CN113573588A - 用于纯化人乳寡糖的方法及相关组合物 - Google Patents

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Abstract

本说明书涉及通过包括纳米过滤的方法从人乳寡糖(HMO)溶液制备纯化的HMO，以及用于制备包含纯化的HMO的食品、膳食补充剂、药物和婴儿配方制品的方法。本说明书还涉及通过本说明书中披露的方法制备的纯化的HMO和食品、膳食补充剂、药物和婴儿配方制品。

Description

用于纯化人乳寡糖的方法及相关组合物
相关专利申请的交叉引用
本说明书要求美国临时专利申请号62/796,272(提交于2019年1月24日)和EP19156345.1(提交于2019年2月11日)的优先权。上述引用的专利申请中的每一个的全文通过引用结合到本说明书中。
技术领域
本说明书涉及通过包括纳米过滤的方法从纯化的人乳寡糖(HMO)溶液制备HMO，以及用于制备包含这种纯化的HMO的食品、膳食补充剂、药物和婴儿配方制品的方法。本说明书还涉及通过本说明书中披露的方法制备的纯化的HMO和食品、膳食补充剂、药物和婴儿配方制品。
背景技术
糖类是人乳的主要组分。尽管在这些糖类中二糖乳糖是主要的，人乳还包含超过150种具有更复杂的结构的糖类，称为人乳寡糖(HMO)。虽然乳糖充当婴儿的能量来源，但是HMO一般是难消化的并且提供各种其他生理益处。具体而言，多种HMO促进有益的肠微生物生长(“益生元”效应)，阻碍病原体粘附于肠上皮表面并且调节先天免疫系统。HMO也被认为在脑发育和神经元活动方面发挥作用。此类益处使得HMO(诸如2’-岩藻糖基乳糖或3-岩藻糖基乳糖)成为包括在食品、膳食补充剂和药物中、且特别是婴儿配方制品中的潜在有吸引力的成分。
HMO包括，例如，2’-岩藻糖基乳糖(也称为“2’-O-岩藻糖基乳糖”或“2’-FL”)、3-岩藻糖基乳糖(也称为“3-O-岩藻糖基乳糖”或“3-FL”)、乳糖-N-四糖(也称为“LNT”)、6’-唾液酸基乳糖(也称为“6’-SL”)、3’-唾液酸基乳糖(也称为“3’-SL”)、乳糖二岩藻四糖、2’,3-二岩藻糖基乳糖、乳糖-N-新四糖(也称为“LNnT”)、乳糖-N-岩藻戊糖、乳糖-N-二岩藻己糖、乳糖-N-新二岩藻己糖、乳糖-N-新八糖、乳糖-N-岩藻戊糖、乳糖-N-新岩藻戊糖、3’唾液酸基-3-岩藻糖基乳糖、唾液酸基-乳糖-N-四糖、LS-四糖、3'-唾液酸基乳糖、乳糖-N-三糖、乳糖-N-新岩藻戊糖、乳糖-N-新岩藻戊糖、乳糖-N-二岩藻己糖、6'-半乳糖基乳糖、3'-半乳糖基乳糖、乳糖-N-六糖、以及乳糖-N-新六糖。人乳中大多数HMO是岩藻糖基化的，不同于由乳畜产生的寡糖。人乳中最丰富的HMO是2’-FL。
开发经济上可行的大规模生产HMO诸如2’-FL、3-FL、LNT、3’-SL和6’-SL的方法继续作为挑战。
多种最近的合成HMO的方法涉及微生物发酵过程，其从乳糖产生HMO(诸如2’-FL、3-FL、LNT、3’-SL和6’-SL)。给定的HMO是通过培养的微生物诸如重组大肠杆菌来合成。然后将HMO通过一系列纯化过程从培养物产生的生物分子的肉汤分离。虽然使用此方法已成功，但是发酵过程通常产生复杂的产物混合物，其除了包含所希望的HMO之外，还时常包含其他成分，诸如一价和二价盐、乳糖、寡糖、单糖、氨基酸、多肽、蛋白质、有机酸、核酸等。因此，继续需要有效、可靠且经济上可行的提供可使用的HMO产品的下游纯化方法。
报告用于HMO下游纯化方法的步骤之一包括纳米过滤。纳米过滤所用的膜通常是聚酰胺膜。膜的选择一般将取决于例如要分离的HMO的分子量。例如，2’-FL和3-FL具有约488道尔顿的分子量，而LNT具有约707道尔顿的分子量，3’-SL和6’-SL具有约633道尔顿的分子量。已用于纯化2’-FL和/或3-FL的膜的实例包括，例如，苏伊士公司Desal5D-系列DK和DL膜(苏伊士水技术&解决方案公司(特里沃斯，宾夕法尼亚州))，其具有150至300道尔顿的分子量截止值(也称为“MWCO”)以确保保留2’-FL和3-FL。
包含源于或可源于微生物诸如重组大肠杆菌发酵的HMO的溶液通常包含大量盐。此外，由于例如发酵需要以及用于生物质去除的条件，所以在这些溶液中通常是低浓度的HMO。
纳米过滤(“NF”)已用于通过将2’-FL保留在NF浓缩物中同时允许盐通过而成为渗透物而浓缩HMO(例如2’-FL)和除去一些盐。但是，用于纳米过滤包含HMO的发酵产物的常规方法可以产生，例如，具有不希望的高盐浓度的浓缩物，或者具有低盐浓度但不希望的低HMO浓度的浓缩物。
在纳米过滤浓缩物中盐的存在导致下游成本增高。例如，附加的盐去除步骤需要额外的设备并且通常产生更多废水。不良的盐去除还可能导致在下游形成不希望的沉淀，由此继而可能造成后续操作单元中的结垢。
仍然继续需要存在更有效、可靠和/或经济上可行的生产纯化的HMO的方法。
发明内容
简言之，本说明书总体而言部分地提供一种用于从HMO溶液制备纯化的HMO的方法。
在一些实施例中，本说明书部分地提供一种制备纯化的人乳寡糖(HMO)的方法。所述方法包括：
●将HMO溶液进给到纳米过滤单元中，
●将所述HMO溶液用所述纳米过滤单元过滤以产生浓缩物和渗透物，和
●收集所述浓缩物。
所述HMO溶液包括含水介质，所述含水介质包含要纯化的HMO和第二碳水化合物。并且，所述纳米过滤单元包括膜，所述膜具有：
●至少约50％的MgSO4保留率(在温度25℃、浓度2g/l、压力8巴和pH 6-7下)；以及
●最高达约60％的NaCl保留率(在温度25℃、浓度2g/L、压力8巴和pH 6-7下)。
在一些这样的实施例中，所述过滤在小于约18℃的温度下进行。
在其他这样的实施例中，所述过滤在小于10℃的温度下进行。
在其他这样的实施例中，所述纳米过滤单元包括膜，所述膜具有大于90％的MgSO4保留率(在温度25℃、浓度2g/L、压力8巴和pH 6-7下)。
在其他这样的实施例中，所述纳米过滤单元包括膜，所述膜具有小于600道尔顿的分子量截止值。
在其他这样的实施例中，所述膜具有至少约80％乳糖保留率(在温度25℃、浓度20g/L、通量5-20kg/m2/h,和pH 8下)。
在其他这样的实施例中，所述方法进一步包括渗滤，并且所述方法包括除了所述HMO溶液之外还将渗滤用水进给到所述纳米过滤单元中。在一些这样的实施例中，当归一化到具有4％(w/w)干物质组成的HMO溶液时，所述渗滤用水与所述HMO溶液的重量比小于1.6。
在一些包括渗滤的实施例中，当归一化到具有4％(w/w)干物质组成的HMO溶液时，所述渗滤用水与所述HMO溶液的重量比是约0.09至0.3。在一些这样的实施例中，所述纳米过滤提供至少约40％的除盐率。在其他这样的实施例中，纳米过滤，所述纳米过滤附加地或可替代地提供至少约85％的纯化的HMO收率。
在包括渗滤的其他实施例中，当归一化到具有4％(w/w)干物质组成的HMO溶液时，所述渗滤用水与所述HMO溶液的重量比是0.3至0.6。在一些这样的实施例中，所述纳米过滤提供至少约90％的除盐率。在其他这样的实施例中，纳米过滤，所述纳米过滤附加地或可替代地提供至少约90％的纯化的HMO收率。
在包括渗滤的其他实施例中，当归一化到具有4％(w/w)干物质组成的HMO溶液时，所述渗滤用水与所述HMO溶液的重量比是0.6至0.9。在一些这样的实施例中，所述纳米过滤提供至少68％的除盐率。在其他这样的实施例中，纳米过滤，所述纳米过滤附加地或可替代地提供至少约85％的纯化的HMO收率。
在一些实施例中，本说明书部分地提供了通过本说明书的方法制备的纯化的HMO(或纯化的HMO混合物)。
在一些实施例中，本说明书部分地提供了一种用于制备食品、膳食补充剂或药物的方法。所述方法包括根据上述方法制备纯化的HMO(或纯化的HMO混合物)，以及将所述纯化的HMO(或混合物)与适合用于所述食品、膳食补充剂或药物的成分混合。
在一些实施例中，本说明书部分地提供了通过本说明书的方法制备的食品、膳食补充剂或药物。
在一些实施例中，本说明书部分地提供了一种用于制备婴儿配方制品的方法。所述方法包括根据上述方法制备纯化的HMO(或纯化的HMO混合物)，以及将所述纯化的HMO(或混合物)与适合用于婴儿配方制品的成分混合。
在一些实施例中，本说明书部分地提供了通过本说明书的方法制备的婴儿配方制品。
通过阅读本说明书，本说明书的传授内容的其他益处对于本领域技术人员而言将是显而易见的。
附图说明
图1示出DK、NFX、DL、NFW、NF245、XN45、XN45(旧的)、NDX、UA60和NFG膜在不同温度下的MgSO4保留率。
图2示出DK、NFX、DL、NFW、NF245、XN45、XN45(旧的)、NDX、UA60和NFG膜在不同温度下的NaCl保留率。
具体实施方式
此详细描述仅旨在使本领域的其他技术人员熟悉申请人的发明、其原理以及其实际应用，以使得本领域的其他技术人员可以其多种形式来改编和应用申请人的发明，因为它们可能最适合于特定用途的要求。此详细描述及其具体实例在指示某些实施例的同时仅旨在出于说明的目的。因此，本说明书不限于所描述的实施例，并且可进行各种修改。
本说明书提供一种用于制备纯化的人乳寡糖(HMO)的方法。所述方法包括：
●将HMO溶液进给到纳米过滤单元中，
●将所述HMO溶液用所述纳米过滤单元过滤以产生浓缩物和渗透物，和
●收集所述浓缩物。
所述HMO溶液包括含水介质，所述含水介质包含要纯化的HMO和另一碳水化合物。典型地，含水介质进一步包含其他成分，例如，一种或多种额外的碳水化合物，可以包含一种或多种其他HMO和/或一种或多种各种其他碳水化合物。
人乳寡糖
在人乳中一般存在超过150种已知的人乳寡糖。本发明的方法可以用于制备单一纯化的HMO，或者两种或更多种HMO的纯化的混合物。
在一些实施例中，本说明书的方法包括制备纯化的HMO，该HMO选自岩藻糖基乳糖(诸如2’-岩藻糖基乳糖(也称为“2’-FL”)或3-岩藻糖基乳糖(也称为“3-FL”))、唾液酸基乳糖(诸如3’-唾液酸基乳糖(也称为“N-乙酰神经胺基-2-3-吡喃半乳糖基-1-4-吡喃葡萄糖”或“3’-SL”)或6’-唾液酸基乳糖(也称为“6’-SL”))、乳糖-N-四糖(也称为“LNT”)、乳糖二岩藻四糖、二岩藻糖基乳糖(也称为“DiFL”)、乳糖-N-新四糖(也称为“LNnT”)、乳糖-N-岩藻戊糖、乳糖-N-二岩藻己糖、乳糖-N-新二岩藻己糖、乳糖-N-新八糖、乳糖-N-岩藻戊糖、乳糖-N-新岩藻戊糖、3’唾液酸基-3-岩藻糖基乳糖、唾液酸基-乳糖-N-四糖、LS-四糖、3'-唾液酸基乳糖、乳糖-N-三糖、乳糖-N-新岩藻戊糖、乳糖-N-新岩藻戊糖、乳糖-N-二岩藻己糖、6'-半乳糖基乳糖、3'-半乳糖基乳糖、乳糖-N-六糖，或乳糖-N-新六糖。在一些实施例中，本说明书的方法包括制备包含以上列出的HMO中的一种或多种的纯化的HMO混合物。在一些实施例中，本说明书的方法包括制备包含以上列出的HMO中的至少两种的纯化的HMO混合物。
在一些实施例中，本说明书的方法用于制备纯化的HMO，该HMO选自岩藻糖基乳糖(例如2’-FL或3-FL)、唾液酸基乳糖(例如3’-SL或6’-SL)、乳糖-N-四糖。
在一些实施例中，本说明书的方法用于制备纯化的岩藻糖基乳糖(也称为“FL”)。在室温和压力下，岩藻糖基乳糖通常是白色至象牙色固体并且可溶于水中。在一些实施例中，该纯化的岩藻糖基乳糖是2’-FL。在一些实施例中，该纯化的岩藻糖基乳糖是3-FL。在一些实施例中，本说明书的方法用于制备包含岩藻糖基乳糖的纯化的HMO混合物。在一些实施例中，本说明书的方法用于制备包含2’-FL或3-FL的纯化的HMO混合物。在一些实施例中，本说明书的方法用于制备包含至少两种岩藻糖基乳糖的纯化的HMO混合物。在一些实施例中，本说明书的方法用于制备包含2’-FL和3-FL的纯化的HMO混合物。
在一些实施例中，本说明书的方法包括制备纯化的唾液酸基乳糖(也称为“SL”)。在一些实施例中，该纯化的唾液酸基乳糖是3’-SL。在一些实施例中，该纯化的唾液酸基乳糖是6’-SL”。在一些实施例中，本说明书的方法用于制备包含唾液酸基乳糖的纯化的HMO混合物。在一些实施例中，本说明书的方法用于制备包含3’-SL或6’-SL的纯化的HMO混合物。在一些实施例中，本说明书的方法用于制备包含至少两种唾液酸基乳糖的纯化的HMO混合物。在一些实施例中，本说明书的方法用于制备包含3’-SL和6’-SL的纯化的HMO混合物。
在一些实施例中，本说明书的方法包括制备纯化的乳糖-N-四糖(“LNT”)。在一些实施例中，本说明书的方法用于制备包含LNT的纯化的HMO混合物。
HMO溶液
根据本说明书从其纯化HMO的“HMO溶液”包括含水介质。该含水介质包含HMO和第二碳水化合物。
在一些实施例中，该含水介质是水。
在一些实施例中，该HMO选自2’-FL、3-FL、LNT、6’-SL、3’-SL、乳糖二岩藻四糖、DiFL、LNnT、乳糖-N-岩藻戊糖、乳糖-N-二岩藻己糖、乳糖-N-新二岩藻己糖、乳糖-N-新八糖、乳糖-N-岩藻戊糖、乳糖-N-新岩藻戊糖、3’唾液酸基-3-岩藻糖基乳糖、唾液酸基-乳糖-N-四糖、LS-四糖、3'-唾液酸基乳糖、乳糖-N-三糖、乳糖-N-新岩藻戊糖、乳糖-N-新岩藻戊糖、乳糖-N-二岩藻己糖、6'-半乳糖基乳糖、3'-半乳糖基乳糖、乳糖-N-六糖，和乳糖-N-新六糖。
在一些实施例中，该HMO是岩藻糖基乳糖。
在一些实施例中，该HMO是2’-FL。
在一些实施例中，该HMO是3-FL。
在一些实施例中，该HMO是唾液酸基乳糖。
在一些实施例中，该HMO是3’-SL。
在一些实施例中，该HMO是6’-SL。
在一些实施例中，该HMO是LNT。
在一些实施例中，该第二碳水化合物是HMO。
在一些实施例中，该第二碳水化合物选自2’-FL、3-FL、LNT、6’-SL、3’-SL、乳糖二岩藻四糖、DiFL、LNnT、乳糖-N-岩藻戊糖、乳糖-N-二岩藻己糖、乳糖-N-新二岩藻己糖、乳糖-N-新八糖、乳糖-N-岩藻戊糖、乳糖-N-新岩藻戊糖、3’唾液酸基-3-岩藻糖基乳糖、唾液酸基-乳糖-N-四糖、LS-四糖、3'-唾液酸基乳糖、乳糖-N-三糖、乳糖-N-新岩藻戊糖、乳糖-N-新岩藻戊糖、乳糖-N-二岩藻己糖、6'-半乳糖基乳糖、3'-半乳糖基乳糖、乳糖-N-六糖,和乳糖-N-新六糖。
在一些实施例中，该第二碳水化合物是岩藻糖基乳糖。
在一些实施例中，该第二碳水化合物是2’-FL。
在一些实施例中，该第二碳水化合物是3-FL。
在一些实施例中，该第二碳水化合物是唾液酸基乳糖。
在一些实施例中，该第二碳水化合物是3’-SL。
在一些实施例中，该第二碳水化合物是6’-SL。
在一些实施例中，该第二碳水化合物是LNT。
在一些实施例中，该第二碳水化合物是乳糖、岩藻糖、2’,3-二-O-岩藻糖基乳糖、2’-O-岩藻糖基乳果糖、乳果糖、葡萄糖或半乳糖。
在一些实施例中，该第二碳水化合物是乳糖。
在一些实施例中，该第二碳水化合物是岩藻糖。
在一些实施例中，该第二碳水化合物是2’,3-二-O-岩藻糖基乳糖。
在一些实施例中，该第二碳水化合物是2’-O-岩藻糖基乳果糖。
在一些实施例中，该第二碳水化合物是乳果糖。
在一些实施例中，该第二碳水化合物是葡萄糖。
在一些实施例中，该第二碳水化合物是半乳糖。
在一些实施例中，该HMO溶液包含至少两种HMO。在一些实施例中，该HMO溶液包含至少三种HMO。在一些实施例中，该HMO溶液包含至少四种HMO。在一些实施例中，该HMO溶液包含至少五种HMO。
在一些实施例中，该HMO溶液包含选自岩藻糖基乳糖、唾液酸基乳糖和LNT中的两种或更多种HMO。在一些这样的实施例中，该岩藻糖基乳糖选自2’-FL和3-FL，并且该唾液酸基乳糖选自3’-SL和6’-SL。
在一些实施例中，该HMO溶液包含2’-FL和3-FL。
在一些实施例中，该HMO溶液包含3’-SL和6’-SL。
通常，除了要纯化的HMO和第二碳水化合物之外，HMO溶液还包含一种或多种成分。此类其他成分可以包括，例如，一价和二价盐、乳糖、寡糖、单糖、氨基酸、多肽、蛋白质、有机酸、核酸等。
在一些实施例中，该HMO溶液还包含(除了要纯化的HMO和第二碳水化合物之外)一种或多种额外的HMO和/或一种或多种其他类型的碳水化合物。
在一些实施例中，该HMO溶液还包含(除了要纯化的HMO和第二碳水化合物之外)一种或多种寡糖。
在一些实施例中，该HMO溶液还包含(除了要纯化的HMO和第二碳水化合物之外)一种或多种额外的HMO。
在一些实施例中，该HMO溶液还包含(除了要纯化的HMO和第二碳水化合物之外)一种或多种额外的HMO，该一种或多种额外的HMO选自2’-FL、3-FL、LNT、6’-SL、3’-SL、乳糖二岩藻四糖、DiFL、LNnT、乳糖-N-岩藻戊糖、乳糖-N-二岩藻己糖、乳糖-N-新二岩藻己糖、乳糖-N-新八糖、乳糖-N-岩藻戊糖、乳糖-N-新岩藻戊糖、3’唾液酸基-3-岩藻糖基乳糖、唾液酸基-乳糖-N-四糖、LS-四糖、3'-唾液酸基乳糖、乳糖-N-三糖、乳糖-N-新岩藻戊糖、乳糖-N-新岩藻戊糖、乳糖-N-二岩藻己糖、6'-半乳糖基乳糖、3'-半乳糖基乳糖、乳糖-N-六糖，和乳糖-N-新六糖。
在一些实施例中，该HMO溶液还包含(除了要纯化的HMO和第二碳水化合物之外)2’-O-岩藻糖基乳果糖。
在一些实施例中，该HMO溶液还包含(除了要纯化的HMO和第二碳水化合物之外)DiFL。
在一些实施例中，该HMO溶液还包含(除了要纯化的HMO和第二碳水化合物之外)乳糖。
在一些实施例中，该HMO溶液还包含(除了要纯化的HMO和第二碳水化合物之外)乳果糖。
在一些实施例中，该HMO溶液还包含(除了要纯化的HMO和第二碳水化合物之外)一种或多种单糖。
在一些实施例中，该HMO溶液还包含(除了要纯化的HMO和第二碳水化合物之外)岩藻糖。
在一些实施例中，该HMO溶液还包含(除了要纯化的HMO和第二碳水化合物之外)葡萄糖。
在一些实施例中，该HMO溶液还包含(除了要纯化的HMO和第二碳水化合物之外)半乳糖。
在一些实施例中，该HMO溶液还包含(除了要纯化的HMO和第二碳水化合物之外)一种或多种一价盐。
在一些实施例中，该HMO溶液还包含(除了要纯化的HMO和第二碳水化合物之外)一种或多种二价盐。
在一些实施例中，该HMO溶液还包含(除了要纯化的HMO和第二碳水化合物之外)一种或多种氨基酸。
在一些实施例中，该HMO溶液还包含(除了要纯化的HMO和第二碳水化合物之外)一种或多种蛋白质。
在一些实施例中，该HMO溶液还包含(除了要纯化的HMO和第二碳水化合物之外)一种或多种有机酸。
在一些实施例中，该HMO溶液还包含(除了要纯化的HMO和第二碳水化合物之外)一种或多种核酸。
在一些实施例中，该HMO溶液包含(或者全部或部分地源于)要纯化的HMO的天然来源，例如，动物乳(例如人乳)。
在一些实施例中，该HMO溶液包含(或者全部或部分地源于)化学合成的产品。在一些实施例中，该HMO溶液包含(或者全部或部分地源于)要纯化的HMO的化学合成的产品。在一些实施例中，该溶液中的其他碳水化合物包括合成中所用的碳水化合物试剂、合成中所用的介质的碳水化合物组分，和/或在合成期间和/或之后形成的碳水化合物。
在一些实施例中，该HMO溶液包含(或者全部或部分地源于)发酵产物。在一些这样的实施例中，HMO溶液是(或者全部或部分地源于)用于制备要纯化的HMO的发酵产物。在一些这样的实施例中，该溶液中的其他碳水化合物来自发酵中所用，并且/或者是在发酵期间和/或之后形成的培养基。在一些实施例中，该发酵包括在包含碳水化合物(诸如乳糖和/或岩藻糖)的含水培养基中培养重组微生物，该重组微生物包含编码能够产生HMO的酶的至少一个重组多核苷酸序列。发酵过程的产物可以称为发酵“产品”或“肉汤”。该产品除了要纯化的HMO之外通常还包含多种成分，包括，例如，一价和二价盐、乳糖、寡糖、单糖、氨基酸、多肽、蛋白质、有机酸、核酸等。
常用于制备HMO的酶的实例包括岩藻糖基转移酶(诸如α-1,2-岩藻糖基转移酶(EC2.4.1.69)、α-1,3-岩藻糖基转移酶、3-半乳糖基-N-乙酰基氨基葡萄糖苷4-α-L-岩藻糖基转移酶(EC 2.4.1.65)、4-半乳糖基-N-乙酰基氨基葡萄糖苷3-α-L-岩藻糖基转移酶(EC2.4.1.152)、肽-O-岩藻糖基转移酶(EC 2.4.1.221))、糖基转移酶(诸如GT1、GT2、GT10GT11、GT23、GT37、GT65、GT68和/或GT74)和唾液酸转移酶(EC 2.4.99.-)。能够产生HMO的酶可以源于但不限于，幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、空肠弯曲菌(Campylobacterjejuni)、盘基网柄菌(Dictyostellium discoideum)、小家鼠(Mus musculus)和智人(Homosapiens)。
在一些实施例中，该要纯化的HMO是岩藻糖基乳糖，并且该HMO溶液包含(或者全部或部分地源于)发酵过程的产物，其中该发酵过程包括在包含碳水化合物(诸如乳糖和/或岩藻糖)的含水培养基中培养重组微生物，该重组微生物包含编码α-1,2-岩藻糖基转移酶(EC 2.4.1.69)或α-1,3-岩藻糖基转移酶(EC 2.4.1.214)的重组多核苷酸序列。
一般而言，当该HMO溶液包含(或者全部或部分地源于)发酵过程的产物时，本说明书的方法包括一步或多步方法步骤，其中将发酵中所用的微生物的细胞生物质从发酵产物分离。通常，这发生在纳米过滤之前。
可以将细胞生物质从发酵产物分离，例如，通过利用过滤、离心、沉降和/或适合于除去细胞生物质的其他过程进行。
在一些实施例中，从发酵产物分离微生物包括超滤(也称为“UF”)。超滤还可以特别有益于例如除去大生物分子，诸如内毒素、蛋白质、核酸和脂多糖。
在一些实施例中，该超滤是利用错流式过滤器进行。通常，超滤膜孔径是约0.1至0.001微米。
在一些实施例中，该超滤进行至少约1天。在一些实施例中，该超滤进行不大于约5天。在一些实施例中，该超滤进行约1天至约5天。在一些实施例中，该超滤进行1天至4天。在一些实施例中，该超滤进行1天至3天。在一些实施例中，该超滤进行1至48hr。在一些实施例中，该超滤进行3至48hr。在一些实施例中，该超滤进行6至48hr。在一些实施例中，该超滤进行9至48hr。在一些实施例中，该超滤进行1至24hr。在一些实施例中，该超滤进行3至24hr。在一些实施例中，该超滤进行6至24hr。在一些实施例中，该超滤进行9至24hr。在一些实施例中，该超滤进行1至18hr。在一些实施例中，该超滤进行3至18hr。在一些实施例中，该超滤进行6至18hr。在一些实施例中，该超滤进行9至18hr。在一些实施例中，该超滤进行1至15hr。在一些实施例中，该超滤进行3至15hr。在一些实施例中，该超滤进行6至15hr。在一些实施例中，该超滤进行9至15hr。在一些实施例中，该超滤进行1至12hr。在一些实施例中，该超滤进行3至12hr。在一些实施例中，该超滤进行6至12hr。在一些实施例中，该超滤进行9至12hr。在一些实施例中，该超滤进行1至9hr。在一些实施例中，该超滤进行3至9hr。在一些实施例中，该超滤进行6至9hr。在一些实施例中，该超滤进行约9hr。在一些实施例中，该超滤进行约12hr。
在一些实施例中，该超滤在不大于约18℃或更小的温度下进行。在一些实施例中，该超滤在不大于16℃的温度下进行。在一些实施例中，该超滤在小于16℃的温度下进行。在一些实施例中，该超滤在不大于15℃的温度下进行。在一些实施例中，该超滤在小于15℃的温度下进行。在一些实施例中，该超滤在不大于10℃的温度下进行。在一些实施例中，该超滤在小于10℃的温度下进行。
在一些实施例中，该超滤在2至18℃的温度下进行。在一些实施例中，该超滤在4至16℃的温度下进行。在一些实施例中，该超滤在2至16℃的温度下进行。在一些实施例中，该超滤在5至15℃的温度下进行。在一些实施例中，该超滤在2至10℃的温度下进行。
在一些实施例中，该超滤在2至18℃的温度下进行约3至约12hr。在一些实施例中，该超滤在2至10℃的温度下进行约1至约48hr。
在一些实施例中，该超滤在小于18℃的温度下进行约3至约12hr。在一些实施例中，该超滤在小于10℃的温度下进行约1至约48hr。
在不大于18℃的温度下进行超滤可以有助于，例如，改进微生物稳定性。在此使用的术语“改进微生物稳定性”是指当与如果在较高温度(例如>20℃)进行超滤而所有其他因素相同的情况下发生的微生物生长相比在该溶液中较少或无微生物生长。
纳米过滤
纳米过滤通常是基于压力驱动的膜过滤过程。纳米过滤膜具有的孔径通常小于微过滤和超滤中所用的孔径。该膜可以是例如，管状、螺旋状或扁平形。
纳米过滤可以通过例如减少体积(例如通过除去水)同时也除去盐和各种小生物分子及其他杂质而浓缩HMO溶液中的HMO。
本说明书部分地提供一种从HMO溶液纯化人乳寡糖的方法。所述方法包括：
●将所述HMO溶液进给到纳米过滤单元中，
●将所述HMO溶液用所述纳米过滤单元过滤以产生浓缩物和渗透物，和
●收集所述浓缩物。
在该方法中，所述HMO溶液包含HMO和另一碳水化合物，二者都在含水介质中。
该纳米过滤产生浓缩物，相比于进给的HMO溶液，该浓缩物富集HMO。在一些这样的实施例中，该浓缩物还富集至少一种额外的HMO。
在一些实施例中，纳米过滤浓缩物富集HMO，该HMO选自岩藻糖基乳糖(诸如2’-FL或3-FL)、唾液酸基乳糖(诸如3’-SL或6’-SL)、LNT、乳糖二岩藻四糖、DiFL、LNnT、乳糖-N-岩藻戊糖、乳糖-N-二岩藻己糖、乳糖-N-新二岩藻己糖、乳糖-N-新八糖、乳糖-N-岩藻戊糖、乳糖-N-新岩藻戊糖、3’唾液酸基-3-岩藻糖基乳糖、唾液酸基-乳糖-N-四糖、LS-四糖、3'-唾液酸基乳糖、乳糖-N-三糖、乳糖-N-新岩藻戊糖、乳糖-N-新岩藻戊糖、乳糖-N-二岩藻己糖、6'-半乳糖基乳糖、3'-半乳糖基乳糖、乳糖-N-六糖和乳糖-N-新六糖。
在一些实施例中，该纳米过滤浓缩物富集岩藻糖基乳糖。
在一些实施例中，该纳米过滤浓缩物富集2’-FL。
在一些实施例中，该纳米过滤浓缩物富集3-FL。
在一些实施例中，该纳米过滤浓缩物富集唾液酸基乳糖。
在一些实施例中，该纳米过滤浓缩物富集3’-SL。
在一些实施例中，该纳米过滤浓缩物富集6’-SL。
在一些实施例中，该纳米过滤浓缩物富集LNT。
在一些实施例中，在纳米过滤期间，上述实施例的纳米过滤浓缩物还富集至少一种额外的HMO。在一些这样的实施例中，该额外的HMO选自岩藻糖基乳糖(诸如2’-FL或3-FL)、唾液酸基乳糖(诸如3’-SL或6’SL)、LNT、乳糖二岩藻四糖、DiFL、LNnT、乳糖-N-岩藻戊糖、乳糖-N-二岩藻己糖、乳糖-N-新二岩藻己糖、乳糖-N-新八糖、乳糖-N-岩藻戊糖、乳糖-N-新岩藻戊糖、3’唾液酸基-3-岩藻糖基乳糖、唾液酸基-乳糖-N-四糖、LS-四糖、3'-唾液酸基乳糖、乳糖-N-三糖、乳糖-N-新岩藻戊糖、乳糖-N-新岩藻戊糖、乳糖-N-二岩藻己糖、6'-半乳糖基乳糖、3'-半乳糖基乳糖、乳糖-N-六糖和乳糖-N-新六糖。
“HMO保留率”是在纳米过滤期间进给到纳米过滤单元中的HMO被保留在纳米过滤浓缩物中的百分比。
在一些实施例中，通过使用更稀释的HMO溶液和/或增大通量来提高HMO保留率。可替代地，在一些实施例中，通过使用更浓缩的HMO溶液和/或减小通量来降低HMO保留率。
在一些实施例中，纳米过滤单元特征在于，当在平均通量5至20kg/m2/hr和HMO浓度50至300g/L下操作时，具有至少约96.0％的所希望的HMO的HMO保留率。在一些这样的实施例中，该保留率是约96.0％至约99.9％。在其他这样的实施例中，该保留率是96.0至99.8％。在其他这样的实施例中，该保留率是96.0至99.7％。在其他这样的实施例中，该保留率是至少96.5％。在其他这样的实施例中，该保留率是96.5至99.8％。在其他这样的实施例中，该保留率是96.5至99.7％。在其他这样的实施例中，该保留率是至少97.0％。在其他这样的实施例中，该保留率是97.0至99.8％。在其他这样的实施例中，该保留率是97.0至99.7％。在其他这样的实施例中，该保留率是97.0至99.5％。在其他这样的实施例中，该保留率是97.3％至99.8％。在其他这样的实施例中，该保留率是97.5至99.8％。在其他这样的实施例中，该保留率是至少98.0％。在其他这样的实施例中，该保留率是至少99.0％。在其他这样的实施例中，该保留率是99.0至99.8％。在其他这样的实施例中，该保留率是99.0％至99.7％。在其他这样的实施例中，该保留率是99.0至99.5％。在其他这样的实施例中，该保留率是至少99.3％。在其他这样的实施例中，该保留率是99.3至99.8％。在其他这样的实施例中，该保留率是至少99.5％。在其他这样的实施例中，该保留率是99.5至99.8％。在其他这样的实施例中，该保留率是至少99.6％。在其他这样的实施例中，该保留率是至少99.7％。在其他这样的实施例中，该保留率是至少99.8％。
在一些实施例中，该纳米过滤单元特征在于，提供至少约85.0％的所希望的HMO的累积收率(包括来自任何渗滤)。在一些这样的实施例中，该收率是85％至99.9％。在其他这样的实施例中，该收率是至少87％。在其他这样的实施例中，该收率是87％至99.9％。在其他这样的实施例中，该收率是至少90％。在其他这样的实施例中，该收率是90％至99.9％。在其他这样的实施例中，该收率是90％至98.0％。在其他这样的实施例中，该收率大于90％。在其他这样的实施例中，该收率大于90％并且不大于98.0％。在其他这样的实施例中，该收率是至少92％。在其他这样的实施例中，该收率是92％至99.9％。在其他这样的实施例中，该收率是至少95％。在其他这样的实施例中，该收率是95％至99.9％。在其他这样的实施例中，该收率是至少约96.0％。在一些这样的实施例中，该收率是约96.0％至约99.8％。在其他这样的实施例中，该收率是96.0至99.8％。在其他这样的实施例中，该收率是96.0至99.7％。在其他这样的实施例中，该收率是至少96.5％。在其他这样的实施例中，该收率是96.5至99.8％。在其他这样的实施例中，该收率是96.5至99.7％。在其他这样的实施例中，该收率是至少97.0％。在其他这样的实施例中，该收率是97.0至99.8％。在其他这样的实施例中，该收率是97.0至99.7％。在其他这样的实施例中，该收率是97.0至99.5％。在其他这样的实施例中，该收率是97.3％至99.8％。在其他这样的实施例中，该收率是97.5至99.8％。在其他这样的实施例中，该收率是至少98.0％。在其他这样的实施例中，该收率是至少99.0％。在其他这样的实施例中，该收率是99.0至99.8％。在其他这样的实施例中，该收率是99.0％至99.7％。在其他这样的实施例中，该收率是99.0至99.5％。
溶液诸如HMO溶液、纳米过滤渗透物和纳米过滤浓缩物的电导率可以通过测量该溶液导电的能力来确定。用于测量电导率的各种探针是商业上可获得的。
“电导率保留率”在纳米过滤期间被计算为进给到纳米过滤单元中的溶液的电导率被纳米过滤浓缩物保留的百分比。
在一些实施例中，纳米过滤单元特征在于，当在平均通量5至20kg/m2/hr和所希望的HMO浓度50至300g/L下操作时，具有不大于约90％的电导率保留率。在一些这样的实施例中，该电导率保留率不大于85％。在其他这样的实施例中，该电导率保留率不大于83％。在其他这样的实施例中，该电导率保留率不大于80％。在其他这样的实施例中，该电导率保留率不大于79％。在其他这样的实施例中，该电导率保留率不大于75％。在其他这样的实施例中，该电导率保留率不大于70％。在其他这样的实施例中，该电导率保留率不大于67％。在其他这样的实施例中，该电导率保留率不大于65％。在其他这样的实施例中，该电导率保留率不大于60％。在其他这样的实施例中，该电导率保留率不大于55％。在其他这样的实施例中，该电导率保留率不大于50％。
多价盐(例如磷酸盐和硫酸盐)的存在时常导致比一价盐(例如氯化物和乙酸盐)更大的电导率保留率。电导率保留率也时常在较高pH下更高，特别是当多价盐存在时。不拘于任何特定的理论，这被认为是至少部分地由于在较低pH下多价盐转变为一价盐。
在一些实施例中，纳米过滤单元特征在于，当在平均通量5至20kg/m2/hr和HMO浓度50至300g/L下操作时，具有至少约96.0％的所希望的HMO的HMO保留率和不大于约90％的电导率保留率。在一些这样的实施例中，所希望的HMO的HMO保留率是至少99.0％，并且电导率保留率不大于70％。在其他这样的实施例中，所希望的HMO的HMO保留率是99.0％至99.7％，并且电导率保留率不大于70％。在其他这样的实施例中，所希望的HMO的HMO保留率大于99.0％，并且电导率保留率不大于70％。在其他这样的实施例中，所希望的HMO的HMO保留率大于99.0％，并且电导率保留率不大于85％。在其他这样的实施例中，HMO保留率大于99.3％，并且电导率保留率不大于85％。在其他这样的实施例中，HMO保留率大于99.7％，并且电导率保留率不大于83％。
本说明书中使用的术语“除盐率”是指在纳米过滤期间从HMO溶液除去的盐量。除盐率可以利用以下方程中的任一个进行计算：
Figure BDA0003261492860000181
或：
Figure BDA0003261492860000182
术语“m”是指质量，术语“进料”是指进给到纳米过滤单元中的HMO溶液。
在一些实施例中，纳米过滤单元特征在于，具有至少约40％的除盐率。在一些实施例中，当在平均通量5至20kg/m2/hr和HMO浓度50至300g/L下操作时，该除盐率是约40％至约96％。在一些这样的实施例中，该除盐率是40％至96％。在其他这样的实施例中，该除盐率是至少50％。在其他这样的实施例中，该除盐率是50％至96％。在其他这样的实施例中，该除盐率是至少约60％。在其他这样的实施例中，该除盐率是60％至96％。在其他这样的实施例中，该除盐率是最少68％。在其他这样的实施例中，该除盐率是68％至96％。在其他这样的实施例中，该除盐率是至少69％。在其他这样的实施例中，该除盐率是69％至96％。在其他这样的实施例中，该除盐率是最少70％。在其他这样的实施例中，该除盐率是70％至96％。在其他这样的实施例中，该除盐率是最少75％。在其他这样的实施例中，该除盐率是75％至96％。在其他这样的实施例中，该除盐率是最少80％。在其他这样的实施例中，该除盐率是80％至96％。在其他这样的实施例中，该除盐率是最少85％。在其他这样的实施例中，该除盐率是85％至96％。在其他这样的实施例中，该除盐率是至少90％。在其他这样的实施例中，该除盐率是90％至96％。在其他这样的实施例中，该除盐率是至少92％。在其他这样的实施例中，该除盐率是92％至96％。在其他这样的实施例中，该除盐率是至少95％。在其他这样的实施例中，该除盐率是95％至96％。
多价盐(例如磷酸盐和硫酸盐)的存在时常导致比一价盐(例如氯化物和乙酸盐)更大的除盐率。除盐率也时常在较高pH下更高，特别是当多价盐存在时。不拘于任何特定的理论，这被认为是至少部分地由于在较低pH下多价盐转变为一价盐。
在一些实施例中，纳米过滤单元特征在于，当在平均通量5至20kg/m2/hr和HMO浓度50至300g/L下操作时，具有至少约85.0％的所希望的HMO的HMO保留率和至少约40％的除盐率。在一些这样的实施例中，所希望的HMO的HMO保留率是约85％至99.9％，并且该除盐率是40％至96％。在其他这样的实施例中，所希望的HMO的HMO保留率是约85％至99.9％，并且该除盐率是68％至96％。在其他这样的实施例中，所希望的HMO的HMO保留率是约85％至99.9％，并且该除盐率是69％至96％。在其他这样的实施例中，所希望的HMO的HMO保留率是约85％至99.9％，并且该除盐率是70％至96％。在其他这样的实施例中，所希望的HMO的HMO保留率是约85％至99.9％，并且该除盐率是75％至96％。在其他这样的实施例中，所希望的HMO的HMO保留率是约90％至99.9％，并且该除盐率是90％至96％。
在一些实施例中，该纳米过滤包括渗滤。在一些这样的实施例中，渗滤包括将溶剂添加到纳米过滤单元的进料流。在一个实施例中，该溶剂是水。
在其中纳米过滤包括渗滤的一些实施例中，其中将溶剂(例如水)与HMO溶液一起进给到纳米过滤单元中，并且进给到纳米过滤单元中的溶剂与HMO溶液的重量比小于1.6(归一化到具有4％(w/w)干物质组成的HMO溶液)。在一些这样的实施例中，进给到纳米过滤单元中的溶剂与HMO溶液的重量比是约0.09至约1.5。在一些这样的实施例中，进给到纳米过滤单元中的溶剂与HMO溶液的重量比是0.09至1.5。在一些这样的实施例中，进给到纳米过滤单元中的溶剂与HMO溶液的重量比是0.3至1.5。在一些这样的实施例中，进给到纳米过滤单元中的溶剂与HMO溶液的重量比是0.6至1.5。在一些这样的实施例中，进给到纳米过滤单元中的溶剂与HMO溶液的重量比是0.9至1.5。在一些这样的实施例中，进给到纳米过滤单元中的溶剂与HMO溶液的重量比是1.0至1.5。在其他这样的实施例中，进给到纳米过滤单元中的溶剂与HMO溶液的重量比小于1.5。在其他这样的实施例中，进给到纳米过滤单元中的溶剂与HMO溶液的重量比不大于1.0。在其他这样的实施例中，进给到纳米过滤单元中的溶剂与HMO溶液的重量比是0.09至1.0。在其他这样的实施例中，进给到纳米过滤单元中的溶剂与HMO溶液的重量比是0.3至1.0。在其他这样的实施例中，进给到纳米过滤单元中的溶剂与HMO溶液的重量比是0.6至1.0。在其他这样的实施例中，进给到纳米过滤单元中的溶剂与HMO溶液的重量比是0.75至1.0。在其他这样的实施例中，进给到纳米过滤单元中的溶剂与HMO溶液的重量比不大于0.9。在其他这样的实施例中，进给到纳米过滤单元中的溶剂与HMO溶液的重量比是0.09至0.9。在其他这样的实施例中，进给到纳米过滤单元中的溶剂与HMO溶液的重量比是0.3至0.9。在其他这样的实施例中，进给到纳米过滤单元中的溶剂与HMO溶液的重量比是0.6至0.9。在其他这样的实施例中，进给到纳米过滤单元中的溶剂与HMO溶液的重量比不大于0.75。在其他这样的实施例中，进给到纳米过滤单元中的溶剂与HMO溶液的重量比是0.09至0.75。在其他这样的实施例中，进给到纳米过滤单元中的溶剂与HMO溶液的重量比是0.3至0.75。在其他这样的实施例中，进给到纳米过滤单元中的溶剂与HMO溶液的重量比是0.6至0.75。在其他这样的实施例中，进给到纳米过滤单元中的溶剂与HMO溶液的重量比不大于0.6。在其他这样的实施例中，进给到纳米过滤单元中的溶剂与HMO溶液的重量比是0.09至0.6。在其他这样的实施例中，进给到纳米过滤单元中的溶剂与HMO溶液的重量比是0.3至0.6。在其他这样的实施例中，进给到纳米过滤单元中的溶剂与HMO溶液的重量比小于0.4。在其他这样的实施例中，进给到纳米过滤单元中的溶剂与HMO溶液的重量比是0.09至0.4。在其他这样的实施例中，进给到纳米过滤单元中的溶剂与HMO溶液的重量比是0.3至0.4。在其他这样的实施例中，进给到纳米过滤单元中的溶剂与HMO溶液的重量比小于0.3。在其他这样的实施例中，进给到纳米过滤单元中的溶剂与HMO溶液的重量比是0.09至0.3。
上述水-比-进料重量比是基于HMO溶液进料，其中干物质组成(即，非水组分构成HMO溶液进料的重量百分比)已被归一化到4％(w/w)。如果所用的HMO溶液具有不同的干物质组成，则水-比-进料之比通常可以成比例地进行换算。例如，具有归一化至4％(w/w)的干物质组成的HMO溶液进料的水-比-进料重量比0.6对应于具有2％(w/w)干物质组成的HMO溶液进料的水-比-进料重量比0.3(即，0.3＝0.6x(2％÷4％)。反之，具有特定干物质组成的HMO溶液进料的水-比-进料重量比可以换算成具有归一化到4％(w/w)的干物质组成的HMO溶液进料的水-比-进料重量比。为了示例说明，如果将1376kg的具有2.9％(w/w)干物质组成的HMO溶液进料与617kg渗滤水一起进给到纳米过滤单元中，则水-比-进料重量比是0.448(这等于617÷1376)。这对应于具有归一化到4％的干物质组成的HMO溶液进料的水-比-进料重量比0.618(即，0.618＝0.448x(4％÷2.9％)。
在一些实施例中，纳米过滤包括渗滤，其中将水与HMO溶液一起以小于约1.6(归一化到具有4％(w/w)干物质组成的HMO溶液)的水-比-进料重量比进给到纳米过滤单元中。在一些这样的实施例中，该纳米过滤提供：
●至少约40％的除盐率，和/或
●至少约85.0％的所希望的HMO的收率。
在一些这样的实施例中，该除盐率是约40％至约96％。在其他这样的实施例中，该除盐率是40％至96％。在其他这样的实施例中，该除盐率是至少68％。在其他这样的实施例中，该除盐率是68至96％。在其他这样的实施例中，该除盐率是至少90％。在其他这样的实施例中，该除盐率是90至96％。在一些这样的实施例中，所希望的HMO收率是85.0％至99.9％。在其他这样的实施例中，该收率是至少90.0％。在其他这样的实施例中，该收率是90.0％至99.9％。在其他这样的实施例中，该收率大于90.0％。其他这样的实施例包括前述除盐率和收率的任何组合。
在一些实施例中，纳米过滤包括渗滤，其中将水与HMO溶液一起以不大于1.5(归一化到具有4％(w/w)干物质组成的HMO溶液)的水-比-进料重量比进给到纳米过滤单元中。在一些这样的实施例中，该纳米过滤提供：
●至少约40％的除盐率，和/或
●至少约85.0％的所希望的HMO的收率。
在一些这样的实施例中，该除盐率是约40％至约96％。在其他这样的实施例中，该除盐率是40％至96％。在其他这样的实施例中，该除盐率是至少68％。在其他这样的实施例中，该除盐率是68至96％。在其他这样的实施例中，该除盐率是至少90％。在其他这样的实施例中，该除盐率是90至96％。在一些这样的实施例中，所希望的HMO收率是85.0％至99.9％。在其他这样的实施例中，该收率是至少90.0％。在其他这样的实施例中，该收率是90.0％至99.9％。在其他这样的实施例中，该收率大于90.0％。其他这样的实施例包括前述除盐率和收率的任何组合。
在一些实施例中，纳米过滤包括渗滤，其中将水与HMO溶液一起以不大于1.0(归一化到具有4％(w/w)干物质组成的HMO溶液)的水-比-进料重量比进给到纳米过滤单元中。在一些这样的实施例中，该纳米过滤提供：
●至少约40％的除盐率，和/或
●至少约85.0％的所希望的HMO的收率。
在一些这样的实施例中，该除盐率是约40％至约96％。在其他这样的实施例中，该除盐率是40％至96％。在其他这样的实施例中，该除盐率是至少68％。在其他这样的实施例中，该除盐率是68至96％。在其他这样的实施例中，该除盐率是至少90％。在其他这样的实施例中，该除盐率是90至96％。在一些这样的实施例中，所希望的HMO收率是85.0％至99.9％。在其他这样的实施例中，该收率是至少90.0％。在其他这样的实施例中，该收率是90.0％至99.9％。在其他这样的实施例中，该收率大于90.0％。其他这样的实施例包括前述除盐率和收率的任何组合。
在一些实施例中，纳米过滤包括渗滤，其中将水与HMO溶液一起以0.6至0.9(归一化到具有4％(w/w)干物质组成的HMO溶液)的水-比-进料重量比进给到纳米过滤单元中。在一些这样的实施例中，该纳米过滤提供：
●至少约40％的除盐率，和/或
●至少约85.0％的所希望的HMO的收率。
在一些这样的实施例中，该除盐率是约40％至约96％。在其他这样的实施例中，该除盐率是40％至96％。在其他这样的实施例中，该除盐率是至少68％。在其他这样的实施例中，该除盐率是68至96％。在其他这样的实施例中，该除盐率是至少90％。在其他这样的实施例中，该除盐率是90至96％。在一些这样的实施例中，所希望的HMO收率是85.0％至99.9％。在其他这样的实施例中，该收率是至少90.0％。在其他这样的实施例中，该收率是90.0％至99.9％。在其他这样的实施例中，该收率大于90.0％。其他这样的实施例包括前述除盐率和收率的任何组合。
在一些实施例中，纳米过滤包括渗滤，其中将水与HMO溶液一起以0.6至0.75(归一化到具有4％(w/w)干物质组成的HMO溶液)的水-比-进料重量比进给到纳米过滤单元中。在一些这样的实施例中，该纳米过滤提供：
●至少约40％的除盐率，和/或
●至少85.0％的所希望的HMO的收率。
在一些这样的实施例中，该除盐率是约40％至约96％。在其他这样的实施例中，该除盐率是40％至96％。在其他这样的实施例中，该除盐率是至少68％。在其他这样的实施例中，该除盐率是68至96％。在其他这样的实施例中，该除盐率是至少90％。在其他这样的实施例中，该除盐率是90至96％。在一些这样的实施例中，所希望的HMO收率是85.0％至99.9％。在其他这样的实施例中，该收率是至少90.0％。在其他这样的实施例中，该收率是90.0％至99.9％。在其他这样的实施例中，该收率大于90.0％。其他这样的实施例包括前述除盐率和收率的任何组合。
在一些实施例中，纳米过滤包括渗滤，其中将水与HMO溶液一起以0.3至0.6(归一化到具有4％(w/w)干物质组成的HMO溶液)的水-比-进料重量比进给到纳米过滤单元中。在一些这样的实施例中，该纳米过滤提供：
●至少约40％的除盐率，和/或
●至少约85.0％的所希望的HMO的收率。
在一些这样的实施例中，该除盐率是约40％至约96％。在其他这样的实施例中，该除盐率是40％至96％。在其他这样的实施例中，该除盐率是至少68％。在其他这样的实施例中，该除盐率是68至96％。在其他这样的实施例中，该除盐率是至少90％。在其他这样的实施例中，该除盐率是90至96％。在一些这样的实施例中，所希望的HMO收率是85.0％至99.9％。在其他这样的实施例中，该收率是至少90.0％。在其他这样的实施例中，该收率是90.0％至99.9％。在其他这样的实施例中，该收率大于90.0％。其他这样的实施例包括前述除盐率和收率的任何组合。
在一些实施例中，纳米过滤包括渗滤，其中将水与HMO溶液一起以小于0.4(归一化到具有4％(w/w)干物质组成的HMO溶液)的水-比-进料重量比进给到纳米过滤单元中。在一些这样的实施例中，该纳米过滤提供：
●至少约40％的除盐率，和/或
●至少约85.0％的所希望的HMO的收率。
在一些这样的实施例中，该除盐率是约40％至约96％。在其他这样的实施例中，该除盐率是40％至96％。在其他这样的实施例中，该除盐率是至少68％。在其他这样的实施例中，该除盐率是68至96％。在其他这样的实施例中，该除盐率是至少90％。在其他这样的实施例中，该除盐率是90至96％。在一些这样的实施例中，所希望的HMO收率是85.0％至99.9％。在其他这样的实施例中，该收率是至少90.0％。在其他这样的实施例中，该收率是90.0％至99.9％。在其他这样的实施例中，该收率大于90.0％。其他这样的实施例包括前述除盐率和收率的任何组合。
在一些实施例中，纳米过滤包括渗滤，其中将水与HMO溶液一起以不大于0.3(归一化到具有4％(w/w)干物质组成的HMO溶液)的水-比-进料重量比进给到纳米过滤单元中。在一些这样的实施例中，该纳米过滤提供：
●至少约40％的除盐率，和/或
●至少约85.0％的所希望的HMO的收率。
在一些这样的实施例中，该除盐率是约40％至约96％。在其他这样的实施例中，该除盐率是40％至96％。在其他这样的实施例中，该除盐率是至少68％。在其他这样的实施例中，该除盐率是68至96％。在其他这样的实施例中，该除盐率是至少90％。在其他这样的实施例中，该除盐率是90至96％。在一些这样的实施例中，所希望的HMO收率是85.0％至99.9％。在其他这样的实施例中，该收率是至少90.0％。在其他这样的实施例中，该收率是90.0％至99.9％。在其他这样的实施例中，该收率大于90.0％。其他这样的实施例包括前述除盐率和收率的任何组合。
在一些实施例中，纳米过滤包括渗滤，其中将水与HMO溶液一起以0.09至0.3(归一化到具有4％(w/w)干物质组成的HMO溶液)的水-比-进料重量比进给到纳米过滤单元中。在一些这样的实施例中，该纳米过滤提供：
●至少约40％的除盐率，和/或
●至少约85.0％的所希望的HMO的收率。
在一些这样的实施例中，该除盐率是约40至约96％。在其他这样的实施例中，该除盐率是40至96％。在其他这样的实施例中，该除盐率是至少68％。在其他这样的实施例中，该除盐率是68至96％。在其他这样的实施例中，该除盐率是至少90％。在其他这样的实施例中，该除盐率是90至96％。在一些这样的实施例中，所希望的HMO的收率是85.0至99.9％。在其他这样的实施例中，该收率是至少90.0％。在其他这样的实施例中，该收率是90.0至99.9％。在其他这样的实施例中，该收率大于90.0％。其他这样的实施例包括前述除盐率和收率的任何组合。
在一些实施例中，从HMO溶液除去的盐包括NaCl、MgSO4、钾磷酸盐(诸如KH2PO4和K2HPO4)和/或铵盐(诸如铵硫酸盐和铵磷酸盐)。
在一些实施例中，从HMO溶液除去的盐包括NaCl和/或MgSO4。
在一些实施例中，该纳米过滤单元包括膜，当在温度25℃、浓度2g/l、压力8巴和pH6至7下测量时，该膜具有至少约50％的MgSO4保留率。在一些这样的实施例中，该MgSO4保留率是约50至约99％。在其他这样的实施例中，该MgSO4保留率是50至99％。在其他这样的实施例中，该MgSO4保留率是70至98％。在其他这样的实施例中，该MgSO4保留率是75至98％。在其他这样的实施例中，该MgSO4保留率是80至97％。在其他这样的实施例中，该MgSO4保留率是90至97％。在其他这样的实施例中，该MgSO4保留率是90至96％。在其他这样的实施例中，该MgSO4保留率大于90％。在其他这样的实施例中，该MgSO4保留率大于90％并且不大于约98％。在其他这样的实施例中，该MgSO4保留率是至少90.5％。在其他这样的实施例中，该MgSO4保留率是90.5至98％。在其他这样的实施例中，该MgSO4保留率是至少91％。在其他这样的实施例中，该MgSO4保留率是91至约98％。在其他这样的实施例中，该MgSO4保留率是91至96％。在其他这样的实施例中，该MgSO4保留率是至少92％。在其他这样的实施例中，该MgSO4保留率是92至约98％。在其他这样的实施例中，该MgSO4保留率是92至96％。
在一些实施例中，该纳米过滤单元包括膜，当在温度25℃、浓度2g/l、压力8巴和pH6至7下测量时，该膜具有最高达约60％(即，0至约60％)的NaCl保留率。在一些这样的实施例中，该NaCl保留率是5至40％。在其他这样的实施例中，该NaCl保留率是10至35％。在其他这样的实施例中，该NaCl保留率是10至25％。在其他这样的实施例中，该NaCl保留率是14至22％。在其他这样的实施例中，该NaCl保留率是16至20％。
在一些实施例中，该纳米过滤单元包括膜，当在温度25℃、浓度2g/l、压力8巴和pH6至7下测量时，该膜具有至少约50％的MgSO4保留率和最高达约60％的NaCl保留率。在一些这样的实施例中，MgSO4保留率是约50至约99％，并且NaCl保留率最高达约60％。在其他这样的实施例中，MgSO4保留率是80至97％，并且NaCl保留率是10至25％。
在一些实施例中，该纳米过滤单元包括膜，当在温度5至15℃、浓度2,000至15,000mg/kg、通量5至20kg/m2/hr和pH 6至7下测量时，该膜具有至少约50％的SO4保留率。在一些这样的实施例中，该SO4保留率是约50％至约99％。在其他这样的实施例中，该SO4保留率是70％至98％。在其他这样的实施例中，该SO4保留率是80％至98％。在其他这样的实施例中，该SO4保留率是90％至97％。在其他这样的实施例中，该SO4保留率是91％至96％。在其他这样的实施例中，该SO4保留率是94％至96％。
在一些实施例中，该纳米过滤单元包括膜，当在温度5至15℃、浓度2,000至15,000mg/kg、通量5至20kg/m2/hr和pH 6至7下测量时，该膜具有最高达约98％(即0至约98％)的PO4保留率。在一些这样的实施例中，该PO4保留率是约30至约90％。在一些这样的实施例中，该PO4保留率最高达70％。在其他这样的实施例中，该PO4保留率是40至60％。在其他这样的实施例中，该PO4保留率是50至60％。在其他这样的实施例中，该PO4保留率是52至55％。
在一些实施例中，该纳米过滤单元包括膜，当在温度25℃、浓度20g/L、通量5至20kg/m2/hr和pH 8下测量时，该膜具有至少约80％的乳糖保留率。在一些这样的实施例中，该乳糖保留率是约80至约99％。在其他这样的实施例中，该乳糖保留率是80至99％。在其他这样的实施例中，该乳糖保留率是80至99％。在其他这样的实施例中，该乳糖保留率是85至98％。在其他这样的实施例中，该乳糖保留率是89至97％。在其他这样的实施例中，该乳糖保留率是89至96％。在其他这样的实施例中，该乳糖保留率是89至93％。在其他这样的实施例中，该乳糖保留率大于90％。在其他这样的实施例中，该乳糖保留率是90.5至约99％。在其他这样的实施例中，该乳糖保留率是至少91％。在其他这样的实施例中，该乳糖保留率是约91％。在其他这样的实施例中，该乳糖保留率是91至约99％。
在一些实施例中，纳米过滤膜具有至少约300道尔顿的分子量截止值。在一些实施例中，纳米过滤具有不大于约1000道尔顿的分子量截止值。在一些实施例中，纳米过滤膜具有约300至约1000道尔顿的分子量截止值。在一些实施例中，纳米过滤膜具有300至800道尔顿的分子量截止值。在一些实施例中，纳米过滤膜具有300至750道尔顿的分子量截止值。在一些实施例中，纳米过滤膜具有300至700道尔顿的分子量截止值。在一些实施例中，纳米过滤膜具有300至650道尔顿的分子量截止值。在一些实施例中，纳米过滤膜具有300至600道尔顿的分子量截止值。在一些实施例中，纳米过滤膜具有小于600道尔顿的分子量截止值。在一些实施例中，纳米过滤膜具有不大于590道尔顿的分子量截止值。在一些实施例中，纳米过滤膜具有300至590道尔顿的分子量截止值。在一些实施例中，纳米过滤膜具有小于590道尔顿的分子量截止值。在一些实施例中，纳米过滤膜具有300至550道尔顿的分子量截止值。在一些实施例中，纳米过滤膜具有约300至约500道尔顿的分子量截止值。在一些实施例中，纳米过滤膜具有不大于500道尔顿的分子量截止值。在一些实施例中，纳米过滤膜具有300至500道尔顿的分子量截止值。在一些实施例中，纳米过滤膜具有350至500道尔顿的分子量截止值。在一些实施例中，纳米过滤膜具有小于500道尔顿的分子量截止值。在一些实施例中，纳米过滤膜具有350至450道尔顿的分子量截止值。在一些实施例中，纳米过滤膜具有400至450道尔顿的分子量截止值。
在一些实施例中，该纳米过滤单元包括膜，当在温度25℃、浓度2g/l、压力8巴和pH6至7下测量时，该膜具有约300至约800道尔顿的分子量截止值和至少约50％的MgSO4保留率。在一些这样的实施例中，分子量截止值是约300至约750道尔顿，并且MgSO4保留率是50至99％。在其他这样的实施例中，分子量截止值是约300至约700道尔顿，并且MgSO4保留率是50至99％。在其他这样的实施例中，分子量截止值是约300至约650道尔顿，并且MgSO4保留率是50至99％。在其他这样的实施例中，分子量截止值是约300至约600道尔顿，并且MgSO4保留率是50至99％。在其他这样的实施例中，分子量截止值小于600道尔顿，并且MgSO4保留率是50至99％。在其他这样的实施例中，分子量截止值是约300至约500道尔顿，并且MgSO4保留率是50至99％。在其他这样的实施例中，分子量截止值是约300至约500道尔顿，并且MgSO4保留率是70至98％。在其他这样的实施例中，分子量截止值是约300至约500道尔顿，并且MgSO4保留率是80至97％。在其他这样的实施例中，分子量截止值是约300至约500道尔顿，并且MgSO4保留率是90至96％。
在一些实施例中，该膜是
Figure BDA0003261492860000301
XN45(迈纳德公司(戈利塔，加利福尼亚州))。XN45据报告具有大约300-500道尔顿的分子量截止值；并且在温度25℃、浓度2g/l浓度、压力7.6巴、温度25℃和pH 8下具有96％MgSO4保留率。
在一些实施例中，该纳米过滤在不大于约18℃的温度下进行。在一些实施例中，该纳米过滤在不大于约18℃的温度下进行。在一些实施例中，该纳米过滤在2至18℃的温度下进行。在一些实施例中，该纳米过滤在小于18℃的温度下进行。在一些实施例中，该纳米过滤在不大于16℃的温度下进行。在一些实施例中，该纳米过滤在2至16℃的温度下进行。在一些实施例中，该纳米过滤在4至16℃的温度下进行。在一些实施例中，该纳米过滤在不大于15℃的温度下进行。在一些实施例中，该纳米过滤在4至15℃的温度下进行。在一些实施例中，该纳米过滤在5至15℃的温度下进行。在一些实施例中，该纳米过滤在不大于14℃的温度下进行。在一些实施例中，该纳米过滤在5至14℃的温度下进行。在一些实施例中，该纳米过滤在不大于12℃的温度下进行。在一些实施例中，该纳米过滤在5至12℃的温度下进行。在一些实施例中，该纳米过滤在不大于约10℃的温度下进行。在一些实施例中，该纳米过滤在不大于10℃的温度下进行。在一些实施例中，该纳米过滤在小于10℃的温度下进行。在一些实施例中，该纳米过滤在4至10℃的温度下进行。在一些实施例中，该纳米过滤在5至10℃的温度下进行。在一些实施例中，该纳米过滤在小于10℃的温度下进行。在一些实施例中，该纳米过滤在2至9.5℃的温度下进行。在一些实施例中，该纳米过滤在3至9.5℃的温度下进行。在一些实施例中，该纳米过滤在小于9.5℃的温度下进行。在一些实施例中，该纳米过滤在不大于9℃的温度下进行。在一些实施例中，该纳米过滤在2至9℃的温度下进行。在一些实施例中，该纳米过滤在4至9℃的温度下进行。在一些实施例中，该纳米过滤在5至9℃的温度下进行。在一些实施例中，该纳米过滤在小于9℃的温度下进行。在一些实施例中，该纳米过滤在2至8℃的温度下进行。在一些实施例中，该纳米过滤在3至8℃的温度下进行。在一些实施例中，该纳米过滤在小于8℃的温度下进行。在一些实施例中，该纳米过滤在2至7℃的温度下进行。在一些实施例中，该纳米过滤在3至7℃的温度下进行。
在不大于18℃的温度下进行纳米过滤可以有利于，例如，改进微生物稳定性。在此使用的术语“改进微生物稳定性”是指与在较高温度(诸如20℃或更高)进行纳米过滤而所有其他因素相同的情况相比在纳米过滤期间在HMO溶液和/或浓缩物中较少或无微生物生长。
在一些实施例中，在纳米过滤HMO溶液期间，在HMO溶液和/或浓缩物中存在低或无微生物生长。
在一些实施例中，该纳米过滤进行至少约1天。在一些实施例中，该纳米过滤进行不大于约5天。在一些实施例中，该纳米过滤进行约1至约5天。在一些实施例中，该纳米过滤进行1至4天。在一些实施例中，该纳米过滤进行1至3天。在一些实施例中，该纳米过滤进行至少1hr。在一些实施例中，该纳米过滤进行不大于48hr。在一些实施例中，该纳米过滤进行1至48hr。在一些实施例中，该纳米过滤进行3至48hr。在一些实施例中，该纳米过滤进行6至48hr。在一些实施例中，该纳米过滤进行9至48hr。在一些实施例中，该纳米过滤进行不大于24hr。在一些实施例中，该纳米过滤进行1至24hr。在一些实施例中，该纳米过滤进行3至24hr。在一些实施例中，该纳米过滤进行6至24hr。在一些实施例中，该纳米过滤进行9至24hr。在一些实施例中，该纳米过滤进行不大于18hr。在一些实施例中，该纳米过滤进行1至18hr。在一些实施例中，该纳米过滤进行3至18hr。在一些实施例中，该纳米过滤进行6至18hr。在一些实施例中，该纳米过滤进行9至18hr。在一些实施例中，该纳米过滤进行不大于15hr。在一些实施例中，该纳米过滤进行1至15hr。在一些实施例中，该纳米过滤进行3至15hr。在一些实施例中，该纳米过滤进行6至15hr。在一些实施例中，该纳米过滤进行9至15hr。在一些实施例中，该纳米过滤进行不大于12hr。在一些实施例中，该纳米过滤进行1至12hr。在一些实施例中，该纳米过滤进行3至12hr。在一些实施例中，该纳米过滤进行6至12hr。在一些实施例中，该纳米过滤进行不大于9hr。在一些实施例中，该纳米过滤进行9至12hr。在一些实施例中，该纳米过滤进行1至9hr。在一些实施例中，该纳米过滤进行3至9hr。在一些实施例中，该纳米过滤进行6至9hr。在一些实施例中，该纳米过滤进行约9hr。在一些实施例中，该纳米过滤进行约12hr。
在一些实施例中，纳米过滤在通量2至20kg/m2/hr(或L/m2/hr(也称为“LMH”))下进行。在一些实施例中，纳米过滤在通量5至20kg/m2/hr(或L/m2/hr)下进行。在一些实施例中，纳米过滤在通量10至20kg/m2/hr(或L/m2/hr)下进行。在此，术语“通量”是指在整个纳米过滤期间的平均通量。
在一些实施例中，纳米过滤是利用具有约40至约200g/L的所希望的HMO浓度的HMO溶液进行。在一些实施例中，纳米过滤是利用具有50至150g/L的所希望的HMO浓度的HMO溶液进行。
在一些实施例中，该纳米过滤是在pH小于约6.4下进行。在一些实施例中，该纳米过滤是在pH大于约3.0下进行。在一些实施例中，该纳米过滤是在pH约3.0至约6.4下进行。在一些实施例中，该纳米过滤是在pH小于6.0下进行。在一些实施例中，该纳米过滤是在pH3.0至5.5下进行。在一些实施例中，该纳米过滤是在pH约5.5下进行。在一些实施例中，该纳米过滤是在pH小于5.5下进行。在一些实施例中，该纳米过滤是在pH约5.4下进行。在一些实施例中，该纳米过滤是在pH小于5.4下进行。在一些实施例中，该纳米过滤是在pH 3.0至5.3下进行。在一些实施例中，该纳米过滤是在pH 3.2至5.3下进行。在一些实施例中，该纳米过滤是在pH约5.3下进行。在一些实施例中，该纳米过滤是在pH小于5.3下进行。在一些实施例中，该纳米过滤是在pH 3.2至5.2下进行。在一些实施例中，该纳米过滤是在pH 3.3至5.2下进行。在一些实施例中，该纳米过滤是在pH 3.4至5.2下进行。在一些实施例中，该纳米过滤是在pH约5.2下进行。在一些实施例中，该纳米过滤是在pH小于5.2下进行。在一些实施例中，该纳米过滤是在pH约5.1下进行。在一些实施例中，该纳米过滤是在pH约5.0下进行。在一些实施例中，该纳米过滤是在pH小于5.0下进行。在一些实施例中，该纳米过滤是在pH小于4.5下进行。在一些实施例中，该纳米过滤是在pH小于4.0下进行。在一些实施例中，该纳米过滤是在pH约3.5下进行。在一些实施例中，该纳米过滤是在pH小于3.5下进行。在一些实施例中，该纳米过滤是在pH约3.4下进行。在一些实施例中，the纳米过滤是在pH小于3.3下进行。
在一些实施例中，对HMO溶液的纳米过滤在低pH(例如约3.0至约5.5)下进行以改进膜对所希望的HMO的保留率。例如，在一些实施例中，对所希望的HMO大于97％的保留率通过利用pH约3.0至约5.5来获得，其中使用pH大于6.0将反而导致保留率小于97.0％。
附加处理
在一些实施例中，该方法包括对HMO进料溶液和/或纳米过滤浓缩物进行一种或多种以下处理：酶处理(例如乳糖的酶水解)、消泡剂去除、电渗析、色谱法、阳离子交换、阴离子交换、混合床离子交换、蒸发、活性炭、结晶、蒸发和/或喷雾干燥。
附加处理通常可以以各种顺序进行，并且在该方法的不同点重复进行。在一些实施例中，该方法包括纳米过滤以及上述附加处理中的至少两种的组合。在一些实施例中，该方法包括纳米过滤以及上述附加处理中的至少三种的组合。
在一些实施例中，该方法包括活性炭处理。活性炭处理可以用于除去产生颜色的材料以及其他不希望的材料诸如较大寡糖。在一些实施例中，该方法包括两次或更多次活性炭处理。在一些实施例中，该方法包括在纳米过滤步骤之前活性炭处理。在一些实施例中，该方法包括在纳米过滤步骤之后活性炭处理。
在一些实施例中，该方法包括除去上游(例如在发酵期间)所用的消泡剂。在一些实施例中，该方法包括在该纳米过滤之前的消泡剂去除步骤。
在一些实施例中，该方法包括至少一个阳离子交换步骤。在一些这样的实施例中，该方法包括发生在纳米过滤步骤之前的阳离子交换步骤。在其他这样的实施例中，该方法包括发生在纳米过滤步骤之后的阳离子交换步骤。在一些实施例中，该方法包括至少一个阴离子交换步骤。在一些这样的实施例中，该方法包括发生在纳米过滤步骤之前的阴离子交换步骤。在其他这样的实施例中，该方法包括发生在纳米过滤步骤之后的阴离子交换步骤。在一些实施例中，该方法包括阳离子交换步骤和阴离子交换步骤。在一些这样的实施例中，该方法包括都发生在纳米过滤步骤之前的阳离子交换步骤和阴离子交换步骤。在一些这样的实施例中，该方法包括都发生在纳米过滤步骤之后的阳离子交换步骤和阴离子交换步骤。
在一些实施例中，该方法包括(两步或更多步)纳米过滤步骤。进一步纳米过滤可以有助于例如进一步缩小浓缩物的体积。
在一些实施例中，对浓缩物进行蒸发。这可以有助于例如通过除去溶剂(例如水)而浓缩HMO。在一些实施例中，该蒸发在约20至约80℃的温度下进行。在一些实施例中，该蒸发在25至75℃的温度下进行。在一些实施例中，该蒸发在30至70℃的温度下进行。在一些实施例中，该蒸发在30至65℃的温度下进行。在一些实施例中，蒸发是所希望的HMO的最终纯化步骤。
在一些实施例中，对浓缩物进行喷雾干燥。在一些实施例中，进入喷雾干燥器中的HMO进料具有约8至约75％白利糖度的白利糖度值。在一些实施例中，该白利糖度值是约30至约65％白利糖度。在一些实施例中，该白利糖度值是约50至约60％白利糖度。在一些实施例中，进入喷雾干燥器中的进料处在约2至约70℃的温度下，立即随后在喷雾干燥器中被分散成微滴。在一些实施例中，进入喷雾干燥器中的进料处在约30至约60℃的温度下，立即随后在喷雾干燥器中被分散成微滴。在一些实施例中，进入喷雾干燥器中的进料处在约2至约30℃的温度下，立即随后在喷雾干燥器中被分散成微滴。在一些实施例中，该喷雾干燥使用具有120至280℃的空气进口温度的空气。在一些实施例中，该空气进口温度是120至210℃。在一些实施例中，该空气进口温度是约130至约190℃。在一些实施例中，该空气进口温度是约135至约160℃。在一些实施例中，该喷雾干燥使用具有约80至约110℃的空气出口温度的空气。在一些实施例中，该空气出口温度是约100至约110℃。在一些实施例中，该喷雾干燥在约20至约90℃的温度下进行。在一些实施例中，该喷雾干燥器是顺流式喷雾干燥器。在一些实施例中，该喷雾干燥器附接至外部流体床。在一些实施例中，该喷雾干燥器包括旋转盘、高压喷嘴或双流体喷嘴。在一些实施例中，该喷雾干燥器包括雾化器轮。在一些实施例中，喷雾干燥是所希望的HMO的最终纯化步骤。
在一些实施例中，该方法包括结晶。在一些实施例中，在结晶期间未使用有机溶剂。在一些实施例中，该结晶包括WO 2018/164937(通过引用并入本说明书中)中披露的结晶过程。在一些实施例中，结晶是所希望的HMO的最终纯化步骤。在一些实施例中，该方法包括结晶和蒸发二者。在一些实施例中，该方法包括结晶和喷雾干燥二者。
包含HMO的产品
在一些实施例中，通过本说明书的方法纯化的HMO被掺入食品(例如人或宠物食品)、膳食补充剂或药物中。在一些实施例中，将HMO与适用于食品、膳食补充剂或药物的一种或多种成分混合。
在一些实施例中，该膳食补充剂包含至少一种益生元成分和/或至少一种益生菌成分。
“益生元”是促进有益于宿主的微生物尤其胃肠道中的微生物生长的物质。在一些实施例中，膳食补充剂提供多种益生元，包括通过本说明书中披露的方法纯化的至少一种HMO，以促进一种或多种有益微生物的生长。用于膳食补充剂的益生元成分的实例包括其他益生元分子(诸如其他HMO)和植物多糖(诸如菊粉、果胶、β-葡聚糖和低聚木糖)。
“益生菌”产品通常包含活微生物，其更新或增加胃肠微生物群落而有益于接受者。此类微生物的实例包括乳杆菌属物种(Lactobacillus)(例如，嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)和保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus))、双歧杆菌属物种(Bifidobacterium)(例如，动物双歧杆菌(B.animalis)、长双歧杆菌(B.longum)和婴儿双歧杆菌(B.infantis)(例如Bi-26))以及布拉迪酵母(Saccharomyces boulardii)。在一些实施例中，通过本说明书的方法纯化的HMO与Bi-26组合经口施用。
用于膳食补充剂其他成分的实例包括二糖(诸如乳糖)、单糖(诸如葡萄糖和半乳糖)、增稠剂(诸如阿拉伯树胶)、酸度调节剂(诸如柠檬酸三钠)、水、脱脂乳和调味剂。
在一些实施例中，将HMO掺入人类婴儿食品(例如婴儿配方制品)中。婴儿配方制品通常是作为人乳的完全或部分替代品用于喂养婴儿的生产食品。在一些实施例中，婴儿配方制品作为粉剂销售，并且通过与水混合进行配制以瓶或杯喂给婴儿。婴儿配方制品的组成通常被设计成大致模拟人乳。在一些实施例中，将通过本说明书中的方法纯化的HMO包含在婴儿配方制品中以提供与由人乳中的一种或多种HMO提供的相似的营养益处。在一些实施例中，将该HMO与婴儿配方制品的一种或多种成分混合。婴儿配方制品成分的实例包括脱脂乳、碳水化合物来源(例如乳糖)、蛋白质来源(例如乳清蛋白浓缩物和酪蛋白)、脂肪来源(例如植物油-诸如棕榈油、高油酸红花籽油、油菜籽油、椰子油和/或葵花籽油；和鱼油)、维生素(诸如维生素A、B6、B12、C和D)、矿物质(诸如柠檬酸钾、柠檬酸钙、氯化镁、氯化钠、柠檬酸钠和磷酸钙)和其他HMO。其他HMO可以包括，例如，DiFL、乳糖-N-三糖II、LNT、LNnT、乳糖-N-岩藻戊糖I、乳糖-N-新岩藻戊糖、乳糖-N-岩藻戊糖II、乳糖-N-岩藻戊糖III、乳糖-N-岩藻戊糖V、乳糖-N-新岩藻戊糖V、乳糖-N-二岩藻己糖I、乳糖-N-二岩藻己糖II、6’-半乳糖基乳糖、3’-半乳糖基乳糖、乳糖-N-六糖和乳糖-N-新六糖。
在一些实施例中，该一种或多种婴儿配方制品成分包括脱脂乳、碳水化合物来源、蛋白质来源、脂肪来源、和/或维生素和矿物质。
在一些实施例中，该一种或多种婴儿配方食品成分包括乳糖、乳清蛋白浓缩物和/或高油酸红花籽油。
在一些实施例中，该HMO是干燥的HMO。
在一些实施例中，婴儿配方制品中的HMO浓度是与通常存在于人母乳中的HMO浓度大约相同的浓度。在一些实施例中，在婴儿配方制品中每种HMO的浓度与人乳中通常存在的HMO的浓度大致相同。
实例
以下实例仅是说明性的，并且不以任何方式限制本说明书。
实例1
在冷温度下不同膜的性能
方法设备包括平板和框架过滤单元(Alfa Laval Labstak M20)、进料泵和渗滤泵、热交换器、冷却单元、70-升进料箱以及进口压力计和出口压力计和压力控制阀。总膜面积是0.65m2。测试的膜是
Figure BDA0003261492860000371
UA60(迈纳德公司，大约600-1000道尔顿的分子量截止值，在25℃下80％MgSO4保留率)、
Figure BDA0003261492860000372
XN45(迈纳德公司，大约300-500道尔顿的分子量截止值，在25℃下90-96％MgSO4保留率)、NF245(陶氏化学公司(米德兰，密歇根州)，大约150-300道尔顿的分子量截止值，在25℃下>98％MgSO4保留率)、DL(苏伊士水技术&解决方案公司(特里沃斯，宾夕法尼亚州)，大约150-300道尔顿的分子量截止值，在25℃下>98％MgSO4保留率)和DK(苏伊士公司，大约150-300道尔顿的分子量截止值，在25℃下>98％MgSO4保留率)。MgSO4保留率被指定在1-2g/L浓度、7-8巴、25℃、pH 6-8和10-25％回收率条件下。
2’-FL的来自基于大肠杆菌发酵的超滤渗透物用作进料。目的是浓缩进料中包含的2’-FL同时使杂质(盐、单糖、二糖)通过至渗透物。
将43kg的进料进给到70-升进料箱中。进料中的干物质浓度是4.6g/100g，电导率是11.4mS/cm，并且pH是6.7。将渗透物从所有的膜收集。进料组成示于表1-1中，其中基于干物质百分比给出HPLC分析。
表1-1
进料组成(％)
L-岩藻糖 0.0
半乳糖+葡萄糖 1.5
乳糖 1.1
3-岩藻糖基乳糖 0.5
2’岩藻糖基乳糖 31.3
二岩藻糖基乳糖 2.1
其他 63.5
将进料保持冷却在10-14℃，并将水用于渗滤。过滤压力是10-30巴，并且对浓缩物DS(干物质)浓度进行控制以保持通量高于2kg/m2/hr(观察到的最低通量点)。
在分批过滤之后，收集一个渗透物级分和最终浓缩物级分。基于干物质百分比，渗透物级分和最终浓缩物的结果(包括HPLC分析)示于表1-2中。
表1-2
Figure BDA0003261492860000381
Figure BDA0003261492860000391
2’-FL总收率计算为69.0％。由电导率计算的除盐率是71.5％。
硫酸盐去除率是45.3％，并且磷酸盐去除率是63.0％。2’-FL保留率是从3个点进行测量，并且对于UA60、XN45、NF245、DL和DK膜，平均值分别是88.1％、99.3％、99.4％、98.3％和97.9％。电导率保留率是从3个点进行测量，并且对于UA60、XN45、NF245、DL和DK膜，平均值分别是37.1％、69.4％、75.2％、78.5％和78.4％。
SO4、PO4和乳糖保留率从在渗滤期间最后的样品组(其中浓度最高)的结果进行计算。总干物质浓度是22.7g/100g，并且2’-FL的浓度是9.28％(w/w)，乳糖0.16％(w/w)，SO4是13660mg/kg，PO4是5020mg/kg。对于UA60、XN45、NF245、DL和DK膜，SO4保留率分别是49％、92％、97％、95％和94％。对于UA60、XN45、NF245、DL和DK膜，PO4保留率分别是18％、55％、72％、81％和81％。对于UA60、XN45、NF245、DL和DK膜，乳糖保留率分别是45％、91％、99％、96％和95％。
实例2
在升高的温度下不同膜的性能
方法设备包括平板和框架过滤单元(Alfa Laval Labstak M20)、进料泵和渗滤泵、热交换器、冷却单元、70-升进料箱以及进口压力计和出口压力计和压力控制阀。总膜面积是0.65m2。测试的膜是
Figure BDA0003261492860000392
UA60(迈纳德公司，大约600-1000道尔顿的分子量截止值，在25℃下80％MgSO4保留率)、
Figure BDA0003261492860000393
XN45(迈纳德公司，大约300-500道尔顿的分子量截止值，在25℃下90-96％MgSO4保留率)、NF245(陶氏公司，大约150-300道尔顿的分子量截止值，在25℃下>98％MgSO4保留率)、DL(苏伊士公司，大约150-300道尔顿的分子量截止值，在25℃下>98％MgSO4保留率)和DK(苏伊士公司，大约150-300道尔顿的分子量截止值，在25℃下>98％MgSO4保留率)。MgSO4保留率被指定在1-2g/L浓度、7-8巴、25℃、pH 6-8和10-25％回收率条件下。
2’-FL的来自基于大肠杆菌发酵的超滤渗透物用作进料。目的是浓缩进料中包含的2’-FL同时使杂质(盐、单糖、二糖)通过至渗透物。
将53.5kg的进料进给到70-升进料箱中。进料中的干物质浓度是4.2g/100g，电导率是11.1mS/cm，并且pH是6.9。将渗透物从所有的膜收集。进料组成示于表2-1中，其中基于干物质百分比给出HPLC分析。
表2-1
进料组成(％)
L-岩藻糖 0.0
半乳糖+葡萄糖 1.6
乳糖 1.0
3-岩藻糖基乳糖 0.5
2’岩藻糖基乳糖 32.7
二岩藻糖基乳糖 2.0
其他 62.1
将进料加热并保持在50℃，并将水用于渗滤。过滤压力是6-40巴，并且对浓缩物DS浓度进行控制以保持通量高于3kg/m2/hr(观察到的最低通量点)。
在分批过滤之后，收集两个渗透物级分和最终浓缩物级分。基于干物质百分比，渗透物级分和最终浓缩物的结果(包括HPLC分析)示于表2-2中。
表2-2
Figure BDA0003261492860000401
Figure BDA0003261492860000411
2’-FL总收率计算为63.4％，并且由电导率计算的除盐率是85.9％。硫酸盐去除率是55.3％，并且磷酸盐去除率是93.3％。2’-FL保留率是从3个点进行测量，并且对于UA60、XN45、NF245、DL和DK膜，平均值分别是78.1％、95.7％、99.7％、98.7％和99.0％。电导率保留率是从3个点进行测量，并且对于UA60、XN45、NF245、DL和DK膜，平均值分别是38.8％、57.0％、70.5％、75.2％和76.4％。
SO4、PO4和乳糖保留率从其中浓度最高的样品组进行计算。总干物质浓度是24.6g/100g，并且2’-FL的浓度是10.31％(w/w)，乳糖是0.23％(w/w)，SO4是13160mg/kg，PO4是6400mg/kg。对于UA60、XN45、NF245、DL和DK膜，SO4保留率分别是46％、83％、97％、98％和98％。对于UA60、XN45、NF245、DL和DK膜，PO4保留率分别是16％、18％、38％、69％和50％。对于UA60、XN45、NF245、DL和DK膜，乳糖保留率分别是63％、71％、99％、94％和97％。
实例3
冷温度浓度以及NF膜对2’-FL液体的除盐率
方法设备包括具有两个单膜壳体的螺旋缠绕的膜单元(GEA，型号R)、进料泵和渗滤泵、热交换器、冷却单元、500-升进料箱以及进口压力计和出口压力计和压力控制阀。总膜面积是13.4m2。测试的膜是
Figure BDA0003261492860000412
XN45(迈纳德公司，大约300-500道尔顿的分子量截止值，在25℃下90-96％MgSO4保留率，7.4m2/31mil隔板尺寸)和DL(苏伊士公司，大约150-300道尔顿分子量截止值，在25℃下>98％MgSO4保留率，6.0m2/50mil隔板尺寸)。将该膜平行地安装。MgSO4保留率被指定在1-2g/L浓度、7-8巴、25℃、pH 6-8和10-25％回收率条件下。
2’-FL的来自基于大肠杆菌发酵的超滤渗透物用作进料。目的是浓缩进料中包含的2’-FL同时使杂质(盐、单糖、二糖)通过至渗透物。
将313kg的进料进给到500-升进料箱中。进料中的干物质浓度是6.1g/100g，电导率是14.0mS/cm，并且pH是6.7。将渗透物从两个膜收集。进料组成示于表3-1中，其中基于干物质百分比给出HPLC分析。
表3-1
进料组成(％)
L-岩藻糖 <0.1
半乳糖+葡萄糖 <0.1
乳糖 0.1
3-岩藻糖基乳糖 0.4
2’岩藻糖基乳糖 44.5
二岩藻糖基乳糖 2.7
其他 52.3
将进料保持冷却在6-8℃，并将水用于渗滤。过滤压力是10-27巴，并且对浓缩物DS浓度进行控制以保持通量高于2kg/m2/hr(观察到的最低通量点)。
在分批过滤之后，收集两个渗透物级分和最终浓缩物级分。基于干物质百分比，渗透物级分和最终浓缩物的结果(包括HPLC分析)示于表3-2中。
表3-2
Figure BDA0003261492860000421
Figure BDA0003261492860000431
基于进料和渗透物级分，2’-FL总收率计算为98.6％，并且由电导率计算的除盐率是58.6％。硫酸盐去除率是24.4％，并且磷酸盐去除率是62.3％。使用了106.5kg的水，因此，归一化到4％(w/w)干物质溶液，水-比-进料重量比是0.22kg/kg(即，水与进料的重量比对应于具有4％(w/w)干物质浓度的进料溶液的0.22)。2’-FL保留率是从4个点进行测量，对于XN45和DL膜，平均值分别是99.6％和98.9％。电导率保留率是从4个点进行测量，并且对于XN45和DL膜，平均值分别是66.6％、78.6％。在过滤期间，XN45膜的渗透性平均是DL膜的2.2倍。
实例4
升高温度浓度以及NF膜对2’-FL液体的除盐率
方法设备包括具有两个单膜壳体的螺旋缠绕的膜单元(GEA，型号R)、进料泵和渗滤泵、热交换器、500-升进料箱以及进口压力计和出口压力计和压力控制阀。总膜面积是13.4m2。测试的膜是
Figure BDA0003261492860000432
XN45(迈纳德公司，大约300-500道尔顿的分子量截止值，在25℃下90-96％MgSO4保留率，7.4m2/31mil隔板尺寸)和DL(苏伊士公司，大约150-300道尔顿分子量截止值，在25℃下>98％MgSO4保留率，6.0m2/50mil隔板尺寸)。将该膜平行地安装。MgSO4保留率被指定在1-2g/L浓度、7-8巴、25℃、pH 6-8和10-25％回收率条件下。
2’-FL的来自基于大肠杆菌发酵的超滤渗透物用作进料。目的是浓缩进料中包含的2’-FL同时使杂质(盐、单糖、二糖)通过至渗透物。
将285kg的进料进给到500-升进料箱中。进料中的干物质浓度是7.4g/100g，电导率是14.4mS/cm，并且pH是6.7。将渗透物从两个膜收集。进料组成示于表4-1中，其中基于干物质百分比给出HPLC分析。
表4-1
进料组成(％)
L-岩藻糖 <0.1
半乳糖+葡萄糖 0.2
乳糖 0.1
3-岩藻糖基乳糖 0.3
2’岩藻糖基乳糖 42.9
二岩藻糖基乳糖 2.6
其他 54.1
将进料加热并保持在58-61℃，并将水用于渗滤。过滤压力是10-25巴，并且对浓缩物DS浓度进行控制以保持通量高于2kg/m2/hr(观察到的最低通量点)。
在分批过滤之后，收集渗透物级分和最终浓缩物级分。基于干物质百分比，渗透物级分和最终浓缩物的结果(包括HPLC分析)示于表4-2中。
表4-2
Figure BDA0003261492860000441
Figure BDA0003261492860000451
基于进料和渗透物级分，2’-FL总收率计算为54.3％，并且由电导率计算的除盐率是92.7％。硫酸盐去除率是90.4％，并且磷酸盐去除率是99.8％。使用了172.0kg的水，因此，归一化到4％(w/w)干物质溶液，水-比-进料重量比是0.33kg/kg(即，水与进料的重量比对应于具有4％(w/w)干物质浓度的进料溶液的0.33)。2’-FL保留率是从2个点进行测量，对于XN45和DL膜，平均值分别是91.2％和97.7％。电导率保留率是从2个点进行测量，并且对于XN45和DL膜，平均值分别是32.9％、58.0％。在过滤期间，XN45膜的渗透性平均是DL膜的5.2倍。
实例5
升高温度浓度和紧密NF膜对2’-FL液体的除盐率
方法设备包括具有两个单膜壳体的螺旋缠绕的膜单元(GEA，型号R)、进料泵和渗滤泵、热交换器、500-升进料箱以及进口压力计和出口压力计和压力控制阀。总膜面积是12.0m2。测试的膜是DL(苏伊士公司，大约150-300道尔顿分子量截止值，在25℃下>98％MgSO4保留率，6.0m2/50mil隔板尺寸)。将该膜平行地安装。MgSO4保留率被指定在1-2g/L浓度、7-8巴、25℃、pH 6-8和10-25％回收率条件下。
2’-FL的来自基于大肠杆菌发酵的超滤渗透物用作进料。目的是浓缩进料中包含的2’-FL同时使杂质(盐、单糖、二糖)通过至渗透物。
将162kg的进料进给到500-升进料箱中。进料中的干物质浓度是7.3g/100g，电导率是17.4mS/cm，并且pH是6.9。将渗透物从两个膜收集。进料组成示于表5-1中，其中基于干物质百分比给出HPLC分析。
表5-1
进料组成(％)
L-岩藻糖 <0.1
半乳糖+葡萄糖 0.2
乳糖 0.1
3-岩藻糖基乳糖 0.3
2’岩藻糖基乳糖 42.9
二岩藻糖基乳糖 2.6
其他 54.1
将进料加热并保持在58-61℃，并将水用于渗滤。过滤压力是10-25巴，并且对浓缩物DS浓度进行控制以保持通量高于2kg/m2/hr(观察到的最低通量点)。
在分批过滤之后，收集渗透物级分和最终浓缩物级分。基于干物质百分比，渗透物级分和最终浓缩物的结果(包括HPLC分析)示于表5-2中。
表5-2
总渗透物 最终浓缩物
质量，kg 275.0 35.0
干物质，g/100g 1.0 25.8
电导率mS/cm 6.8 22.2
L-岩藻糖，％ 0.0 0.0
半乳糖+葡萄糖，％ 0.0 0.0
乳糖，％ 0.7 0.0
3-岩藻糖基乳糖，％ 0.0 0.0
2’岩藻糖基乳糖，％ 4.5 61.7
二岩藻糖基乳糖，％ 0.2 5.3
其他，％ 94.6 32.9
基于进料和渗透物级分，2’-FL总收率计算为97.7％，并且由电导率计算的除盐率是72.4％。硫酸盐去除率是43.4％，并且磷酸盐去除率是93.6％。使用了148.0kg的水，因此，归一化到4％(w/w)干物质溶液，水-比-进料重量比是0.50kg/kg(即，水与进料的重量比对应于具有4％(w/w)干物质浓度的进料溶液的0.50)。2’-FL保留率是从2个点进行测量，并且平均值是99.3％。电导率保留率是从3个点进行测量，并且平均值是61.5％。
实例6
冷温度浓度以及开放NF膜对2’-FL液体的除盐率
方法设备包括具有两个单膜壳体的螺旋缠绕的膜单元(GEA，型号R)、进料泵和渗滤泵、热交换器、500-升进料箱以及进口压力计和出口压力计和压力控制阀。总膜面积是14.8m2。测试的膜是
Figure BDA0003261492860000471
XN45(迈纳德公司，大约300-500道尔顿分子量截止值，在25℃下90-96％MgSO4保留率，7.4m2/31mil隔板尺寸)。将该膜平行地安装。MgSO4保留率被指定在1-2g/L浓度、7-8巴、25℃、pH 6-8和10-25％回收率条件下。
2’-FL的来自基于大肠杆菌发酵的超滤渗透物用作进料。目的是浓缩进料中包含的2’-FL同时使杂质(盐、单糖、二糖)通过至渗透物。
在浓缩期间将1200kg的进料进给到500-升进料箱中。进料中的干物质浓度是3.8g/100g，电导率是12.7mS/cm，并且pH是6.9。将渗透物从两个膜收集。进料组成示于表6-1中，其中基于干物质百分比给出HPLC分析。
表6-1
进料组成(％)
Figure BDA0003261492860000472
Figure BDA0003261492860000481
将进料保持冷却在4-7℃，并将水用于渗滤。过滤压力是10-23巴，并且对浓缩物DS浓度进行控制以保持通量高于3kg/m2/hr(观察到的最低通量点)。
在分批过滤之后，收集两个渗透物级分和最终浓缩物级分。基于干物质百分比，渗透物级分和最终浓缩物的结果(包括HPLC分析)示于表6-2中。
表6-2
总渗透物1 总渗透物2 最终浓缩物
质量，kg 972.0 86.6 250.0
干物质，g/100g 0.6 1.0 16.8
电导率mS/cm 4.8 8.2 34.3
L-岩藻糖，％ 0.0 0.0 0.0
半乳糖+葡萄糖，％ 0.0 0.0 0.0
乳糖，％ 1.9 4.4 3.7
3-岩藻糖基乳糖，％ 0.0 0.0 0.0
2’岩藻糖基乳糖，％ 4.5 53.8
二岩藻糖基乳糖，％ 0.2 4.3
其他，％ 94.6 38.2
基于进料和渗透物级分，2’-FL总收率计算为99.3％，并且由电导率计算的除盐率是43.9％。硫酸盐去除率是29.1％，并且磷酸盐去除率是46.2％。使用了108.6kg的水，因此，归一化到4％(w/w)干物质溶液，水-比-进料重量比是0.10kg/kg(即，水与进料的重量比对应于具有4％(w/w)干物质浓度的进料溶液的0.10)。2’-FL保留率是从2个点进行测量，并且平均值是99.8％。电导率保留率是从2个点进行测量，并且平均值是78.5％。
实例7
在冷温纳米过滤中3-FL液体浓度和除盐率
方法设备包括具有两个单膜壳体的螺旋缠绕的膜单元(GEA，型号R)、进料泵和渗滤泵、热交换器、500-升进料箱以及进口压力计和出口压力计和压力控制阀。总膜面积是14.8m2。测试的膜是
Figure BDA0003261492860000491
XN45(迈纳德公司，大约300-500道尔顿分子量截止值，在25℃下90-96％MgSO4保留率，7.4m2/31mil隔板尺寸)。将该膜平行地安装。MgSO4保留率被指定在1-2g/L浓度、7-8巴、25℃、pH 6-8和10-25％回收率条件下。
3-FL的来自基于大肠杆菌发酵的超滤渗透物用作进料。目的是浓缩进料中包含的3-FL同时使杂质(盐、单糖、二糖)通过至渗透物。
在浓缩期间将1376kg的进料进给到500-升进料箱中。进料中的干物质浓度是2.9g/100g，电导率是12.3mS/cm，并且pH是7.6。将渗透物从两个膜收集。进料组成示于表7-1中，其中基于干物质百分比给出HPLC分析。
表7-1
进料组成(％)
L-岩藻糖 0.0
半乳糖+葡萄糖 0.0
乳糖 1.6
3-岩藻糖基乳糖 44.6
2’岩藻糖基乳糖 0.0
二岩藻糖基乳糖 0.0
其他，％ 53.8
将进料保持冷却在3-7℃，并将水用于渗滤。过滤压力是10-30巴，并且对浓缩物DS浓度进行控制以保持通量高于8kg/m2/hr(观察到的最低通量点)。
在分批过滤之后，收集两个渗透物级分和最终浓缩物级分。基于干物质百分比，渗透物级分和最终浓缩物的结果(包括HPLC分析)示于表7-2中。
表7-2
总渗透物1 总渗透物2 最终浓缩物
质量，kg 940.0 883.0 170.0
干物质，g/100g 0.7 0.7 16.2
电导率mS/cm 2.8 5.7 30.7
L-岩藻糖，％ 0.0 0.0 0.0
半乳糖+葡萄糖，％ 1.6 1.9 0.0
乳糖，％ 0.8 2.2 1.5
3-岩藻糖基乳糖，％ 0.3 1.6 56.4
2’岩藻糖基乳糖，％ 0.0 0.0 0.0
二岩藻糖基乳糖，％ 0.0 0.0 0.0
其他，％ 97.4 94.3 42.1
基于进料和渗透物级分，3-FL总收率计算为99.2％，并且由电导率计算的除盐率是69.2％。硫酸盐去除率是31.7％，并且磷酸盐去除率是64.1％。使用了617.0kg的水，因此，归一化到4％(w/w)干物质溶液，水-比-进料重量比是0.62kg/kg(即，水与进料的重量比对应于具有4％(w/w)干物质浓度的进料溶液的0.62)。电导率保留率是从4个点进行测量，并且平均值是82.0％。
实例8
在各种温度下膜MgSO4和NaCl保留率
方法设备包括平板和框架过滤单元(Alfa Laval Labstak M20)、进料泵和渗滤泵、热交换器、冷却单元、100-升进料箱以及进口压力计和出口压力计和压力控制阀。总膜面积是0.72m2。测试的膜是NFG(星达过滤公司(瓦卡维尔，加利福尼亚州))、
Figure BDA0003261492860000501
UA60(迈纳德公司)、NDX(星达公司)、
Figure BDA0003261492860000502
XN45(迈纳德公司)、2个月使用的
Figure BDA0003261492860000503
XN45(也称为“XN45(旧的)”)、NF245(陶氏公司)、NFW(星达公司)、Desal-5 DL(苏伊士公司)、NFX(星达公司)和Desal-5 DK(苏伊士公司)。术语“XN45(旧的)”是指
Figure BDA0003261492860000511
XN45膜，其已经在纳米过滤单元中在温度5至10℃和压力10至30巴下使用2个月，并且已暴露于数次清洁循环。
膜DK、NFX、DL和NF245通常被视为“紧密”膜，这是因为在pH大于5.0下PO4保留率大于65％，并且在pH大于5.0下SO4保留率大于97％。MgSO4保留率，如生产商指定的，对于膜DK是99％(紧密)，对于膜NFX是99％(紧密)，对于膜DL和NF245是98-99％(紧密)，对于膜NFW是97％(开放)，对于膜XN45是94-98％(开放)，对于膜UA60是70-90％(很开放)，对于膜NDX是90％(很开放)，对于膜NFG是50％(很开放)。
MgSO4保留率测试溶液是通过将40g MgSO4添加到20kg IEX水中进行配制(2g/l溶液)。将pH用少量NaOH调至6.3。进料的电导率是2.25mS/cm。NaCl保留率测试溶液是通过将40g NaCl添加到20kg IEX水中进行配制(2g/l溶液)。将pH用少量NaOH调至6.2。进料的电导率是3.8mS/cm。保留率是依据电导率(CMgSO4＝0,0803*电导率(mS/cm)1 . 1618和CNaCl＝0,0505*电导率(mS/cm)1.0352)进行计算。
将进料从5-10℃逐步加热至60℃。过滤跨膜压力，在温度5-40℃下是7.5巴，在50℃下是5.5巴，而在60℃下是4.5巴。该系统在完全再循环中运行，并且在每个温度下从所有膜取样。该系统在高错流量下运行，从而液体回收率是5-20％。
对于NFG、UA60、NDX、XN45(旧的)、XN45、NF245、NFW、DL、NFX和DK膜，在温度25℃下测量的MgSO4保留率分别是34.5％、51.6％、82.3％、91.3％、95.2％、99.3％、98.4％、99.6％、99.1％和98.8％。对于NFG、UA60、NDX、XN45(旧的)、XN45、NF245、NFW、DL、NFX和DK膜，在温度25℃下测量的NaCl保留率分别是8.3％、10.9％、29.1％、19.5％、16.5％、46.5％、28.2％、33.7％、53.0％和58.6％。
在不同温度下MgSO4和NaCl保留率的变化示于图1和2中。
实例9
在冷温度下HMO模型溶液NF测试
方法设备包括平板和框架过滤单元(Alfa Laval Labstak M20)、进料泵和渗滤泵、热交换器、冷却单元、100-升进料箱以及进口压力计和出口压力计和压力控制阀。总膜面积是0.72m2。测试的膜是NFG(星达公司)、
Figure BDA0003261492860000521
UA60(迈纳德公司)、NDX(星达公司)、
Figure BDA0003261492860000522
XN45(迈纳德公司)、2个月使用的
Figure BDA0003261492860000523
XN45(也称为“XN45(旧的)”)、NF245(陶氏公司)、NFW(星达公司)、Desal-5 DL(苏伊士公司)、NFX(星达公司)和Desal-5DK(苏伊士公司)。
模型溶液通过将1.5kg的2’-FL粉末、0.2kg乳糖、0,2kg的MgSO4和0.2kg的KH2PO4溶解到7.9kg离子交换的水中进行配制。
将10kg的进料进给到70-升进料箱中。进料中的干物质浓度是20.7g/100g，并且电导率是14.3mS/cm。将pH首先用NaOH调至6.3，并且然后使用H2SO4首先降至5.2，并且然后降至3.4。进料通过HPLC分析包含13.55g/100g 2’-FL，并且通过离子色谱分析包含5.8g/kgPO4和13.8g/kg SO4。添加的盐的部分由于沉淀而损失，并且因此未被包括在分析中。保留率是依据HPCL或离子色谱分析进行计算。
使进料保持冷却在10.3-11.6℃。过滤压力是40巴。该系统在完全再循环中运行，并且在每个pH下从所有膜取样。
通过将pH从6.3降至5.2和3.4，2’-FL保留率显著地增大。对于NFG、UA60、NDX、XN45(旧的)、XN45、NF245、NFW、DL、NFX和DK膜，在接近中性pH 6.3下测量的2’-FL保留率分别是88.6％、96.0％、96.7％、98.6％、99.1％、98.3％、98.9％、99.0％、98.7％和97.8％。对于NFG、UA60、NDX、XN45(旧的)、XN45、NF245、NFW、DL、NFX和DK膜，在低pH 3.4下测量的2’-FL保留率分别是90.8％、99.3％、98.6％、99.1％、99.6％、99.2％、99.2％、99.5％、99.3％和98.9％。
电导率保留率在pH 6.3、5.2和3.4下限定。对于NFG、UA60、NDX、XN45(旧的)、XN45、NF245、NFW、DL、NFX和DK膜，在接近中性pH 6.3下测量的电导率保留率分别是19.2％、35.2％、81.3％、75.1％、79.4％、89.5％、89.9％、93.9％、94.5％和92.4％。对于NFG、UA60、NDX、XN45(旧的)、XN45、NF245、NFW、DL、NFX和DK膜，在低pH 3.4下测量的电导率保留率分别是-27.9％、-4.1％、70.5％、15.8％、20.8％、63.2％、40.1％、67.1％、71.5和77.0％。
磷酸盐保留率在pH 6.3、5.2和3.4下限定。对于NFG、UA60、NDX、XN45(旧的)、XN45、NF245、NFW、DL、NFX和DK膜，在接近中性pH 6.3下测量的磷酸盐保留率分别是-6.5％、-5.8％、76.3％、52.5％、54.7％、77.8％、82.4％、91.2％、95.1％和97.6％。对于NFG、UA60、NDX、XN45(旧的)、XN45、NF245、NFW、DL、NFX和DK膜，在低pH 3.4下测量的磷酸盐保留率分别是32.12％、13.2％、49.7％、23.4％、32.0％、59.7％、80.1％、47.6％、61.9％和65.0％。
硫酸盐保留率在pH 6.3、5.2和3.4下限定。对于NFG、UA60、NDX、XN45(旧的)、XN45、NF245、NFW、DL、NFX和DK膜，在接近中性pH 6.3下测量的硫酸盐保留率分别是59.5％、73.4％、94.7％、94.1％、95.9％、97.8％、98.0％、98.8％、98.3％和97.2％。对于NFG、UA60、NDX、XN45(旧的)、XN45、NF245、NFW、DL、NFX和DK膜，在低pH 3.4下测量的硫酸盐保留率分别是31.5％、54.8％、93.6％、66.6％、70.8％、89.7％、80.3％、92.6％、92.9％和95.5％。
实例10
2’-FL液体的冷温度浓度和除盐率用很开放的NF膜在低pH下操作
方法设备包括平板和框架过滤单元(Alfa Laval Labstak M20)、进料泵和渗滤泵、热交换器、冷却单元、100-升进料箱以及进口压力计和出口压力计和压力控制阀。总膜面积是0.72m2。测试的膜是
Figure BDA0003261492860000531
UA60(迈纳德公司)。
2’-FL的来自基于大肠杆菌发酵的超滤渗透物用作进料。目的是浓缩进料中包含的2’-FL同时使杂质(盐、单糖、二糖)通过至渗透物。
将72kg的进料进给到100-升进料箱中。进料中的干物质浓度是3.1g/100g，电导率是6.0mS/cm，并且pH是7.2。将pH用1.0kg的80％乙酸降至3.9。将渗透物从所有的膜收集。进料组成示于表10-1中，其中基于干物质百分比给出HPLC分析。
表10-1
进料组成(％)
L-岩藻糖 0.0
半乳糖+葡萄糖 0.9
乳糖 10.9
3-岩藻糖基乳糖 0
2’岩藻糖基乳糖 49.9
二岩藻糖基乳糖 4.6
其他 33.7
将进料保持冷却在5-11℃，并将水用于渗滤。过滤压力是10-40巴，并且对浓缩物DS浓度进行控制以保持通量高于6kg/m2/hr(观察到的最低通量点)。
在分批过滤之后，收集两个渗透物级分和最终浓缩物级分。基于干物质百分比，两个渗透物级分和最终浓缩物的结果(包括HPLC分析)示于表10-2中。
表10-2
Figure BDA0003261492860000541
Figure BDA0003261492860000551
2’-FL总收率计算为96.5％，并且由电导率计算的除盐率是92.6-95.6％。使用了21.5kg的水，因此，归一化到4％(w/w)干物质溶液，水-比-进料重量比是0.39kg/kg(即，水与进料的重量比对应于具有4％(w/w)干物质浓度的进料溶液的0.39)。从5个样品点测量的平均电导率保留率是21.7％。2’-FL保留率是从4个点测量，并且平均值是99.2％
*********
词语“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”应包含性而非排他性地解释。这种解释旨在与在本文提交时根据美国专利法给出的这些词语的解释相同。
除非上下文另外指示，否则单数形式“一个/种(a)”和“一个/种(an)”旨在包括复数指示物。因此，例如，除非上下文另外指示，否则提及存在“一种赋形剂”并不排除存在多种赋形剂。
本说明书中引用的所有参考文献都通过引用结合到本说明书中。

Claims (72)

1.一种制备纯化的人乳寡糖(HMO)的方法，其中：
所述方法包括：
·将HMO溶液进给到纳米过滤单元中，
·将所述HMO溶液用所述纳米过滤单元过滤以产生浓缩物和渗透物，和
·收集所述浓缩物；
所述HMO溶液包含含水介质，所述含水介质包含要纯化的HMO和第二碳水化合物；
所述纳米过滤单元包括膜，所述膜具有：
·至少约50％的MgSO4保留率(在25℃、2g/l浓度、8巴和pH 6-7下)，以及
·最高达约60％的NaCl保留率(在25℃、2g/l浓度、8巴和pH 6-7下)；以及
所述过滤在小于10℃的温度下进行。
2.一种制备人乳寡糖(HMO)的方法，其中：
所述方法包括：
·将HMO溶液进给到纳米过滤单元中，
·将所述HMO溶液用所述纳米过滤单元过滤以产生浓缩物和渗透物，和
·收集所述浓缩物；
所述HMO溶液包含含水介质，所述含水介质包含要纯化的HMO和第二碳水化合物；
所述纳米过滤单元包括膜，所述膜具有：
·大于90％的MgSO4保留率(在25℃、2g/l浓度、8巴和pH 6-7下)，以及
·最高达约60％的NaCl保留率(在25℃、2g/l浓度、8巴和pH 6-7下)；以及
所述过滤在不大于约18℃的温度下进行。
3.一种制备纯化的人乳寡糖(HMO)的方法，其中：
所述方法包括：
·将HMO溶液进给到纳米过滤单元中，
·将所述HMO溶液用所述纳米过滤单元过滤以产生浓缩物和渗透物，和
·收集所述浓缩物；
所述HMO溶液包含含水介质，所述含水介质包含要纯化的HMO和第二碳水化合物；
所述纳米过滤单元包括膜，所述膜具有：
·至少约50％的MgSO4保留率(在25℃、2g/l浓度、8巴和pH 6-7下)，以及
·最高达约60％的NaCl保留率(在25℃、2g/l浓度、8巴和pH 6-7下)；
所述纳米过滤单元包括膜，所述膜具有小于600道尔顿的分子量截止值；以及
所述过滤在不大于约18℃的温度下进行。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其中，所述过滤在小于10℃的温度下进行。
5.根据权利要求1或3所述的方法，其中，所述纳米过滤单元包括膜，所述膜具有大于90％的MgSO4保留率(在25℃、2g/l浓度、8巴和pH 6-7下)。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述纳米过滤单元包括膜，所述膜具有：
大于90％的MgSO4保留率(在25℃、2g/l浓度、8巴和pH 6-7下)，以及
小于600道尔顿的分子量截止值。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述纳米过滤单元包括膜，所述膜具有大于90％并且不大于约98％的MgSO4保留率(在25℃、2g/l浓度、8巴和pH 6-7下)。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述纳米过滤单元包括膜，所述膜具有300至500道尔顿的分子量截止值。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述过滤在小于10℃并且不小于约2℃的温度下进行。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述膜特征在于，当在以下条件下操作时表现出至少96.0％的所述要纯化的HMO的保留率：
·通量为5至20kg/m2/hr，以及
·在所述HMO溶液中所述要纯化的HMO的浓度为50至300g/L。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述膜特征在于，当在以下条件下操作时表现出96.0％至约99.8％的所述要纯化的HMO的保留率：
·通量为5至20kg/m2/hr，以及
·在所述HMO溶液中所述要纯化的HMO的浓度为50至300g/L。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述膜特征在于，当在以下条件下操作时表现出至少99.0％的所述要纯化的HMO的保留率：
·通量为5至20kg/m2/hr，以及
·在所述HMO溶液中所述要纯化的HMO的浓度为50至300g/L。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述膜特征在于，当在以下条件下操作时表现出99.0％至约99.8％的所述要纯化的HMO的保留率：
·通量为5至20kg/m2/hr，以及
·在所述HMO溶液中所述要纯化的HMO的浓度为50至300g/L。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括渗滤。
15.根据权利要求14所述的方法，其中：
所述方法包括除了所述HMO溶液之外还将渗滤用水进给到所述纳米过滤单元中，并且
当归一化到具有4％(w/w)干物质组成的HMO溶液时，所述渗滤用水与所述HMO溶液的重量比小于1.6。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，当归一化到具有4％(w/w)干物质组成的HMO溶液时，所述渗滤用水与所述HMO溶液的重量比是约0.09至0.3。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述纳米过滤提供至少约40％的除盐率。
18.根据权利要求16所述的方法，其中，所述纳米过滤提供40％至96％的除盐率。
19.根据权利要求16-18中任一项所述的方法，其中，所述纳米过滤提供至少约85％的所述要纯化的HMO的收率。
20.根据权利要求16-18中任一项所述的方法，其中，所述纳米过滤提供85％至约99.9％的所述要纯化的HMO的收率。
21.根据权利要求15所述的方法，其中，当归一化到具有4％(w/w)干物质组成的HMO溶液时，所述渗滤用水与所述HMO溶液的重量比是约0.3至0.6。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述纳米过滤提供至少约90％的除盐率。
23.根据权利要求21所述的方法，其中，所述纳米过滤提供90％至96％的除盐率。
24.根据权利要求21-23中任一项所述的方法，其中，所述纳米过滤提供至少约90％的所述要纯化的HMO的收率。
25.根据权利要求21-23中任一项所述的方法，其中，所述纳米过滤提供90％至约99.9％的所述要纯化的HMO的收率。
26.根据权利要求15所述的方法，其中，当归一化到具有4％(w/w)干物质组成的HMO溶液时，所述渗滤用水与所述HMO溶液的重量比是约0.6至0.9。
27.根据权利要求26所述的方法，其中，所述纳米过滤提供至少约68％的除盐率。
28.根据权利要求26所述的方法，其中，所述纳米过滤提供68％至96％的除盐率。
29.根据权利要求26-28中任一项所述的方法，其中，所述纳米过滤提供至少约85％的所述要纯化的HMO的收率。
30.根据权利要求26-28中任一项所述的方法，其中，所述纳米过滤提供85％至约99.9％的所述要纯化的HMO的收率。
31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述膜具有30％至90％的PO4保留率(在5-15℃、2000-15000mg/kg浓度、通量5-20kg/m2/hr和pH 6-7下)。
32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述膜具有至少约80％的乳糖保留率(在25℃、20g/L浓度、通量5-20kg/m2/h和pH 8下)。
33.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述膜具有大于90％的乳糖保留率(在25℃、20g/L浓度、通量5-20kg/m2/h和pH 8下)。
34.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述HMO溶液包含或源于发酵过程的产物。
35.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述HMO溶液是通过包括从发酵产物中分离微生物的方法形成的。
36.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括超滤。
37.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括逆流超滤。
38.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法包括仅一次纳米过滤处理。
39.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括阳离子交换。
40.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括阴离子交换。
41.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括混合床离子交换。
42.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括色谱分离。
43.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括蒸发。
44.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括喷雾干燥。
45.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括结晶。
46.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中：
所述方法进一步包括结晶，并且
所述结晶不包括用有机溶剂结晶。
47.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括活性炭处理。
48.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述HMO溶液包含岩藻糖基乳糖。
49.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述HMO溶液包含2’-岩藻糖基乳糖。
50.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述HMO溶液包含3-岩藻糖基乳糖。
51.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述HMO溶液包含唾液酸基乳糖。
52.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述HMO溶液包含3’-唾液酸基乳糖。
53.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述HMO溶液包含6’-唾液酸基乳糖。
54.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述HMO溶液包含乳糖-N-四糖。
55.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述要纯化的HMO是岩藻糖基乳糖。
56.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述要纯化的HMO是2’-岩藻糖基乳糖。
57.根据权利要求1-55中任一项所述的方法，其中，要纯化的HMO是3-岩藻糖基乳糖。
58.根据权利要求1-54中任一项所述的方法，其中，所述要纯化的HMO是唾液酸基乳糖。
59.根据权利要求1-54中任一项所述的方法，其中，所述要纯化的HMO是3’-唾液酸基乳糖。
60.根据权利要求1-54中任一项所述的方法，其中，所述要纯化的HMO是6’-唾液酸基乳糖。
61.根据权利要求1-54中任一项所述的方法，其中，所述要纯化的HMO是乳糖-N-四糖。
62.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述过滤是在pH约3.0至约5.5下进行。
63.一种通过前述权利要求中任一项所述的方法制备的纯化的HMO。
64.一种通过前述权利要求中任一项所述的方法制备的纯化的HMO混合物。
65.一种用于制备食品、膳食补充剂或药物的方法，其中，所述方法包括：
根据前述权利要求中任一项所述的方法制备纯化的HMO，以及
将所述纯化的HMO与适用于所述食品、膳食补充剂或药物的成分混合。
66.根据权利要求65所述的方法，其中，所述HMO是干燥的HMO。
67.一种通过权利要求65或66所述的方法制备的食品、膳食补充剂或药物。
68.一种用于制备婴儿配方制品的方法，其中，所述方法包括：
根据前述权利要求中任一项所述的方法制备纯化的HMO，以及
将所述纯化的HMO与婴儿配方制品成分混合。
69.根据权利要求68所述的方法，其中，所述婴儿配方制品成分选自脱脂乳、碳水化合物来源、蛋白质来源、脂肪来源、维生素、矿物质及其他人乳寡糖。
70.根据权利要求51所述的方法，其中，所述婴儿配方制品成分选自乳糖、乳清蛋白浓缩物和高油酸红花籽油。
71.根据权利要求51至53中任一项所述的方法，其中，所述HMO是干燥的HMO。
72.一种通过权利要求68-71中任一项所述的方法制备的婴儿配方制品。
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