据表明，炎症反应发生在SAH后早期，并促进SAH后EBI的进展。已经研究报道的炎症细胞因子作为潜在生物标志物，如白细胞介素-1α(IL-1α)、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18和TNF-α等。IL-6作为一种促炎因子参与急性脑损伤和其他疾病。几项研究表明，高水平的IL-6可能会引起神经炎症，并可能与aSAH患者的预后密切相关。假设SAH发生后，导致脑中小细胞外囊泡中IL-6的表达，这些脑源性小细胞外囊泡(NDSEV)被分泌到血循环中，作为SAH患者的生物标志物。在本发明中，从aSAH患者和健康对照者的血浆中提取NDSEV，并检测IL-6在其的表达的水平。最终，检测到aSAH患者NDSEV中IL-6水平升高，可以用于评估早期炎症反应和疾病进展之间的潜在关系。
动脉瘤性蛛网膜下腔出血是一种严重的伴有较高死亡率和致残率的出血性疾病，而识别循环生物标志物有助于提高对该疾病的治疗效果。本发明首次报道了神经元来源的小细胞外囊泡中的循环白细胞介素-6(IL-6)被认为是影响aSAH预后的潜在生物标志物。
本发明通过从蛛网膜下腔出血患者和健康对照者的血浆中提取小细胞外囊泡，并应用抗L1CAM抗体免疫共沉淀进行富集。随后，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测定IL-6的水平。
本发明具有如下优点：
本发明的试验证明：与正常人相比，aSAH患者血浆中NDSEV中IL-6水平有明显的差异。高水平的NDSEV中IL-6与患者的严重程度及预后呈正相关。这些结果表明在aSAH患者体内出现高水平的的神经炎症级联反应。NDSEV中IL-6可能是预测aSAH患者疾病进展的潜在生物标志物，在未来可能用于评估该疾病的预后。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
图1为本发明实施例提供的临床标本检测分析流程图；
图2为本发明实施例提供的脑源性小细胞外囊泡特征鉴定结果图；
图3为本发明实施例提供的健康对照组和实验组中血浆脑源性小细胞外囊泡标记物IL-6的表达水平图；
图4为本发明实施例提供的血浆脑源性小细胞外囊泡标记物IL-6与SAH严重程度的关系图；
图5为本发明实施例提供的血浆脑源性小细胞外囊泡标记物IL-6与SAH预后的关系图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1、IL-6NDSEV提取鉴定
1、伦理学：所有患者均来源于皖南医学院第一附属医院神经外科，并根据赫尔辛基宣言进行的。在纳入研究之前，患者或监护人均签订了知情同意书。实验并医院伦理委员会批准。
2、实验设计：在本研究中，纳入从2016年5月至2017年3月入院的aSAH患者。在SAH发生后的24小时内，从总共224名SAH病患者中收集了117例血浆。平均年龄标准差为59.91±9.65岁(40-83岁)；有72名女性和45名男性。排除标准：出血后72h后入院；非动脉瘤性SAH；患有肝、肾、心或肺功能不全或感染性疾病；入院时预后不良，无任何干预。并选用空腹状态下年龄匹配的健康人用作对照(n＝40)。
使用WFNS分级对患者入院时的状态进行评估。Fisher’分级用于评估CT中显示的出血量。所有患者均接受血管内弹簧圈治疗。通过电话或者门诊随访，并通过改良的mRS对患者术后1年的神经功能结果进行评估。如果术后无法取得联系，则视为失访。其中，mRS评分为0-2分视为预后良好，而3-6分视为预后不良。
表1入组人群资料和临床特征
NDSEVs脑源性小细胞外囊泡；SD标准差
3、病人特征：共招募了117名SAH患者和40名健康对照者。107例患者被排除，见图1。蛛网膜下腔出血患者在发病24小时后取血浆，对照组在禁食状态下取血浆。表2总结了这两组的详细特征。
表2aSAH患者临床特征
ACA大脑前动脉；AComA前交通动脉；DCI迟发性脑缺血；ICA颈内动脉；MCA大脑中动脉；mFS改良Fisher评分；mRS改良Rankin分级；NDSEVs脑源性小细胞外囊泡；PComA后交通动脉；SD标准差；WFNS世界神经外科医生联合会；
4、样品处理，血液样本在抽取后2小时内用EDTA抗凝管进行血浆分离。4℃条件下，500转/min离心10min。然后将上层清液转移到无RNA/DNA的1.5ml的EP管中，并在同样条件下3000转/min进一步离心10min。并将离心后的血浆平均分配，储存在-80℃用于后续分析。
5、从血浆样品中分离出神经元来源的小细胞外囊泡，使用小囊泡试剂盒(Qiagen,CA)提取sEV。首先，将400μL沉淀缓冲液B加入1ml血浆样品中，4℃下混合60min，然后室温条件下以10,000g继续离心30min。然后通过除去上清液来收获sEV。将sEV重悬于100μL重悬缓冲液中。为了富集NDSEVs，通过用小鼠抗人CD171(L1CAM神经粘附蛋白)生物素化抗体(eBiosciences，CA，USA)免疫吸附富集来收集总sEVs(加入小鼠抗人CD171生物素化抗体孵育过夜，加入预处理的protein A琼脂糖珠使目的抗体与protein A琼脂糖珠偶连，免疫沉淀反应后将琼脂糖珠离心至管底，弃上清，琼脂糖珠用含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂混合物的1％Triton X-100裂解缓冲液(Beyotime，P0013)裂解得到含有CD171蛋白的NDSEVs)。得到的NDSEVs储存在-80℃。
6、外泌体鉴定，通过透射电子显微镜(TEM)观察沉淀颗粒的形态来鉴别NDSEVs。首先，提取前期离心后的5μl洗脱液，稀释至10μl。然后，本发明在铜盘上提取10μl样品1min，并使用滤纸去除漂浮物。随后，将10μl磷钨酸滴在铜盘上1min，同样使用滤纸除去漂浮物。干燥几分钟后，最后用JOEL JEM-1400透射电子显微镜在80kV下检查。使用流式细胞仪测量并分析颗粒的尺寸和浓度，同样对外泌体的标记物CD9、CD81进行测量。
7，外泌体蛋白的分离和浓度测定，使用BCA蛋白检测试剂盒测量外泌体蛋白的浓度。首先，将分离出的NDSEVs解离至37℃。然后快速加入等体积的RIPA裂解液，混合后并在冰上裂解30min。根据说明书配制0.5mg/ml BSA溶液，并按0μl、1μl、2μl、4μl、8μl、12μl、16μl、20μl将其置于96孔板的参照孔内，剩下的以标准品稀释液填补，一共20μl体积。蛋白标本用标准品稀释液配制成特定浓度后转移20μl到96孔板中。将BCA试剂A和B以50:1的比例配制所需的BCA工作液，反复吹打混匀，每个反应空都加200μl BCA工作液，37℃放置30分钟。采用酶标仪检测每个反应孔的562nm吸光度值，根据参照孔BSA的吸光度绘制标准曲线，再将标本孔带入标准曲线计算浓度。
8、蛋白质印迹分析，使用10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)分离分子量标记(5μL/lane MA,USA)和蛋白质样品(20μg/lane)，并电泳转移到聚偏二氟乙烯膜上(聚偏二氟乙烯膜，PSQ，USA)。然后，室温下用5％脱脂牛奶将膜封闭1h。印迹与一抗在5％胎牛血清白蛋白(PBS+0.1％)中于4℃孵育过夜。一抗如下：小鼠抗CD63(1:1000，Abcam)和兔抗Alix(1:1000，Abcam)。然后使用相应的辣根过氧化物酶结合的抗兔或抗小鼠(1:10,000，Pierce)二抗在相同条件下再孵育2小时。用增强化学发光(ECL)试剂盒观察条带。
9、流式细胞仪研究，将20μl NDSEVs稀释至60μl，然后将20μl荧光标记抗体(CD9，CD81)添加至30μl稀释液。充分混合后，在37℃孵育30min。然后加入1ml预冷的PBS，4℃条件下110,000×g离心70min。除去上清液后再次离心。然后去除上清液，重新悬浮在50μl预冷的1×PBS中，并使用流式细胞仪进行分析。
10、NDSEVs表征：利用透射电镜对NDSEVs的形态学特征进行了评价。外泌体呈球形，大小为86.71±16.82nm，被膜包裹，如图2A和2B所示。NDSEVs STD浓度为6.09E+8粒/mL，如图2所示。通过使用NanoFCM定量NDSEVs膜相关标记CD9和CD81，进一步验证了NDSEVs的身份。阳性率分别为5.4％和5.7％，如图2D和2E所示。Western blotting分析显示CD63和Alix在NDSEVs中表达，如图2F所示。
实施例2、IL-6NDSEV作为用于诊断和/或治疗蛛网膜下腔出血症的标志物
1、ELISA试验，使用特定的ELISA试剂盒对NDSEVs中的IL-6(E-EL-H0102c，Elabscience,武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司)和外泌体标记物CD81(CSB-EL004960HU，Cusabio，武汉华美生物工程有限公司)的浓度进行定量。步骤：①按说明书配制标准品液，再将其加入前2列孔内，做好重复性质控，每个浓度两个孔。标准品液和样本液都是每孔100μl，将96孔板盖好，37℃孵育90min。②倒掉并甩干板内液体，生物素标记的抗体100μl加入各个孔中，吹打混匀，再将96孔板盖好，37℃孵育30min。③甩尽板内液体，加洗涤液各350μl，润洗2min，倒掉并甩干板内液体。此洗板过程反复三次。④加入酶结合液100μl到孔内，96孔板盖好，37℃孵育30min。⑤倒掉并甩干板内液体，按照③过程洗板5次。⑥加底物溶液90μl到孔内，96孔板避光盖好，37℃孵育15min。⑦加终止液50μl，结束反应。⑧将酶标仪调到450nm波长，检测各个孔内OD值。根据标准品的OD值(光密度值)绘制标准曲线，最后计算出样本中蛋白浓度。患者中CD81所有测定值的平均值设定为1.00，并对每个样本的相对值标准化，将其作为内参，最后通过OD值计算NDSEVs中的IL-6的最终浓度。
2、统计分析，所有数据均使用MedCalc 15.0进行分析。数据以均值标准差表示。Mann-Whitney U检验用于评估两组之间的差异，Kruskal-Wallis检验用于评估两组以上之间的差异。斯皮尔曼相关系数用于比较两组患者不同预后之间的IL-6水平的变化。ROC曲线用于确定aSAH患者IL-6的最佳阈值。Logistic回归模型以确定在单变量分析中校正达到P<0.1的风险因素后预测mRS的因素，以P<0.05为统计学意义。
3、检测SAH患者和对照组中NDSEVs IL-6的表达情况
117例aSAH患者和40例健康对照组NDSEVs中IL-6的表达水平。与健康对照组相比，在aSAH后1天NDSEVs IL-6水平显著升高(aSAH:365.71±44.57pg/ml；对照品:8.81±1.63pg/ml；p<0.001)，如图3所示。
4、NDSEVs中IL-6与SAH患者病情严重程度的关系
WFNS分级是一种用于评估SAH后早期脑损伤水平的工具。采用改良Fisher量表评估CT片上aSAH患者的出血量。WFNS分级为I-III级为轻度aSAH，WFNS分级为Ⅳ-V级为重度aSAH。如图4A所示，重度aSAH患者与轻度aSAH患者相比，NDSEVs中IL-6水平明显升高(重度aSAH:409.14±27.06pg/ml；轻度aSAH:338.56±29.15pg/ml)(P<0.001)。为了评价NDSEVs中IL-6在区分重度aSAH和轻度aSAH中的应用价值，本发明进行了ROC曲线分析，发现NDSEVs中IL-6的曲线下面积(auc)为0.961(95％CI:0.909-0.988；p<0.001)(图4b)。截止表达值为375.18时，准确率最高，其中识别严重aSAH的阳性预测值为91.1％，阴性预测值为94.4％，敏感性为91.11％，特异性为94.44％。
为进一步探讨NDSEVs中IL-6表达水平与WFNS分级的关系，采用Spearman相关系数分析。结果表明，aSAH患者血浆NDSEVs中IL-6水平(ρ＝0.845；95％CI:0.753-0.890；P<0.001)与WFNS分级评分的aSAH严重程度密切相关。
5、NDSEVs中IL-6与SAH患者预后的关系
在早期阶段确定aSAH患者的预后对优化治疗很重要。因此，根据临床结果将患者分为两组。随访期结束时，mRS评分为0～2分为预后良好，mRS评分为3～6分为预后不良。NDSEVs中IL-6表达较低的患者mRS评分低于表达较高的患者(P<0.001；图5)。在单因素分析中，年龄、WFNS分级、改良Fisher评分和NDSEVs中IL-6水平被确定与SAH 1年后的预后相关(P<0.1)。随后带入logistic回归模型中，NDSEVs中IL-6水平与SAH 1年后mRS评分显著相关(P<0.001；因此，NDSEVs中IL-6的表达可以作为SAH预后生物标记物。
表3多因素logistic分析SAH患者1年预后的危险因素
脑动脉瘤平均直径为6.5mm；CI置信区间；OR风险比；WFNS世界神经外科医生联合会。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (8)
1.NDSEV中IL-6作为用于诊断和/或治疗蛛网膜下腔出血症的标志物。
2.如权利要求1所述的用于诊断和/或治疗蛛网膜下腔出血症的标志物，其特征在于，
所述NDSEV来源于血浆。
3.如权利要求2所述的用于诊断和/或治疗蛛网膜下腔出血症的标志物，其特征在于，
所述血浆的分离过程为：
将待测血液在抽取后2小时内用EDTA抗凝管进行血浆分离，4℃条件下，500转/min离心10min，然后将上层清液转移到EP管中，3000转/min离心10min，得到血浆。
4.如权利要求3所述的用于诊断和/或治疗蛛网膜下腔出血症的标志物，其特征在于，
所述NDSEV提取过程为：
使用小囊泡提取试剂盒提取SEV，将400μL沉淀缓冲液B加入1ml血浆样品中，4℃下混合60min，然后室温条件下以10,000g继续离心30min，然后通过除去上清液来收获SEV，将SEV重悬于100μL重悬缓冲液中，通过用小鼠抗人CD171生物素化抗体免疫吸附富集来收集总NDSEV，加入预处理的protein A琼脂糖珠使目的抗体与protein A琼脂糖珠偶连，免疫沉淀反应后将琼脂糖珠离心至管底，弃上清，琼脂糖珠用含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂混合物的1％Triton X-100裂解缓冲液裂解得到含有CD171蛋白的NDSEV。
5.用于检测权利要求1所述的NDSEV中IL-6的抗体在制备诊断蛛网膜下腔出血症的试剂盒的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，
所述试剂盒用于提供在患有或有风险形成蛛网膜下腔出血症的患者中诊断蛛网膜下腔出血症，预测形成蛛网膜下腔出血症的风险，或预测蛛网膜下腔出血症的结果。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，
所述抗体用于测定样品中所述NDSEV中IL-6的表达水平。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，
所述NDSEV中IL-6的表达水平是患者的NDSEV中IL-6的表达水平与健康对照人的NDSEV中IL-6表达水平为参照。
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